Artykuł metodologiczny

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62293

⸱

13 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustkowej i ich zastosowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do jednoczesnego badania dynamiki wapnia w dużej liczbie żywych komórek, przez długie okresy czasu i z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Streszczenie

Ostry wycinek tkanki trzustki myszy jest unikalnym preparatem in situ z zachowaną komunikacją międzykomórkową i architekturą tkankową, która pociąga za sobą znacznie mniej zmian wywołanych przygotowaniem niż izolowane wyspy trzustkowe, acini, przewody lub rozproszone komórki opisane w typowych badaniach in vitro. Łącząc ostry wycinek tkanki trzustki z obrazowaniem żywych komórek wapnia w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), sygnały wapniowe mogą być badane jednocześnie w dużej liczbie komórek endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych, z rozdzielczością jednokomórkową lub nawet subkomórkową. Czułość pozwala na wykrywanie zmian i umożliwia badanie fal międzykomórkowych i łączności funkcjonalnej, a także badanie zależności reakcji fizjologicznych komórek od ich lokalizacji w obrębie wyspy trzustkowej i relacji parakrynnej z innymi komórkami. Wreszcie, z punktu widzenia dobrostanu zwierząt, rejestrowanie sygnałów z dużej liczby komórek jednocześnie obniża liczbę zwierząt potrzebnych w eksperymentach, przyczyniając się do zasady wymiany, redukcji i udoskonalenia 3R.

Wprowadzenie

Trzustka ssaków to duży gruczoł zewnątrzwydzielniczy i dokrewny. Część zewnątrzwydzielnicza stanowi 96-99% całkowitej objętości trzustki i składa się z acini i przewodów. Część hormonalna składa się z dużej liczby wysepek Langerhansa, które stanowią pozostałe 1-4% całkowitej objętości trzustki1. Część zewnątrzwydzielnicza wydziela główne enzymy trawienne, które rozkładają bogate w energię polimery w pożywieniu, a także płyn bogaty w wodorowęglany, który łączy się z innymi wydzielinami żołądkowo-jelitowymi, zapewniając środowisko odpowiednie do działania enzymów. Część hormonalna wydziela hormony, które regulują poposiłkową dystrybucję, magazynowanie i międzyposiłkowe uwalnianie składników odżywczych bogatych w energię. Chociaż tkanka zewnątrzwydzielnicza jest stosunkowo słabo rozwinięta, a endokrynna stosunkowo dobrze rozwinięta po urodzeniu, ta pierwsza szybko przerasta drugą po odsadzeniu2,3,4. Wczesne badania nad funkcją trzustki oznaczały narodziny nowoczesnej fizjologii, a główne postępy metodologiczne w tej dziedzinie pociągnęły za sobą wielkie przełomy naukowe5. Praca z trzustką jest technicznie trudna ze względu na skomplikowaną strukturę gruczołu, ale jest również dużą motywacją ze względu na choroby takie jak rak trzustki, zapalenie trzustki i cukrzyca, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i dla których potrzebne są nowatorskie podejścia terapeutyczne.

Izolowane wysepki6, acini7,8, a fragmenty przewodów były opracowywane i używane przez dziesięciolecia jako złote metody ze względu na ich zalety w porównaniu z liniami komórkowymi i pierwotnymi rozproszonymi komórkami endokrynnymi, acinarnymi i przewodowymi9,10. Pomimo znacznie ulepszonej funkcji izolowanych zbiorowisk komórkowych, metody te nadal wiążą się ze znacznym obciążeniem mechanicznym i enzymatycznym, izolują komórki od otaczającej tkanki, a tym samym nie mają interakcji parakrynnych i wsparcia mechanicznego, a co najważniejsze, towarzyszą im znaczące zmiany w normalnej fizjologii11,12,13. Ostry wycinek tkanki trzustki myszy został opracowany w 2001 roku z powodu postrzeganej potrzeby opracowania eksperymentalnej platformy podobnej do wycinków mózgu, przysadki mózgowej i nadnerczy z zachowanymi kontaktami międzykomórkowymi, interakcjami parakrynnymi, mezenchymą i architekturą tkankową, a także bez niektórych z najważniejszych wad metody złotego standardu w badaniach wysp trzustkowych tamtych czasów - izolowanych wysepek12, 14. Wśród tych niedociągnięć znajdują się uszkodzenia najbardziej zewnętrznych warstw, brak dostępności obszarów wysepek rdzeniowych oraz potrzeba hodowli, która może mieć istotny wpływ na tożsamość i fizjologię komórek12,15. Co więcej, metoda warstw tkanek umożliwia badania na modelach zwierzęcych o znacznie zaburzonej architekturze wysepek, gdzie niemożliwe jest wyizolowanie wysepek lub gdy wydajność wysepek jest bardzo niska przy tradycyjnej izolacji16,17,18,19,20,21.

Dodatkowo, wycinek jest bardziej odpowiedni do badania zmian morfologicznych podczas rozwoju cukrzycy i zapalenia trzustki, na przykład, ponieważ umożliwia lepszy przegląd całej tkanki i jest również kompatybilny z badaniem różnic regionalnych. Co ważne, pomimo wczesnego skupienia się na części hormonalnej, metoda warstw tkanek z natury umożliwia badanie składników zewnątrzwydzielniczych9,22,23. W ciągu pierwszej dekady po wprowadzeniu metoda ta była stosowana do badań elektrofizjologicznych klasy beta14,24,25,26,27,28,29 i alpha30,31 komórek, a także do badania morfologicznego i funkcjonalnego dojrzewania trzustki2,3. Dziesięć lat później, w 2013 roku, metoda została z powodzeniem zaadaptowana do obrazowania komórek wysp trzustkowych na żywych komórkach wapnia przy użyciu CLSM w celu scharakteryzowania ich reakcji na glukozę32, ich wzorców połączeń funkcjonalnych33 oraz związku między potencjałem błonowym a wewnątrzkomórkowym wapniem poprzez połączenie fluorescencyjnego barwnika wapniowego z barwnikiem potencjału błonowego34. Później w tym samym roku metoda ta została również wykorzystana do oceny dynamiki wapnia w komórkach groniastych22,35. W ciągu następnych lat wycinki tkanki trzustkowej były wykorzystywane w wielu różnych badaniach i z powodzeniem adaptowane do tkanek świńskich i ludzkich9,36,37,38,39,40,41. Jednak podsumowując, obrazowanie wapnia - ogólnie w wycinkach tkanki trzustki myszy, a w szczególności w wyspach trzustkowych - jest nadal wykonywane głównie przez tę grupę. Jedną z głównych przyczyn takiego stanu rzeczy może być połączenie trudnego technicznie przygotowania wycinków tkanki, potrzeby mikroskopu konfokalnego i dość złożonej analizy danych. Głównym celem niniejszego artykułu jest uczynienie tej potężnej metody bardziej dostępną dla innych potencjalnych użytkowników.

Istnieje już kilka doskonałych artykułów metodologicznych szczegółowo omawiających przygotowanie wycinków tkanek i wykorzystanie plastrów do badań strukturalnych i wydzielniczych, ale nie do konfokalnego obrazowania wapnia9,42,43. Dlatego w tym artykule skupiono się na kilku dodatkowych wskazówkach i sztuczkach podczas przygotowywania plastrów, na krokach krytycznych dla pomyślnego ładowania barwnika, akwizycji obrazu, a także na głównych krokach podstawowej analizy danych dotyczących wapnia. W związku z tym wkład ten powinien być postrzegany raczej jako uzupełnienie niż alternatywa dla wyżej wymienionej metody. Podobnie, obrazowanie wapnia w wycinkach tkanki trzustki myszy powinno być postrzegane jako podejście eksperymentalne, które należy zastosować w celu udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania, a zatem jest raczej uzupełnieniem niż absolutną alternatywą dla innych podejść do obrazowania wapnia w fizjologii trzustki, takich jak izolowane przewody lub acini, izolowane wyspy trzustkowe, organoidy, wyspy trzustkowe przeszczepione do przedniej komory oka, i nagrania in vivo11,44,45,46,47,48. Potencjał obrazowania wapnia w wycinkach tkanki trzustki myszy jest prawdopodobnie najlepiej zilustrowany przez niedawne udane nagrania dynamiki wapnia w komórkach mezenchymalnych wysp trzustkowych, takich jak pericytes49 i makrofagi50, a także w komórkach przewodowych23.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach. Protokół został zatwierdzony przez Administrację Republiki Słowenii ds. Bezpieczeństwa Żywności, Sektora Weterynaryjnego i Ochrony Roślin (numer pozwolenia: 34401-35-2018/2).

1. Przygotowanie skrawków tkanki trzustki

UWAGA: Przygotowanie świeżych przekrojów tkanki trzustki myszy do obrazowania wapnia za pomocą CLSM wymaga zastosowania szeregu instrumentów i różnych roztworów oraz przebiega w serii krytycznych etapów, które zostały przedstawione schematycznie na Rysunku 1 i szczegółowo opisane poniżej.

