Artykuł metodologiczny

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy

DOI:

10.3791/62293

⸱

13 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustkowej i ich zastosowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do jednoczesnego badania dynamiki wapnia w dużej liczbie żywych komórek, przez długie okresy czasu i z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostry wycinek tkanki trzustki myszy jest unikalnym preparatem in situ z zachowaną komunikacją międzykomórkową i architekturą tkankową, która pociąga za sobą znacznie mniej zmian wywołanych przygotowaniem niż izolowane wyspy trzustkowe, acini, przewody lub rozproszone komórki opisane w typowych badaniach in vitro. Łącząc ostry wycinek tkanki trzustki z obrazowaniem żywych komórek wapnia w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), sygnały wapniowe mogą być badane jednocześnie w dużej liczbie komórek endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych, z rozdzielczością jednokomórkową lub nawet subkomórkową. Czułość pozwala na wykrywanie zmian i umożliwia badanie fal międzykomórkowych i łączności funkcjonalnej, a także badanie zależności reakcji fizjologicznych komórek od ich lokalizacji w obrębie wyspy trzustkowej i relacji parakrynnej z innymi komórkami. Wreszcie, z punktu widzenia dobrostanu zwierząt, rejestrowanie sygnałów z dużej liczby komórek jednocześnie obniża liczbę zwierząt potrzebnych w eksperymentach, przyczyniając się do zasady wymiany, redukcji i udoskonalenia 3R.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzustka ssaków to duży gruczoł zewnątrzwydzielniczy i dokrewny. Część zewnątrzwydzielnicza stanowi 96-99% całkowitej objętości trzustki i składa się z acini i przewodów. Część hormonalna składa się z dużej liczby wysepek Langerhansa, które stanowią pozostałe 1-4% całkowitej objętości trzustki1. Część zewnątrzwydzielnicza wydziela główne enzymy trawienne, które rozkładają bogate w energię polimery w pożywieniu, a także płyn bogaty w wodorowęglany, który łączy się z innymi wydzielinami żołądkowo-jelitowymi, zapewniając środowisko odpowiednie do działania enzymów. Część hormonalna wydziela hormony, które regulują poposiłkową dystrybucję, magazynowanie i międzyposiłkowe uwalnianie składników odżywczych bogatych w energię. Chociaż tkanka zewnątrzwydzielnicza jest stosunkowo słabo rozwinięta, a endokrynna stosunkowo dobrze rozwinięta po urodzeniu, ta pierwsza szybko przerasta drugą po odsadzeniu2,3,4. Wczesne badania nad funkcją trzustki oznaczały narodziny nowoczesnej fizjologii, a główne postępy metodologiczne w tej dziedzinie pociągnęły za sobą wielkie przełomy naukowe5. Praca z trzustką jest technicznie trudna ze względu na skomplikowaną strukturę gruczołu, ale jest również dużą motywacją ze względu na choroby takie jak rak trzustki, zapalenie trzustki i cukrzyca, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i dla których potrzebne są nowatorskie podejścia terapeutyczne.

Izolowane wysepki6, acini7,8, a fragmenty przewodów były opracowywane i używane przez dziesięciolecia jako złote metody ze względu na ich zalety w porównaniu z liniami komórkowymi i pierwotnymi rozproszonymi komórkami endokrynnymi, acinarnymi i przewodowymi9,10. Pomimo znacznie ulepszonej funkcji izolowanych zbiorowisk komórkowych, metody te nadal wiążą się ze znacznym obciążeniem mechanicznym i enzymatycznym, izolują komórki od otaczającej tkanki, a tym samym nie mają interakcji parakrynnych i wsparcia mechanicznego, a co najważniejsze, towarzyszą im znaczące zmiany w normalnej fizjologii11,12,13. Ostry wycinek tkanki trzustki myszy został opracowany w 2001 roku z powodu postrzeganej potrzeby opracowania eksperymentalnej platformy podobnej do wycinków mózgu, przysadki mózgowej i nadnerczy z zachowanymi kontaktami międzykomórkowymi, interakcjami parakrynnymi, mezenchymą i architekturą tkankową, a także bez niektórych z najważniejszych wad metody złotego standardu w badaniach wysp trzustkowych tamtych czasów - izolowanych wysepek12, 14. Wśród tych niedociągnięć znajdują się uszkodzenia najbardziej zewnętrznych warstw, brak dostępności obszarów wysepek rdzeniowych oraz potrzeba hodowli, która może mieć istotny wpływ na tożsamość i fizjologię komórek12,15. Co więcej, metoda warstw tkanek umożliwia badania na modelach zwierzęcych o znacznie zaburzonej architekturze wysepek, gdzie niemożliwe jest wyizolowanie wysepek lub gdy wydajność wysepek jest bardzo niska przy tradycyjnej izolacji16,17,18,19,20,21.

Dodatkowo, wycinek jest bardziej odpowiedni do badania zmian morfologicznych podczas rozwoju cukrzycy i zapalenia trzustki, na przykład, ponieważ umożliwia lepszy przegląd całej tkanki i jest również kompatybilny z badaniem różnic regionalnych. Co ważne, pomimo wczesnego skupienia się na części hormonalnej, metoda warstw tkanek z natury umożliwia badanie składników zewnątrzwydzielniczych9,22,23. W ciągu pierwszej dekady po wprowadzeniu metoda ta była stosowana do badań elektrofizjologicznych klasy beta14,24,25,26,27,28,29 i alpha30,31 komórek, a także do badania morfologicznego i funkcjonalnego dojrzewania trzustki2,3. Dziesięć lat później, w 2013 roku, metoda została z powodzeniem zaadaptowana do obrazowania komórek wysp trzustkowych na żywych komórkach wapnia przy użyciu CLSM w celu scharakteryzowania ich reakcji na glukozę32, ich wzorców połączeń funkcjonalnych33 oraz związku między potencjałem błonowym a wewnątrzkomórkowym wapniem poprzez połączenie fluorescencyjnego barwnika wapniowego z barwnikiem potencjału błonowego34. Później w tym samym roku metoda ta została również wykorzystana do oceny dynamiki wapnia w komórkach groniastych22,35. W ciągu następnych lat wycinki tkanki trzustkowej były wykorzystywane w wielu różnych badaniach i z powodzeniem adaptowane do tkanek świńskich i ludzkich9,36,37,38,39,40,41. Jednak podsumowując, obrazowanie wapnia - ogólnie w wycinkach tkanki trzustki myszy, a w szczególności w wyspach trzustkowych - jest nadal wykonywane głównie przez tę grupę. Jedną z głównych przyczyn takiego stanu rzeczy może być połączenie trudnego technicznie przygotowania wycinków tkanki, potrzeby mikroskopu konfokalnego i dość złożonej analizy danych. Głównym celem niniejszego artykułu jest uczynienie tej potężnej metody bardziej dostępną dla innych potencjalnych użytkowników.

Istnieje już kilka doskonałych artykułów metodologicznych szczegółowo omawiających przygotowanie wycinków tkanek i wykorzystanie plastrów do badań strukturalnych i wydzielniczych, ale nie do konfokalnego obrazowania wapnia9,42,43. Dlatego w tym artykule skupiono się na kilku dodatkowych wskazówkach i sztuczkach podczas przygotowywania plastrów, na krokach krytycznych dla pomyślnego ładowania barwnika, akwizycji obrazu, a także na głównych krokach podstawowej analizy danych dotyczących wapnia. W związku z tym wkład ten powinien być postrzegany raczej jako uzupełnienie niż alternatywa dla wyżej wymienionej metody. Podobnie, obrazowanie wapnia w wycinkach tkanki trzustki myszy powinno być postrzegane jako podejście eksperymentalne, które należy zastosować w celu udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania, a zatem jest raczej uzupełnieniem niż absolutną alternatywą dla innych podejść do obrazowania wapnia w fizjologii trzustki, takich jak izolowane przewody lub acini, izolowane wyspy trzustkowe, organoidy, wyspy trzustkowe przeszczepione do przedniej komory oka, i nagrania in vivo11,44,45,46,47,48. Potencjał obrazowania wapnia w wycinkach tkanki trzustki myszy jest prawdopodobnie najlepiej zilustrowany przez niedawne udane nagrania dynamiki wapnia w komórkach mezenchymalnych wysp trzustkowych, takich jak pericytes49 i makrofagi50, a także w komórkach przewodowych23.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach. Protokół został zatwierdzony przez Administrację Republiki Słowenii ds. Bezpieczeństwa Żywności, Sektora Weterynaryjnego i Ochrony Roślin (numer zezwolenia: 34401-35-2018/2).

