Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie całkowitej zawartości lipidów i klas lipidów w próbkach morskich

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62315

⸱

11 grudnia 2021

 , 
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół służy do oznaczania lipidów w wodzie morskiej i próbkach biologicznych. Lipidy w filtratach ekstrahuje się chloroformem lub mieszaninami chloroformu i metanolu w przypadku ciał stałych. Klasy lipidów mierzy się za pomocą pręcikowej chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, a ich suma daje całkowitą zawartość lipidów.

Streszczenie

Lipidy składają się głównie z węgla i wodoru, a zatem dostarczają większej energii właściwej niż inne organiczne makrocząsteczki w morzu. Są bogate w węgiel i wodór, są również hydrofobowe i mogą działać jako rozpuszczalnik i nośnik absorpcyjny dla zanieczyszczeń organicznych, a tym samym mogą być czynnikami napędzającymi bioakumulację zanieczyszczeń w ekosystemach morskich. Ich hydrofobowy charakter ułatwia ich izolację od wody morskiej lub próbek biologicznych: analiza lipidów morskich rozpoczyna się od pobrania próbek, a następnie ekstrakcji w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, co zapewnia wygodną metodę ich oddzielenia od innych substancji w matrycy wodnej.

Jeśli pobrano próbki wody morskiej, pierwszym krokiem zazwyczaj jest rozdzielenie na operacyjnie zdefiniowane frakcje 'rozpuszczone' i 'cząstkowe' poprzez filtrację. Próbki są pobierane, a lipidy izolowane z matrycy próbki, zazwyczaj za pomocą chloroformu dla prawdziwie rozpuszczonej masy i koloidów oraz za pomocą mieszanin chloroformu i metanolu dla ciał stałych i próbek biologicznych. Takie ekstrakty mogą zawierać kilka klas ze źródeł biogennych i antropogenicznych. W tym czasie można określić całkowite lipidy i klasy lipidów. Całkowita zawartość lipidów może być mierzona przez sumowanie indywidualnie określonych klas lipidów, które zwyczajowo były rozdzielane chromatograficznie. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (FID) jest regularnie stosowana do analizy ilościowej lipidów z próbek morskich. TLC-FID dostarcza informacji o synoptycznej klasie lipidów oraz, poprzez zsumowanie klas, całkowitego pomiaru lipidów.

Informacje o klasach lipidów są szczególnie przydatne w połączeniu z pomiarami poszczególnych składników, np. kwasów tłuszczowych i/lub steroli, po ich uwolnieniu z ekstraktów lipidowych. Szeroka gama struktur i funkcji lipidów sprawia, że są one szeroko stosowane w badaniach ekologicznych i biogeochemicznych oceniających stan ekosystemów i stopień wpływu oddziaływań antropogenicznych. Zostały one wykorzystane do pomiaru substancji mających wartość dietetyczną dla fauny morskiej (np. pasz dla akwakultury i/lub zdobyczy) oraz jako wskaźnik jakości wody (np. węglowodory).

Wprowadzenie

Opisane tutaj metody dotyczą substancji, które są funkcjonalnie zdefiniowane jako lipidy morskie. Definicja ta opiera się na ich podatności na ekstrakcję ciecz-ciecz w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych i zapewnia wygodną metodę ich oddzielania od innych substancji w matrycy wodnej. Ich hydrofobowy charakter ułatwia ich izolację od wody morskiej lub próbek biologicznych, a także ich wzbogacanie oraz usuwanie soli i białek.

Pomiar zawartości lipidów i ich składu w organizmach morskich od dziesięcioleci cieszy się dużym zainteresowaniem w ekologii sieci pokarmowej, żywieniu w akwakulturze i nauce o żywności. Lipidy są uniwersalnymi składnikami organizmów żywych, działającymi jako niezbędne cząsteczki w błonach komórkowych, jako główne źródła biodostępnej energii, zapewniając izolację termiczną i wyporność oraz służąc jako cząsteczki sygnałowe. Chociaż procedury oznaczania lipidów w innych dziedzinach zostały dobrze opisane, ich stosowanie z próbkami morskimi często wymaga modyfikacji w celu dostosowania do warunków terenowych, a także do typu próbki1.