Schemat procesu obrazowania trzustki: wtryskiwanie, ekstrakcja, krojenie, obrazowanie wapnia, analiza danych.
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy. Schematyczne przedstawienie wszystkich etapów procesu przygotowania skrawków tkanki trzustki, zaczynając od wstrzyknięcia agarozy do wspólnego przewodu żółciowego, a następnie ekstrakcji trzustki i jej krojenia. Przygotowane skrawki mogą być wykorzystane do oceny żywotności tkanki za pomocą zestawu Live/Dead lub barwione sensorem wapnia. Po zabarwieniu są one gotowe do obrazowania. Rejestracje uzyskane w procesie obrazowania są następnie wykorzystywane do analizy danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie roztworów
    UWAGA: Wszystkie roztwory powinny zostać przygotowane z wyprzedzeniem i mogą być przechowywane w lodówce w temperaturze 4-8 °C do jednego miesiąca. Do przygotowania i przechowywania skrawków tkanek potrzeba około 0,5 L roztworu zewnątrzkomórkowego (ECS) z 6 mM glukozą oraz 0,3 L buforu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES). Do jednego dnia obrazowania wapnia z systemem perifuzji ustawionym na szybkość przepływu 1-2 mL/min potrzeba około 0,5 L ECS.
    1. Roztwór zewnątrzkomórkowy z 6 mM glukozą
      1. Przygotować 1 L ECS zawierającego 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM glukozy, 6 mM kwasu mlekowego, 3 mM myo-inozytolu, 2,5 mM KCl, 2 mM pirogronianu sodu, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 oraz 0,5 mM kwasu askorbinowego. Mieszać dokładnie, aż wszystkie składniki całkowicie się rozpuszczą. Przenieść 50 μL ECS do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL, umieścić ją w osmometrze zgodnie z instrukcją producenta i sprawdzić osmolarność.
        UWAGA: Osmolarność powinna wynosić 300-320 mOsm. Do stymulacji komórek beta należy używać roztworów o wyższych stężeniach glukozy. Aby zapewnić fizjologiczną wartość pH 7,4 podczas krojenia i przeprowadzania eksperymentów, ECS należy stale napowietrzać karbogenem (tj. mieszaniną gazową 95% O2 i 5% CO2) pod ciśnieniem barometrycznym. Prosty system napowietrzania można stworzyć, mocując jeden koniec 5 mm silikonowej rurki do źródła karbogenu (np. butli z gazem pod ciśnieniem), a drugi koniec rurki umieszczając bezpośrednio w butelce z ECS.
      2. Alternatywnie można przygotować 10-krotny roztwór zapasowy zawierający 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inozytolu, 25 mM KCl, 20 mM pirogronianu sodu, 12,5 mM NaH2PO4 oraz 5 mM kwasu askorbinowego. Gdy potrzebny jest ECS zawierający 6 mM glukozy, wymieszać 100 mL roztworu zapasowego z 2 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgCl2, 0,455 mL 13,2 M kwasu mlekowego i 1,08 g glukozy, a następnie dopełnić wodą dwukrotnie destylowaną do objętości 1 L. W razie potrzeby użyć innych ilości glukozy, aby uzyskać inne stężenia glukozy.
    2. Bufor HEPES z 6 mM glukozą
      1. Przygotować 0,5 L roztworu buforowanego HEPES (HBS) zawierającego 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM glukozy, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 oraz 1 mM MgCl2; mianować do pH = 7,4 za pomocą 1 M NaOH.
        UWAGA: Jeśli karbogen nie jest dostępny, bufor ten można stosować we wszystkich etapach zamiast ECS.
    3. Agaroza (1,9% w/w)
      1. Podgrzać kąpiel wodną do 40 °C.
      2. Dodać 0,475 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia oraz 25 mL ECS zawierającego 6 mM glukozy do kolby Erlenmeyera i umieścić kolbę w kuchence mikrofalowej na maksymalnej mocy przez kilka sekund, aż zacznie wrzeć. Wyjąć kolbę z kuchenki i kilkakrotnie zakręcić, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przenieść kolbę z płynną agarozą do podgrzanej kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C, aby schłodzić agarozę do pożądanej temperatury i utrzymać ją w stanie ciekłym do czasu wstrzyknięcia. Zabezpieczyć kolbę stabilizującym pierścieniem ołowianym.
        UWAGA: Agarozę można przygotować wcześniej i przechowywać w lodówce. Przed użyciem podgrzać agarozę w kuchence mikrofalowej do czasu jej upłynnienia, a następnie przenieść kolbę Erlenmeyera do kąpieli wodnej podgrzanej do 40 °C. Agarozę można wykorzystać ponownie do 5 razy. Po więcej niż 5 użyciach stanie się ona gęsta i trudniejsza do wstrzyknięcia.
  2. Wstrzykiwanie agarozy do trzustki
    UWAGA: Sekcje 1.2 i 1.3 wyjaśniają przygotowanie skrawków tkanek, które mogą być wykorzystane do różnych celów eksperymentalnych, takich jak obrazowanie wapnia, elektrofizjologia, immunohistochemia, badania sekrecyjnych oraz badania strukturalne/mikroanatomiczne.
    1. Napełnić strzykawkę 5 mL płynną agarozą z kolby Erlenmeyera w kąpieli wodnej z kroku 1.1.3.2, usunąć pęcherzyki powietrza i założyć igłę 30 G. Zabezpieczyć igłę nasadką i ponownie umieścić napełnioną strzykawkę w kąpieli wodnej igłą skierowaną w dół, tak aby cała objętość agarozy znajdowała się poniżej powierzchni wody. Zabezpieczyć strzykawkę stabilizującym pierścieniem ołowianym w taki sposób, aby pierścień dociskał strzykawkę do ścianki kąpieli wodnej.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie wtłoczyć agarozy do igły, ponieważ szybko stwardnieje i zablokuje igłę. Jeśli temperatura w pomieszczeniu jest niska i wstrzykiwanie wykonuje osoba mniej doświadczona, zwiększyć temperaturę kąpieli wodnej do 42 °C, aby zyskać dodatkowy czas na iniekcję.
    2. Napełnić wiadro lodem i umieścić w nim butelkę z ECS. Stałe napowietrzanie ECS karbogenem z przepływem 1,5 mL/min pod ciśnieniem barometrycznym i w temperaturze pokojowej, aby zapewnić natlenienie i pH 7,4.
    3. Uśmiercić mysz poprzez podanie wysokiego stężenia CO2, a następnie przeprowadzić dyslokację szyjną. Dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierzęcia.
    4. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, uzyskać dostęp do jamy brzusznej poprzez laparotomię (Rysunek 2A). Delikatnie odsunąć jelita na lewą stronę myszy (z perspektywy anatomicznej myszy), aby odsłonić wspólny przewód żółciowy. Za pomocą pincety lekko unieść część dwunastniczą i odnaleźć główną brodawkę dwunastniczą (brodawka Vatera). Zaciisnąć wspólny przewód żółciowy na wysokości brodawki dwunastniczej za pomocą hemostatu (Rysunek 2B,C), aby zapobiec wyciekowi agarozy z przewodu do dwunastnicy.
      UWAGA: Aby zapobiec wyciekowi agarozy do dwunastnicy oraz dalej w górę i w dół przewodu pokarmowego, należy umieścić hemostat w taki sposób, aby zacisnął on również dwunastnicę zarówno proksymalnie, jak i dystalnie od brodawki. W tym celu najlepiej użyć hemostatu zakrzywionego.
    5. Małą, ostrą pincetą wejść pod wspólny przewód żółciowy i przerwać błonę łączącą przewód z tkanką trzustki. Dla lepszej kontroli wizualnej i łatwiejszego wstrzyknięcia, usunąć z okolic przewodu jak najwięcej tkanki tłuszczowej i łącznej.
    6. Umieścić przewód prostopadle na dużych pincetach (Rysunek 2D) i wstrzyknąć przygotowaną płynną agarozę do proksymalnej części wspólnego przewodu żółciowego (Rysunek 2D). Należy mocno nacisnąć tłok strzykawki, ponieważ agaroza jest lepka. Napełniać trzustkę, aż stanie się biawa i lekko obrzmiała lub przez co najmniej 20-30 s.
      UWAGA: Jest to krytyczny etap przygotowania skrawków. Jeśli w drzewie przewodowym trzustki występują jakiekolwiek zagięcia, należy delikatnie unieść lub odciągnąć trzustkę od strzykawki, aby je wyprostować. Nie należy decydować o zakończeniu iniekcji na podstawie objętości wypchniętej ze strzykawki, ponieważ cofanie się roztworu w miejscu wstrzyknięcia oraz wyciek do dwunastnicy są zazwyczaj znacznie większe niż objętość wstrzyknięta do drzewa przewodowego trzustki. Co ważne, udane iniekcje mogą zostać wykonane przy praktycznie niezauważalnych zmianach objętości w strzykawce.
    7. Usunąć strzykawkę i powoli wlać na trzustkę 20 mL napowietrzonego, lodowatego ECS o temperaturze 0-4 °C z butelki, aby schłodzić tkankę i utwardzić agarozę.
    8. Delikatnie wyciąć trzustkę za pomocą pincety i precyzyjnych nożyczek do twardych tkanek. Umieścić wyjętą trzustkę w szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej ~40 mL lodowatego ECS i delikatnie przesuwać ją, aby wypłukać. Przenieść trzustkę do nowej szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej ~40 mL lodowatego ECS.
    9. Z dobrze wypełnionej części trzustki, która wygląda na biawą (Rysunek 3A), wyciąć za pomocą pincety i nożyczek do twardych tkanek do 6 bloków tkanki o rozmiarze 0,1-0,2 cm3. Oczyścić je z wszelkiej tkanki łącznej i tłuszczowej.
    10. Napełnić 35 mm szalkę Petriego z nieprzywierającym dnem około 5 mL płynnej agarozy o temperaturze 40 °C, przenieść do niej bloki tkanki i natychmiast umieścić szalkę na lodzie, aby ją schłodzić i utwardzić agarozę.
      ​UWAGA: Sposób uwięzienia bloków trzustki w agarozie determinuje sposób ich cięcia podczas krojenia. Doświadczeni eksperymentatorzy mogą próbować precyzyjnie ustawić pozycję bloków w ciągu kilku chwil przed utwardzeniem agarozy po umieszczeniu jej na lodzie.
    11. Po utwardzeniu agarozy z blokami tkanki, odwrócić szalkę Petriego do góry dnem na płaską, gładką powierzchnię, np. pokrywkę szalki Petriego o średnicy 100 mm, i usunąć agarozę, delikatnie nacinając połową ostrza żyletki margines między ścianą boczną szalki a agarozą. Żyletką wyciąć poszczególne kostki agarozy, z których każda zawiera jeden blok tkanki, dbając o to, aby każdy blok tkanki był otoczony agarozą. Przykleić bloki agarozy do płytki próbnej wibrotomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Rysunek 3B).

