Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62319

⸱

25 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences, Curtin University, 5Department of Medicine, Denver Health Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Streszczenie

Wprowadzenie

Glikozaminoglikany (GAG) to różnorodna rodzina liniowych polisacharydów, które są wszechobecnym pierwiastkiem w organizmach żywych i przyczyniają się do wielu podstawowych procesów fizjologicznych1. GAG, takie jak siarczan heparanu (HS) i siarczan chondroityny (CS), mogą być siarczanowane w różnych miejscach wzdłuż łańcucha polisacharydowego, nadając geograficzne domeny ładunku ujemnego. Te GAG, po przywiązaniu do białek powierzchniowych komórek znanych jako proteoglikany, rzutują do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i wiążą się z pokrewnymi ligandami, umożliwiając regulację procesów sygnalizacji zarówno cis- (ligand przyłączony do tej samej komórki), jak i trans- (ligand przyłączony do sąsiedniej komórki)2. Ponadto GAG pełnią również kluczowe role jako elementy strukturalne w tkankach, takich jak błona podstawna kłębuszków nerkowych3, glycocalyx4 i glikokalix5, oraz w tkankach łącznych, takich jak chrząstka6.

Długość łańcuchów polisacharydowych GAG różni się znacznie w zależności od ich kontekstu biologicznego i może być dynamicznie wydłużana, rozszczepiana i modyfikowana przez wysoce złożony enzymatyczny system regulacyjny7. Co ważne, długość łańcuchów polimerowych GAG w znacznym stopniu przyczynia się do ich powinowactwa do ligandów, a co za tym idzie, do ich funkcji biologicznej8,9. Z tego powodu określenie funkcji endogennego GAG wymaga docenienia jego wielkości. Niestety, w przeciwieństwie do białek i kwasów nukleinowych, istnieje bardzo niewiele łatwo dostępnych technik wykrywania i pomiaru GAG, co historycznie skutkowało stosunkowo ograniczonymi badaniami nad biologicznymi rolami tej różnorodnej rodziny polisacharydów.

Ten artykuł opisuje, jak izolować i oczyszczać GAG z większości tkanek biologicznych, a także opisuje, jak używać elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do oceny długości izolowanych polimerów z odpowiednim stopniem specyficzności. W przeciwieństwie do innych, wysoce złożonych (i często opartych na spektrometrii mas) podejść glikomicznych, metoda ta może być stosowana przy użyciu standardowego sprzętu i technik laboratoryjnych. To praktyczne podejście może zatem poszerzyć zdolność badaczy do określania biologicznej roli natywnych GAG i ich interakcji z kontekstowo ważnymi ligandami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki biologiczne analizowane w tym protokole zostały uzyskane od myszy, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Izolacja siarczanu heparanu

