Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Podsumowanie

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Streszczenie

Okresowa segmentacja mezokremy presomitycznej rozwijającego się zarodka myszy jest kontrolowana przez sieć szlaków sygnałowych. Uważa się, że oscylacje i gradienty sygnalizacyjne kontrolują odpowiednio czas i odstępy tworzenia segmentów. Chociaż zaangażowane szlaki sygnałowe były intensywnie badane w ciągu ostatnich dziesięcioleci, brakowało bezpośrednich dowodów na funkcję oscylacji sygnałowych w kontrolowaniu somitogenezy. Aby umożliwić funkcjonalne badanie dynamiki sygnalizacji, mikrofluidyka jest wcześniej uznanym narzędziem do subtelnej modulacji tej dynamiki. Dzięki temu podejściu opartemu na porywaniu mikrofluidyki, endogenne oscylacje sygnalizacyjne są synchronizowane przez impulsy modulatorów szlaku. Umożliwia to modulację np. okresu oscylacji lub zależności fazowej między dwiema ścieżkami oscylacji. Ponadto można ustalić gradienty przestrzenne modulatorów szlaku wzdłuż tkanki, aby zbadać, w jaki sposób określone zmiany w gradientach sygnałowych wpływają na somitogenezę.

Obecny protokół ma na celu pomóc w ustanowieniu metod mikroprzepływowych dla początkujących użytkowników mikrofluidyki. Opisano podstawowe zasady i sprzęt potrzebny do skonfigurowania systemu mikroprzepływowego, a także dostarczono projekt chipa, za pomocą którego można wygodnie przygotować formę do generowania chipów za pomocą drukarki 3D. Na koniec omówiono sposób hodowli pierwotnej tkanki myszy na chipie mikroprzepływowym i jak porywać oscylacje sygnałowe do zewnętrznych impulsów modulatorów szlaku.

Ten system mikroprzepływowy może być również przystosowany do przechowywania innych systemów modelowych in vivo i in vitro, takich jak gastruloidy i organoidy, do funkcjonalnego badania dynamiki sygnalizacji i gradientów morfogenów w innych kontekstach.

Wprowadzenie

Rozwój jest kontrolowany przez komunikację międzykomórkową za pośrednictwem szlaków sygnałowych. Istnieje tylko ograniczona liczba szlaków sygnałowych, które koordynują złożone tworzenie tkanek i prawidłowe różnicowanie komórek w przestrzeni i czasie. Aby regulować tę mnogość procesów, informacje mogą być zakodowane w dynamice ścieżki sygnałowej, zmianie ścieżki w czasie, takiej jak częstotliwość lub czas trwania sygnału^1,2.

Podczas somitogenezy, tkanka somityczna jest okresowo oddzielana od mezodermy presomitycznej (PSM)³. PSM jest przestrzennie zorganizowany przez gradienty Wnt, czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) i sygnalizacji kwasu retinowego. W przednim PSM na froncie oznaczania, gdzie sygnały Wnt i FGF są niskie, komórki są przygotowywane do różnicowania w somitach. Różnicowanie następuje, gdy fala aktywacji transkrypcyjnej dociera do tego frontu determinacji. W obrębie PSM oscylują sygnalizacje Wnt, FGF i Notch. Sąsiednie komórki oscylują nieznacznie w fazie, co powoduje fale oscylacyjnej aktywacji transkrypcji za szlakami Wnt, FGF i Notch przemieszczającymi się od tylnego do przedniego PSM. W zarodkach myszy fala transkrypcyjna dociera do frontu oznaczania mniej więcej co 2 godziny i inicjuje tworzenie somitów. Badanie somitogenezy poprzez zakłócanie lub aktywowanie szlaków sygnałowych może zilustrować znaczenie tych szlaków^4,5,6,7,8,9. Jednak, aby móc zbadać funkcję dynamiki sygnalizacji w kontroli zachowania komórkowego, konieczne jest subtelne modulowanie szlaków sygnałowych zamiast ich trwałej aktywacji lub hamowania.

Aby czasowo modulować aktywność szlaku sygnałowego w segmentowanym zarodku myszy, Sonnen i in. opracowali system mikroprzepływowy¹⁰. System ten pozwala na ścisłą kontrolę przepływu płynów w mikrokanałach chipa, który zawiera próbkę biologiczną¹¹. Aby zbadać znaczenie dynamiki sygnalizacji dla prawidłowej segmentacji PSM, ta konfiguracja mikrofluidyczna jest wykorzystywana do modulowania dynamiki sygnalizacji mysiego zegara segmentacyjnego ex vivo. Poprzez sekwencyjne pulsowanie aktywatorów lub inhibitorów szlaku do komory hodowlanej, uzyskuje się zewnętrzną kontrolę dynamiki sygnalizacji Wnt, FGF i Notch¹⁰. Na przykład, możliwa jest modyfikacja okresu poszczególnych szlaków i relacji fazowej między wieloma oscylacyjnymi szlakami sygnałowymi. Korzystając z jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym dynamicznych reporterów sygnalizacyjnych, można przeanalizować wpływ porywania na same szlaki, różnicowanie i tworzenie somitów. Korzystając z tego poziomu kontroli nad dynamiką sygnalizacji, podkreślono znaczenie zależności fazowej między szlakami sygnałowymi Wnt i Notch podczas somitogenezy¹⁰.

Spersonalizowane projekty chipów pozwalają na mnóstwo opcji perturbacji czasoprzestrzennych w środowisku lokalnym, np. stabilne tworzenie gradientu^12,13,14,15, aktywacja/hamowanie pulsacji^10,16,17,18 lub zlokalizowane perturbacje^19,20. Mikrofluidyka może również umożliwić bardziej powtarzalny odczyt i wyższą przepustowość dzięki automatyzacji obsługi eksperymentalnej^21,22,23. Obecny protokół ma na celu wprowadzenie mikrofluidyki i porywania endogennych oscylacji sygnalizacyjnych w tkankach do każdego standardowego laboratorium nauk przyrodniczych. Nawet przy braku zaawansowanego sprzętu do generowania chipów, takiego jak pomieszczenia czyste i sprzęt do miękkiej litografii, chipy mikroprzepływowe mogą być produkowane i wykorzystywane do rozwiązywania problemów biologicznych. Formy można projektować za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Formę do generowania chipów mikroprzepływowych, zwykle składającą się z polidimetylosiloksanu (PDMS), można wydrukować za pomocą drukarki 3D lub zamówić w firmach poligraficznych. W ten sposób chipy mikroprzepływowe mogą być produkowane w ciągu jednego dnia bez konieczności stosowania drogiego sprzętu²⁴. W tym miejscu dostarczony jest projekt chipa, za pomocą którego za pomocą drukarki 3D można wydrukować formę do porywania zegara segmentacji myszy w dwuwymiarowych (2D) kulturach ex vivo²⁵

.

