Artykuł metodologiczny

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62306

⸱

17 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Paul Scherrer Institut, 3Central Laser Facility, Science and Technologies Facilities Council, Harwell Science and Innovation Campus, 4Rosalind Franklin Institute, Harwell Science and Innovation Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Streszczenie

Montaż mikrokryształów (<10 μm) do kriokrystalografii monokryształów stanowi nietrywialne wyzwanie. Poprawę jakości danych zaobserwowano dla mikrokryształów wraz z rozwojem optyki linii badawczej, stabilnością wiązki i zmiennym ogniskowaniem wiązki o zmiennej wielkości od submikronów do mikronów, na przykład na linii badawczej VMXm w Diamond Light Source1. Dalsza poprawa jakości danych zostanie osiągnięta dzięki ulepszeniom środowiska próbek i ich przygotowania. Mikrokryształy z natury generują słabszą dyfrakcję, dlatego poprawa stosunku sygnału do szumu jest kluczem do gromadzenia wysokiej jakości danych dyfrakcji rentgenowskiej i będzie pochodzić głównie z redukcji szumu tła. Głównymi źródłami promieniowania rentgenowskiego w tle w eksperymencie dyfrakcyjnym są ich interakcja ze ścieżką powietrza przed i po próbce, nadmiar roztworu krystalizacyjnego otaczającego próbkę, obecność krystalicznego lodu i rozproszenie z jakiegokolwiek innego oprzyrządowania linii badawczej lub okien rentgenowskich. Linia badawcza VMXm składa się z oprzyrządowania i protokołu przygotowania próbki w celu zredukowania wszystkich tych źródeł hałasu.

Po pierwsze, środowisko próbki w próżni w VMXm usuwa ścieżkę powietrza między źródłem promieniowania rentgenowskiego a próbką. Następnie, protokoły przygotowania próbek do krystalografii makromolekularnej w VMXm wykorzystują szereg procesów i narzędzi zaadaptowanych z cryoTEM. Należą do nich miedziane ruszty z dziurawymi foliami węglowymi, zautomatyzowane bibułki i robotyka do chłodzenia wgłębnego wykorzystująca ciekły etan. Narzędzia te umożliwiają przygotowanie setek mikrokryształów na pojedynczej siatce cryoTEM z minimalną ilością otaczającej cieczy na podłożu o niskim poziomie hałasu. Minimalizują również tworzenie się krystalicznego lodu z pozostałej cieczy otaczającej kryształy.
Przedstawiono proces przygotowania i oceny jakości rozpuszczalnych mikrokryształów białek z wykorzystaniem światła widzialnego i skaningowej mikroskopii elektronowej przed zamontowaniem próbek na linii badawczej VMXm do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Podamy również przykłady próbek dobrej jakości, a także takich, które wymagają dalszej optymalizacji i strategii w tym zakresie.

Wprowadzenie

Główną przeszkodą w określaniu struktur cząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości za pomocą krystalografii makromolekularnej (MX) pozostaje produkcja dobrze dyfrakujących kryształów o odpowiedniej wielkości. Istnieje wiele strategii osiągnięcia tego celu, począwszy od projektowania konstruktów genów rekombinowanych białek, a skończywszy na poszukiwaniach dużych rzadkich matryc w poszukiwaniu koktajli chemicznych, które mogą generować początkowe kryształy2. W tym drugim przypadku często zdarza się, że krystalograf będzie musiał zoptymalizować wszelkie początkowe trafienia, aby uzyskać kryształy o wystarczającej jakości i rozmiarze dyfrakcyjnym do badań nad określaniem struktury3. Pomimo tych opcji, niektóre cząsteczki docelowe mogą nigdy nie wytworzyć dużych (>10 μm), dobrze dyfrakujących kryształów, w wyniku czego krystalograf musi wytrwać w swoich mikrokryształach i wyzwaniach, jakie stanowią takie próbki. Obejmują one odpowiednie mocowanie i krioochronę kryształów, zarządzanie z natury słabszą dyfrakcją i zwiększoną czułością na promieniowanie. Mikrokryształy powstają z mniejszej liczby komórek elementarnych i cząsteczek niż większe kryształy i jako takie dyfrakcja nie jest wzmacniana w takim samym stopniu w porównaniu z większymi kryształami, co skutkuje z natury słabszą intensywnością dyfrakcji. Ważne jest, aby sygnał tła nie maskował tych odbić, szczególnie przy wyższej rozdzielczości, gdzie słaba intensywność odbicia może zostać utracona4. Ponadto mikrokryształy są bardziej wrażliwe na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem i pomimo rejestrowania dyfrakcji w temperaturach ciekłego azotu5, zebranie pełnych danych z pojedynczego kryształu może nie być możliwe, co powoduje konieczność zebrania danych z bardzo dużej liczby kryształów w celu stworzenia jednego kompletnego zestawu danych6.

Rosnąca dostępność rentgenowskich laserów na swobodnych elektronach (XFELs) oraz ewolucja metod krystalografii szeregowej (SFX)7 umożliwiły zbieranie danych z mniejszych mikrokryształów. Są to jednak metody dostarczania próbek na zamówienie, które wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej w zakresie sprzętu i oprogramowania, gdzie eksperymenty są ograniczone do temperatury pokojowej, a zużycie próbki jest zazwyczaj wysokie (setki mikrolitrów) i nadal może wymagać dalszej optymalizacji8. W związku z tym projekty, w których można wykonać tylko ograniczoną ilość mikrokryształów, nie są odpowiednie dla SFX.

Tymczasem, technologia synchrotronowych linii badawczych w ostatnich dziesięcioleciach rozwinęła się w celu wytwarzania mniejszych, bardziej stabilnych wiązek9 z blaskiem, który pozwolił na zbieranie danych z coraz mniejszych kryształów10,11. Linie badawcze z mikroogniskowaniem, takie jak FMX w NSLS-II i I24 w Diamond Light Source, były w stanie określić nowe struktury na podstawie kryształów o maksymalnych wymiarach ~3 μm12 i wykazać zdolność do zbierania użytecznych danych z jeszcze mniejszych kryształów o wymiarach ~1 μm13. Linia badawcza musi być precyzyjnie skonfigurowana, z doskonałymi układami optycznymi o wysokiej rozdzielczości w osi, minimalną sferą zamieszania dla rotacji próbki i precyzyjnie ustawioną osią obrotu, która zbiega się z wiązką promieniowania rentgenowskiego. Ważne jest, aby ściśle dopasować profil wiązki promieniowania rentgenowskiego do objętości kryształu i upewnić się, że kryształ jest precyzyjnie wyrównany w wiązce promieniowania rentgenowskiego - wyzwanie dla kryształów <5 μm14. Spełnienie tych warunków eksperymentalnych na linii badawczej jest niezbędne do zarejestrowania najlepszej jakości danych z mikrokryształów.