1. Przygotowanie plastrów tkanki trzustkowej

UWAGA: Przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustki myszy do obrazowania wapnia za pomocą CLSM wymaga wielu instrumentów, różnych rozwiązań i przebiega w serii krytycznych kroków, które są schematycznie przedstawione w Rysunek 1 i szczegółowo opisane poniżej.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Diagram przepływu pracy. Schematyczne przedstawienie wszystkich etapów procesu przygotowania plastrów tkanki trzustkowej, począwszy od wstrzyknięcia agarozy do wspólnego przewodu żółciowego, po którym następuje ekstrakcja trzustki i krojenie. Przygotowane plastry można wykorzystać do oceny żywotności tkanki za pomocą zestawu Live/Dead lub wybarwić czujnikiem wapnia. Po zabarwieniu są gotowe do obrazowania. Nagrania uzyskane z procesu obrazowania są następnie wykorzystywane do analizy danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotowanie roztworów
    UWAGA: Wszystkie roztwory należy przygotować wcześniej i można je przechowywać w lodówce w temperaturze 4-8 °C przez okres do jednego miesiąca. Do przygotowania i przechowywania wycinków tkanek potrzeba około 0,5 l roztworu zewnątrzkomórkowego (ECS) z 6 mM glukozy i 0,3 l buforu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES). Na 1 dzień obrazowania wapnia z systemem peryfuzyjnym ustawionym na natężenie przepływu 1-2 ml/min potrzebne jest około 0,5 l ECS.
    1. Roztwór zewnątrzkomórkowy z 6 mM glukozy
      1. Przygotuj 1 l ECS zawierający 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM glukozy, 6 mM kwasu mlekowego, 3 mM mio-inozytolu, 2,5 mM KCl, 2 mM pirogronianu Na, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 i 0,5 mM kwasu askorbinowego. Dokładnie wymieszaj, aż wszystkie składniki całkowicie się rozpuszczą. Pobrać 50 μl ECS do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml, umieścić ją na osmometrze zgodnie z instrukcjami producenta i sprawdzić osmolarność.
        UWAGA: Osmolarność powinna wynosić 300-320 mOsm. Do stymulacji komórek beta należy stosować roztwory o wyższym stężeniu glukozy. Aby zapewnić fizjologiczną wartość pH 7,4 podczas krojenia i eksperymentów, należy stale bąbelkować ECS karbogenem (tj. mieszaniną gazów o stężeniu 95%O2 i 5%CO2) pod ciśnieniem atmosferycznym. Prosty system bąbelkowania można stworzyć, podłączając jeden koniec rurki silikonowej o średnicy 5 mm do źródła karbogenu (tj. butli z gazem pod ciśnieniem), a drugi koniec rurki umieszczony bezpośrednio w butelce zawierającej ECS.
      2. Alternatywnie przygotuj 10x zapas zawierający 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM mio-inozytolu, 25 mM KCl, 20 mM pirogronianu Na, 12,5 mM NaH2PO4 i 5 mM kwasu askorbinowego. Gdy potrzebny jest ECS zawierający 6 mM glukozy, wymieszaj 100 ml bulionu z 2 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2, 0,455 ml 13,2 M kwasu mlekowego i 1,08 g glukozy i napełnij wodą podwójnie destylowaną do 1 l. W razie potrzeby użyj różnych ilości glukozy, aby uzyskać inne stężenia glukozy.
    2. Bufor HEPES z 6 mM glukozy
      1. Przygotować 0,5 l roztworu buforowanego przez HEPES (HBS) zawierającego 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM glukozy, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2; miareczkować do pH = 7,4 za pomocą 1 M NaOH.
        UWAGA: Jeśli karbogen nie jest dostępny, ten bufor może być używany do wszystkich kroków zamiast ECS.
    3. Agaroza (1,9% w/w)
      1. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 40 °C.
      2. Dodać 0,475 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia i 25 ml ECS zawierającego 6 mM glukozy do kolby Erlenmeyera i umieścić kolbę w kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą na kilka sekund, aż zacznie wrzeć. Wyjmij kolbę z piekarnika i zakręć nią kilka razy, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przenieść kolbę z ciekłą agarozą do wstępnie podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 40 °C w celu schłodzenia agarozy do pożądanej temperatury i utrzymania jej w stanie ciekłym aż do wstrzyknięcia. Zabezpieczyć kolbę stabilizującym pierścieniem prowadzącym.
        UWAGA: Agarozę można przygotować wcześniej i przechowywać w lodówce. Przed użyciem podgrzać agarozę w kuchence mikrofalowej do momentu jej upłynnienia i przenieść kolbę Erlenmeyera do łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 40 °C. Agaroza może być ponownie użyta do 5x. Jeśli zostanie ponownie użyty powyżej 5x, stanie się gęsty i trudniejszy do wstrzyknięcia.
  2. Iniekcja do trzustki z agarozą
    UWAGA: Sekcje 1.2 i 1.3 wyjaśniają sposób przygotowania wycinków tkanek, które mogą być wykorzystane do różnych celów doświadczalnych, takich jak obrazowanie wapnia, elektrofizjologia, immunohistochemia, badania wydzielania oraz badania strukturalne/mikroanatomiczne.
    1. Napełnić strzykawkę o pojemności 5 ml płynną agarozą z kolby Erlenmeyera w łaźni wodnej z kroku 1.1.3.2, usunąć wszelkie pęcherzyki i założyć igłę 30 G. Zabezpieczyć igłę nasadką i trzymać napełnioną strzykawkę z powrotem w łaźni wodnej z igłą skierowaną w dół i całą objętością agarozy pod powierzchnią wody. Zabezpieczyć strzykawkę stabilizującym pierścieniem ołowianym w taki sposób, aby pierścień dociskał strzykawkę do ścianki łaźni wodnej.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wepchnąć agarozy do igły, ponieważ szybko stwardnieje i zablokuje igłę. Jeśli temperatura w pomieszczeniu jest niska, a wstrzyknięcie jest wykonywane przez mniej doświadczoną osobę, należy zwiększyć temperaturę łaźni wodnej do 42 °C, aby zyskać dodatkowy czas na wstrzyknięcie.
    2. Napełnij wiaderko z lodem lodem i umieść w nim butelkę zawierającą ECS. Stale bąbelkować ECS z prędkością 1,5 ml/min karbogenem przy ciśnieniu atmosferycznym i temperaturze pokojowej, aby zapewnić natlenienie i pH 7,4.
    3. Poświęć mysz, podając wysokie stężenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Dołoż wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.
    4. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, uzyskaj dostęp do jamy brzusznej poprzez laparotomię (Ryc. 2A). Delikatnie przełóż jelito na lewą stronę myszy (z perspektywy anatomicznej myszy), aby odsłonić wspólny przewód żółciowy. Użyj kleszczy, aby lekko unieść część dwunastnicy i znajdź główną brodawkę-brodawkę dwunastnicy Vatera. Zacisnąć wspólny przewód żółciowy na brodawce dwunastnicy za pomocą hemostatyku (Rysunek 2B,C), aby zapobiec wyciekowi agarozy z przewodu do dwunastnicy.
      UWAGA: Aby zapobiec wyciekowi agarozy do dwunastnicy i dalej w górę iw dół w przewodzie pokarmowym, należy umieścić hemostat w taki sposób, aby zaciskał również dwunastnicę zarówno proksymalnie, jak i dystalnie od brodawki. Do tego celu najlepiej użyć zakrzywionego hemostatu.
    5. Za pomocą małych ostrych kleszczy sięgnij pod wspólny przewód żółciowy i przerwij błonę mocującą przewód do tkanki trzustki. Aby uzyskać lepszą kontrolę wzrokową i łatwiejsze wstrzyknięcie, należy usunąć jak najwięcej tłuszczu i tkanki łącznej z kanału.
    6. Umieść przewód prostopadle na dużych kleszczach (Rysunek 2D) i wstrzyknij przygotowaną płynną agarozę do bliższej części wspólnego przewodu żółciowego (Rysunek 2D). Należy mocno ścisnąć strzykawkę, ponieważ agaroza jest lepka. Kontynuuj napełnianie trzustki, aż stanie się biaława i lekko rozdęta lub przez co najmniej 20-30 s.
      UWAGA: Jest to najważniejszy krok w przygotowaniu plastrów. Jeśli w drzewie przewodowym trzustki są jakiekolwiek załamania, delikatnie podnieś lub odciągnij trzustkę od strzykawki, aby je wyrównać. Nie należy decydować o tym, kiedy przerwać wstrzykiwanie na podstawie objętości wstrzykniętej ze strzykawki, ponieważ przepływ wsteczny w miejscu wstrzyknięcia i przeciek do dwunastnicy są zwykle znacznie większe niż objętość wstrzyknięta do drzewa przewodowego trzustki. Co ważne, udane iniekcje mogą być wykonywane przy praktycznie niezauważalnych zmianach objętości strzykawki.
    7. Wyjąć strzykawkę i powoli wlać 20 ml bąbelkowego, lodowatego ECS w temperaturze 0-4 °C z butelki na trzustkę, aby schłodzić tkankę i stwardnieć agarozę.
    8. Delikatnie usuń trzustkę za pomocą kleszczy i cienkich, twardych nożyczek. Umieść wyekstrahowaną trzustkę na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej ~40 ml lodowatego ECS i delikatnie przesuwaj ją, aby ją umyć. Przenieś trzustkę na świeżą 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą ~40 ml lodowatego ECS.
    9. Z dobrze wstrzykniętej części trzustki, która wydaje się biaława (Ryc. 3A), wytnij do 6 bloków tkanki o wielkości 0,1-0,2cm3, używając kleszczy i twardych nożyczek. Oczyść je z tkanki łącznej i tłuszczowej.
    10. Napełnić nieklejącą się płytkę Petriego o średnicy 35 mm około 5 ml płynnej agarozy w temperaturze 40 °C, przenieść do niej bloki tkanek i natychmiast umieścić szalkę Petriego na lodzie, aby ją schłodzić i stwardnieć agarozę.
      UWAGA: Sposób, w jaki bloki trzustki są uwięzione w agarozie, determinuje sposób, w jaki są one cięte podczas krojenia. Doświadczeni eksperymentatorzy mogą spróbować dostroić położenie bloków w ciągu kilku chwil, zanim agaroza stwardnieje po umieszczeniu na lodzie.
    11. Po stwardnieniu agarozy z blokami tkanki, obróć szalkę Petriego do góry nogami na płaską, gładką powierzchnię, taką jak pokrywka szalki Petriego o średnicy 100 mm, i usuń agarozę, delikatnie przecinając połówką żyletki krawędź między boczną ścianką szalki Petriego a agarozą. Żyletką pokrój pojedyncze kostki agarozy, z których każda zawiera jeden blok tkanki, uważając, aby każdy blok tkanki był otoczony agarozą. Przyklej bloki agarozy do płytki próbki wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Rysunek 3B).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Wstrzyknięcie agarozy do wspólnego przewodu żółciowego. (A) Otwórz jamę brzuszną i odsłoń narządy w jamie otrzewnej. (B) Powiększona część obszaru zamknięta przez prostokąt w panelu A. Biała plamka na dwunastnicy (oznaczona strzałką) wskazuje na bańkę Vatera. Wysepki Langerhans są oznaczone grotami strzał. (C) Zacisnąć bańkę Vatera za pomocą zakrzywionego hemostatu i lekko ją podnieść, aby odsłonić i delikatnie rozciągnąć wspólny przewód żółciowy (strzałka). (D) Kaniulacja przewodu żółciowego wspólnego i wstrzyknięcie 1,9% roztworu agarozy za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły 30 G. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Krojenie
    1. Napełnij komorę tnącą wibratomu ~0,15 l lodowatego ECS i stale bąbelkuj karbogenem. Otocz komorę krojenia lodem i dodaj do niej 2 kostki lodu (~10 ml każda) wykonane z ECS z 6 mM glukozy. Zamontuj żyletkę do cięcia na wibratomie i przykręć płytkę próbki z blokami agarozy na swoim miejscu.
    2. Ustaw krajalnicę tak, aby kroiła bloki agarozy z prędkością od 0,05 do 1 mm/s i 70 Hz na plastry o grubości 140 μm i powierzchni 20-100 mm2. Aby uzyskać informacje o ustawieniach fragmentatora, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Natychmiast po każdym etapie krojenia zatrzymaj krajalnicę, delikatnie zbierz plastry drobnym pędzlem i przenieś je na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 40 ml buforu HEPES z 6 mM glukozy w temperaturze pokojowej (Rysunek 3C).
      UWAGA: Plastry można przechowywać w buforze HEPES w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin, a bufor należy wymieniać co 2 godziny.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przygotowanie i krojenie tkanki trzustki. (A) Pobrana trzustka myszy po wstrzyknięciu agarozy. Biała tkanka po lewej stronie wskazuje na dobrze wstrzykniętą część (część dwunastnicy), podczas gdy bardziej czerwonawa część po prawej stronie pokazuje niedostatecznie wstrzykniętą część trzustki (część śledzionowa). (B) Krojenie wibratomem dwóch bloków tkanki trzustki zanurzonych w agarozie. (C) Ostry wycinek tkanki trzustki z wysepkami Langerhansa oznaczonymi grotami strzał. Podziałka = 3000 μm. (D) Ostry przekrój tkanki trzustki pod mikroskopem świetlnym z wysepką Langerhansa oznaczoną grotem strzałki, gwiazdka oznacza przewód trzustkowy. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Test żywy/martwy przy użyciu zestawu ŻYWY/MARTWY Żywotność/cytotoksyczność dla komórek ssaków