Hodowle na chipie i precyzyjne zakłócenia, możliwe dzięki mikrofluidyce, mają wyjątkowy potencjał w odkrywaniu molekularnych mechanizmów kontroli zachowań wielokomórkowych szlaków sygnałowych. Dynamika sygnalizacji i gradienty morfogenu są wymagane dla wielu procesów w rozwoju. Wcześniej laboratoria hodowały komórki, tkanki i całe organizmy w chipach mikroprzepływowych, a protokoły do czasoprzestrzennych zakłóceń głównie hodowli komórkowych 2D są dostępne gdzie indziej^{12,26,27,28,29}. Zastosowanie mikrofluidyki do modulacji lokalnych środowisk w układach wielokomórkowych otwiera nowe perspektywy dla wysokoprzepustowych i precyzyjnych perturbacji czasoprzestrzennych. Dziedzina mikrofluidyki osiągnęła obecnie punkt, w którym stała się niespecjalistycznym, niedrogim i łatwym do zastosowania narzędziem dla biologów rozwojowych.

Tutaj dostępny jest protokół do załadowania zegara segmentacji myszy do impulsów inhibitora sygnalizacji Notch. Taki eksperyment składa się z następujących etapów: (1) wytworzenia chipa mikroprzepływowego, (2) przygotowania rurki i pokrycia chipa, oraz (3) samego eksperymentu mikroprzepływowego (Rysunek 1A). Badania obejmujące systemy modelowe kręgowców wymagają uprzedniej zgody etycznej właściwej komisji.

Protokół

Przedstawione tutaj badania zostały zatwierdzone przez komisję etyki EMBL ¹⁰ oraz holenderski komitet ds. badań nad zwierzętami (dierenexperimentencommissie, DEC) i są zgodne z wytycznymi Hubrechta dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

Nosić rękawiczki podczas pracy z płynnym PDMS. Pokryj powierzchnie i sprzęt. Natychmiast usuń wszelkie rozlane płyny, ponieważ czyszczenie staje się trudne po stwardnieniu.

1. Generacja chipa

UWAGA: Mikroprzepływowe chipy są generowane przez odlewanie PDMS (Polydimethylsiloxane) w formie. Formy można projektować za pomocą oprogramowania CAD (np. uFlow lub 3DμF³⁰). Repozytorium darmowych projektów jest dostarczane przez MIT (Metafluidics.org). Formy są drukowane za pomocą drukarki 3D lub mogą być generowane za pomocą miękkiej litografii przy użyciu fotomaski, która zawiera pożądany wzór (więcej informacji można znaleźć np. w Qin et al., 2010³¹). Tutaj dostarczony jest projekt formy, którą można wydrukować za pomocą drukarki 3D do hodowli na chipie tkanki zarodka myszy (Rysunek 1B, C, Pliki uzupełniające 1 i 2). Aby umożliwić drukowanie na drukarkach 3D o niższej rozdzielczości, projekt został zmodyfikowany w stosunku do wcześniej opublikowanego one¹⁰. Dostarczana jest forma bez pułapek pęcherzyków powietrza i jedna z pułapkami pęcherzyków powietrza (odpowiednio pliki uzupełniające 1 i 2). Ponieważ procedura drukowania zależy od dostępnej drukarki, szczegóły drukowania nie zostaną opisane. Należy jednak upewnić się, że cała niespolimeryzowana żywica została całkowicie usunięta. Często wymagane jest wykonanie dodatkowego mycia rozpuszczalnikami w celu usunięcia niespolimeryzowanej żywicy z małych otworów o średnicy <200 μm w komorze mikroprzepływowej. Otwory te utworzą filary PDMS, aby uwięzić tkankę embrionalną w chipie podczas eksperymentu. PDMS jest powszechnie stosowany w mikrofluidyce, ponieważ jest tani, biokompatybilny i przezroczysty oraz ma niską autofluorescencję. Po utwardzeniu chip PDMS jest wycinany z formy i przyklejany do szkiełka podstawowego. Obróbka plazmowa zarówno szkła, jak i chipa PDMS aktywuje powierzchnie i umożliwia tworzenie wiązań kowalencyjnych po zetknięciu się.