Dla próbek wody morskiej, pierwszym krokiem zazwyczaj jest rozdzielenie na funkcjonalnie zdefiniowane frakcje 'rozpuszczone' i 'cząstkowe', zwykle przez filtrację (Krok 1 Protokołu). Frakcja cząstek stałych jest tym, co jest zatrzymywane przez filtr, a wielkość porów jest ważna przy definiowaniu cut-off2. Często, gdy pobieramy próbki cząstek stałych, chcielibyśmy odnieść stężenia lipidów do całkowitych stężeń masowych, w którym to przypadku w tym celu należy pobrać oddzielną, mniejszą próbkę (np. 10 ml) (krok 1 protokołu, uwaga). Aby uzyskać dokładne określenie masy, ważne jest, aby na końcu filtracji dodać mrówczan amonu (35 g/l).

Filtrat wody morskiej z większej próbki powinien wynosić od 250 ml do 1 litra, w zależności od typu próbki i jest poddawany ekstrakcji ciecz-ciecz w lejku separatora (krok 2 protokołu). Hydrofobowy charakter lipidów oznacza, że można je oddzielić od innych związków przez ekstrakcję w rozpuszczalniku niepolarnym, takim jak chloroform. Powstaje system dwuwarstwowy, w którym lipidy rozdzielają się na warstwę organiczną, podczas gdy składniki rozpuszczalne w wodzie pozostają w warstwie wodnej.

Próbki cząstek stałych na filtrze, lub próbki biologiczne są ekstrahowane za pomocą zmodyfikowanej ekstrakcji Folch et al. 3, również z udziałem chloroformu (Krok 3 protokołu). Ponownie powstaje układ organiczno-wodny, w którym lipidy dzielą się na fazę organiczną, podczas gdy cząsteczki rozpuszczalne w wodzie pozostają w fazie wodnej, a białka są wytrącane. W rzeczywistości, w przypadku ciał stałych, większość laboratoriów stosuje pewną odmianę procedury Folch et al. extraction3 obejmującej chloroform i metanol. W przypadku filtrów pierwszym krokiem jest homogenizacja w 2 ml chloroformu i 1 ml metanolu.

Podczas ekstrakcji należy zachować ostrożność w celu ochrony lipidów przed modyfikacją chemiczną lub enzymatyczną, poprzez przechowywanie próbek i rozpuszczalników na lodzie w celu zmniejszenia hydrolizy wiązań estrowych lub utleniania podwójnego wiązania węgiel-węgiel. Tkanki i lipidy komórkowe są dość dobrze chronione przez naturalne przeciwutleniacze i przez podział na przedziały4; Jednak po homogenizacji próbek zawartość komórek jest łączona, co sprawia, że lipidy są bardziej podatne na zmiany chemiczne lub enzymatyczne. Niektóre lipidy, takie jak większość steroli, są bardzo stabilne, podczas gdy inne, takie jak te zawierające wielonienasycone kwasy tłuszczowe, są bardziej podatne na utlenianie chemiczne. Inne, takie jak sterole ze sprzężonymi wiązaniami podwójnymi, są podatne na utlenianie katalizowane przez light5. Po ekstrakcji lipidy są znacznie bardziej podatne na utlenianie chemiczne, a próbki powinny być przechowywane w gazie obojętnym, takim jak azot. Delikatny strumień azotu byłby również używany do zagęszczania ekstraktów.

Po koncentracji, lipidy byłyby zwykle oznaczane ilościowo w dużych ilościach, ponieważ są ważnym składnikiem ekosystemów morskich, dostarczając wysoką koncentrację energii, ponad dwukrotnie większą niż kJ/g węglowodanów i białek. Niezmiennie byłyby one następnie określane ilościowo jako poszczególne składniki: kompleksowa analiza lipidów zazwyczaj obejmuje podział na prostsze kategorie, zgodnie z ich naturą chemiczną. W związku z tym pełna analiza obejmuje pomiar całkowitej liczby lipidów, klas lipidów i poszczególnych związków.