UWAGA: W przypadku niektórych eksperymentów przydatne jest sprawdzenie żywotności komórek w wycinkach (Rysunek 4) za pomocą testu żywe/martwe w następujący sposób.

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby rozmrozić fiolki z odczynnikami zestawu LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity i przygotować roztwory robocze kalceiny AM tuż przed użyciem. Roztwory należy zużyć w ciągu jednego dnia.
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wymieszaj 5 μl 4 mM kalceiny AM (składnik A), 20 μl 2 mM homodimeru etydyny-1 (EthD-1, składnik B) i 10 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco, aby przygotować roztwór roboczy zawierający około 2 μM kalceiny AM i 4 μM EthD-1. Dokładnie wymieszaj.
  3. Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie przenieś plastry tkanki na szalkę Petriego o pojemności 3 ml ze świeżym buforem HEPES, aby rozcieńczyć aktywność esterazy surowicy. Usuń bufor HEPES i przykryj plastry 100-200 μl (lub więcej, jeśli to konieczne) roztworu roboczego z kroku 2.2.
  4. Inkubuj plastry przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej na zamkniętej szalce Petriego. Zobrazuj wycinki tkanki za pomocą filtrów wzbudzenia/emisji zgodnie z zaleceniami producenta.

3. Ładowanie barwnika wapniowego

UWAGA: Barwniki fluorescencyjne powinny być chronione przed światłem podczas całego procesu przygotowania i ładowania barwnika, jak również podczas obchodzenia się z poplamionymi plastrami tkanki. Folia aluminiowa może być używana do pokrywania probówek lub szalek Petriego zawierających barwnik wapniowy.

  1. Przygotowanie barwnika
    1. Rozpuścić zawartość jednej fiolki (50 μg) przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowegoCa2+ (wzbudzenie/emisja 495/523 nm; patrz tabela materiałów), 7,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i 2,5 μl polaksamera (20% roztwór w DMSO; Tabela materiałów) w 6,667 ml HBS zawierającym 6 mM glukozy w 15 ml probówce z nakrętką.
      UWAGA: Ten końcowy roztwór zawiera 6 μM barwnika wskaźnikowego Ca2+, 0,11% DMSO i 0,037% polaksamera.
    2. Kilkakrotnie zasysać i wydalać roztwór z rurki z nakrętką za pomocą pipety przez 20 s; zanurzyć probówkę w komorze kąpieli ultradźwiękowej na 30 s i wirować przez 30 s, aby poprawić rozpuszczalność. Podwielokrotność 3,333 ml końcowego roztworu barwnika wskaźnikowegoCa2+ przygotowanego w kroku 3.1.1 na płytki Petriego o objętości 5 ml.
  2. Ładowanie barwnika
    1. Przenieś przygotowane plastry tkanki z 60 ml szalki Petriego z HBS na 5 ml szalki Petriego wypełnione roztworem barwnika, delikatnie podnosząc każdy plasterek tkanki za pomocą cienkiego, miękkiego pędzla i umieszczając go w roztworze barwnika. Inkubować do 10 plastrów tkanki na szalkę Petriego.
    2. Umieścić obciążoną plasterkami szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej ustawionej na ruch orbitalny z prędkością 40 obrotów na minutę przez 50 minut. Inkubować plastry w roztworze barwnika wystawionym na działanie powietrza otoczenia w temperaturze pokojowej, ale osłonięte przed światłem, przykrywając szalkę Petriego folią aluminiową.
  3. Przechowywanie plastrów
    1. Przenieś poplamione plastry tkanki z szalki Petriego o pojemności 5 ml na szalkę Petriego o pojemności 60 ml wypełnioną bezbarwnikowym HBS, delikatnie podnosząc je za pomocą cienkiego, miękkiego pędzla. Przechowuj do 20 plasterków na szalce Petriego.
      UWAGA: W tym momencie użyj plasterków tkanki do obrazowania. Plastry tkanki zachowają barwnik wskaźnikowy Ca2+ przez kilka godzin. Przeżywalność plastrów i zatrzymywanie barwnika można poprawić, umieszczając szalkę Petriego w izolowanym pojemniku otoczonym lodem. Jest to szczególnie ważne, jeśli mają być transportowane plastry obciążone barwnikiem. Dodatkowo wymieniaj HBS co 2 godziny.