1. Przygotować wymaganą ilość PDMS, mieszając monomer z katalizatorem w stosunku 9:1 (w:w) w celu wywołania polimeryzacji. Do mieszania używaj jednorazowych narzędzi, takich jak plastikowe kubki i widelce. Upewnij się, że mieszanie jest prawidłowe.
2. Umieścić mieszaninę PDMS w eksykatorze i stosować próżnię przez około 30 minut, aby usunąć powietrze z mieszaniny PDMS. Ze względu na próżnię w eksykatorze, powietrze zostanie usunięte z mieszaniny PDMS.
   UWAGA: Przykryj wnętrze eksykatora chusteczkami na wypadek przelania się PDMS.
3. Wlej mieszaninę PDMS do formy do wiórów (wystarczy warstwa PDMS o grubości około 3-5 mm).
4. Umieść formę wypełnioną PDMS z powrotem w eksykatorze i zastosuj próżnię, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki. Upewnij się, że powietrze zostało usunięte ze wszystkich mniejszych struktur formy.
5. Utwardź formę, umieszczając ją na noc w piekarniku o temperaturze 65 °C (lub niższej, w zależności od materiału formy). Wytnij wiór z formy za pomocą skalpela. Wytnij utwardzony PDMS z formy z wystarczającą ilością miejsca (1-2 cm) wokół wzoru, aby umożliwić późniejsze połączenie. Upewnij się, że PDMS został całkowicie przecięty, aby zapobiec pęknięciu chipa podczas jego wyjmowania. Ostrożnie zdejmij wiór PDMS, najpierw końcem skalpela, a jeśli to możliwe, rękami.
6. Przebić otwory wlotowe i wylotowe, zaczynając od wewnętrznej strony komory mikroprzepływowej, za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 1 mm.
7. Wyczyść krótko chip PDMS sprężonym powietrzem i przyklej taśmę klejącą po obu stronach, aby usunąć wszelkie zablokowane kawałki PDMS i kurz i utrzymuj go w czystości do czasu dalszego użycia.
   UWAGA: Chip można przechowywać w ten sposób do dalszego użytkowania.
8. Wyczyść szklane szkiełko sprężonym powietrzem. Uważaj, aby się nie złamał. Usuń taśmę samoprzylepną z chipa PDMS.
9. Przymocuj chip do szkiełka za pomocą pieca plazmowego. Poniższe instrukcje są zoptymalizowane pod kątem plazmy powietrznej.
   UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi laboratoryjnego pieca plazmowego i zoptymalizuj procedurę dla konkretnego eksperymentu.
   1. Umieść chip i szkiełko szklane w piecu plazmowym bokami, które mają być sklejone, do góry.
   2. Umieść pokrywkę na piecu plazmowym i przytrzymaj ją na miejscu podczas stosowania próżni i poczekaj, aż próżnia się ustabilizuje.
   3. Włącz gaz, naciskając przycisk Gaz i odczekaj około 1 minuty (ciśnienie powinno wynosić około 0,37 mbar).
   4. Wygeneruj plazmę, naciskając Generator (Moc: 9.0, Czas: 1 min).
   5. Po zakończeniu wyłącz pompę i gaz; przewietrz i otwórz drzwi.
   6. Przymocuj chip do szkła, umieszczając aktywowane powierzchnie na sobie i równomiernie wywierając nacisk. Uważaj, aby szkło nie pękło.
      UWAGA: Można przeprowadzić test wody, aby potwierdzić, że obróbka plazmowa zadziałała. Umieść kroplę wody na szklanej powierzchni. Jeśli obróbka plazmowa zadziałała, woda powinna natychmiast się rozprowadzić, zamiast tworzyć kropelkę.
10. Umieść związane frytki w piekarniku w temperaturze 65 °C na 5 minut.
11. Uszczelnij odsłoniętą stronę chipa taśmą samoprzylepną, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do wlotów.
    UWAGA: Chip można przechowywać do momentu użycia. Do tego czasu otwory należy zamykać taśmą.

2. Przygotowanie eksperymentu z mikrofluidyką

UWAGA: Następujące kroki przygotowawcze są niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu mikrofluidycznego: Po pierwsze, podczas przeprowadzania eksperymentu mikrofluidycznego, tworzony jest przepływ płynu od wlotów do wylotów. Wszelkie otwory w chipie będą działać jako wyloty z powodu wzrostu ciśnienia z wlotów. Dlatego wszystkie otwory, które nie są używane, muszą zostać zamknięte; Na przykład otwory, które służą do ładowania tkanki na chip. Jeśli nie zostaną one zamknięte, tkanka może wypłynąć wraz z płynem. Aby zamknąć te otwory, stosuje się rurki wypełnione PDMS. Rurki wypełnione PDMS mogą być przechowywane przez czas nieokreślony, a zatem nie muszą być przygotowywane do każdego eksperymentu mikrofluidycznego osobno, ale mogą być wytwarzane w większych partiach. Po drugie, przed rozpoczęciem eksperymentu mikroprzepływowego, rurki, rurki wypełnione PDMS oraz chip wymagany do eksperymentu są przygotowywane i sterylizowane promieniami UV. Na koniec chip musi zostać pokryty fibronektyną, aby tkanka embrionalna mogła przyczepić się do glass²⁵.