  1. Delipidacja próbek tkanek
    UWAGA: Delipidacja jest opcjonalnym etapem w przypadku tkanek bogatych w tłuszcz.
    1. Przygotuj mieszaninę metanolu i dichlorometanu w stosunku 1:1. Przygotować około 500 μl na próbkę; Większe kawałki tkanki mogą wymagać do 1 ml.
    2. Umieść każdą próbkę tkanki w małym szklanym pojemniku z pokrywką do delipidacji.
      UWAGA: Masa próbki może się różnić w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania i potrzeb eksperymentalnych. 50 mg lub mniej jest zazwyczaj wystarczające dla odpowiedniej wydajności GAG, ale użytkownik końcowy może wymagać pewnej optymalizacji.
    3. Dodać 500 μl roztworu metanolu:dichlorometanu do każdego szklanego pojemnika i wymieszać. Upewnij się, że wszystkie próbki tkanek stałych są całkowicie zanurzone w rozpuszczalniku.
      UWAGA: Do mieszania i obchodzenia się z roztworem metanolu/dichlorometanu należy używać pipet serologicznych lub plastikowych stożkowych probówek; Inne tworzywa sztuczne mogą się rozpuścić.
    4. Umieścić próbki na wytrząsarce (w zabezpieczonym stojaku) w dygestoriach chemicznych i delikatnie mieszać przez 1 godzinę.
    5. Mieszać próbki do wymieszania i odwirować w temperaturze 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Ostrożnie odpipetować frakcję rozpuszczalnika organicznego (supernatant). Jest to frakcja lipidowa - nie zawiera GAG i można ją wyrzucić.
      UWAGA: Staraj się nie naruszać tkanki, ponieważ małe kawałki mogą zostać utracone. Lepiej jest pozostawić część warstwy organicznej w pojemniku na próbkę, niż ryzykować utratę próbki.
    7. Pozostaw pokrywkę szklanego pojemnika otwartą i pozwól mu odparować przez noc w kapturze. Wymień probówkę na następny krok, ponieważ te rurki nie przetrwają dalszej obróbki.
    8. Po całkowitym odparowaniu mieszaniny rozpuszczalników należy przystąpić do mechanicznego rozdrobnienia (jeśli pozostała próbka wynosi >50 mg) lub roztwarzania aktynazą E (< 50 mg).
  2. Mechaniczny rozpad tkanki stałej (opcjonalnie; dla większych próbek tkanek)
    UWAGA: Większość mniejszych kawałków tkanki stałej (około 50 mg lub mniej) powinna całkowicie rozpuścić się na etapie trawienia. Jednak większe próbki będą wymagały mechanicznej dezintegracji.
    1. Próbki do błyskawicznego zamrożenia należy umieścić w probówce polipropylenowej o odpowiedniej wielkości i umieścić zamkniętą probówkę w ciekłym azocie. Pozostawić próbkę do zamrożenia aż do całkowitego zestalenia.
    2. Za pomocą czystego moździerza i tłuczka zmiel zamrożone próbki na konsystencję przypominającą proszek.
    3. Przejdź bezpośrednio do trawienia aktynazy E (krok 1.4).
  3. Odsalanie i zagęszczanie próbki
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny i wymagany tylko w przypadku rozcieńczonych płynnych próbek tkanek (np. płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) lub osocza).
    1. Zebrać próbki cieczy w odpowiednich grupach doświadczalnych (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę doświadczalną)
    2. Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl z punktem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 3 000 Da.
    3. Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Powtórzyć w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.
    4. Przemyj każdą kolumnę 3x 400 μL dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ.
    5. Odwróć filtr i wiruj przez 1 minutę przy 2 000 x g w świeżych, odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych. Zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego kroku.
  4. Trawienie aktynazy E
    UWAGA: Ten etap jest wymagany do strawienia i ostatecznego usunięcia zanieczyszczeń białkowych z próbki.
    1. Wymieszać próbki w stosunku 1:1 z rekombinowaną aktynazą E do pożądanego stężenia 10 mg/ml. Dodać odpowiednią objętość 10-krotnego koncentratu buforowego do wytrawiania. Pożądane stężenie końcowe: 0,005 M octan wapnia i 0,01 M octan sodu, pH 7,5. Na przykład: 190 μl próbki cieczy, 190 μl 20 mg/ml aktynazy E, 20 μl 0,05 M octanu wapnia, 0,1 M octanu sodu.
    2. Próbki należy delikatnie mieszać w celu wymieszania, a następnie trawić przez 48–72 godzin w temperaturze 55 °C (do 7 dni w przypadku całej tkanki).
    3. Podgrzewać do 80 °C przez 15-20 minut, aby podgrzać dezaktywację aktynazy E.
    4. Zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C lub przejść do kroku 1.5.
  5. Odsalanie i zagęszczanie próbki
    UWAGA: Jeśli przewiduje się, że w próbce biologicznej znajdzie się mała masa GAG będącego przedmiotem zainteresowania lub jeśli pożądane jest zachowanie odczynników zużywalnych (tj. odśrodkowych kolumn filtracyjnych), próbki można połączyć w celu wytworzenia pojedynczego koncentratu na grupę eksperymentalną (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę eksperymentalną).
    1. Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl o MWCO 3 000 Da.
    2. Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Czynność tę czynność powtórzyć w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.
    3. Każdą kolumnę przemyć 3x 400 μl dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ.
    4. Odwróć filtr i wiruj przez 1 minutę przy 2 000 x g w świeżych, odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych (zwykle dołączonych do kolumn filtra odśrodkowego). Zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego kroku.