Całkowita zawartość lipidów może być określona na podstawie sumy indywidualnie zmierzonych klas lipidów oddzielonych metodą chromatografii6. Ekstrakt z lipidów morskich może zawierać kilkanaście klas ze źródeł biogennych i antropogennych. Duża różnorodność struktur lipidowych oznacza, że można uzyskać wiele informacji, określając poszczególne grupy struktur. Klasy lipidów pojedynczo lub w określonych grupach były używane do sygnalizowania obecności pewnych typów organizmów, a także ich stanu fizjologicznego i aktywności2. Są one również wykorzystywane jako wskaźnik pochodzenia materiału organicznego, w tym rozpuszczonej materii organicznej (DOM), a także zanieczyszczeń hydrofobowych.

Triacyloglicerole, fosfolipidy i sterole należą do ważniejszych klas lipidów biogennych. Pierwsze dwa są biochemicznie powiązane, ponieważ posiadają szkielet glicerolu, do którego estryfikowane są dwa lub trzy kwasy tłuszczowe (Rysunek 1). Triacyloglicerole wraz z estrami wosku są bardzo ważnymi substancjami magazynującymi, podczas gdy inne klasy lipidów zawierające kwasy tłuszczowe, takie jak diacyloglicerole, wolne kwasy tłuszczowe i monoacyloglicerole, są na ogół drugorzędnymi składnikami. Wolne kwasy tłuszczowe są obecne w niższych stężeniach w organizmach żywych, ponieważ te nienasycone mogą być toksyczne7. Sterole (zarówno w postaci wolnej, jak i estryfikowanej) oraz alkohole tłuszczowe zaliczane są również do lipidów mniej polarnych, natomiast glikolipidy i fosfolipidy są lipidami polarnymi. Lipidy polarne mają grupę hydrofilową, która pozwala na tworzenie dwuwarstw lipidowych znajdujących się w błonach komórkowych. Wolne sterole są również składnikami strukturalnymi błony, a w stosunku do triacylogliceroli zapewniają stan lub indeks odżywczy (TAG : ST), który jest szeroko stosowany8. W stosunku do fosfolipidów (ST : PL) mogą być używane do wskazania wrażliwości roślin na sól: wyższe wartości utrzymują integralność strukturalną i zmniejszają przepuszczalność błony9. Odwrotność tego stosunku (PL : ST) badano w tkankach małży podczas adaptacji do temperatury10.

Klasy lipidów morskich mogą być rozdzielone za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na prętach pokrytych żelem krzemionkowym (krok 4 protokołu), a następnie wykryte i określone ilościowo przez detekcję płomieniowo-jonizacyjną (FID) w automatycznym skanerze FID. TLC/FID stała się rutynowo stosowana w próbkach morskich, ponieważ szybko dostarcza danych o synoptycznej klasie lipidów z małych próbek, a poprzez sumę wszystkich klas otrzymuje wartość dla całkowitych lipidów. TLC/FID został poddany ocenie zapewnienia jakości (QA) i stwierdzono, że spełnia standardy wymagane do spójnej kalibracji zewnętrznej, niskiej liczby ślepych prób i precyzyjnej analizy powtórzeń11. Współczynniki zmienności (CV) lub względne odchylenia standardowe wynoszą około 10%, a całkowite dane lipidowe skanera FID wynoszą zwykle około 90% danych uzyskanych za pomocą metod grawimetrycznych i innych2. Grawimetria daje wyższe lipidy całkowite, prawdopodobnie dlatego, że skaner FID mierzy tylko związki nielotne, a także w wyniku możliwego włączenia materiału nielipidowego do pomiarów grawimetrycznych.

Informacje dostarczane przez analizę klas lipidów są szczególnie użyteczne w połączeniu z oznaczeniami kwasów tłuszczowych jako pojedynczych jednostek lub steroli, lub tych dwóch w połączeniu. Pierwszym krokiem w kierunku tych analiz jest uwolnienie wszystkich składowych kwasów tłuszczowych wraz ze sterolami w ekstraktach lipidowych (krok 5 protokołu). Duża różnorodność struktur i funkcji lipidów oznacza, że znalazły one szerokie zastosowanie w badaniach ekologicznych i biogeochemicznych oceniających zdrowie ekosystemów oraz stopień, w jakim wpłynęły na nie czynniki antropogeniczne i lądowe. Zostały one wykorzystane do pomiaru biosyntezy substancji mających wartość pokarmową dla fauny morskiej, a także do wskazania jakości próbek wody. Pomiar lipidów w próbkach rdzeni osadów pomaga wykazać wrażliwość osadów na zmiany w użytkowaniu gruntów przez człowieka w pobliżu granicy lądowo-morskiej.