1. Wykonywanie rurek wypełnionych PDMS.
   1. Weź ±1 m rurki. Więcej rurek można wypełnić PDMS, biorąc wiele kawałków rurek.
   2. Przygotować wymaganą ilość PDMS, mieszając monomer z katalizatorem w stosunku 9:1 (w:w) w celu wywołania polimeryzacji.
      UWAGA: Do mieszania używaj jednorazowych narzędzi, takich jak plastikowe kubki i widelce. Dokładnie wymieszaj.
   3. Umieścić mieszaninę PDMS w eksykatorze i stosować próżnię przez około 30 minut, aby usunąć powietrze z mieszaniny PDMS.
      UWAGA: Przykryj wnętrze eksykatora chusteczkami na wypadek przelania się PDMS.
   4. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml PDMS. Napełnij ostrożnie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w mieszance.
   5. Za pomocą kleszczy włóż końcówkę igły 22 G do rurki.
      UWAGA: Uważaj, aby nie przebić rurki ani palców igłą.
   6. Podłączyć rurkę do strzykawki wypełnionej PDMS za pomocą igły. Użyj pompy strzykawkowej, aby napełnić rurkę o natężeniu przepływu około 500 μl/h. Uważaj, aby nie wywierać zbyt wysokiego ciśnienia, aby zapobiec uszkodzeniu pompy.
   7. Gdy rurka zostanie całkowicie wypełniona PDMS, umieść ją w naczyniu o średnicy 15 cm i utwardź w temperaturze pokojowej (przynajmniej przez noc).
2. Przygotuj rurkę i wiór do eksperymentu.
   UWAGA: Do eksperymentu wymagane są następujące rurki: po pierwsze, około 50 cm rurki na wylot, a po drugie, około 2-3 m na wlot (dokładny rozmiar zależy od organizacji przestrzennej pomp, inkubatora lub mikroskopu używanego później). Rurka wlotowa musi być długa, aby umożliwić pożywce hodowlanej zrównoważenie się z CO₂ do hodowli zarodków podczas eksperymentu.
   1. Przyciąć rurkę pod kątem 45°, tak aby powstały spiczaste końce; ułatwi to włożenie rurki do otworów wióra. Przymocuj jedną igłę do każdej rurki wlotowej. Patrz krok 2.1.5.
   2. Przetnij rurkę wypełnioną PDMS na korki o średnicy ±1 cm. Ciąć pod kątem 45°, aby powstały spiczaste końce; Ułatwi to włożenie rurki do otworów chipa. Potrzebna jest wystarczająca ilość zaślepek, aby wypełnić każdy otwór, który nie jest przymocowany do żadnej rurki.
   3. Usuń taśmę samoprzylepną z chipa.
   4. Umieść wszystkie rurki z dołączonymi igłami, chip i zatyczki w naczyniu i sterylizuj, wystawiając na działanie światła UV przez ±15 minut. Można zastosować dowolny kaptur do hodowli komórkowych z możliwością sterylizacji UV.
3. Powlekanie chipa fibronektyną.
   UWAGA: W przypadku hodowli 2D ex vivo tylnego PSM należy pokryć chip fibronektyną.
   1. Umieść chip w zlewce zawierającej PBS + 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że chip jest całkowicie pokryty PBS. Przepłucz chip za pomocą PBS, aby usunąć powietrze za pomocą pipety P200.
      UWAGA: Cała dalsza obsługa chipa będzie wykonywana w tej zlewce do momentu rozpoczęcia eksperymentu, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do chipa. Uważaj, aby nie rozbić szkiełka chipa.
   2. Przygotuj 2 ml fibronektyny w proporcji 1:20 w PBS i przelej do zlewki.
   3. Załaduj strzykawkę o pojemności 3 ml do każdej komory chipa. Za pomocą kleszczy włóż igłę 22 G do rurki wylotowej. Przymocować igłę do strzykawki zawierającej fibronektynę.
   4. Podłączyć strzykawkę do pompy strzykawkowej. Przepłucz rurkę, aż w rurce nie pozostanie powietrze.
   5. Podłącz rurkę wylotową do wylotu chipa. Upewnij się, że rurka jest dociśnięta do samego dołu. Ustaw niskie natężenie przepływu, aby pokryć wiór. Wszystkie inne otwory mogą pozostać otwarte. Pozwól pompie strzykawkowej pracować przez co najmniej 2 godziny, może również pracować przez noc.
   6. Zatrzymaj pompę. Odetnij rurkę zaraz za igłą. Pozostała rurka posłuży jako wylot podczas późniejszego eksperymentu.

3. Eksperyment mikrofluidyczny

UWAGA: Tutaj przedstawiono protokół porywania zegara segmentacji myszy w hodowlach 2D ex vivo poprzez zastosowanie impulsów inhibitora sygnalizacji Notch DAPT. Stosowanie impulsów o okresie 130 minut, zbliżonym do naturalnego okresu zegara segmentacji myszy (137 min²⁵), pozwala na efektywne porywanie. Stosuje się impulsy 100 min medium i 30 min 2 μM DAPT (Rysunek 2A). Obecność leku w chipie jest monitorowana za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Widma wzbudzenia i emisji tego barwnika i reportera sygnalizacji fluorescencyjnej muszą być na tyle różne, aby zapobiec przedostawaniu się podczas obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym. Gdy żółte białka fluorescencyjne są używane jako reporter sygnalizacyjny, taki jak reporter sygnalizacyjny Notch LuVeLu⁵ (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), można zastosować barwnik Cascade Blue. Aby zidentyfikować inne możliwe kombinacje barwnika fluorescencyjnego i reportera, można użyć swobodnie dostępnej przeglądarki widm. Efekt porywania można wykryć za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym dynamicznych reporterów sygnalizacji^5,10,32. Każdy chip posiada dwie komory inkubacyjne. Pozwala to na bezpośrednie porównanie impulsów leków (DAPT) z impulsami kontrolnymi (DMSO).