  6. Osuszenie
    1. Albo umieścić rozpuszczone próbki z kroku 1.5.5 w rotacyjnym koncentratorze próżniowym na noc, albo liofilizować próbki, jak opisano poniżej.
    2. Próbki należy dokładnie zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C lub zanurzając je w ciekłym azocie.
    3. Przekłuć pokrywki próbek igłą 18 G i umieścić w komorze liofilizatora. Dodaj ręczniki papierowe do pakowania w razie potrzeby.
    4. Przymocuj komorę liofilizatora do liofilizatora i liofilizuj przez noc (co najmniej -40 °C, 0,135 Torr)
  7. Kolumna wymiany kationów
    1. Wysuszone próbki zawiesić w maksymalnie 400 μl 8 M mocznika, 2% roztworze CHAPS (lub, w przypadku łączenia próbek, ponownie zawiesić do maksimum (400/n) μl, gdzie n = liczba próbek w żądanej puli. Używaj jak najmniejszej ilości roztworu detergentu.
    2. Zrównoważyć kolumnę kationowymienności (IEX) z 400 μl 8 M mocznika, 2% roztworu TABLET. Wirować przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze pokojowej.
    3. Załadować 400 μl próbki/próbek zbiorczych do kolumny IEX. Wirować przez 5 minut przy 2,000 x g.
    4. Przemyć 3x 400 μL 8 M roztworu mocznika, 2% CHAPS. Wiruj przez 5 minut przy 2,000 x g za każdym razem.
    5. Elute 3x za pomocą 400 μL 0,2 M NaCl. Wiruj przez 5 minut przy 2,000 x g każdy. Jest to frakcja o niskim powinowactwie - w razie potrzeby można ją zachować do celów kontroli jakości.
    6. Elute 3x za pomocą 400 μL 2,7 M (16%) NaCl. Wiruj przez 5 minut przy 2,000 x g każdy. Ta frakcja będzie zawierała wyizolowane glikozaminoglikany będące przedmiotem zainteresowania - zachowaj ją całą!
    7. Aby odsolić każdą eluowaną frakcję, dodać metanol do 80 % obj. i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Wirować każdą próbkę przez 5 minut w temperaturze 2 000 x g. Odzyskać stałą pozostałość, ponieważ jest to wysuszony, odsolony glikozaminoglikan.
      UWAGA: Alternatywnie pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.8, aby odsolić eluat bez metanolu.
  8. Odsalanie i zagęszczanie próbki
    1. W razie potrzeby połączyć eluowane frakcje (z 1.7.6) w odpowiednie grupy doświadczalne (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę doświadczalną).
    2. Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl o MWCO 3 000 Da.
    3. Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Czynność tę czynność powtórzyć w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.
    4. Każdą kolumnę przemyć 3x 400 μl dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ. Przejdź bezpośrednio do kroku 1.9.
  9. Trawienie chondroityny
    UWAGA: Celem tego kroku jest usunięcie plików GAG, które nie są interesujące dla użytkownika końcowego. W tym przypadku chondroitynaza służy do usuwania chondroityny. W tkankach wykorzystywanych do generowania reprezentatywnych wyników (płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i całe płuca) trawienie siarczanu chondroityny pozostawia siarczan heparanu jako pierwotną resztkową GAG. Użytkownicy końcowi mogą być zmuszeni do dodania dodatkowych etapów trawienia w zależności od ich celów eksperymentalnych.
    1. Załadować 350 μl buforu wytrawiającego (50 mM octanu amonu z 2 mM chlorku wapnia dostosowanym do pH 7,0) do odśrodkowej kolumny filtracyjnej, nie dotykając membrany.
    2. Dodać 5 μl rekombinowanej chondroitynazy ABC.
    3. Umieścić probówkę z próbkami w piecu o temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę.
    4. Odwróć kolumnę i umieść w odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych. Wirować przez 1 minutę przy 2000 x g.
    5. Podgrzewać próbki do temperatury 80 °C przez 15-20 minut w celu inaktywacji chondroitynazy ABC.
  10. Odsalanie i zagęszczanie próbki
    1. W razie potrzeby należy połączyć próbki trawione chondroityną z etapu 1.9.5 w odpowiednie grupy doświadczalne (np. przez kontrpróbę biologiczną lub grupę doświadczalną)
    2. Umieść całkowitą objętość próbki w odśrodkowej kolumnie filtracyjnej o pojemności 500 μl o MWCO 3 000 Da.
    3. Wirować przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Powtórz w razie potrzeby, jeśli żądana objętość próbki przekracza pojemność kolumny filtra odśrodkowego.
    4. Każdą kolumnę przemyć 3x 400 μl dejonizowanej, przefiltrowanej wody. Odrzuć przepływ.
    5. Odwróć filtr i wiruj przez 1 minutę przy 2 000 x g w świeżych, odpowiednio oznakowanych probówkach zbiorczych. Zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego kroku.
  11. Wysuszenie
    UWAGA: Na tym etapie konieczne jest wysuszenie, aby próbki można było ponownie zawiesić w jak najmniejszej ilości wody i bieżącego buforu.
    1. Albo umieścić próbki wytrawione przez chondroitynę z kroku 1.10.5 bezpośrednio w rotacyjnym koncentratorze próżniowym na noc, albo liofilizować w następujący sposób:
    2. Próbki należy dokładnie zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C lub zanurzając je w ciekłym azocie.
    3. Przekłuć pokrywki próbek igłą 18 G i umieścić w komorze liofilizatora. Dodaj ręczniki papierowe do pakowania w razie potrzeby.
    4. Przymocuj komorę liofilizatora do liofilizatora i liofilizuj przez noc (co najmniej 40 °C, 0,135 Torr)

2. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym izolowanych i oczyszczonych glikozaminoglikanów

  1. Przygotować wcześniej roztwory niezbędne do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) (Tabela 1).
    UWAGA: Wybrać procentową zawartość akrylamidu w rozdzielczym roztworze żelu w zależności od wielkości glikozaminoglikanów, które mają znajdować się w próbce. 15% jest zalecane do rozpuszczania większych fragmentów (o długości większej niż 30 podjednostek disacharydowych); 22% dla mniejszych fragmentów (o długości <20 podjednostek disacharydowych).
  2. Umieść pustą kasetę w zbiorniku PAGE. Odlej żel rozdzielczy w następujący sposób: W probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 10 ml roztworu żelu rozdzielczego, 60 μl 10% nadsiarczanu amonu (musi być świeżo przygotowany) i 10 μl TEMED (dodać TEMED na końcu). Delikatnie odwróć rurkę 2-3x. Użyj pipety, aby szybko dodać powyższe 10 ml roztworu do kasety. Nałożyć 2 ml dejonizowanej, przefiltrowanej wody i pozostawić żel rozdzielczy do polimeryzacji przez 30 min.
    UWAGA: Poniższy protokół PAGE został zoptymalizowany dla pionowego systemu PAGE przy użyciu kaset odlewniczych o wymiarach 13,3 x 8,7 cm (szerokość x długość) o grubości 1,0 mm i łącznej objętości około 12 ml. Można stosować inne systemy kasetowe, ale mogą wymagać optymalizacji przez użytkownika końcowego.
  3. Po pełnej polimeryzacji żelu rozdzielczego należy wylać nałożoną wodę i odlać żel do układania w stos w następujący sposób: w probówce o pojemności 15 ml wymieszać 3 ml roztworu żelu do układania w stos, 90 μl 10% nadsiarczanu amonu (musi być świeżo przygotowany), 3 μl TEMED (dodać TEMED na końcu).
  4. Delikatnie odwróć rurkę 2-3x. Za pomocą pipety szybko dodaj roztwór żelu do układania w stos na zestalony żel rozdzielczy; napełnij kasetę po brzegi. Całkowicie włóż grzebień dołączony do zestawu. Pozostawić żel do polimeryzacji żelu do układania na 30 minut.
  5. Po polimeryzacji żelu upewnij się, że pasek taśmy został usunięty z dna kasety i umieść kasetę z powrotem w zespole zbiornika PAGE.
  6. Napełnij górną i dolną komorę odpowiednio buforem górnej i dolnej komory.
  7. Wysuszone próbki z kroku 1.11.4 rozpuścić w minimalnej niezbędnej objętości dejonizowanej, przefiltrowanej wody (co najwyżej 50% objętości studzienek w żelu PAGE). Wymieszać w stosunku 1:1 z buforem ładującym próbkę. Załadować próbki i "drabinki" oligosacharydowe HS (patrz tabela 1) do żelu.
  8. Uruchom żel przez 5 minut przy napięciu 100 V. Następnie uruchom żel pod napięciem 200 V przez 20-25 minut (dla żelu rozdzielczego 15% poliakryloamidu), 40-50 minut (dla żelu rozdzielczego 18% poliakryloamidu), 90-100 minut (dla żelu rozdzielczego 22% poliakryloamidu).
    UWAGA: Może być konieczna pewna optymalizacja czasu pracy 200 V. Czerwień fenolowa migruje przed oligosacharydami heparyny, które mają długość 2 podjednostek polimeru (tj. stopień polimeryzacji 2 lub dp2); Błękit bromofenolowy migruje przed DP10-DP14. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy napięcie jest przyłożone w taki sposób, że czerwony prążek fenolowy migruje prawie, ale nie całkiem, na dno żelu. Dostosuj odpowiednio czas pracy.