Podstawowym narzędziem do identyfikacji i ilościowego oznaczania poszczególnych związków lipidowych tradycyjnie była chromatografia gazowa (GC) z FID. Jednak przed analizą związki te stają się bardziej lotne w wyniku derywatyzacji. Kwasy tłuszczowe są uwalniane w obecności katalizatora kwasowego (H2SO4) z klas lipidów acylowych (Rysunek 1). W chemii organicznej grupa acylowa (R-C = O) jest zwykle pochodząca z kwasu karboksylowego (R-COOH). Następnie są one ponownie estryfikowane do estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), co zapewnia lepszą separację na kolumnach GC (krok 5 protokołu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Aby wyczyścić szkło, instrumenty i filtry do analizy lipidów, umyj je 3 razy metanolem, a następnie 3 razy przemyj chloroformem, lub podgrzej je do 450°C przez co najmniej 8 godzin.

1. Procedura filtracji dla rozpuszczonych w wodzie morskiej i cząstek stałych lipidów

UWAGA: Konkretna frakcja zainteresowania jest operacyjnie definiowana przez procedurę filtracji. W tym przypadku wielkość porów wynosi 1,2 μm.

  1. Ustaw kolektor filtracyjny bez filtra i przepłucz zestaw przefiltrowaną wodą morską.
  2. Za pomocą czystych kleszczy umieść filtr z włókna szklanego (GF/C) o średnicy 47 mm, który został umyty, w czystym systemie filtracji.
  3. Pobrać próbkę i delikatnie zamieszać, aby ponownie zawiesić materiał, który mógł osiąść na dnie pojemnika zbiorczego. Dokładnie odmierz znaną objętość, w tym przypadku 1 l, i przefiltruj ją przez filtr.
    UWAGA: Objętość będzie zależeć od ilości cząstek stałych w próbce: zwykle od 250 ml do 5 l w zależności od pory roku i lokalizacji.
  4. Po odmierzeniu próbki delikatnie zwilż filtr przefiltrowaną wodą morską. Powoli dodaj całą próbkę do systemu filtracji i przepłucz cylinder miarowy przefiltrowaną wodą morską, aby upewnić się, że wszystkie cząstki zostały dodane do filtra. Przepłucz zestaw przefiltrowaną wodą morską po bokach, aby upewnić się, że wszystkie cząstki zostały spłukane na filtr.
    1. Pozwól, aby cała woda morska przeszła przez filtr, ale nie pozwól, aby filtr całkowicie wyschł, ponieważ może to zakłócić działanie komórek na filtrze; przerwij ssanie, gdy ostatnia woda zniknie.
  5. Za pomocą czystych kleszczyków i czystej pipety złóż filtr na pół, następnie na trzy części, a następnie na pół wzdłuż, aby zwinąć filtr do probówki. Umieść go w czystej, oznakowanej szklanej fiolce o pojemności 10 ml.
  6. Przykryj filtr 2 ml chloroformu. Wypełnij przestrzeń nad głową azotem i uszczelnij taśmą PTFE. Umieścić na stojaku w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Próbki będą stabilne w tej temperaturze do roku.
    UWAGA: Aby powiązać stężenia lipidów ze stężeniami masy całkowitej, potrzebny jest również pomiar suchej masy. Polega to na umieszczeniu wstępnie zważonego filtra o średnicy 24 mm w zestawie do filtracji w suchej masie, wymieszaniu próbki i pobraniu małej podpróbki, która jest filtrowana do małego filtra. Gdy filtr jest prawie suchy, dodaje się do niego około 10 ml 3,5% mrówczanu amonu. Filtr składa się na pół, wkłada z powrotem na oznakowaną szalkę Petriego i umieszcza w zamrażarce.