1. Zrób podłoże i odgazuj.
   1. W dniu eksperymentu przygotuj 50 ml pożywki hodowlanej (DMEM-F12 uzupełniony o 0,5 mM glukozy, 2 mM glutaminy i 1% BSA, więcej informacji na temat hodowli mysich pąków ogonowych można znaleźć ²⁵).
   2. Przygotuj strzykawki wypełnione pożywką do eksperymentu. Przygotować pożywkę hodowlaną w zlewkach: Aby porwać oscylacje sygnalizacji Notch, przygotuj 6 ml pożywki z 1,2 μl DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 ml pożywki hodowlanej z 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; dwie probówki po 6 ml pożywki każda. Użyć co najmniej 6 ml pożywki na strzykawkę. Naładować strzykawki z podłożem. Należy upewnić się, że strzykawki zawierające lek i DMSO są oznaczone.
   3. Odgazować chip w PBS i strzykawki zawierające pożywkę w eksykatorze. Umieścić strzykawki w zlewce końcówką skierowaną do góry, tak aby powietrze mogło wydostać się do góry. Może się zdarzyć, że chip unosi się na wodzie i nadal jest wypełniony bąbelkami. Zostaną one następnie usunięte.
   4. Spróbuj wypłukać/zassać większość pęcherzyków powietrza z chipa za pomocą pipety P200. Jeśli pozostanie trochę powietrza, zostanie ono usunięte podczas następnego eksperymentu.
   5. Zainstalować strzykawki w pompach i podłączyć rurki wlotowe do strzykawek. Aby wprowadzić sygnalizację Notch, należy użyć dwóch pomp strzykawkowych, jednej przenoszącej strzykawki z pożywką, a drugiej przenoszącej strzykawki z lekiem/DMSO. Pozwól mu działać z większym natężeniem przepływu (0,5 ml / h) do rozpoczęcia eksperymentu, aby usunąć pęcherzyki powietrza z rurki. Należy zwrócić uwagę, aby prawidłowo ustawić szczegóły (średnicę) strzykawki w pompie.
2. Ładowanie tkanki na chip.
   1. Wypreparuj tkankę zarodkową myszy. Wytnij najbardziej tylny koniec ogona (pączek ogonowy). Wypreparowaną tkankę umieścić w pożywce hodowlanej + 25 μM HEPES.
   2. Przepłukać chip pożywką hodowlaną + 25 μM HEPES za pomocą P200 w celu usunięcia PBS.
   3. Załaduj tkankę do chipa za pomocą pipety P200 (Rysunek 1C). Upewnij się, że nie wprowadzasz pęcherzyków powietrza do chipa.
      UWAGA: Sprawne ładowanie wymaga pewnej wprawy. Jeśli tkanka nie jest prawidłowo zorientowana, może być możliwe jej odwrócenie poprzez ostrożne odsysanie i ponowne spłukiwanie. Jednak często prowadzi to do szybkiej śmierci komórki.
   4. Po każdym etapie ładowania tkanki zamknij odpowiedni wlot ładowania tkanki za pomocą kawałka rurki wypełnionej PDMS. Upewnij się, że wtyczki są wystarczająco dociśnięte do dolnej części chipa za pomocą pęsety.
   5. Po załadowaniu wszystkich próbek zamknij wszelkie nieużywane wloty/wyloty kawałkami rurki wypełnionej PDMS za pomocą kleszczy.
3. Montaż zestawu mikroprzepływowego.
   1. Zmniejsz natężenie przepływu pomp mikroprzepływowych. 60-100 μL/h działa dobrze w przypadku zawiązków ogonowych zarodków myszy. Przy wyższych prędkościach przepływu obserwowano śmierć komórek – prawdopodobnie z powodu zbyt dużego ścinania komórek. Skumulowane natężenie przepływu wielu pomp nie powinno przekraczać tych 60-100 μl/h na komorę mikroprzepływową w danym momencie.
   2. Podłącz rurkę do chipa mikroprzepływowego. Zrób to bez dostania się pęcherzyków powietrza do wnętrza chipa (można to osiągnąć, upewniając się, że na końcu rurki znajduje się kropla medium). Ujścia z powłoki fibronektyny są nadal obecne (patrz 2.3).
   3. Gdy wszystkie rurki zostaną przymocowane do chipa, wyjmij go ze zlewki, dokładnie wysusz, umieść w naczyniu i umieść go razem z około 1,5 m rurki wlotowej w inkubatorze (37 °C, 20% O₂, 5% CO₂) w celu przeprowadzenia hodowli przez noc. Rurka przepuszcza gaz; Umożliwi to zrównoważenie_O2 i CO₂ w pożywce. Alternatywnie, w celu jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym, chip i rurka dopływowa o długości około 1,5 m są umieszczane bezpośrednio w mikroskopie. Uchwyt na chip, który pasuje do standardowych uchwytów na płytki 96-dołkowe, znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
      UWAGA: Upewnij się, że wilgotność jest wystarczająco wysoka podczas inkubacji. W razie potrzeby dodaj wilgotną chusteczkę do komory obrazowania lub inkubatora, aby zapobiec parowaniu w zestawie mikrofluidycznym. Jeśli wilgotność w inkubatorze mikroskopu jest zbyt niska, powoduje to tworzenie się pęcherzyków powietrza w rurkach i chipie mikroprzepływowym. Następnie można użyć zamkniętego pudełka do obrazowania, w którym umieszcza się chip i rurki. Najprostszym sposobem wykonania takiego pudełka do obrazowania jest nałożenie dużej pokrywy na chip i dodanie mokrej chusteczki, nie trzeba jej całkowicie zamykać. Upewnij się, że różnica wysokości między pompą a chipem nie jest zbyt duża i, jeśli to konieczne, powoli zmieniaj wysokość, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza pod wpływem grawitacji.
   4. Pozwól wszystkim pompom płynąć z natężeniem przepływu 20 μl/h przez 20 minut, po umieszczeniu zestawu w docelowym miejscu. Ponieważ komora i pompa najprawdopodobniej przesunęły się na wysokość, jest to konieczne, aby przywrócić prawidłowe ciśnienie w przewodach.
   5. Wyłącz pompę leku, pozwól tylko pompie medium pracować z prędkością 60 μl/h do rozpoczęcia eksperymentu/obrazowania w czasie rzeczywistym.
4. Początek eksperymentu.
   1. Uruchom zaplanowany program pompowania dla eksperymentu. Aby pochwycić sygnalizację Notch, użyj programu pompowania 100 min pożywki i 30 min impulsów leku, który jest powtarzany do końca eksperymentu, zwykle przez 24 godziny
      UWAGA: Można użyć dowolnej programowalnej pompy mikroprzepływowej. W najprostszym formacie pompy można zaprogramować i uruchomić ręcznie. Alternatywnie pompy mogą być sterowane za pomocą oprogramowania komputerowego.
   2. W przypadku wykonywania obrazowania w czasie rzeczywistym należy rozpocząć obrazowanie po upływie co najmniej 30 minut. Pozwoli to na dostosowanie temperatury chipa do temperatury w inkubatorze i zapobiegnie zbyt silnemu dryfowaniu podczas obrazowania. Autofokus jest nadal korzystny.
   3. Wykonaj standardowe obrazowanie konfokalne za pomocą szklanego szkiełka chipa za pomocą odwróconego mikroskopu. Użyj interwału obrazowania wynoszącego 10 minut, aby wystarczająco wykryć oscylacje sygnalizacyjne w okresie 130 minut.
   4. W przypadku krótszych okresów należy skrócić odstęp czasu, aby zapewnić wystarczające pobieranie próbek. Dołącz ścieżkę obrazowania o niskiej rozdzielczości do wykrywania Cascade Blue, aby zwizualizować obecność leku na chipie.
   5. Do wzbudzenia reportera Wenus należy użyć lasera o długości fali 515 nm lub lasera 2-fotonowego o długości fali 960 nm.
   6. Uzyskaj stos z 6-8 płaszczyzn w odległości 8 μm za pomocą obiektywu planistycznego o powiększeniu 20x (rozdzielczość 512 x 512 pikseli, 1,38 μm/piksel). Użyj zmotoryzowanego stolika, aby zobrazować wiele próbek w jednym eksperymencie.
   7. Excite Cascade Blue za pomocą lasera 405 nm i uzyskaj pojedynczą płaszczyznę z co 10 minut (rozdzielczość 32 x 32 piksele, 22,14 μm/piksel).
      UWAGA: Więcej informacji na temat obrazowania i analizy obrazu znajduje się w Reprezentatywnych wynikach i można je znaleźć w reference¹⁰.