3. Protokół barwienia srebrem

  1. Przygotuj wcześniej wszystkie roztwory niezbędne do barwienia srebra (Tabela 2).
    UWAGA: Nie dotykaj bezpośrednio żelu PAGE, dopóki nie zostanie on zabarwiony, rozwinięty i umieszczony w roztworze zatrzymującym. Zamiast tego manipuluj żelem za pomocą czystych plastikowych lub szklanych narzędzi. Bezpośrednie obchodzenie się z żelem spowoduje zniekształcenia odcisków palców i inne widoczne artefakty na żelu po barwieniu.  
  2. Po zakończeniu cyklu zdemontuj kasetę i ekstrahuj żel w czystym, średnio dużym pojemniku wypełnionym dejonizowaną, przefiltrowaną wodą.
    UWAGA: Aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z żelem, użyj końcówki pipety lub innego plastikowego przedmiotu, aby delikatnie oderwać żel od kasety, gdy jest zanurzony w wodzie. Żel może być delikatny - należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    1. Wylej wodę. Zabarwić żel w roztworze barwiącym Alcian blue przez 5 min.
    2. Odrzuć niebieską plamę Alciana. Szybko spłucz/umyj 2-3x dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, aż większość roztworu barwiącego Alcian blue zostanie usunięta.
    3. Pozostaw na noc do odbarwienia w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie na bujaku. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość dejonizowanej, przefiltrowanej wody, aby zapewnić, że wszelkie resztki plamy zostaną całkowicie zmyte z żelu przez noc.
    4. Żel do mycia w 50% metanolu (łącznie 40 minut, zmień roztwór 2-3x).
    5. Żel myć w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie przez 30 min. Wylej wodę i powtórz jeszcze 3 razy, w sumie przez 2 godziny, za każdym razem wymieniając wodę.
    6. W świeżym, czystym pojemniku barwić żel przez 30 minut w roztworze barwiącym z azotanu srebra.
    7. Szybko spłucz/umyj 2-3x w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie, aby całkowicie usunąć roztwór do barwienia srebra.
    8. Myć przez 30 min w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie. Wylej wodę i powtarzaj 2x przez łącznie 90 minut, za każdym razem wymieniając łaźnię wodną.
    9. Wylej wodę i dodaj roztwór rozwijający.
    10. Po dodaniu roztworu do wywoływania należy uważnie obserwować żel i obserwować pojawienie się pasków. W zależności od jakości plamy i masy załadowanej próbki, wywołanie może trwać od kilku sekund do kilku minut.
    11. Gdy tylko pożądane pasma staną się widoczne, natychmiast wyrzuć rozwijający się roztwór i krótko przemyj roztworem zatrzymującym.
    12. Wyrzuć roztwór zatrzymujący, umyj go i zastąp świeżym roztworem zatrzymującym. Pozostawić do namoczenia na 1 godzinę na bujaku lub shakerze.
    13. Myć przez noc w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie (jednak żel można zobrazować natychmiast po przemyciu roztworem).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Błękit alcianowy jest wykorzystywany do barwienia siarczanowanych GAG-ów 10; sygnał ten jest wzmacniany poprzez zastosowanie następującego po nim barwienia srebrem 11. Rysunek 1 przedstawia wizualną demonstrację procesu wywoływania barwienia srebrem. Jak pokazano, sygnał błękitu alcianowego reprezentujący GAG-i rozdzielone za pomocą elektroforezy ulega wzmocnieniu w miarę przenikania czynnika wywołującego do żelu poliakrylamidowego. Zazwyczaj p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