2. Ekstrakcja ciecz-ciecz wody morskiej lub próbek cieczy

  1. Przygotowanie próbki
    1. Odmierzyć znaną objętość filtratu do cylindra z podziałką z czystego szkła lipidowego. Umieścić tę próbkę w czystym rozdzielaczu o pojemności 1 l. Następnie dodać 20 ml chloroformu do próbki i wstrząsać przez 2 minuty, często odpowietrzając.
  2. Usunięcie pierwszego ekstraktu i dodanie kwasu po pierwszym oddzieleniu
    1. Owiń lejek folią aluminiową i odczekaj 5 do 10 minut, aż nastąpi separacja. Oderwij spód folii, aby zobaczyć dwie warstwy. Zebrać dolną, organiczną warstwę przez kran do czystej kolby z okrągłym dnem, uważając, aby nie dodać żadnej górnej warstwy. Zakryj kolbę okrągłodenną azotem i umieść w zamrażarce.
    2. Dodać 0,25 ml stężonegoH2SO4 na każdy litr próbki do próbki w rozdzielaczu i delikatnie wstrząsnąć lejkiem.
    3. Dodaj 10 ml chloroformu i energicznie wstrząsaj przez 2 minuty, często odpowietrzając. Pozwól, aby nastąpiła separacja.
  3. Druga i trzecia separacja
    1. Poczekaj na rozdzielenie i dodaj dolną warstwę do kolby z okrągłym dnem.
    2. Dodaj trzecie 10 ml chloroformu i potrząsaj przez 2 minuty, ponownie często odpowietrzając. Po rozdzieleniu dodać dolną warstwę do kolby okrągłodennej.
    3. Przenieść ekstrakt z kolby okrągłodennej do wyparki obrotowej, odparować i przenieść do fiolki o pojemności 2 ml.

3. Protokół ekstrakcji ciał stałych (zmodyfikowany Folch et al.3 ekstrakcja)

  1. Setup
    UWAGA: Konfiguracja ekstrakcji wymaga izolowanego pojemnika wypełnionego lodem. Rozpuszczalniki obejmują metanol, wodę ekstrahowaną chloroformem i chloroform 2:1. Wszystkie rozpuszczalniki należy umieścić na lodzie, tak aby były zimne do czasu rozpoczęcia ekstrakcji. Próbki trafiają również na lód, dzięki czemu wszystko pozostaje zimne.
    1. Przepłukać wszystkie rurki i nakrętki wyłożone PTFE 3 razy metanolem, a następnie 3 razy chloroformem. Do każdej ekstrakcji potrzebna jest jedna probówka wirówkowa i jedna fiolka o pojemności 15 ml z nakrętką.
    2. Umieścić próbkę w probówce wirówkowej zawierającej 2 ml chloroformu. Wielkość próbki zależy od ilości obecnego lipidu, preferowanych około 5 do 10 mg lipidów.
  2. Mielenie i ekstrakcja
    1. Dodać około 1 ml lodowatego metanolu i szybko zmielić próbkę na miazgę za pomocą czystego homogenizatora lub pręta z PTFE/metalem.
    2. Umyj pręt z powrotem do probówki około 1 ml lodowatego chloroformu w proporcji 2:1: metanol, a następnie 1/2 ml lodowatej wody ekstrahowanej chloroformem. W razie potrzeby użyj czystego zestawu kleszczyków, aby wtłoczyć cząstki z powrotem do fiolki przed umyciem. Zakryj probówkę i sonikuj mieszaninę przez 4 minuty w łaźni ultradźwiękowej (35 - 42 kHz).
  3. Dwukrotne pipetowanie: Odwirować próbkę przez 2 minuty przy masie 1800 × g. Zbierz całą warstwę organiczną (dolną warstwę) za pomocą techniki podwójnego pipetowania, w której pipeta 5 3/4" z luźno założoną bańką jest delikatnie przepychana przez dwie warstwy, jednocześnie ściskając bańkę, powodując wydostawanie się pęcherzyków.
    1. Po osiągnięciu dna drugiej warstwy użyj kciuka, aby wyjąć bańkę bez wciągania warstwy organicznej do pipety. Umieść pipetę 9" w pipecie 5 3/4" i usuń dolną warstwę przez pipetę 5 3/4".
    2. Umieść ekstrakt w czystej fiolce. Kontynuuj zdejmowanie dolnej warstwy, aż zostanie całkowicie usunięta.
  4. Pipety do mycia: Przepłucz pipetę 9" do fiolki zawierającej warstwę organiczną, używając 1,5 ml lodowatego chloroformu do przepłukania zewnętrznej części pipety i 1,5 ml do przepłukania wnętrza. Delikatnie obróć pipetę podczas mycia i upewnij się, że cały chloroform spływa po pipecie do fiolki.
    1. W ten sam sposób wypłucz pipetę 5 3/4" do probówki zawierającej warstwę wodną.
  5. Sonikować i odwirowywać próbki, a po rozdzieleniu odpipetować je dwukrotnie, za każdym razem używając nowych pipet. Powtórz co najmniej trzy razy i połącz wszystkie warstwy organiczne. Po usunięciu warstwy organicznej po raz trzeci, umyć obie pipety w fiolce zawierającej warstwę organiczną.
  6. Używając delikatnego strumienia azotu, skoncentruj do własnej objętości, a następnie uszczelnij taśmą PTFE i przechowuj w zamrażarce.