Wyniki

Za pomocą tego protokołu przedstawiono metodę zewnętrznego porywania oscylacji sygnalizacyjnych zegara segmentacyjnego myszy za pomocą mikrofluidyki. Stosując impulsy inhibitora sygnalizacji Notch, oscylacje sygnalizacyjne w niezależnych hodowlach zarodków są ze sobą synchronizowane¹⁰. Warunkiem wstępnym zastosowania tego systemu do badania funkcjonalności zegara segmentacyjnego jest to, że dynamika sygnalizacji i segmentacja są nadal obecne w układzie scalonym. Wykazano wcześniej, że zarówno dynamika sygnalizacji Wnt, jak i Notch są utrzymywane pomimo stałego przepływu ośrodka, a fizyczne tworzenie granic utrzymuje się w peryferyjnych kulturach 2D, reprezentujących przednie PSM¹⁰.

Aby potwierdzić porywanie oscylacji sygnałowych do zewnętrznych impulsów leku, przeprowadza się obrazowanie w czasie rzeczywistym, na przykład, reportera sygnalizacji Notch LuVeLu⁵, wyrażającego żółte białko fluorescencyjne Wenus, podczas eksperymentu mikroprzepływowego. Ponieważ orientacja kultur 2D na chipie jest trudna do kontrolowania, analizowane są oscylacje sygnalizacyjne w tkance przedniej. Na obrzeżach kultury 2D można wykryć w sposób powtarzalny. Orientacja skrawków tkanek na chipie nie może być dowolnie kontrolowana, a cała wewnętrzna powierzchnia chipa jest pokryta fibronektyną. Dlatego czasami zdarza się, że kultury przyczepiają się do boków lub sufitu chipa. W przypadku gdy próbki przemieszczają się poza pole widzenia (w kierunku x, y i z) lub przyczepiają się do tylnego końca ogona skierowanego w dół, zasadniczo próbki te są wykluczane.

Dla dalszej analizy, wiele takich eksperymentów z porywaniem jest łączonych. Niezależne eksperymenty można dopasować do siebie za pomocą czasu impulsów leku uwidocznionych przez barwnik, Cascade Blue, przy około 400 nm. Aby przeanalizować i zobrazować synchronizację, można zdetrendować oscylacje ilościowe (Rysunek 2B,D), a następnie wyświetlić je jako średnią i odchylenie standardowe lub fazy oscylacji. Pozwala to na analizę zależności fazowej między oscylacjami niezależnych kultur zarodków w tylnej części ciała względem siebie nawzajem i do zewnętrznych impulsów leku (Rysunek 2C,E). Oparty na Pythonie program pyBOAT³³ jest prostym i przyjaznym dla użytkownika narzędziem do określania okresu, fazy i amplitudy takich oscylacji sygnalizacyjnych. Aby potwierdzić porwanie, można na przykład określić okres endogennych oscylacji sygnalizacyjnych. Przy stosowaniu impulsów o okresie 130 min, oscylacje sygnalizacyjne Notch również pokazują okres 130 minut (Rysunek 2F)¹⁰. Ponadto, korzystając z impulsów Cascade Blue, można dostosować do siebie niezależne eksperymenty z różnymi reporterami sygnalizacyjnymi. W ten sposób można pośrednio określić zależność fazową między oscylacjami wielu reporterów sygnalizacyjnych¹⁰.

Tak więc, prezentowany system mikroprzepływowy pozwala na kontrolę oscylacji sygnałowych w hodowlach ex vivo rozwijającego się zarodka myszy. W połączeniu z obrazowaniem markerów tworzenia i różnicowania segmentów, system ten może być teraz stosowany do analizy, w jaki sposób szlaki sygnałowe zegara segmentacyjnego oddziałują na siebie i jak kontrolują tworzenie somitu.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu mikrofluidyki. (A) Formy chipowe mogą być projektowane za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Opracowano projekt chipa do przechwytywania oscylacji sygnałowych w modelach somitogenezy myszy ex vivo. Formy mogą być na przykład generowane przez druk 3D lub zamawiane. Chipy mikroprzepływowe są wytwarzane przez formowanie PDMS. Utwardzony chip PDMS jest wycinany i kowalencyjnie łączony ze szkiełkiem za pomocą pieca plazmowego. Szklana powierzchnia wewnątrz chipa jest pokryta fibronektyną, aby umożliwić przyczepienie się wypreparowanej tkanki. Tkanka embrionalna jest ładowana na chip przez wloty załadowcze, które są następnie zamykane. Pompy z różnymi warunkami mediów są podłączane do wlotów chipa i inicjowany jest program przepływu. Podczas eksperymentu tkankę można obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. (Kymografy zaadaptowane z Sonnen et al., 2018¹⁰. Przedruk i zmodyfikowano z Cell zgodnie z Creative Commons Uznanie autorstwa CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Schematyczny rysunek projektu formy do hodowli na chipie tylnej tkanki zarodka myszy. Wysokość kanałów mikroprzepływowych wynosi 500 μm, co jest wystarczające do hodowli tylnych embrionalnych ogonów myszy. Plik do wydrukowania tej formy znajduje się w pliku uzupełniającym 1, a alternatywa jest podana w pliku uzupełniającym 2. (C) Obraz w jasnym polu ogona myszy z sekcją E10.5 otoczonego filarami PDMS na chipie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki eksperymentu mikrofluidycznego. (A) Schematyczne przedstawienie eksperymentu z porywaniem z medium i pompą leku. Impulsy modulatora szlaku sygnałowego są stosowane do hodowli ex vivo zarodków myszy, a oscylacje sygnałowe mogą być wizualizowane przez obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych reporterów sygnalizacyjnych (na przykład reporter sygnalizacyjny Notch LuVeLu⁵ i reporter sygnalizacyjny Wnt Axin2T2A¹⁰). Linie przerywane wskazują obszar, który jest używany do analiz w czasie. (B-F) Oscylacje reporterowe LuVeLu są porywane przez okresowe impulsy inhibitora sygnalizacji Notch DAPT. (B,D) Kwantyfikacja oscylacji sygnalizacji Notch w przednim PSM po porywaniu przy użyciu DAPT lub kontroli DMSO. (C,E) Wykresy zależności faza-faza między fazą oscylacji sygnalizacji Notch a czasem zewnętrznych impulsów DAPT/DMSO. W przypadku porywania ustalana jest stabilna zależność fazowa. (F) Kwantyfikacja średniego okresu i SEM oscylacji reporterowych porównujących próbki porwane impulsami DMSO i DAPT. (Rysunek zaczerpnięty z Sonnenet al., 2018¹⁰. Przedruk i zmodyfikowano z Cell zgodnie z Creative Commons Uznanie autorstwa CC BY-NC-ND 4.0.). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

