Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62299

⸱

15 marca 2021

 ,  ,  , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Streszczenie

Adoptywne terapie komórkowe wykorzystujące limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (komórki CAR-T) wykazały niezwykłą skuteczność kliniczną u pacjentów z nowotworami hematologicznymi i są obecnie badane pod kątem różnych guzów litych. Limfocyty CAR-T są generowane przez usunięcie limfocytów T z krwi pacjenta i zmodyfikowanie ich w celu ekspresji syntetycznego receptora immunologicznego, który przekierowuje limfocyty T w celu rozpoznania i wyeliminowania docelowych komórek nowotworowych. Edycja genów w komórkach CAR-T może potencjalnie poprawić bezpieczeństwo obecnych terapii komórkowych CAR-T i jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność komórek CAR-T. W tym miejscu opisujemy metody aktywacji, ekspansji i charakterystyki ludzkich komórek CAR-T skierowanych na CD19 za pomocą CRISPR. Obejmuje to transdukcję wektora lentiwirusowego CAR i wykorzystanie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) i endonukleazy Cas9 do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania w limfocytach T. Metody opisane w tym protokole mogą być uniwersalnie stosowane do innych konstruktów CAR i genów docelowych poza tymi, które zostały użyte w tym badaniu. Ponadto w protokole tym omówiono strategie projektowania gRNA, selekcji gRNA i walidacji nokautu genu docelowego w celu uzyskania wysoce wydajnej, multipleksowej inżynierii CRISPR-Cas9 ludzkich limfocytów T klasy klinicznej.

Wprowadzenie

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T zrewolucjonizowała dziedzinę adoptywnych terapii komórkowych i immunoterapii nowotworów. Limfocyty CAR-T to zmodyfikowane limfocyty T wyrażające syntetyczny receptor immunologiczny, który łączy specyficzny dla antygenu fragment przeciwciała jednołańcuchowego z domenami sygnałowymi pochodzącymi z łańcucha TCRzeta i domenami kostymulującymi, niezbędnymi i wystarczającymi do aktywacji komórek T i kostymulacji1,2,3,4. Produkcja komórek CAR-T rozpoczyna się od ekstrakcji własnych limfocytów T pacjenta, a następnie transdukcji wirusa ex vivo modułu CAR i ekspansji produktu komórkowego CAR-T za pomocą kulek magnetycznych, które działają jak sztuczne komórki prezentujące antygen5. Rozszerzone komórki CAR-T są ponownie podawane pacjentowi, gdzie mogą się wszczepić, wyeliminować docelowe komórki nowotworowe, a nawet utrzymywać się przez wiele lat po infuzji6,7,8. Chociaż terapia komórkami CAR-T doprowadziła do znacznych wskaźników odpowiedzi w nowotworach złośliwych komórek B, sukces kliniczny w przypadku guzów litych został zakwestionowany przez wiele czynników, w tym słabą infiltrację komórek T9, immunosupresyjne mikrośrodowisko nowotworu10, pokrycie i swoistość antygenu oraz dysfunkcja komórek CAR-T11,12. Innym ograniczeniem obecnej terapii komórkami CAR-T jest stosowanie autologicznych limfocytów T. Po wielu rundach chemioterapii i wysokim obciążeniu nowotworem, komórki CAR-T mogą być niskiej jakości w porównaniu z allogenicznymi produktami CAR-T od zdrowych dawców, a także czas i koszty związane z produkcją autologicznych komórek CAR-T. Edycja genów produktu komórkowego CAR-T za pomocą CRISPR/Cas9 stanowi nową strategię przezwyciężania obecnych ograniczeń komórek CAR-T13,14,15,16,17.

