Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

André Nicolau Aquime Gonçalves; Vanessa Escolano Maso; Ícaro Maia Santos de Castro; Amanda Pereira Vasconcelos; Rodrigo Luiz Tomio Ogava; Helder I Nakaya

doi:10.3791/62324

Method Article

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

DOI:

10.3791/62324

⸱

March 5th, 2022

André Nicolau Aquime Gonçalves¹^,² , Vanessa Escolano Maso³ , Ícaro Maia Santos de Castro²^,³ , Amanda Pereira Vasconcelos³ , Rodrigo Luiz Tomio Ogava²^,³ , Helder I Nakaya²^,³^,⁴

¹Laboratory of Pathology of Infectious Diseases, Department of Pathology, Medical School, University of São Paulo, ²Scientific Platform Pasteur USP, ³Department of Clinical and Toxicological Analyses, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, ⁴Hospital Israelita Albert Einstein

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny mogą powodować wiele różnych chorób zakaźnych. Procesy biologiczne wywołane przez gospodarza w odpowiedzi na zakażenie określają nasilenie choroby. Aby zbadać takie procesy, naukowcy mogą wykorzystać techniki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (sekwencje RNA), które mierzą dynamiczne zmiany transkryptomu gospodarza na różnych etapach infekcji, wyniki kliniczne lub ciężkość choroby. Badanie to może prowadzić do lepszego zrozumienia chorób, a także do odkrycia potencjalnych celów leków i metod leczenia. Przedstawiony tutaj protokół opisuje kompletny potok do analizy danych sekwencjonowania RNA od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej. Pipeline jest podzielony na pięć etapów: (1) kontrola jakości danych; (2) mapowanie i adnotacja genów; (3) analiza statystyczna w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji i genów o współekspresji; (4) określenie stopnia molekularnego zaburzeń próbek; oraz (5) analiza funkcjonalna. Krok 1 usuwa artefakty techniczne, które mogą mieć wpływ na jakość dalszych analiz. W kroku 2 geny są mapowane i opisywane zgodnie ze standardowymi protokołami bibliotecznymi. Analiza statystyczna w kroku 3 identyfikuje geny, które są różnie wyrażane lub współeksprymowane w zakażonych próbkach w porównaniu z genami niezakażonymi. Zmienność próbki i obecność potencjalnych biologicznych wartości odstających są weryfikowane przy użyciu podejścia molekularnego stopnia perturbacji w kroku 4. Wreszcie, analiza funkcjonalna w kroku 5 ujawnia szlaki związane z fenotypem choroby. Przedstawiona linia produkcyjna ma na celu wsparcie naukowców w analizie danych sekwencyjnych RNA z badań interakcji gospodarz-patogen oraz napędzanie przyszłych eksperymentów in vitro lub in vivo, które są niezbędne do zrozumienia molekularnego mechanizmu infekcji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arbowirusy, takie jak denga, żółta febra, chikungunya i zika, były szeroko kojarzone z kilkoma endemicznymi epidemiami i stały się jednym z głównych patogenów odpowiedzialnych za infekowanie ludzi w ostatnich dziesięcioleciach1^,². Osoby zakażone wirusem chikungunya (CHIKV) często mają gorączkę, ból głowy, wysypkę, wielostawowość i zapalenie stawów³^,⁴^,⁵. Wirusy mogą zaburzać ekspresję genów w komórce i wpływać na różne szlaki sygnałowe gospodarza. Ostatnio w badaniach transkryptomu krwi wykorzystano sekwencję RNA do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) związanych z ostrym zakażeniem CHIKV w porównaniu z rekonwalescencją⁶ lub zdrowymi grupą kontrolną⁷. Dzieci zakażone CHIKV miały podwyższoną regulację genów, które są zaangażowane w wrodzoną odporność, takich jak te związane z czujnikami komórkowymi wirusowego RNA, sygnalizacją JAK/STAT i szlakami sygnałowymi receptorów toll-podobnych⁶. Dorośli z ostrym zakażeniem CHIKV wykazywali również indukcję genów związanych z odpornością wrodzoną, takich jak te związane z monocytami i aktywacją komórek dendrytycznych oraz z odpowiedziami przeciwwirusowymi⁷. Szlaki sygnałowe wzbogacone o geny regulowane w dół obejmowały te związane z odpornością adaptacyjną, takie jak aktywacja i różnicowanie limfocytów T oraz wzbogacanie w komórkach T i B⁷.