problem	Sugerowane rozwiązanie
PDMS nie łączy się ze szkłem.	- Upewnij się, że zarówno PDMS, jak i szkło są czyste.
	- Upewnij się, że wokół komory jest wystarczająca ilość PDMS do klejenia.
	- Zoptymalizuj ustawienia pieca plazmowego.
Na moim chipie są pęcherzyki powietrza.	- Sprawdź, czy pompa jest włączona.
	- Odgazuj chip przed załadowaniem chusteczki na chip.
	- Odgazuj pożywkę przed rozpoczęciem eksperymentu.
	- Upewnij się, że wilgotność w komorze inkubacyjnej jest wystarczająco wysoka.
Tkanka umiera na początku eksperymentu.	- Dodaj HEPES do podłoża podczas ładowania i montażu chipa.
	- Nie spłukuj chusteczki zbyt często podczas ładowania.
	- Sprawdź, czy natężenie przepływu nie jest zbyt wysokie.
Tkanka umiera podczas obrazowania.	- Upewnij się, że obrazowanie nie powoduje fototoksyczności
	- Upewnij się, że nie ma zanieczyszczeń.
	- Natężenie przepływu nie powinno być zbyt wysokie.
Ostrość zmienia się podczas obrazowania.	- Użyj autofokusa podczas obrazowania, aby dostosować się do dryfu slajdu obrazowego.
	- Pozwól chipowi wyrównać się do temperatury w mikroskopie przez co najmniej 30 minut.
Wyloty/wloty odłączają się.	- Wciśnij wszystkie rurki całkowicie na dno.
Szkło chipa pęka.	- Bądź bardziej ostrożny, szkło jest bardzo delikatne.
	- Cienkie szkło jest potrzebne tylko do obrazowania. Jeśli obrazowanie nie jest wykonywane, można użyć normalnego, grubszego szkiełka podstawowego.
	- Jeśli przerwa znajduje się poza chipem, może to nie stanowić problemu. Jeśli szklana uszczelka do chipa zostanie uszkodzona, płyn wycieknie i dostanie się powietrze.
Na moim chipie jest zanieczyszczenie.	- Dodaj antybiotyki do pożywki hodowlanej.
	- Wysterylizuj cały sprzęt i rurki.
	- Pracuj szybko i czysto.

Tabela 1: Rozwiązywanie problemów

Plik uzupełniający 1: plik STL do drukowania formy za pomocą drukarki 3D. Ta forma jest używana do generowania chipa mikroprzepływowego do hodowli na chipie tylnej tkanki embrionalnej (projekt pokazany w Rysunek 1). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: plik STL do drukowania formy za pomocą drukarki 3D w celu wygenerowania mikroprzepływowego chipa do hodowli na chipie tylnej tkanki embrionalnej. W przeciwieństwie do pliku uzupełniającego 1 i projektu pokazanego na Rysunek 1, ten projekt zawiera pułapki bąbelkowe na wszystkich wlotach, aby zapobiec przedostawaniu się niewielkich ilości powietrza do głównej komory mikroprzepływowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plik projektowy do generowania uchwytu do umieszczenia chipa w mikroskopie. Ten uchwyt ma wymiary płytki 96-dołkowej i powinien pasować do standardowych uchwytów większości mikroskopów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

To, w jaki sposób dynamika sygnalizacji kontroluje systemy wielokomórkowe, jest od dawna pytaniem w tej dziedzinie. Badania funkcjonalne stanowią kluczowe wyzwanie, ponieważ dynamika ta musi być subtelnie modulowana, aby to umożliwić^. Taką czasową kontrolę nad perturbacjami szlaku można w zasadzie osiągnąć za pomocą optogenetyki, która umożliwia również wysoką kontrolę przestrzenną³⁴. Jednak optogenetyka wymaga ustanowienia wyrafinowanych narzędzi genetycznych do analizy każdego szlaku sygnałowego, o którym mowa. Opisany tutaj obecny protokół zapewnia bardzo wszechstronne narzędzie do perturbacji dowolnej ścieżki sygnałowej. Eksperyment mikrofluidyczny pozwala na zastosowanie czasowo sterowanych impulsów leków w celu funkcjonalnego zbadania dynamiki szlaków sygnałowych w kulturach tkankowych. W tym przypadku nacisk kładziony jest na badanie somitogenezy w kulturach ex vivo , ale protokół można dostosować do dowolnych innych systemów modelowych.