4. Opracowywanie systemów i kroków do separacji TLC prętów dla klas lipidów morskich

  1. Przygotowanie prętów do TLC
    1. Trzykrotnie zeskanuj pręty w automatycznym skanerze FID
    2. Wykrywanie próbki: Nałóż próbki i wzorce za pomocą strzykawki na pręty w punkcie początkowym lub tuż pod nim. Dozuj 0,5 μl i przyłóż kroplę do pręta. Pozostaw do wyschnięcia przed umieszczeniem następnej kropli w tym samym miejscu. Znajdź wszystkie próbki w linii na prętach.
    3. Ogniskowanie w acetonie: Próbki należy skupić dwukrotnie (trzy razy, jeśli próbki są bardzo stężone) w 70 ml acetonu. Obserwuj przód rozpuszczalnika, gdy wspina się po pręcie, aż dolna część plamki połączy się z górną. Usuń pręciki, susz je przez około 5 sekund, a następnie powtórz procedurę, aby wytworzyć wąskie pasmo materiału lipidowego w pobliżu dna pręta.
    4. Wysuszyć i kondycjonować pręty w komorze o stałej wilgotności przez 5 minut. Komora o stałej wilgotności to eksykator z nasyconym roztworem chlorku wapnia pod płytką.
  2. Sekwencja prowadząca do pierwszego chromatogramu (węglowodór do ketonu)
    1. Pierwszy system rozwoju: Pierwszym systemem rozwoju jest heksan: eter dietylowy: kwas mrówkowy, 98,95: 1: 0,05. Dodać kwas mrówkowy za pomocą strzykawki, ale najpierw przepłukać strzykawkę 3× kwasem mrówkowym. Natychmiast po tym wypłukać kwas mrówkowy ze strzykawki chloroformem. Użyj 30 ml mieszaniny, aby zwilżyć papier i wypłukać zbiornik. Wylej roztwór płuczący i dodaj pozostałe 70 ml do zbiornika.
      1. Weź stojaki i delikatnie opuść je do zbiornika. Obserwuj, aż czoło rozpuszczalnika dotrze do miejsc próbki, a następnie uruchom stoper. Po 25 minutach wyjąć pręciki z komory wywoływania, wysuszyć w komorze o stałej wilgotności przez 5 minut i ponownie rozwinąć w tym samym roztworze przez kolejne 20 minut.
    2. Suszyć pręty przez 5 minut w automatycznym skanerze FID, a następnie zeskanować do najniższego punktu za pikiem ketonowym, używając skanu PPS 25.
  3. Sekwencja prowadząca do drugiego chromatogramu (triacyloglicerol do diacyloglicerolu):
    1. Kondycjonuj pręty przez 5 minut w komorze o stałej wilgotności.
    2. Drugi system rozwoju: Drugi system rozwoju to heksan: eter dietylowy: kwas mrówkowy, 79:20:1. Dodaj ~30 ml do zbiornika wywoływacza, aby zwilżyć papier i wypłukać zbiornik. Następnie wyrzuć i rozwijaj pręciki przez 40 minut w pozostałych 70 ml. Aby uzyskać najlepszą separację między pikami TAG (nasyconymi) i TAG (wielonienasyconymi), użyj mieszaniny 79,9:20:0,1, ale do separacji pików ST i DAG użyj mieszaniny 79:20:1.
    3. Wysuszyć i zeskanować do najniższego punktu za pikiem diacyloglicerolu w drugim częściowym skanowaniu przy użyciu skanu PPS 11.
  4. Sekwencja prowadząca do trzeciego chromatogramu (aceton-ruchomy polarny lipid i fosfolipid)
    1. Kondycjonuj pręty przez 5 minut w komorze o stałej wilgotności.
    2. Rozwijaj pręty dwa razy przez 15 minut w 70 ml acetonu. Pomiędzy opracowaniami suszyć pręty na powietrzu przez około 30 sekund.
    3. Kondycjonuj pręty przez 5 minut w komorze o stałej wilgotności.
    4. Trzeci system rozwoju: Trzeci system rozwoju to mieszanina chloroformu, metanolu i wody ekstrahowanej chloroformem, 50:40:10. Rozwijaj pręciki dwa razy przez 10 minut w 70 ml mieszanki. Pomiędzy rozwojem suszyć pręty na powietrzu przez około 30 sekund.
    5. Wysuszyć i zeskanować pręty na całej długości.

