Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Podsumowanie

Escherichia coli jest główną przyczyną Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Podczas infekcji bakteryjnej główną rolę bakteriobójczą odgrywają reaktywne formy tlenu wytwarzane przez neutrofile. Tutaj przedstawiamy metodę wykrywania reaktywnych form tlenu w neutrofilach w odpowiedzi na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych E. coli.

Streszczenie

Escherichia coli (E. coli) jest najczęstszą bakterią Gram-ujemną powodującą zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych noworodków. Występowanie bakteriemii i przenikanie bakterii przez barierę krew-mózg są niezbędnymi etapami rozwoju zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych E. coli. Reaktywne formy tlenu (ROS) reprezentują główne mechanizmy bakteriobójcze neutrofili w celu zniszczenia zaatakowanych patogenów. W tym protokole zależną od czasu wewnątrzkomórkową produkcję ROS w neutrofilach zakażonych meningitycznymi E. coli określono ilościowo za pomocą fluorescencyjnych sond ROS wykrytych przez czytnik mikropłytek fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym. Metoda ta może być również stosowana do oceny produkcji ROS w komórkach ssaków podczas interakcji patogen-gospodarz.

Wprowadzenie

Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków jest powszechną chorobą zakaźną u dzieci. Escherichia coli (E. coli) z kapsułką K1 jest najczęstszym patogenem Gram-ujemnym powodującym bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, stanowiącym około 80% całkowitej częstości występowania1^,2,3. Pomimo postępów w chemioterapii przeciwbakteryjnej i leczeniu wspomagającym, bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych jest nadal jednym z najbardziej wyniszczających stanów o wysokiej zachorowalności i śmiertelności⁴.

Występowanie bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków zwykle zaczyna się od bakteriemii spowodowanej przedostaniem się bakterii chorobotwórczych do krążenia obwodowego z miejscowych zmian u noworodków, po której następuje przenikanie przez barierę krew-mózg (BBB) do mózgu, co skutkuje zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych⁴. Początek bakteriemii zależy od interakcji między bakteriami a komórkami odpornościowymi gospodarza, w tym neutrofilami i makrofagami itp. Neutrofile, które stanowią ~50-70% białych krwinek, są pierwszą linią obrony przed infekcjami bakteryjnymi^5,6. Podczas inwazji bakterii aktywowane neutrofile są rekrutowane do miejsc infekcji i uwalniają reaktywne formy tlenu (ROS), w tym anion ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru, rodniki hydroksylowe i tlen singletowy⁷. ROS ulegają reakcjom redoks z błoną komórkową, cząsteczkami kwasu nukleinowego i białkami bakterii, co skutkuje uszkodzeniem i śmiercią atakujących bakterii⁸. Mitochondria są głównym miejscem produkcji ROS w komórkach eukariotycznych, a różne oksydazy (np. kompleks oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), system lipooksygenazy, kinaza białkowa C i układ cyklooksygenazy) pośredniczą w produkcji ROS^9,10. Pomiar produkcji RFT w czasie rzeczywistym, reprezentującego główny mechanizm przeciwdrobnoustrojowy w neutrofilach, jest przydatną metodą badania obrony gospodarza podczas interakcji bakteria-gospodarz.

W tym protokole, zależna od czasu produkcja ROS u neutrofili zakażonych meningitycznymi E. coli została określona ilościowo za pomocą fluorescencyjnej sondy ROS DHE, wykrytej przez czytnik mikropłytek fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym. Metoda ta może być również stosowana do oceny produkcji ROS w komórkach innych ssaków podczas interakcji patogen-gospodarz.

Protokół

Krew obwodowa od ochotników zastosowana w tym badaniu została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną pierwszego Szpitala Chińskiego Uniwersytetu Medycznego (#2020-2020-237-2).