Pozostałym i prawdopodobnie najważniejszym aspektem zbierania danych z mikrokryształów jest prezentacja kryształu wiązce promieniowania rentgenowskiego. Mikrokryształy były często montowane na próbkach z mikrosiatki, wykonanych z poliimidu, materiału o niskim rozproszeniu promieniowania rentgenowskiego o aperturach tak małych jak 10 μm15,16. Siatka poliimidowa jest zamontowana na standardowym trzpieniu, który jest osadzony w magnetycznej podstawie SPINE, dzięki czemu jest kompatybilna z większością linii badawczych MX17. Mocowanie siatkowe służy do łowienia kryształów z kropli krystalizacji, często zgodnie z tą samą procedurą, co montaż kryształu 100 μm za pomocą standardowego mocowania pętlowego. Podczas gdy kryształy mogą być rozmieszczone w poprzek siatki, kluczową wadą jest to, że stosunkowo duża objętość płynu może być przenoszona przez siatkę i szpilkę podczas zbioru (Rysunek 1C,D). Ta objętość cieczy, która może być wielokrotnie większa niż same kryształy, przyczyni się do szumu tła po oświetleniu promieniami rentgenowskimi. To rozproszenie tła może być jeszcze silniejsze, jeśli ciecz tworzy krystaliczny lód podczas błyskawicznego chłodzenia, zmniejszając stosunek sygnału do szumu i tak już słabych intensywności w rozdzielczościach dyfrakcji lodu. Dlatego tak ważne jest, aby usunąć nadmiar cieczy z próbki, aby zapewnić zarejestrowanie wszystkich możliwych sygnałów. Wyzwanie to jest jeszcze większe w przypadku kryształów białek błonowych powstających w fazie sześciennej lipidów (LCP), gdzie LCP generuje silne rozproszenie tła i jest również trudne do usunięcia z otoczenia kryształów 18.

Nowa linia badawcza do mikrofokusa (VMXm) w Diamond Light Source zapewnia warunki do zbierania danych z kryształów potencjalnie o rozmiarach mniejszych niż mikron. Linia badawcza została zaprojektowana tak, aby dostarczać profil wiązki o wymiarach 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, goniometr ze sferą rozmycia nie większą niż 60 nm i środowiskiem próbki in vacuo. Te cechy konstrukcyjne stacji końcowej VMXm minimalizują generowanie szumu promieniowania rentgenowskiego tła przez aparaturę linii badawczej podczas zbierania danych z największym pozostałym źródłem tła generowanym przez sample14.

Specyficzne metody przygotowania próbek zaprojektowane dla linii badawczej VMXm dają możliwość zmniejszenia tego tła i dalszej poprawy sygnału do szumu danych dyfrakcyjnych, maksymalizując jakość danych, które mogą być rejestrowane z mikrokryształów o wymiarach <10 μm. Wiele z przedstawionych tutaj wymagań dotyczących dyfrakcji niskiego tła od mikrokryształów jest również wspólnych dla kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryoTEM)19 i dyfrakcji elektronów mikrokrystalicznych (microED)20. W rezultacie wiele narzędzi, które zostały już opracowane do przygotowania próbek cryoTEM, nadaje się, z pewnymi dostosowaniami, do przygotowania mikrokryształów. Podczas przygotowywania próbek do krioTEM pojedynczych cząstek, badane cząstki są osadzone w bardzo cienkich warstwach (zwykle <100 nm) lodu szklistego, tak że elektrony są w stanie przechodzić przez próbkę. Cienką, jednolitą warstwę uzyskuje się poprzez usunięcie nadmiaru cieczy, a zeszklenie próbki uzyskuje się poprzez szybkie schłodzenie próbki (~104 K s-1)21 poprzez zanurzenie w ciekłym etanie utrzymywanym w temperaturze ~93 K22. W przeciwieństwie do tego, ciekły azot, stosowany rutynowo do przygotowania próbek MX, jest mniej wydajnym kriogenem niż etan i ma większą skłonność do tworzenia się krystalicznego lodu w próbce21. Powstawanie krystalicznego lodu, który może degradować dyfrakcję i generować szum tła, jest zwykle łagodzone poprzez stosowanie związków krioochronnych23. Polimery o niskiej masie cząsteczkowej, takie jak glikol polietylenowy (PEG) 400 i metylo-2,4-pentanodiol (MPD), cukry, oleje lub nasycone sole można dodać do podwielokrotności roztworu krystalizacyjnego w niskich stężeniach24- nie ma jednego uniwersalnego rozwiązania w zakresie wyboru najbardziej odpowiedniego krioprotektantu, co często wymaga optymalizacji25. Kryształ jest również poddawany wielu manipulacjom podczas procesu zbierania i krioochrony, co może skutkować uszkodzeniem kryształu, możliwość wykorzystania ciekłego etanu pozwala na pominięcie tego kroku i pomaga chronić integralność kryształu.

Podczas gdy ciekły etan jest skutecznym kriogenem dla mikrokryształów (<10 μm) ze względu na cienkość próbki, istnieją alternatywne metody zapobiegania tworzeniu się krystalicznego lodu, szczególnie w większych kryształach, w tym zmniejszenie zawartości wody w krysztale za pomocą ściśle kontrolowanego wilgotnego środowiska26, lub poprzez odprowadzanie nadmiaru cieczy zarówno z pętli, jak i powierzchni kryształu27, jednak ponownie wymagają one większej manipulacji próbką. Zastosowanie automatycznego blottingu i zamrażania wgłębnego ciekłym etanem, podobnie jak w cryoTEM, razem usuwa nadmiar roztworu krystalizacyjnego i zapewnia środki do kontrolowanego chłodzenia mikrokryształów, jednocześnie starając się zminimalizować manipulację.

Tutaj prezentujemy protokół, który może być wykorzystany nie tylko zarówno przez użytkowników linii VMXm, jak i na innych liniach mikrofokusowych do zbierania danych dyfrakcyjnych o wysokim poziomie sygnału do szumu, ale może być również przydatny dla osób przygotowujących rozpuszczalne kryształy białek i próbki kryształów białek błonowych na bazie detergentu do eksperymentów z mikroED. Podczas gdy wszystkie urządzenia do przygotowywania i oceny próbek są dostępne w VMXm, wiele laboratoriów biologii strukturalnej jest coraz częściej wyposażonych w sprzęt do przygotowywania próbek cryoTEM. W związku z tym przewidujemy, że niektórzy użytkownicy mogą chcieć skorzystać z własnych urządzeń do przygotowania swoich próbek do czasu badawczego w VMXm.

Protokół

1. Konfiguracja sprzętu

UWAGA: Opisane tutaj metody wykorzystują narzędzie do zamrażania wgłębnego z pojedynczym ramieniem do bibuły. Niektóre instrumenty są wyposażone w dwa ramiona do bibuły i zalecamy użytkownikowi zapoznanie się z instrukcjami producenta dotyczącymi regulacji instrumentu, tak aby używane było tylko jedno ramię do bibuły.