4. Obrazowanie wapnia

  1. Konfiguracja mikroskopu konfokalnego
    1. Dobierz odpowiednie powiększenie obiektywu w zależności od zainteresowania badaniem. Wybierz 20x i 25x (apertura numeryczna [NA] 0.77-1.00), aby uwidocznić całą wysepkę, kilka acini jednocześnie lub większe kanały. Wybierz większe powiększenia, aby badać dynamikę wewnątrzkomórkową.
    2. Wybierz tryb akwizycji dla obrazowania poklatkowego (np. tryb poklatkowy, xyt lub podobny). Ustaw otwór na 100-200 μm.
    3. Ustaw ścieżkę światła dla zielonych fluoroforów: wzbudzenie przy 488 nm i odbiór emisji przy 500-700 nm. Najlepiej wybrać detektory o wysokiej wydajności kwantowej (np. fosforek arsenku galu) zamiast detektorów fotopowielaczy.
  2. Konfiguracja komory rejestracyjnej i systemu peryfuzji
    1. Zamontuj komorę zapisu na stoliku mikroskopu z kontrolowaną temperaturą i systemie peryfuzji (konfiguracja zasilana grawitacyjnie lub oparta na pompie perystaltycznej, objętość 1 ml). Umieść wlot i wylot na dalekich krawędziach komory nagrywania, aby uniknąć meandrowania perfuzatu w komorze i ustaw dopływ i odpływ na równe wartości (1-2 ml/min). Unikać dryftowania wysokości cieczy menisku i kropelek w peryfuzacie.
    2. Ustawić regulator temperatury systemu peryfuzji na 37 °C. Rozpocząć peryfuzję roztworem niestymulującym i przygotować roztwory stymulujące. Zmieniaj roztwory za pomocą zaworów z napędem silnikowym lub ręcznie przełączając roztwory zasilające system peryfuzyjny.
  3. Rekordowa dynamika wapnia
    1. Przenieść pojedynczy wycinek tkanki do komory rejestracyjnej. Unieruchomić plaster tkanki za pomocą platynowego ciężarka w kształcie litery U z napiętą nylonową siatką (np. z nylonowych pończoch). Unikaj umieszczania nylonowych nici nad strukturą będącą przedmiotem zainteresowania.
    2. Zlokalizuj wysepkę/acinus/kanał za pomocą opcji jasnego pola. Uruchom obrazowanie na żywo, aby ustawić badane struktury w polu widzenia i ustawić parametry obrazowania. Zoptymalizuj stosunek sygnału do szumu, dostosowując moc lasera, wzmocnienie detektora i uśrednianie/kategoryzowanie linii, aby umożliwić wizualizację komórek przy jednoczesnym utrzymaniu minimalnej mocy lasera.
    3. Dostosuj płaszczyznę ogniskową nagrania do ~15 μm poniżej powierzchni cięcia (Rysunek 5), aby uniknąć nagrywania z potencjalnie uszkodzonych komórek na powierzchni cięcia.
    4. Pobieranie obrazów. Ustaw częstotliwość próbkowania na 1-2 Hz, aby początkowo wykryć poszczególne oscylacje, i użyj skanera rezonansowego zdolnego do szybkiego uśredniania linii (8-20) z wyższą szybkością akwizycji (>10 Hz), aby zarejestrować wewnątrzkomórkową aktywność Ca2+ ([Ca2+] IC). Należy pozostawić przerwę (np. 30% całkowitego czasu pobierania próbek) między kolejnymi oświetleniami punktowymi, aby zapobiec fototoksyczności. Nagraj obraz o wysokiej rozdzielczości (np. 1024 x 1024 pikseli, uśrednianie linii > 50) przed akwizycją szeregów czasowych (patrz sekcja 5).
      UWAGA: Częstotliwość próbkowania 1-2 Hz jest poniżej kryterium Nyquista dla częstotliwości akwizycji dla większości komórek, a kształt sygnału będzie domyślnie niedopróbkowywany.
    5. Zapoznaj się z wykresem online, jeśli jest dostępny w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać natychmiastową informację zwrotną na temat reakcji preparatu, nadmiernego oświetlenia, fotowybielania i dryfu mechanicznego. W przypadku dużej szybkości wybielania podczas akwizycji, należy zatrzymać zapis i zmniejszyć moc lasera, jednocześnie zwiększając wzmocnienie detektora, aby utrzymać stosunek sygnału do szumu. W przypadku dryftu mechanicznego należy sprawdzić, czy nie ma naprężenia między rurkami/a stolikiem mikroskopu, a także czy nie ma wycieków cieczy lub zmian objętości w komorze rejestracyjnej. Opcjonalnie spróbuj ręcznie skorygować dryft podczas akwizycji; Należy jednak pamiętać, że z natury rzeczy przyniesie to ograniczone wyniki.
      UWAGA: Komórki endokrynne są wysoce niejednorodne w stężeniach bliskich progowi. Potrzebna jest wystarczająca długość stymulacji, aby wykryć zakres opóźnień aktywacji/dezaktywacji w poszczególnych komórkach. Jest to szczególnie ważne dla dokładnego wykrywania reakcji off-response po wysoce stymulujących protokołach.
    6. Użyj obrazowania wapnia, aby funkcjonalnie rozróżnić komórki endo- i zewnątrzwydzielnicze (Ryc. 6). Aby rejestrować przejściową aktywność podczas aktywacji i dezaktywacji, stosuj bodźce bez zatrzymywania nagrywania.
    7. Zapisz dane po zakończeniu eksperymentowania (rozważ użycie funkcji automatycznego zapisywania). Przed wyłączeniem zasilania lasera należy odczekać okres chłodzenia, aby nie uszkodzić laserów podczas procedury wyłączania.

5. Analiza danych

  1. Sprawdź wizualnie jakość nagrania, odtwarzając ponownie film poklatkowy. Sprawdź, czy komórki nie odbiegają od pola view lub płaszczyzny optycznej. Jeśli wystąpił dryft w płaszczyźnie optycznej, użyj wtyczki korekcji dryfu w ImageJ.
  2. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania mikroskopowego lub oprogramowania innych firm. Użyj obrazu o wysokiej rozdzielczości, maksymalnej projekcji lub średniej klatek jako odniesienia do wybranych ROI. Odtwórz ponownie obrazowanie poklatkowe, aby zwizualizować odpowiadające komórki, które nie są widoczne na obrazach referencyjnych. Umieść ROI w taki sposób, aby wybrany obszar ROI nie nakładał się na sąsiednie komórki, aby uniknąć przesłuchów sygnału między ROI.
  3. Eksportuj dane szeregów czasowych jako średnią wartość ROI na klatkę. Eksportuj współrzędne ROI.
  4. Popraw dane szeregów czasowych dla bielenia (Rysunek 7A), stosując kombinację dopasowania wykładniczego i liniowego, zgodnie z opisem
    figure-protocol-4 (1)
    gdzie x(t) oznacza sygnał fluorescencyjny w punkcie czasowym t; xcorr(t) skorygowany sygnał w odpowiednich punktach czasowych; oraz a, b i c parametry pasowania obliczone jako najmniejsza suma kwadratów między corr(t) i x(t).
  5. Przeanalizuj fazę aktywacji i dezaktywacji odpowiedzi (Rysunek 7B). Oblicz pierwszą pochodną danych szeregów czasowych i wyznacz zenit i nadir pochodnej odpowiadające odpowiednio aktywacji i dezaktywacji. Alternatywnie można ręcznie wybrać początek przyrostu fazowego. Zapisz i wyeksportuj czasy aktywacji/dezaktywacji oraz odpowiadające im współrzędne komórki.
  6. Przeanalizuj fazę plateau (Rysunek 7C). Wykrywanie poszczególnych oscylacji przez progowanie danych pierwotnych lub progowanie pierwszej pochodnej danych szeregów czasowych. Zdefiniuj początek i koniec pojedynczej oscylacji jako czas odpowiadający połowie amplitudy oscylacji.
    1. Oblicz czas trwania i częstotliwość poszczególnych oscylacji dla każdej komórki. Oblicz odwrotną wartość interwału międzykolcowego (odpowiednią dla regularnych wzorców aktywności). Alternatywnie, podziel liczbę oscylacji przez przedział czasowy zapisu (odpowiednie dla nieregularnych wzorców aktywności).
    2. Oblicz czas aktywności. Wyraź aktywny czas jako sumę czasów trwania i podziel tę wartość przez przedział czasu. Alternatywnie pomnóż częstotliwość i czas trwania, które odpowiadają oscylacji.
      UWAGA: Dzielenie sumy czasów trwania przez przedział czasu daje wiarygodne wyniki, ale zapewnia niską dyskryminację statystyczną, ponieważ uzyskuje się pojedynczy punkt danych na komórkę. Pomnożenie częstotliwości i czasu trwania oscylacji zapewnia rozdzielczość czasową między oscylacjami.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzyknięcie roztworu agarozy do przewodu trzustkowego jest najbardziej krytycznym krokiem w przygotowaniu wycinka tkanki trzustki. Udane wstrzyknięcie można rozpoznać po wybielaniu tkanki trzustki, co widać po lewej stronie Rycina 3A, podczas gdy niecałkowicie wstrzyknięta część trzustki jest przedstawiona po prawej stronie Rycina 3A. Wysepki Langerhansa można rozpoznać gołym okiem lub pod mikroskopem stereoskopowym, co pomaga w wycinaniu odpowiednich części trzustki do późniejszego osadzenia w blokach agarozy (Ryc. 3B). W świeżo ściętym wycinku tkanki trzustkowej myszy wysepki Langerhansa można łatwo odróżnić od otaczającej tkanki zewnątrzwydzielniczej i mezenchymy jako białe plamy pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 3C) lub jako brązowawe struktury pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 3D). Plastry tkanki trzustki mogą być używane do różnych rodzajów eksperymentów przez co najmniej 12 godzin po pokrojeniu. Oprócz ogólnej oceny morfologicznej pod mikroskopem stereoskopowym, mikroskopem świetlnym i funkcjonalnymi reakcjami komórek podczas obrazowania wapnia, można ocenić żywotność wycinków tkanki trzustki (Ryc. 4).