1. Przygotowanie odczynników i pożywki hodowlanej

1. Przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek, dodając 8,29 g NH₄Cl, 1 g KHCO₃, 37,2 mg Na₂EDTA do 1 l podwójnie destylowanej wody i dostosować pH do 7,2-7,4. Usuń bakterie przez filtrację za pomocą filtrów 0,22 μm.
2. Przygotować eksperymentalną pożywkę hodowlaną dla neutrofili, dodając 5% płodowej surowicy bydlęcej do pożywki RPMI 1640 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zrównoważyć do temperatury pokojowej.
   UWAGA: Użyj pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej.
3. Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) przez dodanie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄·2H₂O i 0,2 g KH₂PO₄ do 1 l podwójnie destylowanej wody w szklanej kolbie o pojemności 1 l. Dostosuj pH do 7,2-7,4. Autoklawować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.
4. Przygotować roztwór ryfampicyny, rozpuszczając 0,5 g ryfampicyny w proszku w 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania roztworu ryfampicyny o stężeniu 50 mg/ml.
5. Przygotować roztwór agaru LB, dodając 10 g NaCl, 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 15 g proszku agarowego do 1 l podwójnie destylowanej wody i autoklawować mieszaninę. Napełnić szalki Petriego do połowy objętości, wlewając ciepły roztwór agaru LB zawierający 100 μg/ml ryfampicyny. Przechowywać schłodzoną płytę stałą w temperaturze 4 °C.
6. Przygotować bulion z naparu z mózgu i serca (BHI) odpowiedni dla szczepów bakterii, rozpuszczając 37 g proszku BHI w 1 litrze podwójnie destylowanej wody. Dostosuj pH do 7,2 i przeprowadź go w autoklawie.
7. Rozpuść sondę fluorescencyjną dihydroetydydową (DHE) w rozpuszczalniku DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM. Delikatnie wymieszać przed użyciem.
   UWAGA: Natychmiast przesypać roztwór podstawowy do fiolek odpornych na światło. Okres przechowywania roztworu podstawowego wynosi 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie szczepu bakterii E44

UWAGA: E44 to zmutowany szczep meningitycznej E. coli z odpornością na ryfampicynę.

1. Zanurzyć kriokonserwowaną kolonię E44 sterylną końcówką pipety, zaszczepić szczep E44 na płytce agarowej LB zawierającej 100 μg/ml ryfampicyny, rysując linie. Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Dzień przed eksperymentem należy pobrać jedną kolonię E44 z płytki za pomocą sterylnej końcówki pipety i umieścić ją w 5 ml bulionu BHI zawierającego 100 μg/ml ryfampicyny w kolbie o pojemności 50 ml. Inkubować kulturę bakteryjną w temperaturze 37 °C przy 90 obr./min przez 17 godzin w wytrząsarce do inkubacji.

3. Izolacja neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej

1. Pobrać 5 ml próbki krwi od ochotników dożylnie do probówki próżniowej zawierającej EDTA w celu antykoagulacji.
2. Odwirować próbki krwi obwodowej przy 500 x g przez 5 minut. Próbki krwi są dzielone na trzy warstwy przez wirowanie, które od dołu do góry obejmują kolejno warstwę czerwonych krwinek (RBC), warstwę białych krwinek (WBC) i warstwę osocza.
3. Odessać warstwę białych krwinek za pomocą pipety do nowej probówki z 3x buforem do lizy RBC. Dokładnie zmiksuj mieszaninę i umieść w temperaturze pokojowej na 5 minut.
4. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut. Całkowicie odessać supernatant i wyrzucić.
   1. Powtórz procedurę lizy z buforem do lizy RBC 1-2 razy, aż osad zmieni kolor na biały.
5. Przemyć komórki, ponownie zawieszając osad za pomocą 2 ml PBS. Następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut, aby komórki opadły na dno probówki.
6. Oznaczyć neutrofile mikrogranulkami CD16 poprzez ponowne zawieszenie osadu za pomocą 50 μl wstępnie schłodzonego buforu do sortowania komórek magnetycznych. Następnie dokładnie wymieszaj z 50 μl ludzkich mikrogranulek CD16. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 30 min.
   UWAGA: Roztwory powinny być wstępnie schłodzone, aby zapobiec zamykaniu przeciwciał na powierzchni komórki i niespecyficznemu znakowaniu. Większość dorosłych ma około 4 000 do 10 000 białych krwinek na mikrolitr krwi, wśród których neutrofile stanowią około 50-70%. Szacuje się, że całkowita liczba białych krwinek w 5 ml ludzkiej krwi obwodowej wynosi zwykle do 2-5 x 10⁷.
7. Przemyć komórki, dodając 2 ml magnetycznego buforu do sortowania komórek i odwirować w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 10 minut. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 500 μl buforu sortującego.
8. Zamontuj kolumnę magnetyczną i półkę oddzielającą. Przenieść separator na półkę z kolumną magnetyczną i przepłukać kolumnę 3 ml buforu sortującego.
9. Wrzuć zawiesinę komórek do kolumny, aby umożliwić neutrofile oznaczone kulkami magnetycznymi przyczepienie się do kolumny magnetycznej.
10. Zmyj nieoznakowane komórki, dodając 3 ml magnetycznego bufora do sortowania komórek 3 razy, upewniając się, że zbiornik kolumny jest za każdym razem pusty
.
11. Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją w probówce o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml magnetycznego buforu do sortowania komórek do kolumny. Wypchnij komórki oznaczone magnetycznie za pomocą tłoka.
    UWAGA: Aby poprawić czystość neutrofili, etapy sortowania można powtórzyć przy użyciu nowej kolumny.
12. Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut, całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej. Określ liczbę komórek za pomocą licznika komórek i przygotuj komórki do dalszych eksperymentów.