  1. Upewnij się, że mikroskop świetlny znajduje się w pobliżu przyrządu do zamrażania wgłębnego, najlepiej tak, aby zarówno mikroskop, jak i zamrażarka wgłębna były łatwo dostępne dla użytkownika.
  2. Ustaw i schłodzić automatyczną zamrażarkę wgłębną zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Temperaturę w komorze próbki należy ustawić na temperaturę, w której rosły kryształy. Nie umieszczaj bibuły w komorze na próbki.
    UWAGA: Ciekły etan jest wysoce łatwopalnym materiałem wybuchowym i może być używany wyłącznie w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, z dala od potencjalnych źródeł iskier.
  3. Odpowiednio oznacz pudełka siatkowe i schłodź je w małym dewarze przy użyciu ciekłego azotu.
  4. Ostrożnie umieść siatki, stroną z folią węglową do góry, na odpowiednim nośniku do wyładowania jarzeniowego (takim jak szklane szkiełko mikroskopowe owinięte parafilmem).
  5. Kratki cryoTEM z jarzeniowym wyładowaniem przez 25 s przy 0,39 mBar, przy użyciu prądu 15 mA. Wyładowanie jarzeniowe tuż przed użyciem kratek. Trzymaj rozładowane blaszki na przykrytej szalce Petriego, aż będą gotowe; Jeśli po wyładowaniu jarzeniowym upłynie 30 minut, powtórz rozładowywanie blasku.
    UWAGA: Gdy zamrażarka wgłębna jest gotowa, a kratki przygotowane, uwaga może zwrócić się na próbkę.

2. Określanie początkowych parametrów blottingu

  1. Ustaw wilgotność względną w komorze na próbkę na 90%, a czas osuszania na 5 s i upewnij się, że zamrażarka wgłębna jest ustawiona na automatyczne zanurzanie próbki po zakończeniu osuszania.
    UWAGA: Te parametry początkowe są najbardziej odpowiednie dla zamrażarki wgłębnej Leica GP, inne parametry, takie jak siła krzepnięcia, są dostępne w FEI Vitrobot. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że integralność kryształów jest bardziej prawdopodobna do utrzymania przy użyciu jednego ramienia bibuły.
  2. Aby móc uszczelnić tackę krystalizacyjną po otwarciu interesującej nas studni, odetnij mały pasek taśmy i złóż na jednym końcu, aby utworzyć zakładkę ułatwiającą otwieranie uszczelki i ostrożnie odłóż na bok.
  3. Rozciąć uszczelkę nad studnią krystalizacji, łącznie ze zbiornikiem. Działając szybko, nałóż 2-5 μl roztworu zbiornika na kroplę zawierającą kryształ, aby utrzymać objętość cieczy w kropli.
  4. Użyj wypustki taśmy, aby następnie ponownie uszczelnić studzienkę i upewnić się, że kropla krystalizacji nie wyschnie.
  5. Trzymając przez chwilę otwartą taśmę nad studzienką krystalizacji, przenieś 10 μl roztworu zbiornika do probówki o pojemności 0,5 ml w celu wykorzystania w późniejszych krokach.
  6. Ponownie uszczelnij studnię.
  7. Umieść kawałek wstępnie przyciętej bibuły na ramieniu bibuły wgłębnego zamrażarki wgłębnej.
  8. Umieść pojedynczą jarzeniową siatkę wyładowczą w kleszczach do zamrażania wgłębnego i załaduj do instrumentu tak, aby strona z włókna węglowego była skierowana od ramienia bibuły.
  9. Upewnij się, że wilgotność względna w komorze bibuły wynosi 90%.
  10. Obróć kleszcze tak, aby strona z folii węglowej była skierowana w stronę ramienia bibuły.
  11. Za pomocą pipety o pojemności 2,5 μl nanieść 2 μl roztworu zbiornika z probówki o pojemności 0,5 ml na niepodpartą (błyszczącą miedź) stronę siatki cryoTEM.
  12. Obróć siatkę tak, aby strona podporowa z włókna węglowego była skierowana w stronę przeciwną do ramienia bibułki i powtórz proces, ostrożnie nakładając płyn na stronę nośną siatki z folii węglowej. Unikaj dotykania filmu węglowego końcówką pipety, aby nie uszkodzić filmu węglowego. Ciecz powinna rozprzestrzenić się po siatce z powodu ładunku osadzonego podczas rozładowywania żarzenia.
  13. Zainicjuj proces bibuły, obserwując siatkę. W tym celu w Leica GP2 dostępna jest luneta obserwacyjna.
  14. Obserwuj, czy w tym czasie ciecz jest pobierana z powierzchni węgla siatki, zaczyna się to od spłaszczenia większości bolusa cieczy na siatce, gdy ciecz jest przesiąknięta przez siatkę. W miarę dalszego zmniejszania się ilości cieczy w każdym kwadracie siatki, można zaobserwować falę "wyskakując" na powierzchni siatki. Jeśli ten efekt zostanie zaobserwowany, blotting można zatrzymać w ciągu 2-3 s od zakończenia efektu trzaskania. Nie ma potrzeby zanurzania siatki testowej, którą można wyrzucić.
  15. Jeśli nie zaobserwuje się tak zwanego efektu "trzaskania", powtórz kroki 2.11-2.14, za każdym razem wydłużając czas blottingu o 1-2 s, aż efekt trzaskania zostanie zaobserwowany tuż przed wycofaniem się ramienia bibułki z siatki. Zwróć uwagę na ten czas dla kroku 3.
    UWAGA: Ważne jest, aby blotting ustał natychmiast po wystąpieniu tego efektu pękania, aby zapewnić, że podczas tego procesu kryształy nie ulegną odwodnieniu z powodu nadmiernego blottingu. Roztwór krystalizacyjny ze zbiornika należy stosować do osuszania wstecznego i rozcieńczania próbki, ponieważ zapewnia to, że kryształy podlegają spójnemu roztworowi, zmniejszając ryzyko destabilizacji kryształów.

3. Zbieranie kryształów

  1. Umieść płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem świetlnym i dobrze ustaw cel w polu view.
  2. Umieść świeżą, rozżarzoną siatkę w kleszczach zamrażarki wgłębnej i zamontuj kleszcze w zamrażarce wgłębnej, stroną z folią węglową skierowaną od ramienia bibuły.
  3. Obróć kleszcze tak, aby strona z folii węglowej była skierowana w stronę ramienia bibuły.
  4. Za pomocą pipety o pojemności 2,5 μl nanieść 2 μl roztworu zbiornika z probówki o pojemności 0,5 ml na nienośną stronę siatki cryoTEM i obrócić siatkę tak, aby strona nośna z filmu węglowego była skierowana w stronę portu próbki zamrażarki wgłębnej.
  5. Zdejmij tymczasowe uszczelnienie i przy pipecie ustawionej na 2 μl delikatnie zasysaj kilkakrotnie kroplę krystalizacji, aby zawiesić mikrokryształy (ważne jest, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do kropli).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby obserwować ten proces pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że kryształy są uwalniane z dowolnej powierzchni, skóry lub podstawy studzienki. Jeśli kryształy są zablokowane i nie są wyciągane za pomocą aspiracji, do delikatnego usunięcia kryształów można użyć końcówki pipety lub innych narzędzi do krystalizacji, takich jak igła do akupunktury. W zależności od wielkości kryształów i głębi ostrości mikroskopu świetlnego, czasami możliwe jest obejrzenie za pomocą mikroskopu kryształów wchodzących do końcówki pipety.
  6. Przenieść 2 μl zasysanej zawiesiny mikrokrystalicznej do zamrażarki wgłębnej i nanieść całą próbkę na węglową stronę siatki cryoTEM.
  7. Osusz na czas określony w kroku 2 i natychmiast rozpocznij zamrażanie wgłębne. Podczas osuszania obserwuj, czy występuje efekt pękającej fali w poprzek siatki i zanotuj, czy wystąpił on całkowicie w poprzek siatki. Obecność kryształów może wpływać na początkowy czas blottingu, który może wymagać dostosowania dla kolejnych siatek o 1-2 s.
  8. Pracując szybko, przenieś siatkę z ciekłego etanu do skrzynki siatkowej zanurzonej w ciekłym azocie. Resztkowy etan może przekształcić się w nieprzezroczyste białe ciało stałe na siatce, gdy dostanie się do ciekłego azotu. Aby to zmniejszyć, należy stopniowo usuwać siatkę z ciekłego etanu, a następnie szybko przenieść do zbiornika ciekłego azotu.
  9. Po umieszczeniu 4 siatek w skrzynce siatkowej, zabezpiecz pokrywę pudełka śrubą i przenieś ją do pianki dewara z ciekłym azotem, aby umożliwić dalszą ocenę próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) lub do dewara do przechowywania ciekłego azotu przy użyciu odpowiedniego pojemnika do przechowywania.