CRISPR/Cas9 to dwuskładnikowy system, który może być używany do celowej edycji genomu w komórkach ssaków18,19. Endonukleaza Cas9 związana z CRISPR może indukować specyficzne dla miejsca pęknięcia podwójnej nici prowadzone przez małe RNA poprzez parowanie zasad z docelową sekwencją DNA20. W przypadku braku szablonu naprawczego, pęknięcia dwuniciowe są naprawiane przez podatny na błędy szlak łączenia niehomologicznych końców (NHEJ), co skutkuje mutacjami przesunięcia ramki lub przedwczesnymi kodonami stop poprzez mutacje insercji i delecji (INDELs)19,20,21. Wydajność, łatwość użycia, opłacalność i możliwość multipleksowej edycji genomu sprawiają, że CRISPR/Cas9 jest potężnym narzędziem zwiększającym skuteczność i bezpieczeństwo autologicznych i allogenicznych komórek CAR-T. To podejście można również wykorzystać do edycji komórek T skierowanych przez TCR, zastępując konstrukcję CAR TCR. Ponadto allogeniczne komórki CAR-T, które mają ograniczony potencjał do wywoływania choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, mogą być również generowane przez edycję genów locus TCR, b2m i HLA.

W tym protokole pokazujemy, jak inżynieria CRISPR limfocytów T może być połączona z dostarczaniem CAR-Transgene za pośrednictwem wektora wirusowego, aby generować produkty komórkowe CAR-T z edytowanym genomem o zwiększonej skuteczności i bezpieczeństwie. Schemat ideowy całego procesu jest pokazany w Rysunek 1. Stosując to podejście, wykazaliśmy wysoką skuteczność nokautu genów w pierwotnych ludzkich komórkach CAR-T. Rysunek 2A szczegółowo opisuje harmonogram każdego kroku edycji i produkcji komórek T. Omówiono również strategie projektowania przewodnikowego RNA i walidacji nokautu w celu zastosowania tego podejścia do różnych genów docelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzkie limfocyty T zostały pozyskane przez University of Pennsylvania Human Immunology Core, który działa zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej, z ustalonymi standardowymi procedurami operacyjnymi i/lub protokołami odbioru, przetwarzania, zamrażania i analizy próbek zgodnych z wytycznymi etycznymi MIATA i University of Pennsylvania.

1. Produkcja wektorów lentiwirusowych

UWAGA: Produkty wirusowe zostały uszkodzone pod względem replikacji poprzez rozdzielenie konstruktów pakujących (Rev, gag/pol/RRE, VSVg i plazmid transferowy) na cztery oddzielne plazmidy, co znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzeń rekombinacji, które mogą skutkować wirusem kompetentnym do replikacji.