figure-results-1
Rysunek 4: Żywotność komórek w obrębie tkanki. Żywotność komórek określono za pomocą testu Żywe/Martwe. Żywe komórki są barwione przez Calcein AM (pokazane na zielono), podczas gdy martwe komórki są barwione etydyną homodimerem-1 (pokazane na czerwono). Żółte linie oznaczają położenie przekroju X-Y stosu Z wyświetlanego na dole i po prawej stronie. Pełna głębokość stosu Z wynosi 88 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Do eksperymentów z obrazowaniem wapnia, fluorescencyjny wskaźnik wapnia musi przenikać przez kilka warstw komórek. Rysunek 5A przedstawia udane ładowanie przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowego Ca2+ do wycinka tkanki trzustkowej, w którym można rozpoznać pojedyncze wyspy trzustkowe i komórki groniaste. W przeciwieństwie do tego, plastry w Rysunek 5B-D nie są optymalne ze względu na nieudaną penetrację barwnika (Rycina 5B), brak komórek wysp trzustkowych (Rysunek 5C) i dużo tkanki martwiczej na powierzchni (Figura 5D). Takie wycinki można wyrzucić, sprawdzić pod kątem obecności dodatkowych wysepek, które są lepiej pocięte lub wybarwione (patrz Tabela 1 w celu rozwiązywania problemów) lub wykorzystać do rejestrowania odpowiedzi komórek zewnątrzwydzielniczych.

figure-results-2
Rysunek 5: Przykłady użytecznych i nieużytecznych preparatów. (A) Przykład udanego przygotowania wycinka tkanki trzustki z dobrze wybarwionymi komórkami w wyspach Langerhansa, a także komórkami przewodowymi i otaczającą tkanką groniastą. (B) Przykład słabo poplamionego wycinka tkanki. (C) Przykład wysepki Langerhans z zanikami strukturalnymi. (D) Przykład wysepki Langerhans zawierającej wiele martwych komórek i sporo odłamków. Tabela przeglądowa "glow-over, glow-under" po prawej stronie wyświetla intensywność 0 na zielono i nasycenie na niebiesko. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywne wyniki obrazowania wapnia przy użyciu przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowego Ca2+ są pokazane w Rysunek 6. W Rysunek 6A, prezentowany jest obraz o wysokiej rozdzielczości wycinka tkanki trzustkowej, zawierający wysepkę Langerhansa, tkankę groniastą i przewód trzustkowy. Dla lepszego rozróżnienia, endokrynna, zewnątrzwydzielnicza i przewodowa część wycinka tkanki trzustki przedstawiona na Rycina 6A jest pokolorowana na Rysunek 6B. Użycie odpowiednich bodźców może funkcjonalnie rozróżnić różne komórki wysp trzustkowych lub komórki wysp trzustkowych i niewysp51. Komórki beta zazwyczaj reagują na stymulację impulsem kwadratowym przez glukozę przejściowym wzrostem [Ca2 +] IC, po którym następują szybkie oscylacje wapnia na utrzymującym się plateau (Rysunek 6C, górny panel).

Ponieważ wszystkie komórki beta są połączone w pojedyncze, duże, funkcjonalne syncytium, oscylacje te są również bardzo dobrze zsynchronizowane między różnymi komórkami za pomocą rozprzestrzeniania się [Ca2+]fal IC32,34,52,53,54 (Rysunek 7C). Wolniejsze oscylacje [Ca2+]IC o okresie 5-15 minut mogą leżeć u podstaw szybkich oscylacji, a nawet być dominującym typem odpowiedzi55,56. Ten sam prosty protokół może ujawnić inne typy odpowiedzi, zwłaszcza na obrzeżach wysepek (Rysunek 6C, dolny panel). Ponieważ komórki te nie są zsynchronizowane z komórkami beta i reagują szybszymi i bardziej nieregularnymi oscylacjami, które są już obecne w warunkach niskiego poziomu glukozy lub przy spadku aktywności, takie reakcje są wysoce sugerujące komórki inne niż beta21,32,57,58. Jednak ich ostateczna charakterystyka funkcjonalna wymaga bardziej złożonych protokołów z dodatkowymi etapami stymulacji lub alternatywnymi podejściami, które omówiono poniżej. Typowe reakcje komórek groniastych i przewodowych są przedstawione odpowiednio w Rysunek 6D i Rysunek 6E. Więcej informacji na temat komórek groniastych i przewodowych można znaleźć w literaturze22,23,35.

figure-results-3
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki dynamiki wapnia w różnych typach komórek trzustki. (A) Obraz w wysokiej rozdzielczości wyspy Langerhans wraz z otaczającą ją tkanką. Pasek skali = 100 μm. (B) Wytyczenie odrębnych części tkanki trzustki z tkanką groniastą zaznaczoną na żółto, wysepką Langerhansa pokazaną na czerwono i segmentem drzewa przewodowego na niebiesko. Pasek skali = 100 μm. (C) Typowe ślady dynamiki wapnia w komórkach beta i przypuszczalnych komórkach niebeta podczas stymulacji 12 mM glukozy; Glukozę 3 mM stosowano w stanach niestymulujących. Protokoły, które można wykorzystać do bardziej szczegółowej dyskryminacji komórek innych niż beta, są opisane w sekcji dyskusji. (D) Typowy ślad dynamiki wapnia w komórkach groniastych stymulowanych przez acetylocholinę 25 nM. (E) Typowy ślad dynamiki wapnia w komórkach przewodowych stymulowanych przez 1 mM kwas chenodeoksycholowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po udanym obrazowaniu wapnia, dane są najpierw eksportowane i korygowane pod kątem bielenia poprzez kombinację dopasowania wykładniczego i liniowego, jak opisano w sekcji protokołu. Szereg czasowy przed i po korekcie bielenia jest przedstawiony w Rysunek 7A. Następnie można przeanalizować kilka parametrów w fazie aktywacji i dezaktywacji odpowiedzi, a także w fazie plateau. Opóźnienie w rozpoczęciu wzrostu [Ca2 +] IC po stymulacji można zmierzyć jako opóźnienieA w Rysunek 7B i niejednorodność opóźnień między poszczególnymi komórkami (opóźnienieA1). Te same parametry (opóźnienieD i opóźnienieD1) można wykorzystać do opisania fazy dezaktywacji. Po początkowym przejściowym wzroście IC [Ca2 +], faza plateau w większości komórek beta trzustki w wysepce charakteryzuje się stosunkowo regularnymi oscylacjami IC o wysokiej częstotliwości [Ca2 +]. Fazę plateau można opisać, analizując klasyczne parametry funkcjonalne. Schematyczne przedstawienie czasu trwania oscylacji [Ca2+]IC, częstotliwości i procentu czasu aktywności zaprezentowane jest w Rysunek 7C. W obrazowaniu wapnia z szybkością akwizycji wyższą niż 10 Hz, fale wapniowe wielokrotnie rozchodzące się po wysepce mogą być również wyraźnie rozpoznane (Rysunek 7C).