4. Ocena gęstości próbki za pomocą mikroskopii świetlnej

UWAGA: Ta metoda jest destrukcyjna. Jeśli dostępność próbki jest ograniczona, na przykład tylko jedna lub dwie krople krystalizacji, zaleca się pominięcie tego etapu. Po zamrożeniu próbek wgłębnych (krok 3.7) można ocenić rozkład kryształów w siatce.

  1. Zamontuj suchą siatkę cryoTEM o temperaturze pokojowej w kleszczykach do zamrażarek wgłębnych i umieść kleszcze na boku na mikroskopie świetlnym, tak aby siatka znajdowała się w polu view. Ustaw odpowiednie powiększenie i ostrość, aby można było rozdzielić całą siatkę i poszczególne kwadraty siatki.
  2. Wykonaj kroki 3.1-3.7.
  3. Zamiast przenosić siatkę do skrzynki rusztowej (krok 3.8), wycofaj zanurzoną siatkę z ciekłego etanu, resetując zamrażarkę wgłębną.
    UWAGA: Siatka i próbka ogrzeją się do temperatury pokojowej i nie mogą być używane do dalszych eksperymentów dyfrakcyjnych.
  4. Usuń kleszcze z przyrządu do zamrażania wgłębnego.
  5. Trzymając siatkę w kleszczach, umieść siatkę pod mikroskopem świetlnym - ostrość będzie już z grubsza ustawiona.
  6. Wykonaj dokładne ustawianie ostrości i oceń gęstość kryształów w całej siatce. Dobra siatka będzie zawierała kilka izolowanych kryształów z dala od prętów siatki w każdym kwadracie siatki, a zbijanie się kryształów jest minimalne.
  7. W przypadku, gdy gęstość kryształów w siatce powoduje zlepianie się kryształów z zaledwie kilkoma izolowanymi kryształami, należy dodatkowo rozcieńczyć zawiesinę kryształów roztworem zbiornika i powtórzyć krok 3. Podczas rozcieńczania próbek należy zachować ostrożność, aby rozcieńczenie nie spowodowało rozpuszczenia kryształów.
  8. Rozcieńczać kryształy stopniowo, używając małych objętości 0,5-1 μl.

5. Ocena próbki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

UWAGA: Przygotowanie mikrokryształów na siatkach cryoTEM najlepiej oceniać za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w warunkach kriogenicznych, można to osiągnąć za pomocą SEM wyposażonego w krio-stolik. W VMXm wykorzystywane są JEOL JSM-IT100 SEM (źródło wolframu) ze śluzą powietrzną Quorum PP3006 i kriostopniem. Aby zapewnić minimalne uszkodzenia spowodowane promieniowaniem podczas przeglądania próbek na VMXm28,29, stosuje się następujące ustawienia: napięcie przyspieszające 5 kV; wielkość plamki 40 (dowolne jednostki na JEOL JSM-IT100); Odległość robocza 10 mm. Obrazy są rejestrowane za pomocą wtórnego detektora elektronów, do wyrównania i ogniskowania próbki stosuje się czas przebywania 0,8 μs, podczas gdy obrazy monokryształów o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane przy użyciu czasu przebywania 16 μs. Ważne jest, aby przed załadowaniem próbki do SEM mikroskop był ustawiony zgodnie z instrukcjami producenta. Zaleca się, aby do SEM ładowana była tylko jedna siatka, podczas gdy wszelkie pozostałe siatki przygotowane o tych samych parametrach są zarezerwowane do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej.

  1. Przygotować SEM, schładzając kriostolik próbki do temperatury -180 °C zgodnie z instrukcją producenta. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi ładowania siatek cryoTEM do konkretnego dostępnego systemu.
  2. Po załadowaniu próbki do SEM włącz wiązkę elektronów, wyrównaj próbkę i ustaw ostrość za pomocą dużego powiększenia (czas przebywania 0,8 μs).
  3. Najpierw przeprowadź wstępną ocenę, mając na uwadze całą siatkę w małym powiększeniu (x45). Nagraj obraz w tym powiększeniu.
  4. Zwiększ powiększenie, aby umożliwić dokładniejsze przyjrzenie się poszczególnym kwadratom siatki, poszczególne kryształy powinny być bardzo wyraźnie widoczne.
  5. Poruszaj się po siatce, robiąc nieruchome obrazy (czas przebywania 16 μs) kryształów, upewniając się, że spełniają następujące wymagania, zanim przejdziesz dalej:
    1. Upewnij się, że kratki są płaskie, a węglowa folia nośna jest w dużej mierze nienaruszona.
    2. Upewnij się, że wokół kryształu znajduje się wiele monokryształów z wąską aureolą zeszklonej cieczy.
    3. Upewnij się, że otwory w węglowej folii nośnej są widoczne.
    4. Upewnij się, że nie ma dużych obszarów zeszklonej cieczy, zgodnie z ciemnym i gładkim wyglądem.
    5. Upewnij się, że lodu sześciokątnego jest mało lub nie ma go wcale, lub lód powierzchniowy jest rozrzucony po siatce.
    6. Upewnij się, że kryształy są równomiernie rozmieszczone na folii nośnej i nie zachodzą na siebie.
  6. W tym momencie dokładnie zmierz wymiary wielu kryształów, aby umożliwić dokładną korelację wielkości wiązki promieniowania rentgenowskiego podczas późniejszych eksperymentów dyfrakcyjnych.
  7. Próbki, które można niezawodnie pobrać z SEM i utrzymywać w temperaturach kriogenicznych, mogą być później wykorzystane do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej. Jeśli nie jest to możliwe, należy zutylizować te próbki.
    UWAGA: Podczas obrazowania zarówno całej siatki, jak i pojedynczych mikrokryształów (odpowiednio powiększenie ok. x45 i x700) należy dokonać oceny, czy należy przejść do linii badawczej z siatkami przygotowanymi przy użyciu tych samych parametrów, czy też niektóre parametry mogą wymagać korekty w kroku 3. Siatki powinny spełniać testy opisane w kroku 5.5. Jeśli siatki nie spełniają tych kryteriów, przed powtórzeniem kroku 5 wymagana jest dalsza optymalizacja w kroku 3.