GAG odgrywają kluczową rolę w wielu różnych procesach biologicznych. Jedną z głównych funkcji siarczanowych GAG (takich jak HS i CS) jest oddziaływanie i wiązanie się z ligandami, które mogą zmieniać dalsze funkcje sygnalizacyjne. Ważnym wyznacznikiem powinowactwa wiązania GAG do ligandów pokrewnych jest długość łańcucha polimerowego GAG 8,9,14. Z tego powodu ważne jest, aby naukowcy byli w stanie określić z rozsądną precyzją ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL i EPS)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrowirówka stołowa Accuspin Micro17thermoFisher Scientific13-100-675Każda kombinacja mikrowirówki/wirnika stołowego o wydajności 14000 xG jest odpowiednia
Akrylamid (stały)thermoFisher ScientificBP170-100Klasa elektroforezy
Actinase ESigma AldrichP5147Mieszanina proteaz z S. griseus
Alcian Blue 8GX (ciało stałe)thermoFisher ScientificAC400460100
octan amonu (stały)thermoFisher ScientificA639-500klasa biologii molekularnej
Wodorotlenek amonu (płynny)thermoFisher ScientificA669S-500certyfikowany ACS
Nadsiarczan amonu (stały)thermoFisher ScientificBP179-25klasa elektroforezy
Barnstead GenPure Pro Water System oczyszczaniaThermoFisher Scientific10-451-217PKGKażdy system dejonizacji/oczyszczania wody jest dopuszczalnym substytutem
Kwas borowy (stały)thermoFisher ScientificA73-500Klasa biologii molekularnej
Błękit bromfenolowy (stały)thermoFisher ScientificB392-5
Octan wapnia (stały)ThermoFisher Scientific18-609-432Klasa biologii molekularnej
Chlorek wapnia (stały)ThermoFisher ScientificAC349610250klasy do biologii molekularnej
(3-((3-cholamidopropylo)dimetyloamonio)-1-propanosulfonian)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitynaza ABCSigma AldrichC3667
Kryterium pusta kaseta do PAGE (grubość 1,0 mm, 12 + 2 dołki)Bio-Rad3459901Wystarczy dowolny system kaset odlewniczych PAGE o grubości 1,0 mm
System Criterion PAGE Cell (ogniwo i zasilacz)Bio-Rad1656019każdy porównywalny pionowy żelowy system PAGE będzie działał)
Dichlorometan (ciecz)thermoFisher ScientificAC610931000certyfikowana przez ACS
EDTA sól disodowa (stała)thermoFisher Scientific02-002-786Molekularny klasa biologiczna
Lodowcowy kwas octowy (płynny)thermoFisher ScientificA35-500Certyfikowany ACS
Glicyna (stała)thermoFisher ScientificG48-500Klasa elektroforezy
Heparanaza I/IIISigma AldrichH3917Z Flavobacterium heparinum
Decasacharyd pochodzący z heparyny (dp10)galen scientificHO10
Heksazacharda pochodząca z heparyny (dp6)Galen scientificHO06
Oligosacharydy pochodzące z heparyny (dp20)galen scientificHO20
Kwas solny (płynny)thermoFisher ScientificA466-250
LiofilizatorLabconco7752020Każdy liofilizator, który może osiągnąć -40C i 0,135 Torr, będzie działał; można go również zastąpić rotacyjnym koncentratorem próżni
Metanol (płynny)thermoFisher ScientificA412-500Certyfikowany żel do
obrazowania molekularnego ACS Doc XR SystemBio-Rad170-8170Każdy porównywalny system obrazowania żeli jest dopuszczalnym substytutem
N,N'-metyleno-bis-akryloamid (stały)thermoFisher ScientificBP171-25Klasa do elektroforezy
Czerwony fenolowy (stały)thermoFisher ScientificP74-10Wolny kwas
Q Mini H Kolumna jonowymiennaVivapureVS-IX01QH24Kolumna jonowymienna musi mieć minimalną objętość ładunku 0,4 ml, pH robocze 2-12 i selektywność dla grup jonowych o pKa
11 Azotan srebra (stały)octan sodu (stały)certyfikatemACS ThermoFisher ScientificS181-25
stały)ThermoFisher ScientificS210-500Klasa biologii molekularnej
Chlorek sodu (stały)thermoFisher ScientificS271-500Klasa biologii molekularnej
Wodorotlenek sodu (stały)thermoFisher ScientificS392-212
Sacharoza (stała)thermoFisher ScientificBP220-1Klasa biologii molekularnej
TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina)thermoFisher ScientificBP150-20Klasa elektroforezy
Podstawa Tris (stała)thermoFisher ScientificBP152-500klasy biologii molekularnej
, 0,5 mL, odcięcie masy cząsteczkowej 3000 DaAmiconUFC500324Można stosować jednostki filtrujące o większej objętości, w zależności od wielkości próbki.
Mocznik (stały)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Każdy rotacyjny koncentrator próżni będzie działał; można go zastąpić liofilizatorem
Filtr próżniowy, jednorazowego użytku, 0,22uM porów PES, objętość 500 mlthermoFisher Scientific569-0020Dopuszczalne alternatywne objętości i materiały filtracyjne
Detergent CHAPS z ( Ultra filtry odśrodkowe

Bibliografia

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie glikozaminoglikan wsiarczan heparanusiarczan chondroitynybarwienie b kitem Alcianemoczyszczanie glikozaminoglikan wanaliza glikokaliksudrabinka oligosacharydowap ukanie oskrzelop cherzykowe
Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.