  1. Przygotuj HEK293T komórek na dzień przed transfekcją. Umieść około 6 x 106 komórek w naczyniach hodowlanych T150 w 30 ml standardowej pożywki hodowlanej (określanej jako R10: RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 10 mM HEPES, 1% Pen/Strep, 1% L-glutaminy) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. 18-24 godziny później komórki powinny być w 60-70% zlewające się i wyglądać zdrowo (wypustki dendrytyczne i równomierne rozmieszczenie w kolbie). Jeśli komórki wyglądają zdrowo, przejdź do kroku 1.2.
  2. Przygotować mieszaninę do transfekcji zawierającą odczynnik do lipofekcji (96 μl), pTRP gag/pol (Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (Lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) plazmidy pakujące i 15 μg plazmidu ekspresyjnego (CD19bbz scFv sklonowany w pTRPE).
    1. Dla każdej reakcji transfekcji przygotować jedną probówkę zawierającą 1 ml minimalnej pożywki niezbędnej o zredukowanej surowicy oraz cztery plazmidy opisane w kroku 1.2, jak również jedną probówkę zawierającą 2 ml pożywki o obniżonej surowicy oraz 90 μl odczynnika do lipofekcji. Połączyć te dwa roztwory przez kroplowe dodawanie 1 ml mieszaniny plazmidu do 2 ml mieszaniny odczynników do lipofekcji. Pamiętaj, aby energicznie wymieszać roztwór, pipetując kilka razy w górę i w dół. Inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. W międzyczasie odessać pożywkę z kolby HEK293T komórkowej i delikatnie przemyć komórki 10 ml minimalnej ilości niezbędnej pożywki o obniżonej surowicy i ponownie odessać.
    3. Delikatnie dodać mieszaninę do transfekcji (3 ml) z kroku 1.2.1 do dolnego rogu kolby do hodowli komórkowych za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Delikatnie przechylić kolbę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcyjną w kolbie do hodowli komórkowej i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że nie przeszkadzasz monowarstwie komórek. Po 10 minutowej inkubacji dodać 35 ml pożywki R10 i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze na 24 godziny.
  3. Po 24 godzinach zebrać supernatant z kolb do hodowli komórkowych HEK293T i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dodać świeży R10 do komórek HEK29T i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny. Odwiruj supernatant (300 x g), aby usunąć resztki komórek i przefiltruj supernatant przez filtr 0,45 μm.
  4. Zagęścić filtrat od etapu 1.3 przez ultrawirowanie z dużą prędkością (25 000 x g przez 2,5 godziny lub 8000 x g przez noc (O/N)). Przechowywać 24-godzinny osad wirusa w temperaturze 4 °C podczas gromadzenia 48-godzinnego wirusa.
  5. Powtórz kroki 1.3-1.4 dla kolekcji 48 godzin i połącz 24-godzinne i 48-godzinne kolekcje wirusów. Granulki z kolekcji 48 h będą zawierały łączny zbiór lentiwirusa.
  6. Zawiesić osad wirusa w około 1 ml zimnego R10 i podwielokrotność do fiolek o pojemności 100 μl. Natychmiast zamrozić porcje za pomocą suchego lodu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Obliczyć funkcjonalne miano wirusa w jednostkach transdukcyjnych/ml, transdukując stałą ilość pierwotnych ludzkich komórek T aktywowanych kulkami CD3/CD28 z seryjnymi rozcieńczeniami supernatantu lentiwirusa. Zmierzyć transdukcję CAR po 72 godzinach za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Barwienie CAR skierowanego na CD19 przeciwciałem anty-FCM63 scFv. W przypadku innych chimerycznych receptorów antygenowych barwienie za pomocą rekombinowanego białka znakowanego fluoroforem, które jest specyficzne dla CAR scFv. Rozcieńczenie wirusa, które generuje poniżej 20% komórek CAR dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej, jest najdokładniejszym rozcieńczeniem, na podstawie którego można obliczyć miano wirusa. Powyżej 20% komórek CAR-dodatnich zwiększa się szansa na dwukrotną transdukcję każdej dodatniej komórki, co skutkuje niedoszacowaniem liczby transdukujących cząstek. Obliczyć jednostki transdukcyjne na ml (TU / ml ) = (liczba transdukowanych komórek x procent komórek dodatnich CAR x współczynnik rozcieńczenia)/(objętość transdukcji w ml).