Do analizy danych transkryptomu genów gospodarza i patogenu można użyć kilku metod. Często przygotowanie biblioteki sekwencyjnej RNA rozpoczyna się od wzbogacenia dojrzałych transkryptów poli-A. Ten etap usuwa większość rybosomalnego RNA (rRNA), a w niektórych przypadkach wirusowe/bakteryjne RNA. Jednakże, gdy kwestia biologiczna obejmuje wykrywanie transkryptów patogenu, a RNA jest sekwencjonowane niezależnie od poprzedniej selekcji, wiele innych różnych transkryptów można wykryć przez sekwencjonowanie. Na przykład wykazano, że subgenomowe mRNA są ważnym czynnikiem weryfikującym nasilenie chorób⁸. Ponadto w przypadku niektórych wirusów, takich jak CHIKV i SARS-CoV-2, nawet biblioteki wzbogacone o poli-A generują odczyty wirusów, które można wykorzystać w dalszych analizach⁹^,¹⁰. Koncentrując się na analizie transkryptomu gospodarza, naukowcy mogą badać zakłócenia biologiczne w próbkach, identyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji i wzbogacone szlaki oraz generować moduły koekspresji⁷^,¹¹^,¹². Protokół ten podkreśla analizy transkryptomu pacjentów zakażonych CHIKV i osób zdrowych przy użyciu różnych podejść bioinformatycznych (Rysunek 1A). Do uzyskania reprezentatywnych wyników wykorzystano dane z wcześniej opublikowanego badania⁷ składającego się z 20 zdrowych i 39 osób z ostrym zakażeniem CHIKV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki użyte w tym protokole zostały zatwierdzone przez komisje etyczne zarówno z Wydziału Mikrobiologii Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo, jak i z Uniwersytetu Federalnego w Sergipe (protokoły: odpowiednio 54937216.5.0000.5467 i 54835916.2.0000.5546).

1. Instalacja pulpitu Docker

UWAGA: Kroki przygotowania środowiska Docker różnią się w zależności od systemu operacyjnego. Dlatego użytkownicy komputerów Mac muszą postępować zgodnie z krokami wymienionymi jako 1.1, użytkownicy systemu Linux muszą postępować zgodnie z krokami wymienionymi jako 1.2, a użytkownicy systemu Windows muszą postępować zgodnie z krokami wymienionymi jako 1.3.