Schemat procedury chirurgicznej u szczura; kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego; etapy sekcji anatomicznej.
Rycina 2: Wstrzyknięcie agarozy do wspólnego przewodu żółciowego. (A) Otwarcie jamy brzusznej i odsłonięcie narządów w jamie otrzewnowej. (B) Powiększony fragment obszaru obramowanego prostokątem na panelu A. Biała plamka na dwunastnicy (wskazana strzałką) oznacza opuszkę Vatera. Wyspy Langerhansa są oznaczone grotami strzałek. (C) Zaciśnięcie opuszki Vatera za pomocą zakrzywionego kleszczyka hemostatycznego i jej lekkie uniesienie w celu odsłonięcia i delikatnego rozciągnięcia wspólnego przewodu żółciowego (strzałka). (D) Kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego i wstrzyknięcie 1,9% roztworu agarozy przy użyciu strzykawki 5 mL i igły 30 G. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Krojenie
    1. Napełnić komorę tnącą wibratomu ok. 0,15 L lodowatego roztworu ECS i stale napowietrzać go karbogenem. Otoczyć komorę tnącą lodem, a do wnętrza komory dodać 2 kostki lodu (ok. 10 mL każda) wykonane z roztworu ECS z 6 mM glukozy. Zamontować ostrze do cięcia w wibratomie, a płytkę z próbką przytwierdzić śrubami za pomocą bloków agarozy na jej miejscu.
    2. Ustawić wibratom tak, aby kroił bloki agarozy z prędkością od 0,05 do 1 mm/s i częstotliwością 70 Hz na plastry o grubości 140 µm i powierzchni 20-100 mm2. W kwestii ustawień urządzenia należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Natychmiast po każdym etapie cięcia wstrzymać pracę urządzenia, delikatnie zebrać plastry za pomocą cienkiego pędzla i przenieść je do szalki Petriego o średnicy 100 mm wypełnionej 40 mL buforu HEPES z 6 mM glukozy w temperaturze pokojowej (Rysunek 3C).
      UWAGA: Plastry można przechowywać w buforze HEPES w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 h, przy czym bufor należy wymieniać co 2 h.

Analiza wstrzyknięcia do tkanki tłuszczowej; schematy procedury chirurgicznej, przetwarzania tkanki tłuszczowej, wyniki mikroskopowe.
Rysunek 3: Przygotowanie i krojenie tkanki trzustki. (A) Wyekstrahowana trzustka myszy po wstrzyknięciu agarozy. Biała tkanka po lewej stronie wskazuje na prawidłowo wstrzykniętą część (część dwunastnicza), natomiast bardziej czerwonawa część po prawej stronie wskazuje na niedostatecznie wstrzykniętą część trzustki (część śledzionowa). (B) Krojenie w wibratomie dwóch bloków tkanki trzustki zatopionych w agarozie. (C) Przekrój świeżej tkanki trzustki z zaznaczonymi grotami strzałek wyspami Langerhansa. Pasek skali = 3000 µm. (D) Przekrój świeżej tkanki trzustki pod mikroskopem świetlnym z zaznaczoną grotem strzałki wyspą Langerhansa; gwiazdka oznacza przewód trzustkowy. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Test żywotności/śmierci komórek z użyciem zestawu LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit dla komórek ssaków

UWAGA: W przypadku niektórych eksperymentów warto sprawdzić żywotność komórek w skrawkach (Rysunek 4), przeprowadzając test żywych i martwych komórek w następujący sposób.

  1. Zgodnie z instrukcją producenta rozmrozić fiolki z odczynnikami z zestawu LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit i przygotować roztwory robocze kalceiny AM bezpośrednio przed użyciem. Roztworów należy użyć w ciągu jednego dnia.
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 15 mL zmieszać 5 µL 4 mM kalceiny AM (Komponent A), 20 µL 2 mM etydium homodimeru-1 (EthD-1, Komponent B) oraz 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (D-PBS), aby przygotować roztwór roboczy zawierający około 2 µM kalceiny AM i 4 µM EthD-1. Całość dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex.
  3. Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie przenieść skrawki tkanki doy szalki Petriego o pojemności 3 mL z nowym buforem HEPES w celu rozcieńczenia aktywności esterazy surowiczej. Usunąć bufor HEPES i pokryć skrawki 100-200 µL (lub więcej, jeśli jest to konieczne) roztworu roboczego z kroku 2.2.
  4. Inkubować skrawki przez 30-45 min w temperaturze pokojowej w zamkniętej szalce Petriego. Wykonać obrazowanie skrawków tkanki, stosując filtry wzbudzenia/emisji zalecane przez producenta.

3. Obciążanie barwnikiem wapniowym

UWAGA: Barwniki fluorescencyjne powinny być chronione przed ekspozycją na światło podczas całego procesu przygotowywania i nakładania barwnika, a także podczas manipulowania zabarwionymi skrawkami tkanek. Do przykrywania probówek lub szalek Petri zawierających barwnik wapniowy można użyć folii aluminiowej.

  1. Przygotowanie barwnika
    1. Rozpuścić zawartość jednej fiolki (50 µg) przepuszczalnego przez błony komórkowe barwnika wskaźnikowego Ca2+ (stymulacja/emisja 495/523 nm; patrz Tabela materiałów), 7,5 µL dimetylosulfotlenku (DMSO) oraz 2,5 µL poloksameru (roztwór 20% w DMSO; Tabela materiałów) w 6,667 mL buforu HBS zawierającego 6 mM glukozy w 15 mL probówce z nakrętką.
      UWAGA: Ten końcowy roztwór zawiera 6 µM barwnika wskaźnikowego Ca2+, 0,11% DMSO oraz 0,037% poloksameru.
    2. Wielokrotnie aspirować i wydmuchiwać roztwór w probówce z nakrętką za pomocą pipety przez 20 s; zanurzyć probówkę w komorze kąpieli ultradźwiękowej na 30 s, a następnie mieszać w vortexie przez 30 s w celu poprawy rozpuszczalności. Odmierzyć 3,333 mL końcowego roztworu barwnika wskaźnikowego Ca2+ przygotowanego w kroku 3.1.1 do naczyń Petriego o pojemności 5 mL.
  2. Ładowanie barwnika
    1. Przenieść przygotowane skrawki tkanek z 60 mL naczynia Petriego z HBS do 5 mL naczyń Petriego wypełnionych roztworem barwnika, delikatnie podnosząc każdy skrawek cienkim, miękkim pędzlem i umieszczając go w roztworze barwnika. Inkubować do 10 skrawków tkanek na jedno naczynie Petriego.
    2. Umieścić naczynie Petriego ze skrawkami na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej, ustawionej na ruch orbitalny z prędkością 40 obrotów na minutę przez 50 min. Inkubować skrawki w roztworze barwnika, wystawiając je na powietrze w temperaturze pokojowej, ale chroniąc przed światłem poprzez przykrycie naczynia Petriego folią aluminiową.
  3. Przechowywanie skrawków
    1. Przenieść zabarwione skrawki tkanek z 5 mL naczynia Petriego do 60 mL naczynia Petriego wypełnionego HBS bez barwnika, delikatnie podnosząc je za pomocą cienkiego, miękkiego pędzla. Przechowywać do 20 skrawków w jednym naczyniu Petriego.
      UWAGA: Na tym etapie można wykorzystać skrawki tkanek do obrazowania. Skrawki tkanek zatrzymują barwnik wskaźnikowy Ca2+ przez kilka godzin. Przeżywalność skrawków i retencję barwnika można poprawić, umieszczając naczynie Petriego w izolowanym pojemniku w otoczeniu lodu. Jest to szczególnie istotne w przypadku transportu skrawków załadowanych barwnikiem. Dodatkowo wymieniać HBS co 2 h.