2. Projektowanie sgRNA i rozerwanie genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T

  1. Projektowanie CRISPR sgRNA
    UWAGA: Kilka serwerów i programów ułatwia projektowanie sgRNA specyficznych dla celu. W tym protokole sgRNA CRISPR zostały zaprojektowane przy użyciu CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) i portalu projektowego gRNA z Broad institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
    1. Dla każdego genu docelowego zaprojektuj od sześciu do dziesięciu sekwencji sgRNA, aby celować we wczesne kodujące sekwencje egzonów.
      UWAGA: sgRNA powinno mieć wysoką skuteczność na miejscu i niską skuteczność poza celem. Każdy algorytm uczenia maszynowego do określania skuteczności sgRNA działa nieco inaczej. Dlatego zaleca się porównanie wielu narzędzi do projektowania sgRNA i sporządzenie listy od sześciu do dziesięciu sgRNA do badań przesiewowych.
  2. Zakłócenie genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T
    1. Pozyskanie autologicznych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców-ochotników. Schematyczna oś czasu protokołu jest opisana w Rysunek 2A i opisana poniżej.
    2. Wyizoluj limfocyty T CD4+ i CD8+ za pomocą dostępnych na rynku zestawów selekcyjnych CD4 i CD8.
    3. Połącz limfocyty T CD4 + i CD8 + w stosunku 1:1 i inkubuj przez noc w 3x106 komórek/ml w R10 uzupełnionym 5 ng / ml huIL-7 i huIL-15 każdy. Dodanie IL-7 i IL-15 jest zalecane, ponieważ wiadomo, że promują one fenotyp pamięci centralnej, a komórki CAR-T rozszerzone IL-7 i IL-15 mają lepszą skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z ekspandowanymi komórkami CAR-T IL-222,23,24.
    4. Następnego dnia należy policzyć limfocyty T i odwirować 5-10 x 106 komórek przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić cały supernatant i przemyć osad komórkowy w zminimalizowanej ilości niezbędnych pożywek o zredukowanej surowicy. Zawiesić osad w 100 μl roztworu nukleofekcji zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
    5. Podczas mycia komórek przygotuj kompleks rybonukleoproteinowy (RNP) z Cas9 i gRNA, inkubując 10 μg nukleazy Cas9 z 5 μg sgRNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Stosunek molowy Cas9 do sgRNA wynosi 1:2,4. Zalecana jest fałszywa kontrola, która zawiera Cas9 i wzmacniacz elektroporacji, ale nie sgRNA.
      UWAGA: Na tym etapie można przeprowadzić multipleksową edycję genów, tworząc kompleksy RNP dla każdego celu osobno i łącząc je z komórkami w czasie nukleofekcji, jak opisano w następnym kroku. Wybór odczynników do złożenia kompleksu RNP jest kluczem do uzyskania wysokiej wydajności KO. Na przykład nukleazy Cas9 od różnych dostawców mają różne efekty poza celem, a chemicznie zmodyfikowane gRNA zmniejszają toksyczność dla limfocytów T, zwiększając w ten sposób wydajność KO.
    6. Połączyć zawieszone komórki z kroku 2.2.4 z kompleksem RNP z kroku 2.2.5 i dodać 4,2 μl wzmacniacza elektroporacji 4 μM (oligonukleotyd ssDNA, który nie jest homologiczny do ludzkiego genomu). Dobrze wymieszaj i przenieś do kuwet do elektroporacji. Unikaj pęcherzyków powietrza, ponieważ pogarszają one wydajność elektroporacji.
    7. Elektroporacja ogniw za pomocą kodu impulsowego EH111. Po elektroporacji inkubować komórki w R10 uzupełnionym 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15 w 5x106 komórek/ml w temperaturze 30 °C przez 48 godzin na płytkach 12-dołkowych. Po 48 godzinach przystąp do aktywacji i ekspansji limfocytów T.

3. Aktywacja limfocytów T, transdukcja i ekspansja lentiwirusa

UWAGA: Do badania przesiewowego sgRNA, transdukcja lentiwirusowa (Krok 3.2) konstruktu CAR nie jest konieczna.