Zainstaluj w systemie MacOS.
1. Uzyskaj dostęp do witryny internetowej Pobierz platformę Docker (spis materiałów), kliknij pozycję Docker Desktop dla komputerów Mac, a następnie kliknij link Pobierz z usługi Docker Hub.
2. Pobierz plik instalacyjny, klikając przycisk Pobierz Docker.
3. Uruchom plik Docker.dmg, aby otworzyć instalator, a następnie przeciągnij ikonę do folderu Aplikacje. Zlokalizuj i wykonaj Docker.app w folderze Aplikacje, aby uruchomić program.
  UWAGA: Menu specyficzne dla oprogramowania na górnym pasku stanu wskazuje, że oprogramowanie jest uruchomione i że jest dostępne z terminala.
Zainstaluj program kontenera w systemie operacyjnym Linux.
1. Uzyskaj dostęp do witryny internetowej Pobierz platformę Docker Linux (tabela materiałów) i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi instalowania przy użyciu sekcji repozytorium dostępnej w linku Repozytorium platformy Docker Linux.
2. Zaktualizuj wszystkie pakiety Linuksa za pomocą wiersza poleceń:
  sudo apt-get update
3. Zainstaluj wymagane pakiety w Docker:
  sudo apt-get install apt-transport-https certyfikaty ca curl gnupg lsb-release
4. Utwórz plik kluczy archiwum oprogramowania:
  curl -fsSL https://download.docker.com/linux/ubuntu/gpg | sudo gpg --dearmor -o /usr/share/keyrings/docker-archive-keyring.gpg
5. Dodaj informacje o deb platformy Docker w pliku source.list:
  echo "deb [arch=amd64 signed-by=/usr/share/keyrings/docker-archive-keyring.gpg] https://download.docker.com/linux/ubuntu $(lsb_release -cs) stable" | sudo tee /etc/apt/sources.list.d/docker.list > /dev/null
6. Ponownie zaktualizuj wszystkie pakiety, w tym te ostatnio dodane:
  sudo apt-get update
7. Zainstaluj wersję na komputery:
  sudo apt-get install docker-ce docker-ce-cli containerd.io
8. Wybierz obszar geograficzny i strefę czasową, aby zakończyć proces instalacji.
Zainstaluj program kontenera w systemie operacyjnym Windows.
1. Wejdź na stronę Get Docker (Spis materiałów) i kliknij Rozpocznij. Znajdź instalatora programu Docker Desktop dla systemu Windows. Pobierz pliki i zainstaluj je lokalnie na komputerze.
2. Po pobraniu uruchom plik instalacyjny (.exe) i zachowaj domyślne parametry. Upewnij się, że dwie opcje Zainstaluj wymagane składniki systemu Windows dla WSL 2 i Dodaj skrót do pulpitu są oznaczone.
  UWAGA: W niektórych przypadkach, gdy to oprogramowanie próbuje uruchomić usługę, wyświetla błąd: Instalacja WSL jest niekompletna. Aby rozwiązać ten błąd, wejdź na stronę internetową WSL2-Kernel (Tabela materiałów).
3. Pobierz i zainstaluj najnowsze jądro WSL2 Linux.
4. Uzyskaj dostęp do terminala PowerShell jako administrator i wykonaj polecenie:
  dism.exe /online /enable-feature /featurename:Microsoft-Windows-Subsystem-Linux /all /norestart
5. Upewnij się, że oprogramowanie Docker Desktop zostało pomyślnie zainstalowane.
Pobierz obraz z repozytorium CSBL na Docker hub (Tabela materiałów).
1. Otwórz program Docker Desktop i sprawdź, czy stan to "uruchomiony" w lewym dolnym rogu paska narzędzi.
2. Przejdź do wiersza polecenia terminala programu Windows PowerShell. Pobierz obraz kontenera systemu Linux dla tego protokołu z repozytorium CSBL w centrum platformy Docker. Wykonaj następujące polecenie, aby pobrać obraz:
  docker pull csblusp/transcriptome
  UWAGA: Po pobraniu obrazu plik można zobaczyć w programie Docker Desktop. Aby utworzyć kontener, użytkownicy systemu Windows muszą wykonać krok 1.5, a użytkownicy systemu Linux muszą wykonać krok 1.6.
Zainicjuj kontener serwera w systemie operacyjnym Windows.
1. Wyświetl plik obrazu platformy Docker w menedżerze aplikacji klasycznych z paska narzędzi i uzyskaj dostęp do strony Obrazy.