figure-results-4
Rysunek 7: Analiza danych szeregów czasowych. (A) Korekta danych szeregów czasowych dla fotowybielania. (B) Analiza opóźnień w aktywacji po stymulacji i w dezaktywacji po ustaniu stymulacji 12 mM glukozy. Czas trwania stymulacji jest oznaczony jasnoszarym, zacienionym paskiem na obrazie. (C) Analiza kilku parametrów fazy plateau: I) Czas trwania oscylacji wyznaczony w połowie wysokości, II) Częstotliwość oscylacji wyznaczona przez interwały międzyoscylacyjne. III) czas aktywności jako iloczyn częstotliwości i czasu trwania oscylacji. I-IV) Opóźnienia pomiędzy oscylacjami w dowolnej fali oscylacji rozchodzących się po wysepce Langerhansa wyznaczone przez opóźnienia (Δt) w czasie, w którym pojedyncza komórka osiąga połowę wysokości oscylacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda warstw tkanki trzustki jest szybką metodą eksperymentalną do badania morfologii i fizjologii endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych części trzustki w bardziej konserwatywnym preparacji in situ. Wiele z tych zalet zostało już podkreślonych we Wprowadzeniu. Warto podkreślić, że ogólnie (tj. nie tylko w przypadku obrazowania wapnia) podejście warstwowe do badania fizjologii trzustki oszczędza czas, ponieważ nie obejmuje okresu rekonwalescencji po izolacji. To ostatnie nie jest absolutnie konieczne przy wszystkich typach eksperymentów i zastosowań izolowanych wysepek różnych gatunków, ale jest zwykle stosowane w celu zwiększenia czystości, przywrócenia żywotności i funkcjonalności, a czasami do zbierania wysepek od kilku dawców 59,60,61,62,63,64. Jednak w kontekście obrazowania wapnia stwierdzono, że odpowiedzi komórek beta zależą od czasu trwania i warunków hodowli, co jest ważnym źródłem zmienności, które należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu izolowanych wysp trzustkowych15,65. Tę samą kwestię należy rozważyć w przypadku wycinków tkanek, jeśli ich długotrwała hodowla stanie się w przyszłości powszechnie stosowaną opcją22,36. Metoda plastrowania tkanek ma również wysoką wydajność, a tym samym potencjalnie zmniejsza cierpienie zwierząt i zwiększa moc statystyczną. Co więcej, ze względu na to, że z jednego zwierzęcia można przygotować wiele plastrów, a także dlatego, że plastry te przeżywają przez długi czas, możliwe staje się włączenie tego samego zwierzęcia lub nawet tej samej wysepki zarówno w grupie doświadczalnej, jak i kontrolnej.

Ponieważ zachowana jest oryginalna architektura i komunikacja międzykomórkowa, a także ponieważ jest zgodna z wieloma analizami strukturalnymi, metodami elektrofizjologicznymi, obrazowaniem i testami wydzielania hormonów, metoda ta jest szczególnie przydatna do badania funkcji trzustki, które zależą od niezakłóconych interakcji między poszczególnymi komórkami, np. wrażliwości na wydzielanie, interakcje parakrynne i immunologiczne między różnymi typami komórek. wzorce aktywności elektrycznej, właściwości dynamiki wapnia i wydzielanie różnych hormonów. W przypadku obrazowania wapnia głównymi zaletami stosowania plastrów są naświetlanie rdzenia wyspy trzustkowej oraz możliwość pozyskiwania sygnałów z wielu różnych typów komórek z wysoką rozdzielczością. W zależności od wymagań eksperymentu i wieku zwierząt, grubość może być zróżnicowana, plastry mogą być transfekowane lub uzyskane od zwierząt z genetycznie zakodowanymi reporterami. Jak wyjaśniono bardziej szczegółowo poniżej, dwa ostatnie podejścia umożliwiają również specyficzną funkcjonalną identyfikację i charakterystykę odpowiedzi z komórek innych niż beta 31,66. Co więcej, wysepki z dobrze zdefiniowanych części narządu mogą być badane pod kątem różnic w reakcji lub podatności na choroby. Chociaż nie wymagają okresu inkubacji rekonwalescencji, można je łatwo inkubować z różnymi środkami farmakologicznymi, kwasami tłuszczowymi, wysokim poziomem glukozy i cytokinami.

Co najważniejsze, ponieważ wysoka rozdzielczość jest osiągalna w połączeniu z rozdzielczością jednokomórkową lub nawet subkomórkową, konfokalne obrazowanie wapnia w warstwach jest jedną z najbardziej odpowiednich metod analizy fal wapniowych, połączeń funkcjonalnych i różnych ról funkcjonalnych komórek w różnych częściach wysepki54,67. Pomimo wielu zalet, metoda polegająca na warstwach tkanek ma istotne ograniczenia. Po pierwsze, nadal przynajmniej częściowo zakłóca architekturę wysp trzustkowych i zewnątrzwydzielniczych, zwłaszcza na powierzchni cięcia, a środki ostrożności, takie jak niska temperatura, częsta wymiana roztworów oraz delikatna i szybka manipulacja, są konieczne podczas przygotowania, aby zapobiec dodatkowym mechanicznym i endogennym uszkodzeniom enzymatycznym. Po drugie, wzorce dostarczania składników odżywczych i wydzielania są nadal gorsze niż w przypadku metod in vivo, preparat jest oderwany od unerwienia ogólnoustrojowego, a sprzężenie zwrotne między narządami, na przykład między wyspą trzaskową a jej tkankami docelowymi, jest niemożliwe, w przeciwieństwie do metod in vivo. Po trzecie, maksymalna grubość plastra jest ograniczona przez natlenienie, dostarczanie składników odżywczych i regulację pH na poziomie ~200 μm9. Co więcej, zarówno przygotowanie wycinków, jak i obrazowanie wymagają wielu szkoleń, a dogłębne analizy danych dotyczących wapnia z długich szeregów czasowych i z wielu komórek wymagają specjalistycznej wiedzy, która często nie jest zawarta w zestawie narzędzi klasycznego fizjologa i wymaga pomocy fizyków lub naukowców zajmujących się danymi. Zaleta polegająca na tym, że interakcje homo- i heterotypowe są zachowane, może również komplikować analizę próbek ze względu na obecność sygnałów z innych komórek w obszarach zainteresowania. W zależności od protokołów, aktywacja innych komórek może prowadzić do pośredniej dodatkowej stymulacji lub zahamowania obserwowanej komórki.

Problem ten można rozstrzygająco rozwiązać jedynie za pomocą metod dekonwolucji, bardziej złożonych protokołów stymulacji zawierających substancje, które blokują niektóre z efektów pośrednich, poprzez wykorzystanie określonych zwierząt knock-out oraz poprzez staranne porównanie wyników z wynikami innych badań wykorzystujących bardziej redukcjonistyczne metodologie. Dodatkowo, jeśli konieczne są pomiary wydzielania, należy pamiętać, że niektóre plastry mogą nie mieć wysepek, a całkowita masa tkanki endokrynnej w jednym plasterku jest zwykle niska. Przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustki do obrazowania obejmuje kilka krytycznych etapów omówionych w poniższych sekcjach i podsumowanych w Tabeli 1, gdzie czytelnik może również znaleźć krótkie, ale ważne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Po pierwsze, podczas przygotowywania roztworu agarozy, proszek agarozy musi całkowicie się rozpuścić, w przeciwnym razie nierozpuszczone cząstki mogą utrudniać wstrzyknięcie. Przechowywać jednorodny roztwór agarozy w temperaturze 37-45 °C, aby zapobiec stwardnieniu agarozy z powodu zbyt niskiej temperatury z jednej strony, a z drugiej strony, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek z powodu zbyt wysokich temperatur. Po użyciu pozostałą agarozę można przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie podgrzać, chociaż wielokrotne podgrzewanie może spowodować zwiększenie gęstości z powodu parowania wody, co ostatecznie utrudni lub uniemożliwi wstrzyknięcie.

Kolejnym krytycznym krokiem w przygotowaniu jest prawidłowe zaciśnięcie głównej brodawki dwunastnicy. Biała plama na dwunastnicy wskazuje na połączenie wspólnego przewodu żółciowego i dwunastnicy. Zacisk umieszczony zbyt proksymalnie będzie skutkował niedrożnością niektórych bocznych gałęzi trzustki przewodu wspólnego, uniemożliwiając wstrzykiwanie tych części, natomiast zacisk umieszczony zbyt dystalnie będzie skutkował wyciekiem agarozy przez dolną ścieżkę oporu bezpośrednio do dwunastnicy. Przed kaniulacją przewodu żółciowego wspólnego otaczającą tkankę tłuszczową można ostrożnie usunąć w celu lepszej wizualizacji przewodu i większej kontroli podczas iniekcji. Niedostateczna precyzja podczas usuwania otaczającej tkanki może skutkować perforacją kanału. Istotny jest również dobór średnicy igły używanej do wstrzykiwania agarozy. U myszy korzystnie stosuje się igłę 30 G; mniejsze (32 lub 33 G) igły wymagają większego wysiłku ze względu na wysoką lepkość roztworu agarozy i są bardziej podatne na niedrożność. Jednak w połączeniu z roztworem agarozy o mniejszej gęstości mogą być bardzo pomocne u mniejszych szczepów myszy i młodszych zwierząt. W pierwszych dniach po urodzeniu agaroza może być alternatywnie wstrzykiwana podtorebkowo, a nie doprzewodowo2. Używanie igieł o większej średnicy u myszy najprawdopodobniej spowoduje uszkodzenie wspólnego przewodu żółciowego. Może się to również zdarzyć przy prawidłowej średnicy igły, a kleszcze mogą pomóc w utrzymaniu igły na miejscu podczas wstrzykiwania. Igły o większej średnicy mogą być jedynym rozwiązaniem w przypadku większych przewodów, jak u szczurów. Jeśli igła jest zbyt wąska, aby zapewnić szczelne uszczelnienie zapobiegające przeciekom wstecznym, po pomyślnym wprowadzeniu do kanału można umieścić wokół niej ligatturę.