4. Pomiar ROS

1. Odwirować wyizolowane neutrofile przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad i dostosować stężenie komórek do 2 x 10⁶/ml za pomocą pożywki hodowlanej zawierającej sondę fluorescencyjną 5 μM DHE.
2. Inkubować neutrofile w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby załadować sondę DHE, a następnie przydzielić zawiesinę komórek do 96-dołkowej czarnej mikropłytki polistyrenowej z 200 μl na studzienkę.
3. Włącz czytnik mikropłytek i otwórz oprogramowanie wykrywające. Wybierz nieprzezroczysty format płytki 96-dołkowej i określ obszar odczytu.
   1. Ustaw fluorescencję (Ex/Em = 518/605 nm) w trybie kinetycznym co 5 minut przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że potrząsasz płytką przez 3 sekundy przed każdym odczytem.
4. Wyjąć mikropłytkę z inkubatora, dodać wyhodowany E44 (MOI=100) lub 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) (100 ng/ml) do każdej studzienki zawierającej wstępnie załadowane neutrofile z 3 powtórzeniami. Użyj PMA jako kontroli pozytywnej.
5. Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i natychmiast rozpocząć oznaczanie.

Wyniki

Stosując protokół opisany w niniejszym artykule, neutrofile wyizolowano z ludzkiej krwi obwodowej i załadowano sondą fluorescencyjną DHE, aby wykryć zmiany poziomów ROS w odpowiedzi na zakażenie szczepem E44. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne dane obrazujące produkcję ROS wywołaną przez szczep E44, zmierzoną w czasie rzeczywistym za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych. Po dodaniu szczepów E44 przy MOI wynoszącym 100, poziomy ROS wzrosły natychmiastowo i wykazały ciągłą tendencję wzrostową w zależności od czasu (...

Dyskusja

Neutrofile działają jako najobficiej występujący składnik białych krwinek w ludzkim krążeniu krwi. Są ważnymi komórkami efektorowymi we wrodzonym układzie odpornościowym człowieka, który buduje pierwszą linię obrony przed inwazją patogenów¹¹. Wytwarzanie ROS stanowi jeden z głównych mechanizmów bakteriobójczych neutrofili po fagocytozie¹¹. Ostatnie badania wykazały, że struktura przypominająca siatkę uwalniana przez neutrofile zwana zewnątrzkomórkową pułapką neutrofili (NET...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 ml	KIRGEN	KG2611
96-dołkowa płytka	Corning	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
Automatyczny licznik komórek	Bio-rad	508BR03397
Bezpieczeństwo biologiczne Carbinet	Shanghai Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
Napar z serca mózgu	BD	237500
CD16 Mikrogranulki, ludzkie	Miltenyi Biotec	130-045-701
Wirówka	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
Kolumny	Miltenyi Biotec	130-042-401
Dihydroethidium (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
Surowica bydlęca	płodu Cellmax	SA211.02
Inkubator	Heraeus	Hera Cell
Bufor separacyjny MACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Czytnik mikropłytek	Urządzenia molekularne	SpectraMax M5
Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
Jednostka separacji QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640 medium	Sangon Biotech	E600027-0500
Shaker termostatyczny	Shanghai Zhicheng	ZWY-100D
Trypton	OXOID	LP0042
Ekstrakt drożdżowy	OXOID	LP0021