6. Przygotowanie siatki do eksperymentów dyfrakcyjnych w VMXm

  1. Chłodzić wymaganą liczbę uchwytów na próbki VMXm (Rysunek 4A) (do 5) załadowanych do wkładu z próbką (z pokrywką) za pomocą ładowarki próbek w dużej piance dewara (Rysunek 4B) przy użyciu ciekłego azotu - może to wymagać dużej objętości ciekłego azotu. Poziom ciekłego azotu powinien znajdować się tuż powyżej pozycji próbki w ładowarce próbek.
  2. Przygotuj pierścienie osadcze i narzędzia.
  3. Umieść narzędzia, w tym narzędzie do przycinania, kleszcze i kleszczyki do próbek VMXm, w otworach w ładowarce próbek, aby ostygły. Przydatne może być ustawienie reflektora punktowego nad dewarem.
  4. Szybko przenieś skrzynkę siatkową zawierającą siatki naładowane mikrokryształami do wgłębienia w ładowarce próbek i odkręć pokrywę tak, aby była luźna i obracała się (nie zdejmuj).
  5. Pod ciekłym azotem zdejmij pokrywkę z wkładu z próbką za pomocą dużych kleszczyków i umieść ją pod ładowarką próbek.
  6. Użyj kleszczyków do próbek VMXm, aby podnieść uchwyt próbki na ładowarkę próbek, upewniając się, że uchwyt jest skierowany do góry, aby mógł przyjąć siatkę. W prawidłowej pozycji mały kołek na ładowarce próbek zazębi się z małym otworem pośrodku uchwytu na próbkę.
  7. Za pomocą schłodzonych drobnych kleszczyków ostrożnie wyjmij siatkę z pudełka z siatką i przenieś ją w pobliże otworu siatki w uchwycie na próbkę. Obróć siatkę tak, aby leżała płasko (nie ma znaczenia, w którą stronę skierowana jest strona folii nośnej).
  8. Delikatnie opuść kleszcze tak, aby kratka znajdowała się jak najbliżej otworu kratki (uważaj, aby nie zgiąć siatki) i zwolnij kratkę do otworu. Jeśli siatka nie jest prawidłowo osadzona, ostrożnie użyj cienkich kleszczyków, aby popchnąć siatkę na miejsce lub delikatnie postukaj w uchwyt próbki większymi kleszkami.
  9. Szybko umieść wstępnie schłodzone narzędzie do pierścieni osadczych nad rusztem w otworze kratki i osadzić pierścień osadczy, naciskając przycisk. Pomocne może być zastosowanie 2 wgłębień przycisku, aby upewnić się, że pierścień zabezpieczający jest prawidłowo osadzony.
  10. Uzupełnij ciekły azot tak, aby poziom znajdował się ~1,5 cm powyżej uchwytu próbki. Za pomocą kleszczyków do próbek VMXm ostrożnie podnieś załadowany uchwyt próbki do góry i nad mały kołek na ładowarce próbek i z powrotem do wkładu z próbką. Zanotować numer pozycji uchwytu na próbkę w kartridżu z próbką.
  11. Kontynuuj ładowanie siatek do uchwytów na próbki, aż wszystkie próbki zostaną załadowane.
  12. Zwróć pudełka siatkowe do dewara magazynowego, jeśli próbki pozostają w środku, i wyjmij ładowarkę próbek z dewara, aby zrobić więcej miejsca.
  13. Załóż pokrywę wkładu na wkład, upewniając się, że kołek na górze wkładu zazębia się z otworem w pokrywie.
  14. Ostudzić i napełnić śluzę VMXm dewara ciekłym azotem i umieścić obok pianki dewara zawierającej załadowany wkład próbki.
  15. Używając narzędzia do nabojów VMXm, ostrożnie wsuń narzędzie w grzbiety z boku wkładu i szybko podnieś wkład do śluzy powietrznej Dewara.
  16. Upewnij się, że poziom ciekłego azotu zakrywa wkład.
  17. Umieść pokrywę na śluzie dewara i przejdź do stacji końcowej VMXm z załadowanym wkładem próbki.
    UWAGA: Załadunek kasety z próbką do stacji końcowej VMXm zostanie przeprowadzony przez personel linii badawczej.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest uzyskanie zwitryfikowanych mikrokryształów z minimalną objętością cieczy otaczającej kryształ, co umożliwia przeprowadzenie eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej z minimalnym rozproszeniem tła w celu poprawy sygnału dyfrakcyjnego. Przykładowe obrazy SEM mikrokryształów przygotowanych na siatkach cryoTEM dla minimalnego rozproszenia tła przedstawiono na Rysunku 1A,B oraz Rysunku 2. Siatki z równomiernie rozmieszczonymi pojedynczymi kryształami zapewnią najbardziej efektywne wykorzystanie siatki oraz dobry stosunek sygnału do szumu. Zazwyczaj nie jest to jednak możliwe na całej powierzchni siatki, a w niektórych obszarach mogą występować skupiska (Rysunek 2A,B). Pomimo tych skupisk, przedstawione przykłady wciąż wykazują użyteczną liczbę pojedynczych, izolowanych kryształów, które zapewnią dyfrakcję z niskim tłem (Rysunek 5). Stopień odsączania (blottingu), który wciąż pozwala zachować niskie rozproszenie tła, może być zróżnicowany. Celem jest intensywne odsączanie w taki sposób, aby otwory w węglowej folii wspierającej były wyraźnie widoczne, lecz kryształy pozostały nawodnione (Rysunek 2C,D). Niemniej jednak, siatki wysokiej jakości mogą wciąż wykazywać obecność pewnej ilości cieczy w otworach folii wspierającej, choć położenie otworów powinno pozostać możliwe do zidentyfikowania (Rysunek 2A,B). Co istotne, we wszystkich tych przykładach widoczne są pojedyncze, izolowane kryształy z otaczającym je zwitryfikowanym halo cieczy, co pozwala zachować nawodnienie pomiędzy etapem odsączania a szybkim zamrażaniem (plunge freezing).

Wiele próbek może wymagać dalszej optymalizacji (Rycina 3), co może obejmować zmianę czasu osuszania (blottingu) lub stężenia mikrokryształów. Siatki przeładowane kryształami będą wykazywać obniżoną wydajność osuszania, co może prowadzić do zarejestrowania wielu sieci w pojedynczych obrazach dyfrakcyjnych (Rycina 3A,B). Bardziej lepkie warunki krystalizacji, takie jak w przypadku trypsyny zawierającej 8% PEG 4000 i 15% glikolu etylenowego (Rycina 3C), mogą skutkować koniecznością wydłużenia czasu osuszania (>10 s). Z kolei warunki krystalizacji o bardzo niskiej lepkości, które osuszają się bardzo szybko, mogą wykazywać problemy z rozmieszczeniem kryształów ze względu na grawitację powodującą ich osiadanie przed zakończeniem blottingu, co prowadzi do zgromadzenia się wszystkich mikrokryształów wzdłuż jednej krawędzi siatki (Rycina 3D).

Optymalne przygotowanie próbek pozwala na pełne wykorzystanie możliwości VMXm w celu zebrania wysokiej jakości danych z dyfrakcji rentgenowskiej przy najwyższej możliwej rozdzielczości i wysokim stosunku sygnału do szumu (Rycina 5). Próbki te zyskują dzięki kompatybilności z środowiskiem próbek in-vacuo, co skutkuje bardzo niską lub zerową średnią liczbą zliczeń tła na obrazach dyfrakcyjnych. Zastosowanie ciekłego etanu, bez krioprotektanta, prowadzi do braku pierścieni lodowych (Rycina 5), choć w przypadkach, gdy kryształy znajdują się blisko prętów miedzianej siatki, wiązka rentgenowska może musknąć pręty, co powoduje powstanie pierścieni dyfrakcji proszkowej miedzi przy ~2.1 Å i ~1.8 Å.