Wstrzykiwanie agarozy wymaga pewnego wysiłku ze względu na lepkość roztworu, a po rozpoczęciu procesu wstrzykiwania nie należy go przerywać, ponieważ roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia może zestalić się w igle lub największych częściach drzewa kanałowego przed zakończeniem wstrzykiwania. Spowoduje to słabą penetrację tkanek i gorsze wsparcie podczas cięcia. Przewód powinien być zawsze kaniulowany w miejscu, w którym lewy przewód wątrobowy i przewód torbielowaty łączą się, tworząc wspólny przewód żółciowy. Jeśli wspólny przewód żółciowy zostanie perforowany, kilkakrotnie spróbuj kaniulować bliżej dwunastnicy. Gdy trzustka jest wystarczająco ustabilizowana roztworem agarozy i wyekstrahowana z jamy otrzewnej, wycina się małe kawałki dobrze wstrzykniętej tkanki. Przed osadzeniem ich w agarozie ważne jest usunięcie całej tkanki tłuszczowej i łącznej, ponieważ ich pozostałości utrudniają krojenie. To samo dotyczy naczyń krwionośnych i pozostałości przewodów, z wyjątkiem sytuacji, gdy to na nich skupia się eksperyment. W takim przypadku należy upewnić się, że ustawiłeś je w taki sposób, aby uzyskać pożądany przekrój. Podczas osadzania tkanki w agarozie należy upewnić się, że temperatura jest odpowiednia (37 °C) i że tkanka jest całkowicie otoczona agarozą, ponieważ siły działające podczas krojenia wibratomu mogą oderwać tkankę trzustki od bloków agarozy.

Szybkie wysuszenie bloków tkanek przed umieszczeniem ich w agarozie poprzez umieszczenie ich na krótko na papierowej chusteczce może pomóc zapobiec słabemu kontaktowi tkanki z agarozą na tym etapie. Podczas krzepnięcia bloków agarozy należy umieścić szalkę Petriego poziomo i zapobiegać kontaktowi tkanki trzustki z dnem szalki Petriego. Jeśli trzustka nie zostanie w pełni wstrzyknięta, proces cięcia będzie trudny. Dlatego staraj się zmniejszyć prędkość cięcia, aby uzyskać plastry tkanki. Aby zminimalizować uszkodzenia komórek podczas krojenia wibratomem, należy regularnie wymieniać ECS (i kostki lodu wykonane z ECS) w komorze krojenia. Ten ostatni zmniejszy aktywność enzymów trzustkowych uwalnianych z tkanki groniastej podczas krojenia. Kluczowe znaczenie ma również grubość plastrów. Do badań dynamiki wapnia i eksperymentów elektrofizjologicznych zwykle kroi się plastry o wielkości 140 μm; Jednak zgodnie z celem pracy grubość plastra może wynosić od 90 μm do 200 μm. Należy pamiętać, że w grubszych plastrach dyfuzja tlenu i składników odżywczych będzie ograniczona, ale będą one zawierały więcej tkanki. Ponadto można oczekiwać, że udział nieoszlifowanych wysepek będzie wzrastał wraz ze wzrostem grubości plastrów. Plastry mogą być przechowywane w regularnie wymienianym ECS w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, a nawet hodowane w odpowiednim podłożu komórkowym przez kilka dni; Jednak może to ostatecznie wpłynąć na prawidłową fizjologię komórek wysp trzustkowych 3,22.

Przygotowując roztwór barwnika, należy upewnić się, że wszystkie składniki są dokładnie wymieszane i unikać wystawiania na działanie światła otoczenia. Wycinek trzustki składa się z wielu warstw komórkowych, a wychwyt barwnika wapnia jest ograniczony do kilku pierwszych najbardziej powierzchownych warstw komórek, jak opisano wcześniej dla izolowanych wysepek58,68 i wycinków przysadki69. Jednak w przeciwieństwie do izolowanych wysepek, w których otaczająca torebka i zewnętrzne warstwy komórkowe utrudniają przenikanie barwnika do głębszych warstw, wycinki tkankowe umożliwiają dostęp do całej powierzchni przekroju poprzecznego wysepki, umożliwiając jednoczesny pomiar dynamiki wapnia w setkach komórek ze wszystkich warstw wysepki. Fluorescencyjne wskaźnikiCa2+ są najczęściej stosowane do pomiaru dynamiki wapnia, a wraz z CLSM umożliwiają zapisy o wysokiej rozdzielczości czasowej, sięgającej kilkuset Hz. Wybierając najodpowiedniejszy fluorescencyjny wskaźnik Ca2+, należy wziąć pod uwagę różne czynniki, w tym formę wskaźnika, która wpływa na metodę obciążenia komórek, tryb pomiaru (jakościowy lub ilościowy) oraz stałą dysocjacji (Kd), która musi mieścić się w zakresie stężeń Ca2+ będącym przedmiotem zainteresowania i zależy od pH, temperatury, obecności Mg2+ i innych jonów, a także wiązanie białek. Ponieważ sygnały komórkowe Ca2+ są zwykle przejściowe, należy również wziąć pod uwagę stałą szybkości wiązania Ca2+. Do pomiaru dynamiki [Ca2 +] IC w komórkach trzustki grupa ta używa głównie przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowego Ca2 + opisanego w tym protokole (Tabela materiałów), ponieważ jest to wskaźnik o długiej długości fali z długościami fal emisji w widmie, w którym autofluorescencja komórkowa jest zwykle mniej problematyczna, a energia światła wzbudzającego jest niska, co zmniejsza potencjał fotouszkodzenia komórek. Ponieważ barwnik ten jest fluorescencyjny przy niskich stężeniach Ca2+, ułatwia to określenie wyjściowego [Ca2+] IC i zwiększa widoczność komórkową przed stymulacją. Po związaniu Ca2+ intensywność fluorescencji barwnika wzrasta 14-krotnie, umożliwiając wykrycie nawet niewielkich zmian w [Ca2+]IC.

Aby skutecznie obrazować wapń na żywych komórkach, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych parametrów sprzętowych, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. W przypadku obrazowania żywych komórek, w których amplitudy sygnału są niskie, a szanse na fototoksyczność wysokie, preferowane są obiektywy o wyższym NA, aby zebrać więcej światła z próbki. Jeśli dynamika wapnia musi być rejestrowana z wysoką rozdzielczością czasową, należy użyć skanera rezonansowego zamiast galwanometrów liniowych. Oprócz wyboru odpowiedniego obiektywu, zastosowanie detektorów o wysokiej czułości, takich jak detektory hybrydowe, które wymagają mniejszej mocy lasera, pozwala uniknąć fototoksyczności i fotowybielania. Ma to szczególne znaczenie dla długotrwałego obrazowania wapnia. Innymi ważnymi etapami obrazowania wapnia są ustawienia parametrów jakości obrazu dla akwizycji szeregów czasowych. Najważniejsze z nich to rozdzielczość czasowa i przestrzenna. Ponieważ dynamika wapnia sama w sobie określa najniższą akceptowalną rozdzielczość czasową, częstotliwość próbkowania musi być co najmniej dwukrotnie wyższa niż oczekiwana częstotliwość sygnału, aby wykryć sygnał, lub nawet 10 razy wyższa, aby niezawodnie wykryć kształt sygnału. W ostrych wycinkach tkanki trzustkowej dynamika wapnia może być mierzona w setkach komórek jednocześnie, dlatego ważna jest również rozdzielczość przestrzenna. Można to poprawić, zwiększając liczbę pikseli lub zwiększając uśrednianie linii podczas akwizycji na żywo. Jednak ze względu na odwrotną zależność między rozdzielczością przestrzenną i czasową potrzebny jest kompromis między oboma ustawieniami.