4. Obrazowanie wapnia

  1. Konfiguracja mikroskopu konfokalnego
    1. Wybierz odpowiednie powiększenie obiektywu w zależności od celu badania. Wybierz 20x i 25x (apertura numeryczna [NA] 0,77-1,00) do wizualizacji całego wysepki, kilku acinusów jednocześnie lub większych przewodów. Wybierz większe powiększenia do badania dynamiki wewnątrzkomórkowej.
    2. Wybierz tryb akwizycji dla obrazowania poklatkowego (np. time-lapse, xyt lub podobny tryb). Ustaw otwór pinhole na 100-200 µm.
    3. Ustaw tor światła dla fluoroforów zielonych: wzbudzenie przy 488 nm i zbieranie emisji w zakresie 500-700 nm. Preferowane jest zastosowanie detektorów o wysokiej wydajności kwantowej (np. fosforku arsenku galu) zamiast detektorów z fotopowielaczem.
  2. Konfiguracja komory pomiarowej i systemu perifuzji
    1. Zamocuj komorę pomiarową na stoliku mikroskopu z kontrolą temperatury oraz system perifuzji (układ grawitacyjny lub oparty na pompie perystaltycznej, objętość 1 mL). Umieść wlot i wylot na przeciwległych krawędziach komory pomiarowej, aby uniknąć meandrowania perfuzatu wewnątrz komory, i ustaw przepływ wlotowy oraz wylotowy na równe wartości (1-2 mL/min). Unikaj dryfu wysokości menisku cieczy oraz powstawania kropli w perfuzacie.
    2. Ustaw kontrolę temperatury systemu perifuzji na 37 °C. Rozpocznij perifuzję roztworem niestymulującym i przygotuj roztwory stymulujące. Zmieniaj roztwory za pomocą zaworów zmotoryzowanych lub poprzez ręczne przełączanie roztworów zasilających system perifuzji.
  3. Rejestracja dynamiki wapnia
    1. Przenieś pojedynczy skrawek tkanki do komory pomiarowej. Unieruchom skrawek tkanki za pomocą platynowego obciążnika w kształcie litery U z napiętą nylonową siatką (np. z pończoch nylonowych). Unikaj umieszczania nici nylonowych nad badaną strukturą.
    2. Zlokalizuj wysepkę/acinus/przewód, korzystając z opcji jasnego pola. Uruchom obrazowanie na żywo, aby ustawić badane struktury w polu widzenia, i skonfiguruj parametry obrazowania. Zoptymalizuj stosunek sygnału do szumu, regulując moc lasera, wzmocnienie detektora oraz uśrednianie linii/binning, aby umożliwić wizualizację komórek przy minimalnej mocy lasera.
    3. Ustaw płaszczyznę ogniskowania rejestracji na ok. 15 µm poniżej powierzchni cięcia (Rysunek 5), aby uniknąć rejestracji z potencjalnie uszkodzonych komórek na powierzchni cięcia.
    4. Wykonaj akwizycję obrazów. Ustaw częstotliwość próbkowania na 1-2 Hz, aby początkowo wykryć poszczególne oscylacje, i użyj skanera rezonansowego zdolnego do szybkiego uśredniania linii (8-20) przy wyższej częstotliwości akwizycji (>10 Hz) w celu rejestracji aktywności wewnątrzkomórkowego Ca2+ ([Ca2+]IC). Zachowaj odstęp (np. 30% całkowitego czasu próbkowania) między kolejnymi punktami oświetlenia, aby zapobiec fototoksyczności. Zarejestruj obraz o wysokiej rozdzielczości (np. 1024 x 1024 pikseli, uśrednianie linii > 50) przed akwizycją serii czasowej (patrz sekcja 5).
      UWAGA: Częstotliwość próbkowania 1-2 Hz jest poniżej kryterium Nyquista dla częstotliwości akwizycji większości komórek, a kształt sygnału będzie domyślnie niedopróbkowany.
    5. Korzystaj z wykresu online, jeśli jest dostępny w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać natychmiastową informację zwrotną o odpowiedzi preparatu, nadmiernym oświetleniu, fotoblaknięciu i dryfcie mechanicznym. W przypadku wysokiego tempa blaknięcia podczas akwizycji, przerwij rejestrację i zmniejsz moc lasera, zwiększając jednocześnie wzmocnienie detektora, aby utrzymać stosunek sygnału do szumu. W przypadku dryftu mechanicznego sprawdź, czy nie ma napięcia między przewodami/kablami a stolikiem mikroskopu, a także czy nie występują wycieki cieczy lub zmiany objętości w komorze pomiarowej. Opcjonalnie można próbować ręcznie korygować dryft podczas akwizycji; należy jednak pamiętać, że przyniesie to ograniczone rezultaty.
      UWAGA: Komórki endokrynne są wysoce heterogenne przy stężeniach bliskich progowych. Wymagany jest odpowiedni czas stymulacji, aby wykryć zakres opóźnień aktywacji/deaktywacji w poszczególnych komórkach. Jest to szczególnie ważne dla dokładnego wykrywania odpowiedzi wyłączenia (off-responses) po protokołach silnie stymulujących.
    6. Wykorzystaj obrazowanie wapnia do funkcjonalnego rozróżnienia między komórkami endokrynnymi a egzokrynnymi (Rysunek 6). Aby zarejestrować aktywność przejściową podczas aktywacji i deaktywacji, aplikuj bodźce bez przerywania rejestracji.
    7. Zapisz dane po zakończeniu eksperymentu (rozważ użycie funkcji autozapisu). Pozostaw czas na chłodzenie przed wyłączeniem lasera, aby nie uszkodzić laserów podczas procedury wyłączania.

5. Analiza danych

  1. Dokonaj jakościowej inspekcji nagrania, odtwarzając wideo time-lapse. Sprawdź, czy nie występuje dryft komórek poza pole widzenia lub płaszczyznę optyczną. Jeśli wystąpił dryft w obrębie płaszczyzny optycznej, zastosuj wtyczkę do korekcji dryftu w programie ImageJ.
  2. Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania mikroskopu lub oprogramowania zewnętrznego. Jako referencję do wyboru ROI wykorzystaj obraz o wysokiej rozdzielczości, projekcję maksymalną lub średnią z klatek. Odtwórz obrazowanie time-lapse, aby zwizualizować komórki reagujące, które nie są widoczne na obrazach referencyjnych. Ustaw ROI w taki sposób, aby wybrany obszar ROI nie nakładał się na sąsiednie komórki, co zapobiegnie przesłuchom sygnałów (crosstalk) pomiędzy ROI.
  3. Wyeksportuj dane z serii czasowej jako średnią wartość ROI na klatkę. Wyeksportuj współrzędne ROI.
  4. Skoryguj dane z serii czasowej pod kątem blaknięcia (fotobleachingu) (Rysunek 7A), stosując kombinację dopasowania wykładniczego i liniowego, zgodnie z opisem w
    Wzór na korelacji krzyżowej xcorr(t)=a·e^(-bx(t))+c·x(t); koncepcja analizy sygnału. (1)
    gdzie x(t) oznacza sygnał fluorescencji w punkcie czasowym t; xcorr(t) skorygowany sygnał w odpowiadających punktach czasowych; a a, b i c to parametry dopasowania obliczone jako najmniejsza suma kwadratów różnic między corr(t) a x(t).
  5. Przeanalizuj fazę aktywacji i deaktywacji odpowiedzi (Rysunek 7B). Oblicz pierwszą pochodną danych z serii czasowej i wyznacz maksimum (zenit) oraz minimum (nadir) pochodnej, odpowiadające odpowiednio aktywacji i deaktywacji. Alternatywnie, ręcznie zaznacz początek fazowego wzrostu. Zapisz i wyeksportuj czasy aktywacji/deaktywacji oraz odpowiadające im współrzędne komórek.
  6. Przeanalizuj fazę plateau (Rysunek 7C). Wykryj poszczególne oscylacje poprzez progowanie surowych danych lub progowanie pierwszej pochodnej danych z serii czasowej. Zdefiniuj początek i koniec pojedynczej oscylacji jako czas odpowiadający połowie amplitudy oscylacji.
    1. Oblicz czas trwania i częstotliwość poszczególnych oscylacji dla każdej komórki. Oblicz wartość odwrotną do odstępu między impulsami (interspike interval) (odpowiednie dla regularnych wzorców aktywności). Alternatywnie, podziel liczbę oscylacji przez przedział czasowy nagrania (odpowiednie dla nieregularnych wzorców aktywności).
    2. Oblicz czas aktywny. Wyraź czas aktywny jako sumę czasów trwania i podziel tę wartość przez przedział czasowy. Alternatywnie, pomnóż częstotliwość przez czas trwania pojedynczej oscylacji.
      UWAGA: Podzielenie sumy czasów trwania przez przedział czasowy daje wiarygodne wyniki, ale charakteryzuje się niską dyskryminacją statystyczną, ponieważ uzyskuje się tylko jeden punkt danych na komórkę. Mnożenie częstotliwości i czasu trwania oscylacji zapewnia rozdzielczość czasową z oscylacji na oscylację.