Analiza siatki mikroskopowej; obrazy SEM wzorowanych mikrostruktur; szczegóły wzoru powierzchni.
Rycina 1: Porównanie montażu mikrokryształów na podłożach micromesh i siatkach cryoTEM.Mikrografie elektronowe skaningowe błyskawicznie zamrożonych mikrokryształów polihedralnego wirusa o średnicy 2,5 µm (A, B) przy napięciu przyspieszającym 5 kV, rozmiarze plamki 39 (jednostki umowne) i czasie przebywania 16 µs. Siatka jest wolna od nadmiaru cieczy (A), wokół kryształów obserwuje się wąską otoczkę cieczy (B). Te same próbki zamontowane na micromesh (otwory 20 µm) przed szybkim chłodzeniem w ciekłym azocie i obserwowane przy użyciu systemu widoku osiowego w linii wiązki I24 z przodu (C) oraz z boku (D). Zniekształcenia optyczne (C) podczas obserwacji z przodu wskazują na grubość warstwy cieczy na całej powierzchni micromesh, co jest wyraźniejsze podczas obserwacji micromesh z boku (D). Czerwony celownik w C i D reprezentuje pozycję i rozmiar wiązki promieni rentgenowskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy wzrostu nanostruktur na podłożach perforowanych; wyniki badań z zakresu mikrofabrykacji.
Rysunek 2: Przykłady próbek dobrej jakości. Kryształy wielościanowe (A) obserwowane w obrębie jednego pola siatki o rozmiarze ~100 µm. Choć niektóre z kryształów są lekko skupione i wykazują pewną łączność z otaczającym je płynem, występuje szereg odizolowanych pojedynczych kryształów z niewielką otoczką płynu wokół kryształu. Nieco większe kryształy insuliny (B) o wymiarach ~5 x 5 µm również wykazują pewne skupianie, lecz ponownie widoczne są dobrze odizolowane pojedyncze kryształy. Kryształy igiełkowe mogą mieć bardzo niewielkie wymiary i wymagają zastosowania mikrowiązki, jak w przypadku tych igiełkowatych kryształów lizozymu (C). Wokół tych kryształów widoczny jest wąski pas płynu (jasnoszara otoczka). Większe mikrokryształy o rozmiarach do dziesiątek mikronów również mogą być dobrze osadzone na siatkach do cryoTEM, jak te kryształy proteinazy K o rozmiarze ~7 µm (D). Zarówno w przypadku (C) i (D), jak i w mniejszym stopniu w (A), otwory w węglowej folii podporowej są wyraźnie widoczne, co świadczy o obecności bardzo niewielkiej ilości płynu lub jego całkowitym braku. W przykładzie B, mimo że nie zaobserwowano pustych otworów, ich położenie można wciąż zidentyfikować, co wskazuje, że płyn wypełnia jedynie otwory w folii podporowej. We wszystkich tych przykładach wokół krawędzi pola siatki (zaokrąglony wewnętrzny kwadrat) widoczna jest otoczka płynu, gdzie otwory mają jaśniejszy szary wygląd. Jest to typowa cecha dobrze przygotowanych siatek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopu, eksperymentalna konfiguracja mikrokratki, wzrost komórek, analiza mikroskopowa z użyciem elektronów.
Rysunek 3: Przykłady próbek wymagających dalszej optymalizacji.Kratki przeładowane mikrokryształami (A, B) mogą zwiększać rozproszenie tła, ponieważ próbki blokują otwory w folii wspierającej, co zmniejsza wydajność odsączania, a wyższe napięcie powierzchniowe między kryształami sprawia, że pozostaje więcej cieczy. Oprócz pogorszenia stosunku sygnału do szumu, co prowadzi do utraty informacji, prawdopodobne jest zarejestrowanie wielu sieci krystalicznych. Zastosowanie zbyt krótkiego czasu odsączania lub użycie bardzo lepki roztworu krystalizacyjnego może doprowadzić do nadmiernego zawilgocenia próbki (C), co również skutkuje niskim stosunkiem sygnału do szumu. Warunki krystalizacji bez czynników wytrącających, np. w przypadku insuliny wołowej (D), charakteryzują się bardzo niską lepkością. Choć skutkuje to bardzo krótkim czasem odsączania, może to również prowadzić do przemieszczania się kryształów po kratce przed i w trakcie odsączania pod wpływem grawitacji. Zazwyczaj prowadzi to do powstania w dużej mierze pustej kratki z wysoką koncentracją kryształów wzdłuż jednej krawędzi (D). Korzystne może być dodanie środka zwiększającego lepkość, takiego jak glikol etylenowy, do zawiesiny kryształów tuż przed nałożeniem ich na kratkę, aby ograniczyć przepływ kryształów i poprawić ich rozkład. Może to również wydłużyć czas odsączania, co ułatwia obserwację tego procesu.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Urządzenia do równowagi statycznej w układzie spektroskopowym, przedstawiające komponenty i zespół uchwytu próbek.
Rycina 4: Narzędzia do ładowania próbek w VMXm.Zaprojektowano specjalny zestaw narzędzi do ładowania uchwytów próbek VMXm (A). Ładowarka próbek (B) posiada miejsce na pojedynczy uchwyt próbek VMXm, pudełko na kratki oraz miejsce na narzędzia podczas pracy. Została ona również zaprojektowana tak, aby umożliwić pracę tuż poniżej powierzchni ciekłego azotu i pozwolić na umieszczenie wkładu z próbkami pod spodem (B). Sosnowy naczynie Dewar do śluzy (C), które pasuje do azotowej skrzyni śluzy na stacji końcowej VMXm, służy do transportu załadowanego wkładu z próbkami z laboratorium do komory eksperymentalnej linii wiązki. Aby umożliwić oglądanie próbek w trybie offline w SEM, wykonano specjalny transporter (D) składający się z uchwytu próbek VMXm bez podstawy, co pozwala na ocenę w uchwycie stosowanym na linii wiązki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram spektroskopowy z wykresem intensywności pikseli do analizy danych; badanie wzbudzenia optycznego.
Rycina 5: Przykład dyfrakcji z mikrokryształów w VMXm. Pojedynczy obraz dyfrakcyjny zarejestrowany przy użyciu detektora Pilatus 3 6M w VMXm dla wielościennego kryształu wirusa o rozmiarze ~3 µm, osadzonego na siatce cryoTEM metodą szybkiego mrożenia (plunge freezing). Dyfrakcję obserwuje się powyżej 1.7 Å; wstawka przedstawia refleks (niebieski kwadrat) przy 1.74 Å, co demonstruje niskie rozpraszanie tła z dużą liczbą pikseli o zerowej liczbie zliczeń. Do zawiesiny kryształów przed nałożeniem na siatkę dodano glikol etylenowy do stężenia końcowego 50% v/v. Niski poziom tła w pozycji próbki VMXm jest wykazany przez stałe tło w całym obrazie, co obrazują intensywności wykreślone poniżej niebieskiej przerywanej linii, nawet w pobliżu centrum wiązki. Wykreślone intensywności pokazują, że tło pozostaje poniżej 3 zliczeń. Obserwuje się dwa słabe pierścienie przy 2.15 Å i 1.86 Å, które są generowane przez dyfrakcję proszkową miedzi z siatki cryoTEM. Nie stwierdzono obecności pierścieni lodowych, co świadczy o skuteczności blotowania, a następnie chłodzenia w ciekłym etanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób narzędzia do przygotowywania próbek cryoTEM mogą być wykorzystywane do przygotowania mikrokryształów do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej na liniach mikrofokusowych. Standardowe oprzyrządowanie linii badawczej jest skoncentrowane wokół próbki zamontowanej na szpilce i chociaż podjęto wysiłki, aby zapewnić wsparcie próbki na tych mocowaniach dla mikrokryształów, często trudno jest je załadować próbką przy jednoczesnym zapewnieniu najwyższego stosunku sygnału do szumu (rysunek 1C,D). Wiele z tych próbek może również wymagać optymalizacji warunków krioochrony, aby zapewnić, że próbka jest szklista. Metoda zamrażania wgłębnego zapewnia powtarzalny sposób usuwania nadmiaru cieczy i błyskawicznego schładzania próbki w wydajnym kriogenie (rysunek 1A,B). Podczas gdy siatkę można następnie zamontować na standardowej linii badawczej za pomocą mocowania pinowego na bazie pęsety, uchwyty na próbki VMXm zostały specjalnie zaprojektowane do przyjmowania siatek i utrzymywania ich poniżej temperatury zeszklenia w środowisku próżniowym poprzez chłodzenie przewodzące. Środowisko próbkowania VMXm umożliwia zbieranie danych o niskim poziomie tła, gdzie próbka jest pozostałym źródłem tła i zapewnia mikrowiązkę, którą można wykorzystać do dopasowania kryształów o wymiarach mniejszych niż 10 μm. Ta metoda przygotowania próbki może być również stosowana do przygotowania nanokryształów do dyfrakcji elektronów, gdzie wymagane jest również bardzo małe nadmiar cieczy i szklista próbka ze względu na słabą penetrację elektronów. Podczas gdy siatki cryoTEM są delikatne, osoby doświadczone w zbieraniu kryształów w pętlach szybko dostosują się do obchodzenia się z kratkami. Przy niewielkim doświadczeniu niewiele siatek zostanie utraconych podczas etapów osuszania, zamrażania i ładowania protokołu. Kroki optymalizacji mają jednak kluczowe znaczenie dla tego sukcesu, a staranne przygotowanie zmniejszy ryzyko utraty kryształów lub zmniejszenia integralności kryształów.