Jeśli obrazowanie wapnia musi być wykonane w określonej populacji komórek w trzustce, konieczny jest bodziec zdolny do funkcjonalnego różnicowania komórek w wycinku. Wysoki poziom glukozy niezawodnie i szybko aktywuje komórki beta do wzorca oscylacyjnego, który nakłada się na podwyższony poziom wapnia i jest wysoce zsynchronizowany między wszystkimi komórkami w obrębie wysepki 32,58,70. Komórki beta są najliczniejszym typem komórek w obrębie wysepki i znajdują się głównie w rdzeniu wyspy trzustkowej u myszy. Ten sam protokół stymulacji zmniejsza się, a czasami nie zmienia znacząco pękania w komórkach alfa 30,32,58,70,71,72. Aby funkcjonalnie rozróżnić komórki alfa, można użyć niskiego (3 mM) poziomu glukozy, glutaminianu lub adrenaliny w celu zwiększenia ich częstotliwości lub podstawowego [Ca2 +] IC 21,72,73,74,75. Stanowią one 10-20% komórek wysp trzustkowych i zostaną wykryte na obrzeżach wysp trzustkowych1. Komórki Delta znajdują się również na obrzeżach. Stanowią one tylko ~ 5% całkowitej liczby komórek endokrynnych w wysepce i są zwykle aktywne w 6 mM glukozy i reagują na stymulację glukozą zwiększoną nieregularną aktywnością pękania w stosunku do wartości wyjściowej lub nieznacznie podwyższonym poziomem wapnia 1,32,71,76. Grelina może być stosowana do specyficznej stymulacji komórek delta 21,77,78,79 w eksperymentach obrazowania wapnia. Jednak protokoły specyficznej identyfikacji funkcjonalnej komórek PP i epsilon pozostają do zdefiniowania. Co więcej, acetylocholina 25 nM niezawodnie aktywuje komórki groniaste do aktywności pękającej 35,80,81. Ponadto szereg innych substancji wydzielających, takich jak ceruleina, cholecystokinina i karbamylcholina, może być wykorzystywanych do wywoływania odpowiedzi wapniowych w komórkach groniastych 22,40,82,83.

Wreszcie, 1 mM kwas chenodeoksycholowy niezawodnie wywołuje reakcje wapnia w komórkach przewodowych w wycinkach tkanki; angiotensyna II, ATP i niektóre inne sekretagogi mogą być również używane 11,23,84,85. Ilekroć identyfikacja funkcjonalna oparta na charakterystycznych reakcjach na określone wydzielanie i inhibitory nie jest wystarczająca, do identyfikacji różnych typów komórek można zastosować genetycznie znakowane zwierzęta31, transfekowane komórki73 lub immunocytochemię 9,22,71,86 . W ciągu ostatnich kilku lat metoda warstw tkanek została z powodzeniem zaadaptowana do tkanki ludzkiej, otwierając wiele nowych ważnych ścieżek badawczych zarówno w zakresie egzokrynologii41, jak i fizjologii endokrynnej 9,36,37,39. Co ciekawe, szczegółowa ocena dynamiki wapnia w ludzkich wyspach trzustkowych była niezwykle trudna i wymaga jeszcze bardziej szczegółowego zbadania87. W połączeniu z zaawansowaną mikroskopią konfokalną, metoda warstw tkanki trzustkowej umożliwiła wiele nowych spostrzeżeń na temat dynamiki wapnia u myszy i miejmy nadzieję, że zrobi to samo w przypadku tkanek ludzkich.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakiegokolwiek interesu komercyjnego lub finansowego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca przedstawiona w tym badaniu była finansowana przez Słoweńską Agencję Badawczą (podstawowe finansowanie badań nr P3-0396 i I0-0029, a także projekty badawcze nr J3-9289, N3-0048 i N3-0133) oraz przez Austriacki Fundusz Naukowy / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (granty dwustronne I3562--B27 i I4319--B30). Dziękujemy Marušie Rošerowi, Mašie Čaterowi i Rudiemu Mlakarowi za doskonałą pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Waga analityczna KERN ALJ 120-4KERN & SOHN GmbHALJ 160-4A
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5 II Ustawienie pionoweMikroskop
Konfiguracja Leica TCS SP5 AOBS Tandem II PodkładkaLeica
15 cm x 15 cm
Corning  Probówki wirówkowe 15 mlMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyCLS430790
Corning  Okrągłe wiaderko na lód z pokrywką, 4 LFischer Scientific, Leicestershire, Wielka Brytania432124
Żyletka z podwójną krawędziąPersonna, Stany Zjednoczone
Dumont #5 - Kleszcze precyzyjneFST, Niemcy11254-20
Probówki Eppendorf Safe-Lock 0,5 mlEppendorf0030 121.023
Kolba Erlenmeyera 200 mlIsoLab, Niemcy027.01.100
Cienkie nożyczki - ToughCutFST, Niemcy14058-11
Płaska wytrząsarka orbitalna  IKA KS 260 basicIKAIdent. Nr: 0002980200
Szklana butelka laboratoryjna 1000 mlIsoLab, Niemcy091.01.901
Hartman Hemostat, zakrzywionyFST, Niemcy13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (obiektyw do zanurzenia w wodzie, 20x, NA 1.0)Leica15507701
25 mLIsoLab, Niemcy015.01.025
Skrzynka kontrolna mikromanipulatora SM-7, Klawiatura SM-7Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Kuchenka mikrofalowa owenGorenje, SłoweniaMO20MW
Osmometr Gonotec 010Gonotec, Berlin, NiemcyOSMOMAT 010 Nr 01-02-20
PędzelFaber-Castell, nr 2Dowolny cienki miękki okrągły pędzel nr 2, najlepiej
Ręczniki
Pompy peryfuzyjneIsmatecISM 827Reglo Analog MS -
szalka Petriego 4/8 100/20 mmSarstedt83.3902
szalka Petriego 35/10 mmGreiner bio-one627102
szalka Petriego 35 x 10 mm Nunclon DeltaThermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA153066NON-STICKY do bloków agarozy
pH-metr inoLab pH Level 1WTW, Weilheim, NiemcyE163694
Pipeta 1000 mlEppendorf3121 000.120
Pipeta 50 mlEppendorf3121 000.066
Pinezki 23 mmDeli, Ningbo, ChinyE0021
Rurka z nakrętką, 15 mlSarstedt62.554.502
Kleszcze SemkenFST, Niemcy11008-13
Pierścień stabilizujący do kolby ErlenmeyeraIsoLab, Niemcy027.11.048
Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ 745Nikon, Melville, NY USA
Strzykawka Injekt Solo 5 mLBraun, Melsungen, Niemcy4606051V
Igła strzykawkowa 0,30 x 12 mm (30 G x 1/2")Braun, Melsungen, Niemcy4656300
Regulator temperaturyLuigs & Neumann200-100 500 0150, 200-150-500-145Mini komora Slice, regulator temperatury TC 07
Rurki do systemu peryfuzyjnegoIsmatecSC0310Ismatec Pharmed 1,14 mm(ID) + rurka silikonowa 1,0 (ID) x 1,8 mm(OD)
Wanna ultradźwiękowa Studio GT-7810AWibrotom Globaltronics
Leica VT 1000 SLeica, Nussloch, Niemcy14047235613
Wolumetryczny kolba 1000 mlIsoLab, Niemcy013.01.910
Mieszalnik wirowy Neolab 7-2020Neolab  7-2020
Łaźnia wodna Pompa cyrkulacyjna otwarta Thermo HaakeThermo Fisher ScientificZ527912
Materiał/Odczynnik
Dwuwodny chlorek wapnia - CaCl2.2H2OSigma Aldrich, NiemcyC5080-500G
D-(+)-glukozaSigma Aldrich, NiemcyG8270-1KG
DimetylosulfotlenekSigma AldrichD4540-100ML
Kwas DL-mlekowySigma Aldrich, NiemcyL1250-500ML
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyD8662-500ML
Mieszanina gazów zawierająca 95% O2 i 5% CO2 przy ciśnieniu
Klej Wekem sekundenkleber WK-110Wekem GmbH, Bergkamen, NiemcyWK 110-020
HEPESSigma Aldrich, NiemcyH3375-250G
L-(+)- Kwas askorbinowySigma Aldrich, NiemcyA9,290-2
ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssakówThermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stany ZjednoczoneL3224
Chlorek magnezu sześciowodny - MgCl2.2H2OSigma Aldrich, NiemcyM2670-500G
Myo-inozytolSigma Aldrich, NiemcyI5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AMInvitrogen (Thermo FisherScientific)Przepuszczalnydla komórek wskaźnik Ca2+ (wzbudzenie/emisja: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)P3000MPPolaxamer: niejonowy kopolimer triblokowy
Chlorek potasu - KClSigma Aldrich, Niemcy31248
SeaPlaque GTG agarozaLonza, Rockland, Stany Zjednoczone50111
Wodorowęglan sodu - NaHCO3Honeywell, Niemcy31437-500G
Chlorek sodu - NaClHoneywell, Niemcy31434-1KG
Wodorotlenek sodu - NaOHSigma Aldrich, Niemcy30620
Fosforan sodu jednozasadowy- NaH2PO4Sigma Aldrich, NiemcyS0751-500G
Pirogronian soduSigma Aldrich, Niemcy15990-100G
Software
FIJIFIJI to projekt open source
LASAFLeica microsystems, Inc.
MatlabMathworks
PythonPython Software FoundationPython to projekt open source
konfokalny Leica 5100001578 korkowa Cylinder miarowy papieroweatmosferycznym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405(2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160(2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255(2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125(2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343(2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137(2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706(2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229(2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638(2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923(2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374(2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113(2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525(2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449(2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495(2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106(2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnaobrazowanie wapniaobrazowanie ywych kom rekkomunikacja mi dzykom rkowakom rki wysepekiniekcja agarozykrojenie w wibratomiebarwnik wska nikowy wapnia

Powiązane artykuły