Wyniki

Wstrzyknięcie roztworu agarozy do przewodu trzustkowego jest najważniejszym krokiem w przygotowaniu plastrów tkanki trzustki. Prawidłowe wstrzyknięcie można rozpoznać po wybieleniu tkanki trzustki, co widoczne jest po lewej stronie Rysunku 3A, natomiast niedostatecznie wypełniona część trzustki przedstawiona jest po prawej stronie Rysunku 3A. Wyspy Langerhansa można rozpoznać gołym okiem lub pod stereomikroskopem, co ułatwia wycinanie odpowiednich części trzustki do późniejszego zatopienia w blokach agarozowych (Rysunek 3B). W świeżo wyciętym plastrze tkanki trzustki myszy wyspy Langerhansa można łatwo odróżnić od otaczającej tkanki egzokrynnej i mezenchymy jako białe punkty pod stereomikroskopem (Rysunek 3C) lub jako brązowawe struktury pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 3D). Plastry tkanki trzustki mogą być wykorzystywane do różnych typów eksperymentów przez co najmniej 12 h po wycięciu. Oprócz ogólnej oceny morfologicznej pod stereomikroskopem, mikroskopem świetlnym oraz analizy odpowiedzi funkcjonalnych komórek podczas obrazowania wapnia, można ocenić żywotność plastrów tkanki trzustki (Rysunek 4).

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający struktury komórkowe; barwienie czerwono-zielone podkreśla rozmieszczenie.
Rysunek 4: Żywotność komórek w skrawku tkanki. Żywotność komórek określono za pomocą testu Live/Dead. Żywe komórki są barwione Calcein AM (kolor zielony), natomiast martwe komórki są barwione etydium homodimerem-1 (kolor czerwony). Żółte linie wyznaczają położenie przekroju X-Y stosu Z (Z-stack) wyświetlonego na dole i po prawej stronie. Pełna głębokość stosu Z wynosi 88 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

W eksperymentach z obrazowaniem wapnia fluorescencyjny wskaźnik wapnia musi przeniknąć przez kilka warstw komórek. Rysunek 5A przedstawia pomyślne wprowadzenie przenikalnego przez błony komórkowe barwnika wskaźnikowego Ca2+ do przekroju tkanki trzustki, w którym można rozpoznać poszczególne komórki wysepek oraz komórki acinarne. W przeciwieństwie do tego, przekroje na Rysunku 5B-D nie są optymalne ze względu na niepowodzenie w przenikaniu barwnika (Rysunek 5B), brak komórek wysepek (Rysunek 5C) oraz obecność dużej ilości tkanki martwiczej na powierzchni (Rysunek 5D). Takie przekroje można odrzucić, sprawdzić pod kątem obecności dodatkowych wysepek, które są lepiej przecięte lub zabarwione (patrz Tabela 1 w celu rozwiązywania problemów), lub wykorzystać do rejestracji odpowiedzi komórek egzokrynnych.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza tkanki komórkowej; rozkład intensywności emisji.
Rysunek 5: Przykłady preparatów użytecznych i nieużytecznych. (A) Przykład prawidłowo przygotowanego przekroju tkanki trzustki z dobrze wybarwionymi komórkami w wysepkach Langerhansa, a także komórkami przewodowymi i otaczającą tkanką acynarną. (B) Przykład słabo wybarwionego przekroju tkanki. (C) Przykład wysepki Langerhansa z przerwami w strukturze. (D) Przykład wysepki Langerhansa zawierającej wiele martwych komórek i dużo debrisu. Tabela mapowania kolorów „glow-over, glow-under” po prawej stronie wyświetla intensywność 0 w kolorze zielonym, a nasycenie w kolorze niebieskim. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Reprezentatywne wyniki obrazowania wapnia z użyciem przenikającego przez błony komórkowe barwnika wskaźnikowego Ca2+ przedstawiono na Rysunku 6. Na Rysunku 6A zaprezentowano obraz o wysokiej rozdzielczości przekroju tkanki trzustki, zawierający wysepkę Langerhansa, tkankę acynarną oraz przewód trzustkowy. W celu lepszego rozróżnienia, części endokrynna, egzokrynna i przewodowa przekroju tkanki trzustki przedstawionego na Rysunku 6A zostały pokolorowane na Rysunku 6B. Zastosowanie odpowiednich bodźców pozwala na funkcjonalne rozróżnienie pomiędzy różnymi komórkami wysepek lub pomiędzy komórkami wysepek a komórkami pozawysepkowymi51. Komórki beta zazwyczaj reagują na stymulację glukozą w formie impulsu prostokątnego przejściowym wzrostem [Ca2+]IC, po którym następują szybkie oscylacje wapnia na stałym plateau (Rysunek 6C, panel górny).

Ponieważ wszystkie komórki beta są sprzężone w jedno duże, funkcjonalne syncytium, oscylacje te są również bardzo dobrze zsynchronizowane pomiędzy różnymi komórkami poprzez rozprzestrzenianie się fal [Ca2+]IC32,34,52,53,54 (Rysunek 7C). Wolniejsze oscylacje [Ca2+]IC o okresie od 5 do 15 minut mogą stanowić podstawę oscylacji szybkich lub nawet być dominującym typem odpowiedzi55,56. Ten sam prosty protokół może ujawnić inne typy odpowiedzi, szczególnie na obrzeżach wysepek (Rysunek 6C, dolny panel). Ponieważ komórki te nie są zsynchronizowane z komórkami beta i odpowiadają szybszymi oraz bardziej nieregularnymi oscylacjami, które występują już w warunkach niskiego stężenia glukozy lub objawiają się spadkiem aktywności, takie odpowiedzi silnie sugerują obecność komórek innych niż beta21,32,57,58. Jednak ich ostateczna charakterystyka funkcjonalna wymaga bardziej złożonych protokołów z dodatkowymi etapami stymulacji lub alternatywnych podejść, które zostaną omówione poniżej. Typowe odpowiedzi komórek acynarnych i przewodowych przedstawiono odpowiednio na Rysunku 6D i Rysunku 6E. Szczegółowe informacje na temat komórek acynarnych i przewodowych znajdują się w literaturze22,23,35.

Schemat wysepki Langer한sa z komórkami beta, acynarnymi i przewodowymi oraz wykresami odpowiedzi na stymulację.
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki dynamiki wapnia w poszczególnych typach komórek trzustki. (A) Obraz wysokiej rozdzielczości wysepki Langer한sa z otaczającą tkanką. Pasek skali = 100 µm. (B) Wyznaczenie poszczególnych części tkanki trzustki z tkanką acynarną zaznaczoną na żółto, wysepką Langer한sa na czerwono oraz fragmentem drzewa przewodowego na niebiesko. Pasek skali = 100 µm. (C) Typowe przebiegi dynamiki wapnia w komórkach beta oraz domniemanych komórkach nie-beta podczas stymulacji 12 mM glukozy; 3 mM glukozy zastosowano w warunkach niestymulujących. Protokoły, które mogą być wykorzystane do bardziej specyficznego rozróżnienia komórek nie-beta, opisano w sekcji dyskusji. (D) Typowy przebieg dynamiki wapnia komórek acynarnych stymulowanych 25 nM acetylocholiny. (E) Typowy przebieg dynamiki wapnia komórek przewodowych stymulowanych 1 mM kwasu chenodeoksycholowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Po pomyślnym obrazowaniu wapnia dane są najpierw eksportowane i korygowane pod kątem blaknięcia (bleachingu) poprzez kombinację dopasowania wykładniczego i liniowego, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Szeregi czasowe przed i po korekcie blaknięcia przedstawiono na Rysunku 7A. Następnie można przeanalizować kilka parametrów w fazie aktywacji i deaktywacji odpowiedzi, a także w fazie plateau. Opóźnienie początku wzrostu [Ca2+]IC po stymulacji można zmierzyć, co przedstawiono jako delayA na Rysunku 7B, a także heterogeniczność opóźnień między poszczególnymi komórkami (delayA1). Te same parametry (delayD i delayD1) mogą być użyte do opisu fazy deaktywacji. Po początkowym przejściowym wzroście [Ca2+]IC, fazę plateau w większości komórek beta trzustki w wysepce charakteryzują stosunkowo regularne, wysokoczęstotliwościowe oscylacje [Ca2+]IC. Fazę plateau można opisać, analizując klasyczne parametry funkcjonalne. Schematyczne przedstawienie czasu trwania, częstotliwości i procentowego czasu aktywności oscylacji [Ca2+]IC ukazano na Rysunku 7C. W obrazowaniu wapnia przy częstotliwościach akwizycji przekraczających 10 Hz można również wyraźnie rozpoznać fale wapniowe wielokrotnie rozprzestrzeniające się w obrębie wysepki (Rysunek 7C).