Siatki CryoTEM zapewniają stosunkowo duży pojedynczy montaż, który może zawierać wiele setek kryształów, poprawiając w ten sposób przepustowość tam, gdzie możliwe jest zarejestrowanie tylko małego klina danych dyfrakcyjnych. Pojedyncza siatka może również dostarczyć wystarczającą ilość kryształów do określenia struktury białka, szczególnie w kryształach o wysokiej symetrii. W przypadku, gdy tylko jedna lub dwie pojedyncze krople krystalizacji wytworzyły mikrokryształy, samo próbne osuszanie warunków krystalizacji może pomóc w zapewnieniu, że podczas osuszania mikrokryształów użyte czasy są jak najbardziej zbliżone do tych, które są potrzebne do wygenerowania początkowych próbek dobrej jakości. Podpory z folii węglowej są niewidoczne dla promieni rentgenowskich i są dostępne z różnymi odstępami między otworami, które można zastosować w celu dopasowania do określonej morfologii. Najczęściej stosujemy folie nośne z otworami 2 μm w odstępach 2 μm, ale mniejsze otwory z większymi odstępami mogą być bardziej odpowiednie dla kryształów mniejszych niż 2 μm. Dostępne są inne folie nośne, takie jak te z otworami 1 μm i odstępem 4 μm, a także folie nośne z otworami o różnych kształtach, z których wszystkie wpływają na czas blottingu. Kwadratowy rozmiar siatki wynoszący 200 (200 kwadratów na cal) zapewnia również wystarczającą przestrzeń (~100 μm) między miedzianymi prętami siatki, aby wiązka promieniowania rentgenowskiego nie oddziaływała silnie z miedzią, zapewniając jednocześnie wystarczające wsparcie strukturalne dla warstwy węglowej obciążonej kryształami. Zastosowanie ciekłego etanu eliminuje potrzebę stosowania krioprotektantów, co z kolei zmniejsza zapotrzebowanie na objętość próbki, która zostałaby wykorzystana do optymalizacji warunków krioprotektantu.

Głównymi parametrami, które należy zoptymalizować podczas procesu, są czas osuszania i rozcieńczenie próbki. Czas osuszania powinien być wystarczająco długi, aby zaobserwować efekt "pękania" na całej siatce przed zamrożeniem zanurzenia. Nadmierne osuszanie może spowodować odwodnienie kryształów, jednak w celu zminimalizowania tego efektu stosuje się kontrolę wilgotności w komorze próbki. Chociaż sugeruje się, że stosuje się wilgotność względną na poziomie 90%, niektóre próbki mogą korzystnie wpłynąć na optymalizację wilgotności. Wilgotność może wpływać na skuteczność bibuły, która może powoli nasycać się wodą. Dodatkowo, kontrola wilgotności w komorze próbki może być wykorzystana do poprawy jakości dyfrakcji kryształów30. Zaleca się wprowadzenie niewielkich zmian (<5%) wilgotności przed sprawdzeniem integralności dyfrakcyjnej, aby upewnić się, że jakość dyfrakcji nie ulega pogorszeniu.

Optymalizację próbek nieszlachetnych można przeprowadzić przy użyciu mikroskopu świetlnego zamiast SEM. Chociaż jest destrukcyjny, jest przydatny do oceny gęstości kryształów w całej siatce i umożliwia podejmowanie decyzji o tym, czy próbka powinna być rozcieńczona, czy zagęszczona, aby lepiej rozproszyć kryształy w siatce. Ten etap jest najbardziej przydatny, gdy dostępna jest duża liczba kryształów i szczególnie wysoce skoncentrowane próbki. Należy unikać zlepiania się kryształów (rysunek 3), ponieważ o ile nie jest to znaczący problem, jeśli dwa kryształy są oświetlone w tym samym czasie podczas zbierania danych6, o tyle prawdopodobnie wokół grudki będzie znajdować się większa objętość cieczy, co zmniejszy stosunek sygnału do szumu (rysunek 5). Podczas gdy możliwe jest obserwowanie dużych nadmiarów cieczy na całym świecie w całej sieci za pomocą mikroskopu świetlnego, ocena objętości cieczy otaczającej mikrokryształy i obecność krystalicznego lodu może być dokonana tylko za pomocą mikroskopu elektronowego wyposażonego w kriogeniczny system transferu próżni i stolik. Czasami, po nałożeniu kryształów na siatkę, a przed wystąpieniem blottingu, kryształy w roztworach o niskiej lepkości mogą osiadać wzdłuż jednej krawędzi siatki. Odkryliśmy, że dodanie do 50% końcowego stężenia glikolu etylenowego może spowolnić ruch kryształów przez kroplę, zapewniając lepszą dystrybucję mikrokryształów w siatce, a także zapewniając większą kontrolę nad blottingiem poprzez wydłużenie czasu blottingu (rysunek 3D).