  1. Policz elektroporowane limfocyty T i rozcieńcz do stężenia 1 x 106 komórek/ml za pomocą ciepłego R10 uzupełnionego 5 ng / ml huIL-7 i huIL-15. Aktywuj komórki, dodając kulki magnetyczne pokryte przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 / anty-CD28 w stosunku 3 kulek na żywą komórkę T.
    UWAGA: Elektroporacja powoduje znaczną śmierć ogniwa, w wyniku czego powstaje około 60% ± 15% żywotnych ogniw w porównaniu z ogniwami nieelektroporowanymi. Użyj liczby żywych/martwych komórek, aby określić odpowiednią ilość koralików. Przenieść komórki do temperatury 37 °C i inkubować przez noc.
  2. Po całonocnej stymulacji transdukuj komórki T zmodyfikowane przez CRISPR supernatantem lentiwirusowym z kroku 1. Dodać odpowiednią objętość na podstawie miana wirusa obliczonego w kroku 1.7, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 3 i inkubować komórki przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Osad wirusa zawieszony w R10 jest po prostu dodawany na komórki zgodnie ze stężeniem komórek, mianem wirusa i pożądanym MOI.
  3. Po 72 godzinach nakarmić komórki z 50% obecnej objętości hodowli R10 zawierającej 10 ng/ml huIL-7 i huIL-15 i wstawić je z powrotem do inkubatora na kolejne 48 godzin. Nie przeszkadzaj skupiskom, które utworzyły się między limfocytami T a koralikami.
  4. Po 48 godzinach usuń kulki z komórek, delikatnie ponownie zawieszając mieszaninę komórkowo-kulkową, a następnie rozdzielając magnetycznie. Policz komórki po usunięciu kulek i doprowadź do stężenia 0,8 x 106 komórek/ml za pomocą R10 uzupełnionego 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15. Po usunięciu koralików liczba komórek powinna być podobna do liczby komórek w dniu 1 przed elektroporacją (Rysunek 2B).
  5. Po 24 godzinach należy policzyć komórki i podawać do stężenia 1 x 106 komórek/ml z R10 + 5 ng/ml huIL-7 i huIL-15. Powtarzaj to co 24 godziny, aż kinetyka wzrostu i wielkość komórki wykażą, że komórki odpoczęły od stymulacji.
    UWAGA: Od tego momentu limfocyty T podwajają się mniej więcej co 24 godziny. Limfocyty T zwykle przechodzą 5-7 podwojeń populacji i mają objętość komórek około 300 ± 50 fL, gdy są wypoczęte.
  6. Po odpoczynku odwiruj komórki CAR-T zaprojektowane przez CRISPR i ponownie zawieś w pożywkach do zamrażania (1:1 X-Vivo i FBS plus 10% DMSO) w celu kriokonserwacji. Użyte komórki CAR-T powinny być rozmrożone i odpoczęte w temperaturze 37 °C przez 16 godzin przed eksperymentem.
    UWAGA: Zachowaj około 10x106 komórek zarezerwowanych do pomiaru skuteczności wybijania i integracji CAR. Oczekiwane podwojenie populacji i zmiany objętości podczas ekspansji zostały pokazane w Rysunek 2B,2C. Dodatkowo, Rysunek 2D pokazuje poziomy ekspresji CAR zarówno na makietach, jak i genetycznie edytowanych komórkach CAR-T.