Niektóre kroki w protokole mają kluczowe znaczenie dla przeprowadzenia udanego eksperymentu mikrofluidycznego (podsumowane w Tabeli 1). Kluczowe punkty omówiono w następujący sposób. Ze względu na przepływ medium w trakcie eksperymentu, kultura tkankowa doświadcza naprężeń ścinających. Wystawienie systemu modelowego na ciągły przepływ może powodować stres komórkowy, a w skrajnych przypadkach śmierć komórki z powodu efektu ścinania. W przypadku hodowli tkankowych ex vivo mysich pąków ogonowych i obecnej konstrukcji chipa stwierdzono, że natężenie przepływu wynoszące 60 μl/h (maksymalnie 100 μl/h) działa dobrze przy minimalnym efekcie ścinania. Gdy wiele pomp jest włączanych jednocześnie dla tego samego chipa, natężenie przepływu poszczególnych pomp musi być odpowiednio dostosowane, aby nie powodować wzrostu całkowitego natężenia przepływu. Gdy obecny protokół zostanie dostosowany do innych systemów modelowych i projektów chipów, natężenie przepływu powinno zostać zoptymalizowane. Alternatywnie możliwe jest nie spłukiwanie medium w sposób ciągły, ale okresowa wymiana medium na chipie³⁵. Taki układ można również zastosować do kontrolowania oscylacji sygnalizacyjnych w somitogenezie myszy (niepublikowane, dane nie pokazane). Co więcej, można również wyobrazić sobie konfigurację, w której hodowle tkankowe nie są narażone na bezpośredni przepływ płynów, ale leki docierają do tkanki poprzez dyfuzję z sąsiedniego kanału. Systemy te zostały z powodzeniem wykorzystane do zastosowania gradientów czynników wzrostu do modeli różnicowania ESC in vitro ^14,36.

Jednym z głównych problemów związanych z eksperymentami mikroprzepływowymi jest występowanie pęcherzyków powietrza na chipie podczas eksperymentu. Pęcherzyki powietrza w chipie lub rurki mogą zakłócać równomierny przepływ cieczy na chipie i mogą prowadzić do usunięcia kultury zarodka z jego lokalizacji. Aby zapobiec obecności pęcherzyków powietrza, niezbędne są różne etapy protokołu. Po pierwsze, pożywka hodowlana w strzykawkach i sam chip mikroprzepływowy muszą zostać odgazowane za pomocą eksykatora (krok 3.1.3). Po drugie, podczas ładowania próbek do wlotów załadowczych należy uważać, aby nie wlać powietrza do chipa razem z próbką (krok 3.2.3). Po trzecie, podczas napełniania rurki medium, wszystkie pęcherzyki powietrza muszą zostać wypompowane przed zamocowaniem chipa (krok 3.3.2). W przeciwnym razie bąbelki te zostaną wepchnięte do głównego chipa podczas eksperymentu. Wreszcie, podczas eksperymentu, podłoże jest równoważone w komorze obrazowania lub inkubatorze dzięki półprzepuszczalnym rurkom. Przepuszczalność rurki pozwala również na odparowanie medium, dlatego należy upewnić się, że wilgotność jest regulowana podczas eksperymentu, aby zapobiec tworzeniu się nowych pęcherzyków w wężyku.

Ogólnie rzecz biorąc, mikrofluidyka jest bardzo wszechstronnym narzędziem, które można dostosować do konkretnego pytania badacza. Obecne podejście projektowe pozwala na obrazowanie do 12 kultur ex vivo równolegle na chip. Liczba ta jest ograniczona głównie liczbą zarodków w eksperymencie i czasem potrzebnym do zobrazowania każdej kultury zarodka z wystarczającą rozdzielczością. Jeśli w jednym eksperymencie trzeba porównać wiele warunków, wiele chipów można zamontować na jednym szklanym szkiełku. Zapewniona jest konstrukcja chipa, która jest idealna do równoległego obrazowania wielu eksplantatów tkanek, ale spersonalizowane projekty mogą przezwyciężyć ograniczenia w liczbie próbek, aby umożliwić analizę o wysokiej przepustowości i zwiększyć kombinację większej liczby warunków w jednym eksperymencie^16,17. Mikrofluidyka jest ograniczona do modeli, które mogą być hodowane na chipie, a kultura na chipie będzie musiała być zoptymalizowana dla każdego systemu modelowego^{indywidualnie} 27,37,38.

W ciągu ostatnich 5-10 lat mikrofluidyka została zastosowana do rozwiązywania różnych problemów biologicznych ze względu na jej potencjał w zakresie podejść o wysokiej przepustowości i subtelnych modulacji dynamiki sygnalizacji i gradientów. W dzisiejszych czasach mikrofluidyka stała się łatwym w zastosowaniu, tanim i wszechstronnym narzędziem, które laboratoria mogą z łatwością opracować. W tym przypadku obecny protokół jest zoptymalizowany pod kątem konkretnego zastosowania, a mianowicie badania dynamiki sygnalizacji rządzącej somitogenezą. Łatwo jest dostosować ten protokół i projekt do indywidualnych pytań badawczych w biologii tkankowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 10 ml	Becton, Dickinson and company	300912
184 Utwardzacz z elastomeru silikonowego	SYLGARD	1673921
184 Elastomer silikonowy PDMS	SYLGARD	1673921
strzykawki 3 ml	Becton, Dickinson i spółka	309657
Taśma			Scotch Magic lub podobna
Kleszczyki z końcówką Bochem 18/10 Stal nierdzewna	Fisher Scientific	10663341
Albumina surowicy bydlęcej Liofilizowane pH ~ 7	Biowest	P6154
System sprężonego powietrza
Naczynie krystalizujące	VWR	10754-7	Sterylizowany
D-(+)-glukoza 45%	Sigma	G8769
Eksykator	VWR	467-0104
Kubki jednorazowe	Duni	173 941
Widelce jednorazowe	Zszywki	511514
Sprzęt do
DMEM/F12	Technologie hodowli komórkowych	niestandardowe	DMEM/F-12, bez czerwieni fenolowej, bez L-glutaminy, bez glukozy
Fibronektyna	Sigma	F1141-5MG
Kaptur przepływowy BioVanguard Greenline	CleanAir firmy Baker	511514	Do źródła światła UV
Szkiełko szklane nr 1,5H wysoka precyzja, 70x70 mm	Marienfeld	107999098
HEPES Bufor	Gibco	15630-056
L-glutamina	Gibco	25030024
Mikroskop	Leica	Leica SP8 MP
Igły 22G	Becton, dickinson i Firma	z412139-100EA
Piekarnik	VWR	390-09
PBS0
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15070063
Piec plazmowy Femto	Diener elektroniczny
dziurkacz & Oslash; 1mm	Uni-Core	WB100073
		Entris
Pompa strzykawkowa	WPI	AL-4000
Rurka i Oslash; 1mm	APT	AWG24T
Pompa próżniowa	VWR	181-0308