Wykres elektrofizjologiczny; odpowiedź na stymulację nerwu; analiza opóźnienia czasowego; trend danych w czasie 200s.
Rysunek 7: Analiza danych szeregów czasowych. (A) Korekcja danych szeregów czasowych pod kątem fotoblaknięcia. (B) Analiza opóźnień aktywacji po stymulacji oraz dezaktywacji po zaprzestaniu stymulacji glukozą 12 mM. Czas trwania stymulacji zaznaczono na obrazie jasnoszarym, zacieniowanym paskiem. (C) Analiza kilku parametrów fazy plateau: I) Czas trwania oscylacji wyznaczony na połowie wysokości, II) częstotliwość oscylacji wyznaczona na podstawie odstępów międzyoscylacyjnych, III) czas aktywności jako iloczyn częstotliwości i czasu trwania oscylacji. I-IV) Opóźnienia między oscylacjami w dowolnej fali oscylacji rozprzestrzeniającej się przez wysepek Langerhansa, wyznaczone na podstawie opóźnień (Δt) w czasie, w którym pojedyncza komórka osiąga połowę wysokości oscylacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Metoda warstw tkanki trzustki jest szybką metodą eksperymentalną do badania morfologii i fizjologii endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych części trzustki w bardziej konserwatywnym preparacji in situ. Wiele z tych zalet zostało już podkreślonych we Wprowadzeniu. Warto podkreślić, że ogólnie (tj. nie tylko w przypadku obrazowania wapnia) podejście warstwowe do badania fizjologii trzustki oszczędza czas, ponieważ nie obejmuje okresu rekonwalescencji po izolacji. To ostatnie nie jest absolutnie konieczne przy wszystkich typach eksperymentów i zastosowań izolowanych wysepek różnych gatunków, ale jest zwykle stosowane w celu zwiększenia czystości, przywrócenia żywotności i funkcjonalności, a czasami do zbierania wysepek od kilku dawców 59,60,61,62,63,64. Jednak w kontekście obrazowania wapnia stwierdzono, że odpowiedzi komórek beta zależą od czasu trwania i warunków hodowli, co jest ważnym źródłem zmienności, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu izolowanych wysp trzustkowych15,65. Tę samą kwestię należy rozważyć w przypadku wycinków tkanek, jeśli ich długotrwała hodowla stanie się w przyszłości powszechnie stosowaną opcją22,36. Metoda plastrowania tkanek ma również wysoką wydajność, a tym samym potencjalnie zmniejsza cierpienie zwierząt i zwiększa moc statystyczną. Co więcej, ze względu na to, że z jednego zwierzęcia można przygotować wiele plastrów, a także dlatego, że plastry te przeżywają przez długi czas, możliwe staje się włączenie tego samego zwierzęcia lub nawet tej samej wysepki zarówno w grupie doświadczalnej, jak i kontrolnej.

Ponieważ zachowana jest oryginalna architektura i komunikacja międzykomórkowa, a także ponieważ jest zgodna z wieloma analizami strukturalnymi, metodami elektrofizjologicznymi, obrazowaniem i testami wydzielania hormonów, metoda ta jest szczególnie przydatna do badania funkcji trzustki, które zależą od niezakłóconych interakcji między poszczególnymi komórkami, np. wrażliwości na wydzielanie, interakcje parakrynne i immunologiczne między różnymi typami komórek. wzorce aktywności elektrycznej, właściwości dynamiki wapnia i wydzielanie różnych hormonów. W przypadku obrazowania wapnia głównymi zaletami stosowania plastrów są naświetlanie rdzenia wyspy trzustkowej oraz możliwość pozyskiwania sygnałów z wielu różnych typów komórek z wysoką rozdzielczością. W zależności od wymagań eksperymentu i wieku zwierząt, grubość może być zróżnicowana, plastry mogą być transfekowane lub uzyskane od zwierząt z genetycznie zakodowanymi reporterami. Jak wyjaśniono bardziej szczegółowo poniżej, dwa ostatnie podejścia umożliwiają również specyficzną funkcjonalną identyfikację i charakterystykę odpowiedzi z komórek innych niż beta 31,66. Co więcej, wysepki z dobrze zdefiniowanych części narządu mogą być badane pod kątem różnic w reakcji lub podatności na choroby. Chociaż nie wymagają okresu inkubacji rekonwalescencji, można je łatwo inkubować z różnymi środkami farmakologicznymi, kwasami tłuszczowymi, wysokim poziomem glukozy i cytokinami.

Co najważniejsze, ponieważ wysoka rozdzielczość jest osiągalna w połączeniu z rozdzielczością jednokomórkową lub nawet subkomórkową, konfokalne obrazowanie wapnia w warstwach jest jedną z najbardziej odpowiednich metod analizy fal wapniowych, połączeń funkcjonalnych i różnych ról funkcjonalnych komórek w różnych częściach wysepki54,67. Pomimo wielu zalet, metoda polegająca na warstwach tkanek ma istotne ograniczenia. Po pierwsze, nadal przynajmniej częściowo zakłóca architekturę wysp trzustkowych i zewnątrzwydzielniczych, zwłaszcza na powierzchni cięcia, a środki ostrożności, takie jak niska temperatura, częsta wymiana roztworów oraz delikatna i szybka manipulacja, są konieczne podczas przygotowania, aby zapobiec dodatkowym mechanicznym i endogennym uszkodzeniom enzymatycznym. Po drugie, wzorce dostarczania składników odżywczych i wydzielania są nadal gorsze niż w przypadku metod in vivo, preparat jest oderwany od unerwienia ogólnoustrojowego, a sprzężenie zwrotne między narządami, na przykład między wyspą trzaskową a jej tkankami docelowymi, jest niemożliwe, w przeciwieństwie do metod in vivo. Po trzecie, maksymalna grubość plastra jest ograniczona przez natlenienie, dostarczanie składników odżywczych i regulację pH na poziomie ~200 μm9. Co więcej, zarówno przygotowanie wycinków, jak i obrazowanie wymagają wielu szkoleń, a dogłębne analizy danych dotyczących wapnia z długich szeregów czasowych i z wielu komórek wymagają specjalistycznej wiedzy, która często nie jest zawarta w zestawie narzędzi klasycznego fizjologa i wymaga pomocy fizyków lub naukowców zajmujących się danymi. Zaleta polegająca na tym, że interakcje homo- i heterotypowe są zachowane, może również komplikować analizę próbek ze względu na obecność sygnałów z innych komórek w obszarach zainteresowania. W zależności od protokołów, aktywacja innych komórek może prowadzić do pośredniej dodatkowej stymulacji lub zahamowania obserwowanej komórki.

Problem ten można rozstrzygająco rozwiązać jedynie za pomocą metod dekonwolucji, bardziej złożonych protokołów stymulacji zawierających substancje, które blokują niektóre z efektów pośrednich, poprzez wykorzystanie określonych zwierząt knock-out oraz poprzez staranne porównanie wyników z wynikami innych badań wykorzystujących bardziej redukcjonistyczne metodologie. Dodatkowo, jeśli konieczne są pomiary wydzielania, należy pamiętać, że niektóre plastry mogą nie mieć wysepek, a całkowita masa tkanki endokrynnej w jednym plasterku jest zwykle niska. Przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustki do obrazowania obejmuje kilka krytycznych etapów omówionych w poniższych sekcjach i podsumowanych w Tabeli 1, gdzie czytelnik może również znaleźć krótkie, ale ważne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Po pierwsze, podczas przygotowywania roztworu agarozy, proszek agarozy musi całkowicie się rozpuścić, w przeciwnym razie nierozpuszczone cząstki mogą utrudniać wstrzyknięcie. Przechowywać jednorodny roztwór agarozy w temperaturze 37-45 °C, aby zapobiec stwardnieniu agarozy z powodu zbyt niskiej temperatury z jednej strony, a z drugiej strony, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek z powodu zbyt wysokich temperatur. Po użyciu pozostałą agarozę można przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie podgrzać, chociaż wielokrotne podgrzewanie może spowodować zwiększenie gęstości z powodu parowania wody, co ostatecznie utrudni lub uniemożliwi wstrzyknięcie.

Kolejnym krytycznym krokiem w przygotowaniu jest prawidłowe zaciśnięcie głównej brodawki dwunastnicy. Biała plama na dwunastnicy wskazuje na połączenie wspólnego przewodu żółciowego i dwunastnicy. Zacisk umieszczony zbyt proksymalnie będzie skutkował niedrożnością niektórych bocznych gałęzi trzustki przewodu wspólnego, uniemożliwiając wstrzykiwanie tych części, natomiast zacisk umieszczony zbyt dystalnie będzie skutkował wyciekiem agarozy przez dolną ścieżkę oporu bezpośrednio do dwunastnicy. Przed kaniulacją przewodu żółciowego wspólnego otaczającą tkankę tłuszczową można ostrożnie usunąć w celu lepszej wizualizacji przewodu i większej kontroli podczas iniekcji. Niedostateczna precyzja podczas usuwania otaczającej tkanki może skutkować perforacją kanału. Istotny jest również dobór średnicy igły używanej do wstrzykiwania agarozy. U myszy korzystnie stosuje się igłę 30 G; mniejsze (32 lub 33 G) igły wymagają większego wysiłku ze względu na wysoką lepkość roztworu agarozy i są bardziej podatne na niedrożność. Jednak w połączeniu z roztworem agarozy o mniejszej gęstości mogą być bardzo pomocne u mniejszych szczepów myszy i młodszych zwierząt. W pierwszych dniach po urodzeniu agaroza może być alternatywnie wstrzykiwana podtorebkowo, a nie doprzewodowo2. Używanie igieł o większej średnicy u myszy najprawdopodobniej spowoduje uszkodzenie wspólnego przewodu żółciowego. Może się to również zdarzyć przy prawidłowej średnicy igły, a kleszcze mogą pomóc w utrzymaniu igły na miejscu podczas wstrzykiwania. Igły o większej średnicy mogą być jedynym rozwiązaniem w przypadku większych przewodów, jak u szczurów. Jeśli igła jest zbyt wąska, aby zapewnić szczelne uszczelnienie zapobiegające przeciekom wstecznym, po pomyślnym wprowadzeniu do kanału można umieścić wokół niej ligatturę.