4. Wydajność CRISPR

  1. Ekstrakcja genomowego DNA i amplifikacja genów docelowych
    1. Z każdej hodowli przesiewowej odwiruj 3-5 x 106 limfocytów T. Komórki można zamrozić w postaci suchej granulki lub przeprowadzić ekstrakcję genomowego DNA. W czasie ekstrakcji DNA ponownie zawiesić granulki w 200 μl soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i wyekstrahować genomowe DNA z komórek poddanych elektroporacji za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcją producenta.
      1. Krótko mówiąc, zjonizuj komórki proteinazą K i załaduj lizat na kolumnę wiążącą DNA. Podczas wirowania DNA wiąże się z błoną, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą przez nią. Po dwóch etapach mycia w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń i inhibitorów enzymów, wymyj DNA w wodzie.
    2. Amplifikuj 200-300 ng genomowego DNA za pomocą standardowej mieszanki PCR zawierającej polimerazę DNA, białka pomocnicze, sole i dNTP oraz 10 μM starterów do przodu i do tyłu flankujących obszar zamierzonego pęknięcia podwójnej nici.
      UWAGA: W przypadku projektowania startera PCR, referencyjna sekwencja genomowa (którą można znaleźć za pomocą http://www.ensemble.org) flankująca miejsce cięcia gRNA jest wprowadzana do narzędzia NCBI starter blast tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Startery PCR powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby amplikon miał docelową wielkość 600-700 pz. Długość ta pozwala na zaprojektowanie starterów sekwencjonowania, które wiążą się w amplikonie w wystarczającej odległości od miejsca cięcia gRNA (co najmniej 150 pz), aby zapewnić dobrą jakość sekwencjonowania wokół indeli indukowanych Cas9 (patrz 4.2.1). Każda gRNA wymaga unikalnej pary starterów, chyba że miejsca cięcia gRNA znajdują się w bliskiej odległości.
    3. Uruchom cały produkt PCR na 1% żelu agarozowym i oczyść amplikon za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania w żelu agarozowym.
      UWAGA: Proces określania optymalnej Tm dla PCR może obejmować wiele rund rozwiązywania problemów. Dzieje się tak, ponieważ sekwencja KO ma indele, a gen docelowy powinien być przygotowany do sekwencjonowania, w którym nie byłoby indeli, zwykle 100 pz przed lub za miejscem cięcia. Może się to znacznie różnić ze względu na indele wynikające z niehomologicznego łączenia końców. Zaprojektowanie zagnieżdżonych starterów sekwencjonowania do starterów PCR i zwiększenie stężenia sekwencjonowanych produktów może wyeliminować problemy z sekwencjonowaniem.
  2. Sekwencjonowanie i wykrywanie indel
    1. Zaprojektuj startery sekwencjonowania, które wiążą się z oczyszczonym żelem amplikonem i wysyłają makiety i nokautujące amplikony do sekwencjonowania Sangera. Po zakończeniu sekwencjonowania prześlij pliki śledzenia do oprogramowania Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) w celu analizy TIDE.
      1. W celu sekwencjonowania projektu startera wprowadź sekwencję amplikonu PCR do standardowego oprogramowania do projektowania starterów (NCBI, Eurofins lub inne publicznie dostępne narzędzia). Oprogramowanie do projektowania zasugeruje wiele sekwencji starterów, które są odpowiednie do sekwencjonowania Sangera.
      2. Wybierz startery do przodu i do tyłu, które wiążą się w amplikonie co najmniej 150 pz przed lub za miejscem cięcia gRNA, aby zapewnić dobrą jakość sekwencjonowania wokół indeli. Chromatogram sekwencjonowania zostanie użyty w ppkt 4.2 do analizy TIDE, dlatego ważne jest, aby jakość sekwencjonowania była dobra dla dokładnego rozkładu indelu (patrz Hultquist i wsp.)25.
    2. Użyj analizy TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition), aby wykryć skuteczność nokautu (KO) na poziomie genomu26. Algorytm dokładnie rekonstruuje widmo indeli na podstawie śladów sekwencji i oblicza wartości R2, odzwierciedlając dobroć dopasowania po nieujemnym modelowaniu liniowym przez oprogramowanie TIDE.
  3. Detekcja białka docelowego
    1. W przypadku genów docelowych, których produkt genowy ulega ekspresji na powierzchni limfocytów T, należy wybarwić około 1 x 105 komórek z każdej hodowli przesiewowej przeciwciałem znakowanym fluorochromem specyficznym dla białka docelowego. Porównaj poziomy ekspresji białka docelowego między grupą kontrolną a grupą nokautową za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Rysunek 3A,3B.
    2. W przypadku genów docelowych, których produkt genu ulega ekspresji wewnątrzkomórkowej, należy lizować około 3 x 106 milionów komórek na grupę przesiewową w buforze do lizy i postępować zgodnie ze standardowymi protokołami dla SDS-PAGE i western blotting. Alternatywnie, powierzchniowa lub wewnątrzkomórkowa cytometria przepływowa może być użyta do sondowania docelowego białka.

5. Monitorowanie efektów niezamierzonych za pomocą iGUIDE - Przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie i analiza DNA

UWAGA: Technika iGUIDE pozwala na wykrywanie lokalizacji rozszczepienia kierowanego Cas9 i ilościowe określenie rozkładu tych dwuniciowych pęknięć DNA.