5. Derywatyzacja FAME za pomocą H2SO4 w MeOH

  1. Wytwarzanie odczynnika Hilditch
    1. Przygotowanie metanolu: Umieścić 100 ml MeOH w czystej kolbie miarowej, a następnie delikatnie rozsypać bezwodnymNaSO4 do momentu przykrycia dna kolby. Po przykryciu odwrócić dwukrotnie, aby cała woda zawarta w metanolu została wchłonięta przez NaSO4. Po odwróceniu i wstrząśnięciu odstaw na co najmniej 5 minut.
    2. Dodawanie kwasu: Powoli zdekantować metanol do szklanego słoika (do tej pory NaSO4 jest twardym grudkiem na dnie kolby) i dodaćH2SO4 . Powoli dodawać 1,5 ml kwasu siarkowego do metanolu za pomocą pipety. Dodawaj po kilka kropli na raz, a gdy cały kwas zostanie dodany, zakręć i delikatnie wymieszaj, aby wymieszać. Rozwiązanie jest teraz gotowe do użycia w przypadku instrumentów pochodnych, ale musi być uzupełniane co tydzień.
  2. Tworzenie instrumentów pochodnych
    1. Przenieść około 200 μg lipidów z fiolki z ekstraktem, której objętość została zwiększona do znanej ilości, do czystej fiolki o pojemności 15 ml i odparować w atmosferze azotu do sucha. Usunięta ilość zostanie określona na podstawie stężenia próbki z TLC/FID. Użyj czystej pipety, aby usunąć próbkę.
    2. Gdy próbka wyschnie, dodaj 1,5 ml dichlorometanu i 3 ml nowo wyprodukowanego odczynnika Hilditcha.
    3. Odwirować próbkę i poddać ją sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 4 minuty, aby usunąć lipidy, które przylgnęły do szklanej fiolki. Napełnij fiolkę azotem, nakrętką i uszczelnij taśmą PTFE i podgrzewaj w temperaturze 100°C przez 1 godzinę.
  3. Zatrzymanie reakcji
    1. Pozostawić próbki do całkowitego ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 10 minut po wyjęciu z pieca, a następnie ostrożnie otworzyć fiolki.
    2. Powoli dodawać około 0,5 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu (9 g/100 ml wody ekstrahowanej chloroformem), a następnie 1,5 ml heksanu. Potrząsnąć lub zawirować fiolkę, a następnie odstawić, aby rozdzieliła się na 2 warstwy.
  4. Zbieranie FAME
    1. Usuwanie wierzchniej warstwy: Po zatrzymaniu derywatyzacji i wyraźnym oddzieleniu, usuń górną, organiczną fazę i umieść w czystej lipidowo fiolce o pojemności 2 ml.
    2. Odparować rozpuszczalnik w fiolce o pojemności 2 ml do sucha i ponownie napełnić ją heksanem do objętości około 0,5 ml.
    3. Napełnij przestrzeń nad fiolką azotem, nakręć i uszczelnij fiolkę taśmą PTFE, poddaj sonikacji przez kolejne 4 minuty w celu ponownego zawieszenia kwasów tłuszczowych, a następnie jest gotowa do przejścia do GC.
      UWAGA: Jeśli wymagane jest stężenie kwasów tłuszczowych, warstwę wodną należy trzykrotnie przemyć heksanem, a wszystkie warstwy organiczne zebrać w fiolce o pojemności 2 ml. Polega to na dodaniu 2 ml heksanu, wirowaniu próbki, odwirowaniu i usunięciu warstwy organicznej, a wszystko to powtórzone 3 razy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Akwakultura, jako najszybciej rozwijający się sektor produkcji żywności, ewoluuje pod kątem innowacji technologicznych i adaptacji w celu sprostania zmieniającym się wymaganiom. Jednym z tych działań jest zmniejszenie zależności od mączki i oleju rybnego pozyskiwanego z naturalnych łowisk, które stanowią składniki pasz