  UWAGA: Jeśli obraz potoku został pobrany pomyślnie, dostępny będzie obraz csblusp/transcriptome.
2. Zainicjuj kontener z obrazu csblusp/transcriptome, klikając przycisk Uruchom. Rozwiń Ustawienia opcjonalne, aby skonfigurować kontener.
3. Zdefiniuj nazwę kontenera (np. serwer).
4. Skojarz folder na komputerze lokalnym z folderem wewnątrz okna dokowanego. W tym celu określ ścieżkę hosta. Ustaw folder na komputerze lokalnym, w którym będą przechowywane przetworzone dane, które zostaną pobrane na końcu. Ustaw ścieżkę kontenera. Zdefiniuj i połącz folder kontenera csblusp/transcriptome ze ścieżką komputera lokalnego (użyj nazwy "/opt/transferdata" dla ścieżki kontenera).
5. Następnie kliknij Uruchom, aby utworzyć kontener csblusp/transcriptome.
6. Aby uzyskać dostęp do terminala Linux z kontenera csblusp/transcriptome, kliknij przycisk CLI.
7. Wpisz terminal bash, aby mieć lepsze wrażenia. W tym celu wykonaj polecenie:
  Bash
8. Po wykonaniu polecenia bash upewnij się, że terminal pokazuje (root@:/#):
  root@ac12c583b731:/#
Zainicjuj kontener serwera dla systemu operacyjnego Linux.
1. Wykonaj to polecenie, aby utworzyć kontener platformy Docker na podstawie obrazu:
  docker run -d -it --rm --name server -v <Ścieżka hosta>:/opt/transferdata csblusp/transcriptome
  UWAGA: <ścieżka hosta>: zdefiniuj ścieżkę do komputera folderu lokalnego.
2. Wykonaj to polecenie, aby uzyskać dostęp do terminala poleceń kontenera platformy Docker:
  docker exec -it server bash
3. Upewnij się, że terminal Linux może wykonywać dowolne programy/skrypty za pomocą wiersza poleceń.
4. Po wykonaniu polecenia bash upewnij się, że terminal pokazuje (root@:/#):
  root@ac12c583b731:/#
  UWAGA: Hasło roota to domyślnie "transcriptome". W razie potrzeby hasło roota można zmienić, wykonując polecenie:
  passwd
5. Najpierw wykonaj polecenie źródłowe, aby addpath.sh, aby upewnić się, że wszystkie narzędzia są dostępne. Wykonaj polecenie:
  źródło /opt/addpath.sh
Sprawdź strukturę folderu sekwencjonowania RNA.
1. Uzyskaj dostęp do folderu skryptów potoku transkryptomu i upewnij się, że wszystkie dane z sekwencjonowania RNA są przechowywane w folderze: /home/transcriptome-pipeline/data.
2. Upewnij się, że wszystkie wyniki uzyskane z analizy są przechowywane w folderze ścieżki /home/transcriptome-pipeline/results.
3. Upewnij się, że pliki referencyjne genomu i adnotacji są przechowywane w folderze ścieżki /home/transcriptome-pipeline/datasets. Pliki te pomogą we wszystkich analizach.
4. Upewnij się, że wszystkie skrypty są przechowywane w folderze ścieżki /home/transcriptome-pipeline/scripts i oddzielone każdym krokiem, jak opisano poniżej.
Pobierz adnotację i genom ludzki.
1. Uzyskaj dostęp do folderu skryptów:
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
2. Wykonaj to polecenie, aby pobrać odniesienie do ludzkiego genomu:
  bash downloadGenome.sh
3. Aby pobrać adnotację, wykonaj polecenie:
  bash downloadAnnotation.sh
Zmień adnotację lub wersję genomu referencyjnego.
1. Otwórz downloadAnnotation.sh i downloadGenome.sh, aby zmienić adres URL każdego pliku.
2. Skopiuj pliki downloadAnnotation.sh i downloadGenome.sh do obszaru przesyłania i edytuj je w lokalnym systemie OS.
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
  cp downloadAnnotation.sh downloadGenome.sh /opt/transferdata
3. Otwórz folder Ścieżka hosta, który został wybrany do połączenia między hostem a kontenerem platformy Docker w kroku 1.5.4.
4. Edytuj pliki za pomocą preferowanego edytora i zapisz. Na koniec umieść zmodyfikowane pliki w folderze skryptu. Wykonaj polecenie:
  cd /opt/transferdata