Wstrzykiwanie agarozy wymaga pewnego wysiłku ze względu na lepkość roztworu, a po rozpoczęciu procesu wstrzykiwania nie należy go przerywać, ponieważ roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia może zestalić się w igle lub największych częściach drzewa kanałowego przed zakończeniem wstrzykiwania. Spowoduje to słabą penetrację tkanek i gorsze wsparcie podczas cięcia. Przewód powinien być zawsze kaniulowany w miejscu, w którym lewy przewód wątrobowy i przewód torbielowaty łączą się, tworząc wspólny przewód żółciowy. Jeśli wspólny przewód żółciowy zostanie perforowany, kilkakrotnie spróbuj kaniulować bliżej dwunastnicy. Gdy trzustka jest wystarczająco ustabilizowana roztworem agarozy i wyekstrahowana z jamy otrzewnej, wycina się małe kawałki dobrze wstrzykniętej tkanki. Przed osadzeniem ich w agarozie ważne jest usunięcie całej tkanki tłuszczowej i łącznej, ponieważ ich pozostałości utrudniają krojenie. To samo dotyczy naczyń krwionośnych i pozostałości przewodów, z wyjątkiem sytuacji, gdy to na nich skupia się eksperyment. W takim przypadku należy upewnić się, że ustawiłeś je w taki sposób, aby uzyskać pożądany przekrój. Podczas osadzania tkanki w agarozie należy upewnić się, że temperatura jest odpowiednia (37 °C) i że tkanka jest całkowicie otoczona agarozą, ponieważ siły działające podczas krojenia wibratomu mogą oderwać tkankę trzustki od bloków agarozy.

Szybkie wysuszenie bloków tkanek przed umieszczeniem ich w agarozie poprzez umieszczenie ich na krótko na papierowej chusteczce może pomóc zapobiec słabemu kontaktowi tkanki z agarozą na tym etapie. Podczas krzepnięcia bloków agarozy należy umieścić szalkę Petriego poziomo i zapobiegać kontaktowi tkanki trzustki z dnem szalki Petriego. Jeśli trzustka nie zostanie w pełni wstrzyknięta, proces cięcia będzie trudny. Dlatego staraj się zmniejszyć prędkość cięcia, aby uzyskać plastry tkanki. Aby zminimalizować uszkodzenia komórek podczas krojenia wibratomem, należy regularnie wymieniać ECS (i kostki lodu wykonane z ECS) w komorze krojenia. Ten ostatni zmniejszy aktywność enzymów trzustkowych uwalnianych z tkanki groniastej podczas krojenia. Kluczowe znaczenie ma również grubość plastrów. Do badań dynamiki wapnia i eksperymentów elektrofizjologicznych zwykle kroi się plastry o wielkości 140 μm; Jednak zgodnie z celem pracy grubość plastra może wynosić od 90 μm do 200 μm. Należy pamiętać, że w grubszych plastrach dyfuzja tlenu i składników odżywczych będzie ograniczona, ale będą one zawierały więcej tkanki. Ponadto można oczekiwać, że udział nieoszlifowanych wysepek będzie wzrastał wraz ze wzrostem grubości plastrów. Plastry mogą być przechowywane w regularnie wymienianym ECS w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, a nawet hodowane w odpowiednim podłożu komórkowym przez kilka dni; Jednak może to ostatecznie wpłynąć na prawidłową fizjologię komórek wysp trzustkowych 3,22.

Przygotowując roztwór barwnika, należy upewnić się, że wszystkie składniki są dokładnie wymieszane i unikać wystawiania na działanie światła otoczenia. Wycinek trzustki składa się z wielu warstw komórkowych, a wychwyt barwnika wapnia jest ograniczony do kilku pierwszych najbardziej powierzchownych warstw komórek, jak opisano wcześniej dla izolowanych wysepek58,68 i wycinków przysadki69. Jednak w przeciwieństwie do izolowanych wysepek, w których otaczająca torebka i zewnętrzne warstwy komórkowe utrudniają przenikanie barwnika do głębszych warstw, wycinki tkankowe umożliwiają dostęp do całej powierzchni przekroju poprzecznego wysepki, umożliwiając jednoczesny pomiar dynamiki wapnia w setkach komórek ze wszystkich warstw wysepki. Fluorescencyjne wskaźnikiCa2+ są najczęściej stosowane do pomiaru dynamiki wapnia, a wraz z CLSM umożliwiają zapisy o wysokiej rozdzielczości czasowej, sięgającej kilkuset Hz. Wybierając najodpowiedniejszy fluorescencyjny wskaźnik Ca2+, należy wziąć pod uwagę różne czynniki, w tym formę wskaźnika, która wpływa na metodę obciążenia komórek, tryb pomiaru (jakościowy lub ilościowy) oraz stałą dysocjacji (Kd), która musi mieścić się w zakresie stężeń Ca2+ będącym przedmiotem zainteresowania i zależy od pH, temperatury, obecności Mg2+ i innych jonów, a także wiązanie białek. Ponieważ sygnały komórkowe Ca2+ są zwykle przejściowe, należy również wziąć pod uwagę stałą szybkości wiązania Ca2+. Do pomiaru dynamiki [Ca2 +] IC w komórkach trzustki grupa ta używa głównie przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowego Ca2 + opisanego w tym protokole (Tabela materiałów), ponieważ jest to wskaźnik o długiej długości fali z długościami fal emisji w widmie, w którym autofluorescencja komórkowa jest zwykle mniej problematyczna, a energia światła wzbudzającego jest niska, co zmniejsza potencjał fotouszkodzenia komórek. Ponieważ barwnik ten jest fluorescencyjny przy niskich stężeniach Ca2+, ułatwia to określenie wyjściowego [Ca2+] IC i zwiększa widoczność komórkową przed stymulacją. Po związaniu Ca2+ intensywność fluorescencji barwnika wzrasta 14-krotnie, umożliwiając wykrycie nawet niewielkich zmian w [Ca2+]IC.

Aby skutecznie obrazować wapń na żywych komórkach, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych parametrów sprzętowych, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. W przypadku obrazowania żywych komórek, w których amplitudy sygnału są niskie, a szanse na fototoksyczność wysokie, preferowane są obiektywy o wyższym NA, aby zebrać więcej światła z próbki. Jeśli dynamika wapnia musi być rejestrowana z wysoką rozdzielczością czasową, należy użyć skanera rezonansowego zamiast galwanometrów liniowych. Oprócz wyboru odpowiedniego obiektywu, zastosowanie detektorów o wysokiej czułości, takich jak detektory hybrydowe, które wymagają mniejszej mocy lasera, pozwala uniknąć fototoksyczności i fotowybielania. Ma to szczególne znaczenie dla długotrwałego obrazowania wapnia. Innymi ważnymi etapami obrazowania wapnia są ustawienia parametrów jakości obrazu dla akwizycji szeregów czasowych. Najważniejsze z nich to rozdzielczość czasowa i przestrzenna. Ponieważ dynamika wapnia sama w sobie określa najniższą akceptowalną rozdzielczość czasową, częstotliwość próbkowania musi być co najmniej dwukrotnie wyższa niż oczekiwana częstotliwość sygnału, aby wykryć sygnał, lub nawet 10 razy wyższa, aby niezawodnie wykryć kształt sygnału. W ostrych wycinkach tkanki trzustkowej dynamika wapnia może być mierzona w setkach komórek jednocześnie, dlatego ważna jest również rozdzielczość przestrzenna. Można to poprawić, zwiększając liczbę pikseli lub zwiększając uśrednianie linii podczas akwizycji na żywo. Jednak ze względu na odwrotną zależność między rozdzielczością przestrzenną i czasową potrzebny jest kompromis między oboma ustawieniami.