dla wielu gatunków hodowlanych. Oleje roślinne lądowe są badane jako zrównoważone i ekonomiczne zamienniki oleju rybnego w paszach dla ryb, a wątroba jest tkanką docelową do analizy, ponieważ jest ona głów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szybkość, z jaką system TLC-FID dostarcza informacji o synoptycznej klasie lipidów z małych próbek, sprawia, że TLC-FID jest skutecznym narzędziem do badań przesiewowych próbek morskich przed podjęciem bardziej skomplikowanych procedur analitycznych. Takie analizy zwykle wymagają uwolnienia związków składowych z ekstraktów lipidowych i derywatyzacji w celu zwiększenia lotności w przypadku chromatografii gazowej. Stwierdzono, że TLC-FID w połączeniu z GC-FID jest potężną kombinacją ekstraktów z owoców morza i innych produ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) grant numer 105379 dla C.C. Parrisha. Sieć Memorial University's Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) pomogła sfinansować tę publikację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki 15 mlVWR66009-560
1-heksadekanolSigma258741-1G
1-monopalmitoilo-rac-glicerolSigmaM1640-1g
Fiolki 2 mlVWR46610-722
Filtry z włókna szklanego 25 mmFisher09 874 32A
2ml żarówki do pipetVWR82024-554
Filtry z włókna szklanego 47 mmFisher09 874 32
5 Pipety 3/4"Fisher1367820A
Pipety 9"Fisher1367820C
AcetonVWRCAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890Agilent
Chlorek wapnia ANHS 500gmVWRCACX0160-1
Nakrętki do fiolek 2 mlVWR46610-712
chloroformVWRCACX1054-1
Palmitynian cholesryluSigmaC6072-1G
Chromarod S5Shell USA3252
DichlorometanVWRCADX0831-1
DL-a-fosfatydylocholina, dipalmotoylSigmaP5911-1g
Eter etylowy, bezwodnik klasy ACS 4LVWRCAEX0190-4
Tripalmitynian gliceroluSigmaT5888-100MG
Strzykawka Hamilton 702SNR 25µ lSigma58381
HeliumAir LiquideA0492781
HexaneVWRCAHX0296-1
Regulator wodoruVWR55850-484
Iatroscan MK6Shell USA
KimwipesFisher066662
Medical AirLiquideA0464563
Średnie rękawice nitryloweFisher191301597C
Rękawice nitrylowe LVWRCA82013-782
RegulatorAir LiquideA0464775
VWR55850-474
NonadecaneSigma74158-1G
Kwas palmitynowySigmaP0500-10G
Dozownik powtarzalnySigma20943
Wodorowęglan sodu 1kgVWRCA97062-460
Siarczan sodu Anhy ACS 500grVWRCA71008-804
Kwas siarkowyVWRCASX1244-5
Taśma teflonowaFisher14610120
tissue master 125 115V z homogenatorem 7mmOMNI InternationalTM125-115
Zbiornik rozwojowy TLCShell USA3201
Wodór UHPAir LiquideA0492788
Repippetter rozpuszczalnika VWRVWR82017-766
Zegar VWR dioda LED 2-kanałowaVWR89140-196
Kolumna Zebron ZB-Wax GCPhenomenex7HM-G013-11
azotu

Bibliografia

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045(2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49(2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024(2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178(2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza lipidów morskichekstrakcja lipidówoznaczanie całkowitej zawartości lipidówchromatografia cienkowarstwowadetekcja przez jonizację płomieniowąekstrakcja chloroformowo-metanolowafiltracja wody morskiejbioakumulacja lipidówekosystemy wodne
Oznaczanie całkowitej zawartości lipidów i klas lipidów w próbkach morskich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.