  cp downloadAnnotation.sh downloadGenome.sh /home/potok-transkryptomu/skrypty
  UWAGA: Pliki te można edytować bezpośrednio za pomocą edytora vim lub nano Linux.
Następnie skonfiguruj narzędzie fastq-dump za pomocą wiersza poleceń:
vdb-config --interactive
UWAGA: Pozwala to na pobranie plików sekwencjonowania z przykładowych danych.
1. Poruszaj się po stronie Narzędzia za pomocą Tab i wybierz opcję bieżącego folderu. Przejdź do opcji Zapisz i kliknij OK. Następnie wyjdź z narzędzia fastq-dump.
Rozpocznij pobieranie odczytów z poprzednio opublikowanego artykułu⁷. Dla każdej próbki wymagany jest numer dostępu. Numery można uzyskać ze strony internetowej NCBI (Tabela materiałów).
UWAGA: Aby przeanalizować dane RNA-Seq dostępne w publicznych bazach danych, wykonaj krok 1.12. Aby przeanalizować prywatne dane sekwencyjne RNA, wykonaj krok 1.13.
Analizowanie określonych danych publicznych.
1. Wejdź na stronę internetową National Center for Biotechnology Information (NCBI) i wyszukaj słowa kluczowe dla określonego tematu.
2. Kliknij link Wynik dla BioProject w sekcji Genomy.
3. Wybierz i kliknij konkretne badanie. Kliknij eksperymenty. Otworzy się nowa strona, na której znajdują się wszystkie próbki dostępne dla tego badania.
4. Kliknij na "Wyślij do:" nad numerem dostępu. W opcji "Wybierz miejsce docelowe" wybierz opcję Plik i format, wybierz UruchomInfo. Kliknij "Utwórz plik", aby wyeksportować wszystkie informacje z biblioteki.
5. Zapisz plik SraRunInfo.csv w ścieżce hosta zdefiniowanej w kroku 1.5.4 i uruchom skrypt pobierania:
  cp /opt/transferdata/SraRunInfo.csv /home/potok-transkryptomu/data
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
  bash downloadAllLibraries.sh
Analizuj prywatne i niepublikowane dane sekwencjonowania.
1. Uporządkuj dane sekwencjonowania w folderze o nazwie Reads.
  UWAGA: W folderze Reads utwórz jeden folder dla każdej próbki. Te foldery muszą mieć tę samą nazwę dla każdej próbki. Dodaj dane każdej próbki w jej katalogu. W przypadku, gdy jest to sekwencja RNA-Seq z parowanym końcem, każdy katalog próbki powinien zawierać dwa pliki FASTQ, które muszą przedstawiać nazwy kończące się zgodnie ze wzorcami {sample}_1.fastq.gz i {sample}_2.fastq.gz, odpowiednio sekwencjami do przodu i do tyłu. Na przykład przykład o nazwie "Healthy_control" musi mieć katalog o tej samej nazwie i pliki FASTQ o nazwach Healthy_control_1.fastq.gz i Healthy_control_2.fastq.gz. Niemniej jednak, jeśli sekwencjonowanie biblioteki jest strategią jednokierunkową, do dalszej analizy należy zapisać tylko jeden plik odczytu. Na przykład ten sam przykład, "Kontrola w dobrej kondycji", musi mieć unikatowy plik FASTQ o nazwie Healthy_control.fastq.gz.
2. Utwórz plik fenotypowy zawierający wszystkie nazwy próbek: Nazwij pierwszą kolumnę jako "Próbka", a drugą kolumnę jako "Klasa". Wypełnij kolumnę Próbka nazwami próbek, które muszą być takie same jak katalogi próbek, a kolumnę Klasa wypełnij grupą fenotypową każdej próbki (np. kontrolną lub zakażoną). Na koniec zapisz plik o nazwie "metadata.tsv" i wyślij go do katalogu /home/transcriptome-pipeline/data/. Zapoznaj się z istniejącym metadata.tsv, aby zrozumieć format pliku fenotypowego.
  cp /opt/transferdata/metadata.tsv
  /home/potok-transkryptomu/data/metadata.tsv
3. Uzyskaj dostęp do katalogu Ścieżka hosta zdefiniowanego w kroku 1.5.4 i skopiuj przykłady nowych katalogów strukturalnych. Na koniec przenieś przykłady z /opt/transferdata do katalogu danych potoku.
  cp -rf /opt/transferdata/reads/*
  /home/potok-transkryptomu/dane/odczyty/
Zwróć uwagę, że wszystkie odczyty są przechowywane w folderze /home/transcriptome-pipeline/data/reads.