  1. Wykonaj iGUIDE zgodnie z opisem Nobles et al.21. Niecelowe efekty locus TRAC ukierunkowane na sgRNA przy użyciu techniki iGUIDE zostały pokazane w Stadtmauer i in., 202013.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisujemy tutaj protokół inżynierii genetycznej limfocytów T, który może być wykorzystany do generowania zarówno autologicznych, jak i allogenicznych komórek CAR-T, a także limfocytów T z przekierowanym receptorem TCR.

Rysunek 1 przedstawia szczegółowy opis etapów zaangażowanych w proces wytwarzania limfocytów T edytowanych za pomocą CRISPR. Proces rozpoczyna się od zaprojektowania sgRNA dla genu docelowego. Po zaprojektowaniu i syntezie sgRNA są one wykorzystywan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy podejścia do edycji genów komórek CAR-T przy użyciu technologii CRISPR Cas9 i wytwarzania produktów w celu dalszego testowania funkcji i skuteczności. Powyższy protokół został zoptymalizowany pod kątem przeprowadzania edycji genu CRIPSR w pierwotnych ludzkich limfocytach T w połączeniu z inżynierią limfocytów T z chimerycznymi receptorami antygenowymi. Protokół ten pozwala na wysoką skuteczność nokautu przy minimalnej zmienności między dawcami. Modyfikacja za pomocą CRISPR może poprawić zarówno sk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Doceniamy Human Immunology Core za dostarczanie normalnych limfocytów T dawcy oraz Flow Cytometry Core na University of Pennsylvania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednostka podstawowa 4D-NucleofactorLonzaAAF-1002B
4D-Nucleofactor X-UnitLonzaAAF-1002X
Accuprime Pfx SupermixThermoFisher12344040
Ultrawirówka Beckman Optima XPN BeckmanCoulter
Brilliant Violet 605 anty-ludzkie przeciwciało CD3Biolegend317322Klon OKT3
BV711 Anty-ludzki klon PD1BiolegendEH12.2H7
Cas9-Wzmacniacze elektroporacjiIDT1075915
CD3 / CD28 DynabeadsThermoFisher40203D
CD4 + Zestaw do izolacji limfocytów TTechnologie stemCell15062
CD8 + Zestaw do izolacji limfocytów TTechnologie StemCell15063
Filtr/butelka próżniowa Corning 0,45 mikronaCorning430768
Kolba do hodowli komórkowych Corning T150Millipore SigmaCLS430825
DMSOMillipore SigmaD2650
DNAeasyQiagen69504
Magnes DynaMagThermoFisher12321D
SuplementGlutamaxTermoFisher35050061
HEK293T ogniwaATCCCRL-3216
HEPES (1 M)ThermoFisher15630080
huIL-15PeproTech200-15
huIL-7PeproTech200-07
Lipofectamine 2000ThermoFisher11668019
Nucleospin Gel i czyszczenie PCRTakara740609.25
Opti-MEMThermoFisher31985062
P3 Komórka pierwotna 4D-nukleofactor X Kit LLonzaV4XP-3024
Penicylina-Streptomycyna-GlutaminaThermoFisher10378016
ekspresja pTRPE Plazmidw domu
Królik Anti-Mouse FMC63 scFv Przeciwciało monoklonalne, (R19M), PECytoArt200105
RPMI1640ThermoFisher12633012
sgRNA IDT
Spy Fi Cas9Aldevron9214
Probówki do ultrawirówekBeckman Coulter326823
Wirusowa mieszanka opakowaniowawe własnym zakresie
X-Vivo-15 MediaLonzaBE02-060F
Zestaw do krwi i tkanek

Bibliografia

  1. Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
  2. Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
  3. Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
  4. Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
  5. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  6. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139(2015).
  8. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  9. Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
  10. Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
  11. Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
  12. Beatty, G. L., O'Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
  13. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  14. MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
  15. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  16. Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
  17. Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  21. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471(2013).
  22. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
  23. Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
  24. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  25. Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
  26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

In ynieria CRISPRedycja gen waktywacja limfocyt w Ttransdukcja lentiwirusemcytometria przep ywowaprojektowanie gRNAnukleaza Cas9walidacja knockoututesty cytotoksyczno ci
Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.