Niektóre roztwory krystalizacyjne zawierające lepkie środki strącające, takie jak PEG o dużej masie cząsteczkowej, mogą okazać się trudne do osuszenia, wymagając coraz dłuższego czasu osuszania (>10 s). W takich przypadkach pomocne może być zmniejszenie objętości cieczy osadzonej z tyłu siatki, a także objętości roztworu zawierającego kryształy po stronie warstwy nośnej siatki. Strategie takie jak użycie 2 warstw bibuły lub włókien szklanych mogą również pomóc w bibułowaniu w tych trudnych przypadkach31.

Podczas gdy ten rurociąg jest odpowiedni dla rozpuszczalnych kryształów białek, te, które tworzą się w bardzo lepkich podłożach, takich jak białka błonowe w LCP, stanowią inne wyzwanie, do którego ten protokół nie jest odpowiedni. Pojawiają się jednak strategie przygotowania kryształów LCP na siatkach cryoTEM dla mikroED, które obejmują zmniejszenie lepkości próbek poprzez wywołanie zmiany fazy LCP. Pozwala to na nakładanie próbek na siatki w sposób podobny do opisanego w tym artykule. Na koniec próbkę można zmielić za pomocą skupionej wiązki jonów w celu usunięcia nadmiaru materiału niekrystalicznego 32,33,34.

Ogólnie rzecz biorąc, proces ten zajmuje zazwyczaj 1-2 godziny (wliczając czas konfiguracji sprzętu) od momentu przybycia próbki do VMXm do dostarczenia zoptymalizowanych siatek z dobrze zdyspergowanymi, zeszklonymi próbkami, w zależności od dostępności próbki, stężenia kryształów i lepkości roztworu krystalizacyjnego. Metody te zostały już z powodzeniem zastosowane do przygotowania mikrokryształów do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej badających uszkodzenia mikrokryształów spowodowane promieniowaniem, w których niezbędna była minimalna objętość cieczy otaczającej próbkę28,35. Należy zauważyć, że protokół może być stosowany do wszystkich rozpuszczalnych próbek mikrokryształów, a nie tylko do dobrze dyfrakcyjnych próbek, które zostały już zoptymalizowane. Eksperyment krystalizacji, w wyniku którego powstaje materiał mikrokrystaliczny, tradycyjnie byłby celem optymalizacji w celu uzyskania większych kryształów, jednak ta metoda przygotowania próbki i możliwości VMXm mogą pozwolić na zebranie odpowiednich danych z takich próbek bez dalszej optymalizacji. Alternatywnie, jeśli takie próbki mikrokrystaliczne słabo ulegają dyfrakcji, dane zebrane z VMXm przy użyciu tej metody przygotowania próbki mogą nadal służyć jako przydatny przewodnik do dalszej optymalizacji warunków krystalizacji. Narzędzia do przygotowania siatek, w tym wyładowywania jarzeniowego i zamrażania wgłębnego, są obecnie szeroko dostępne w instytutach badawczych wyposażonych w eksperymenty krioTEM i będą dostępne dla wielu użytkowników, umożliwiając im przygotowanie próbek przed czasem badawczym w VMXm.

Oświadczenia

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Jeremy'emu Keownowi, Jonowi Grimesowi, Geoffowi Suttonowi i Dave'owi Stuartowi, STRUBI University of Oxford oraz Rachel Bolton, University of Southampton za uprzejme dostarczenie próbek mikrokrystalicznych do opracowania i demonstracji metod przygotowania próbek dla linii badawczej VMXm, a także za umożliwienie uruchomienia linii badawczej. Autorzy pragną również podziękować iNEXT-Discovery (numer projektu 871037) za możliwość i wsparcie w wydaniu tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zautomatyzowany przyrząd do zamrażania wgłębnego Cryo-EMLeica lub ThermoFisherRóżne
mikroskopy świetlne ze źródłem światłaRóżne
różne ostrza / skalpeleFisher ScientificRóżne
siatki CryoTEM Copper 200 z węglową folią nośną z 2 i mikro; m otworyQuantifoilN1-C16nCu20-50
Skrzynki do przechowywania siatek CryoTEMAgar ScientificAGG3727
ddH2Oniedotyczy nie dotyczy
Dostawa gazu etanowegoniedotyczy Glikol
etylenowy Acros Organics146750010
Szkiełka mikroskopoweFisherBrand12383118
Szklana szalka PetriegoFisherBrand455732
Urządzenie do rozładowywania jarzeniowegoPelco91000S
Laboratoryjna folia do owijania (Parafilm)BemisHS234526B
Duże i małe, drobne kleszczeAgar ScientificRóżne
Dostarczanie ciekłego azotunie dotyczynie
Końcówki do pipetRóżneRóżne
urządzenia do pipetowaniaRóżne
Różne Taśma uszczelniająca do płytek krystalizacyjnych.Wymiary molekularneMD6-01
Mały/średni ciekły azot dewarsSpearlabRóżne
narzędzie do przycinania pierścieni osadczychSprung SubangstromSCT08
Whatmann No.1 wstępnie przycięta bibuła filtracyjnaLeica16706440
dotyczy

Bibliografia

  1. Laundy, D., et al. Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes. Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).
  2. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  3. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).
  4. Holton, J. M., Frankel, K. A. The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set. Acta Crystallographica Section D. 66, Pt 4 393-408 (2010).
  5. Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).
  6. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 10 2652-2666 (2014).
  7. Chapman, H. N. X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules. Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).
  8. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).
  9. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).
  10. Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).
  11. Miller, M., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), 496(2019).
  12. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Crystallographica Section D. 70, Pt 5 1435-1441 (2014).
  13. Ji, X., et al. Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses. Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).
  14. Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. The design of macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 4 261-270 (2011).
  15. MiTeGen. MiTeGen. , Available from: https://www.mitegen.com/product/micromeshes/ (2020).
  16. Guo, G., et al. Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography. IUCrJ. 5, 238-246 (2018).
  17. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  18. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  19. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  20. Nannenga, B. L. MicroED methodology and development. Structural Dynamics. , 1-8 (2020).
  21. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  22. Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. An improved cryogen for plunge freezing. Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).
  23. Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
  24. Pflugrath, J. W. Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).
  25. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta crystallographica Section D. 66, Pt 4 366-373 (2010).
  26. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration. Acta Crystallographica Section D. 62, Pt 9 991-995 (2006).
  27. Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary. Acta Crystallographica Section D. 67, Pt 10 902-906 (2011).
  28. Beale, E. V., et al. Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography. IUCrJ. , 1-9 (2020).
  29. Hattne, J., et al. Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM. Structure. 26 (5), 759-766 (2018).
  30. Sanchez-Weatherby, J., et al. Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines. Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).
  31. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).
  32. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  33. Zhu, L., et al. Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED. Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).
  34. Polovinkin, V., et al. Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures. Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).
  35. Storm, S. L. S., et al. Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals. IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie mikrokryszta wsiatki do CryoTEMmro enie w ciek ej cieczydyfrakcja rentgenowskaosuszanie pr bkiskaningowa mikroskopia elektronowaroztw r krystalizacyjnyciek y azotw glowa folia wspieraj ca
Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.