Jeśli obrazowanie wapnia musi być wykonane w określonej populacji komórek w trzustce, konieczny jest bodziec zdolny do funkcjonalnego różnicowania komórek w wycinku. Wysoki poziom glukozy niezawodnie i szybko aktywuje komórki beta do wzorca oscylacyjnego, który nakłada się na podwyższony poziom wapnia i jest wysoce zsynchronizowany między wszystkimi komórkami w obrębie wysepki 32,58,70. Komórki beta są najliczniejszym typem komórek w obrębie wysepki i znajdują się głównie w rdzeniu wyspy trzustkowej u myszy. Ten sam protokół stymulacji zmniejsza się, a czasami nie zmienia znacząco pękania w komórkach alfa 30,32,58,70,71,72. Aby funkcjonalnie rozróżnić komórki alfa, można użyć niskiego (3 mM) poziomu glukozy, glutaminianu lub adrenaliny w celu zwiększenia ich częstotliwości lub podstawowego [Ca2 +] IC 21,72,73,74,75. Stanowią one 10-20% komórek wysp trzustkowych i zostaną wykryte na obrzeżach wysp trzustkowych1. Komórki Delta znajdują się również na obrzeżach. Stanowią one tylko ~ 5% całkowitej liczby komórek endokrynnych w wysepce i są zwykle aktywne w 6 mM glukozy i reagują na stymulację glukozą zwiększoną nieregularną aktywnością pękania w stosunku do wartości wyjściowej lub nieznacznie podwyższonym poziomem wapnia 1,32,71,76. Grelina może być stosowana do specyficznej stymulacji komórek delta 21,77,78,79 w eksperymentach obrazowania wapnia. Jednak protokoły specyficznej identyfikacji funkcjonalnej komórek PP i epsilon pozostają do zdefiniowania. Co więcej, acetylocholina 25 nM niezawodnie aktywuje komórki groniaste do aktywności pękającej 35,80,81. Ponadto szereg innych substancji wydzielających, takich jak ceruleina, cholecystokinina i karbamylcholina, może być wykorzystywanych do wywoływania odpowiedzi wapniowych w komórkach groniastych 22,40,82,83.

Wreszcie, 1 mM kwas chenodeoksycholowy niezawodnie wywołuje reakcje wapnia w komórkach przewodowych w wycinkach tkanki; angiotensyna II, ATP i niektóre inne sekretagogi mogą być również używane 11,23,84,85. Ilekroć identyfikacja funkcjonalna oparta na charakterystycznych reakcjach na określone wydzielanie i inhibitory nie jest wystarczająca, do identyfikacji różnych typów komórek można zastosować genetycznie znakowane zwierzęta31, transfekowane komórki73 lub immunocytochemię 9,22,71,86 . W ciągu ostatnich kilku lat metoda warstw tkanek została z powodzeniem zaadaptowana do tkanki ludzkiej, otwierając wiele nowych ważnych ścieżek badawczych zarówno w zakresie egzokrynologii41, jak i fizjologii endokrynnej 9,36,37,39. Co ciekawe, szczegółowa ocena dynamiki wapnia w ludzkich wyspach trzustkowych była niezwykle trudna i wymaga jeszcze bardziej szczegółowego zbadania87. W połączeniu z zaawansowaną mikroskopią konfokalną, metoda warstw tkanki trzustkowej umożliwiła wiele nowych spostrzeżeń na temat dynamiki wapnia u myszy i miejmy nadzieję, że zrobi to samo w przypadku tkanek ludzkich.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakiegokolwiek interesu komercyjnego lub finansowego.

Podziękowania

Praca przedstawiona w tym badaniu była finansowana przez Słoweńską Agencję Badawczą (podstawowe finansowanie badań nr P3-0396 i I0-0029, a także projekty badawcze nr J3-9289, N3-0048 i N3-0133) oraz przez Austriacki Fundusz Naukowy / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (granty dwustronne I3562--B27 i I4319--B30). Dziękujemy Marušie Rošerowi, Mašie Čaterowi i Rudiemu Mlakarowi za doskonałą pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Waga analityczna KERN ALJ 120-4KERN & SOHN GmbHALJ 160-4A
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5 II Ustawienie pionoweMikroskop
Konfiguracja Leica TCS SP5 AOBS Tandem II PodkładkaLeica
15 cm x 15 cm
Corning  Probówki wirówkowe 15 mlMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyCLS430790
Corning  Okrągłe wiaderko na lód z pokrywką, 4 LFischer Scientific, Leicestershire, Wielka Brytania432124
Żyletka z podwójną krawędziąPersonna, Stany Zjednoczone
Dumont #5 - Kleszcze precyzyjneFST, Niemcy11254-20
Probówki Eppendorf Safe-Lock 0,5 mlEppendorf0030 121.023
Kolba Erlenmeyera 200 mlIsoLab, Niemcy027.01.100
Cienkie nożyczki - ToughCutFST, Niemcy14058-11
Płaska wytrząsarka orbitalna  IKA KS 260 basicIKAIdent. Nr: 0002980200
Szklana butelka laboratoryjna 1000 mlIsoLab, Niemcy091.01.901
Hartman Hemostat, zakrzywionyFST, Niemcy13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (obiektyw do zanurzenia w wodzie, 20x, NA 1.0)Leica15507701
25 mLIsoLab, Niemcy015.01.025
Skrzynka kontrolna mikromanipulatora SM-7, Klawiatura SM-7Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Kuchenka mikrofalowa owenGorenje, SłoweniaMO20MW
Osmometr Gonotec 010Gonotec, Berlin, NiemcyOSMOMAT 010 Nr 01-02-20
PędzelFaber-Castell, nr 2Dowolny cienki miękki okrągły pędzel nr 2, najlepiej
Ręczniki
Pompy peryfuzyjneIsmatecISM 827Reglo Analog MS -
szalka Petriego 4/8 100/20 mmSarstedt83.3902
szalka Petriego 35/10 mmGreiner bio-one627102
szalka Petriego 35 x 10 mm Nunclon DeltaThermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA153066NON-STICKY do bloków agarozy
pH-metr inoLab pH Level 1WTW, Weilheim, NiemcyE163694
Pipeta 1000 mlEppendorf3121 000.120
Pipeta 50 mlEppendorf3121 000.066
Pinezki 23 mmDeli, Ningbo, ChinyE0021
Rurka z nakrętką, 15 mlSarstedt62.554.502
Kleszcze SemkenFST, Niemcy11008-13
Pierścień stabilizujący do kolby ErlenmeyeraIsoLab, Niemcy027.11.048
Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ 745Nikon, Melville, NY USA
Strzykawka Injekt Solo 5 mLBraun, Melsungen, Niemcy4606051V
Igła strzykawkowa 0,30 x 12 mm (30 G x 1/2")Braun, Melsungen, Niemcy4656300
Regulator temperaturyLuigs & Neumann200-100 500 0150, 200-150-500-145Mini komora Slice, regulator temperatury TC 07
Rurki do systemu peryfuzyjnegoIsmatecSC0310Ismatec Pharmed 1,14 mm(ID) + rurka silikonowa 1,0 (ID) x 1,8 mm(OD)
Wanna ultradźwiękowa Studio GT-7810AWibrotom Globaltronics
Leica VT 1000 SLeica, Nussloch, Niemcy14047235613
Wolumetryczny kolba 1000 mlIsoLab, Niemcy013.01.910
Mieszalnik wirowy Neolab 7-2020Neolab  7-2020
Łaźnia wodna Pompa cyrkulacyjna otwarta Thermo HaakeThermo Fisher ScientificZ527912
Materiał/Odczynnik
Dwuwodny chlorek wapnia - CaCl2.2H2OSigma Aldrich, NiemcyC5080-500G
D-(+)-glukozaSigma Aldrich, NiemcyG8270-1KG
DimetylosulfotlenekSigma AldrichD4540-100ML
Kwas DL-mlekowySigma Aldrich, NiemcyL1250-500ML
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyD8662-500ML
Mieszanina gazów zawierająca 95% O2 i 5% CO2 przy ciśnieniu
Klej Wekem sekundenkleber WK-110Wekem GmbH, Bergkamen, NiemcyWK 110-020
HEPESSigma Aldrich, NiemcyH3375-250G
L-(+)- Kwas askorbinowySigma Aldrich, NiemcyA9,290-2
ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssakówThermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stany ZjednoczoneL3224
Chlorek magnezu sześciowodny - MgCl2.2H2OSigma Aldrich, NiemcyM2670-500G
Myo-inozytolSigma Aldrich, NiemcyI5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AMInvitrogen (Thermo FisherScientific)Przepuszczalnydla komórek wskaźnik Ca2+ (wzbudzenie/emisja: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)P3000MPPolaxamer: niejonowy kopolimer triblokowy
Chlorek potasu - KClSigma Aldrich, Niemcy31248
SeaPlaque GTG agarozaLonza, Rockland, Stany Zjednoczone50111
Wodorowęglan sodu - NaHCO3Honeywell, Niemcy31437-500G
Chlorek sodu - NaClHoneywell, Niemcy31434-1KG
Wodorotlenek sodu - NaOHSigma Aldrich, Niemcy30620
Fosforan sodu jednozasadowy- NaH2PO4Sigma Aldrich, NiemcyS0751-500G
Pirogronian soduSigma Aldrich, Niemcy15990-100G
Software
FIJIFIJI to projekt open source
LASAFLeica microsystems, Inc.
MatlabMathworks
PythonPython Software FoundationPython to projekt open source
konfokalny Leica 5100001578 korkowa Cylinder miarowy papieroweatmosferycznym

Bibliografia

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405(2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160(2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255(2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125(2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343(2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137(2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706(2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229(2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638(2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923(2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374(2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113(2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449(2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495(2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106(2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnaobrazowanie wapniaobrazowanie ywych kom rekkomunikacja mi dzykom rkowakom rki wysepekiniekcja agarozykrojenie w wibratomiebarwnik wska nikowy wapnia
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.