2. Kontrola jakości danych

UWAGA: Oceń graficznie prawdopodobieństwo wystąpienia błędów w odczytach sekwencyjnych. Usuń wszystkie sekwencje techniczne, np. adaptery.

Uzyskaj dostęp do jakości sekwencjonowania bibliotek za pomocą narzędzia FastQC.
1. Aby wygenerować wykresy jakości, uruchom program fastqc. Wykonaj polecenie:
  bash FastQC.sh
  UWAGA: Wyniki zostaną zapisane w folderze /home/transcriptome-pipeline/results/FastQC. Ponieważ adaptery sekwencji są używane do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania, w niektórych przypadkach fragmenty sekwencji adapterów mogą zakłócać proces mapowania.
Usuń sekwencję adaptera i odczyty o niskiej jakości. Uzyskaj dostęp do folderu Skrypty i wykonaj polecenie narzędzia Trimmomatic:
cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
bash trimmomatic.sh
UWAGA: Parametry używane do filtra sekwencjonowania to: Usuń wiodące zasady niskiej jakości lub 3 zasady (poniżej jakości 3) (WIODĄCE: 3); Usuń końcowe zasady niskiej jakości lub 3 zasady (poniżej jakości 3) (KOŃCOWE: 3); Skanuj odczyt za pomocą okna przesuwnego o szerokości 4 podstaw, tnąc, gdy średnia jakość na bazę spadnie poniżej 20 (SLIDINGWINDOW: 4:20); a Drop czyta się poniżej długości 36 zasad (MINLEN: 36). Parametry te można zmienić, edytując plik skryptu Trimmomatic.
1. Upewnij się, że wyniki są zapisane w następującym folderze: /home/transcriptome-pipeline/results/trimreads. Wykonaj polecenie:
  ls /home/potok-transkryptomu/wyniki/trimreads

3. Mapowanie i adnotacja próbek

UWAGA: Po uzyskaniu dobrej jakości odczytów, muszą one zostać zmapowane do genomu referencyjnego. W tym kroku mapowanie STAR zostało użyte do mapowania przykładowych przykładów. Narzędzie do mapowania STAR wymaga 32 GB pamięci RAM do załadowania i wykonania odczytów i mapowania genomu. W przypadku użytkowników, którzy nie mają 32 GB pamięci RAM, można użyć już zmapowanych odczytów. W takich przypadkach przejdź do kroku 3.3 lub użyj mappera Bowtie2. Ta sekcja zawiera skrypty dla STAR (wyniki pokazane na wszystkich rysunkach) i Bowtie2 (maper wymagany z małą ilością pamięci).

Najpierw indeksuj genom referencyjny do procesu mapowania:
1. Uzyskaj dostęp do folderu Skrypty za pomocą wiersza poleceń:
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
2. W przypadku mapera STAR wykonaj:
  bash indexGenome.sh
3. W przypadku mapowania Bowtie wykonaj:
  bash indexGenomeBowtie2.sh
Wykonaj następujące polecenie, aby zmapować filtrowane odczyty (uzyskane z kroku 2) na genom referencyjny (wersja GRCh38). Zarówno mappery STAR, jak i Bowtie2 są wykonywane przy użyciu parametrów domyślnych.
1. W przypadku mapera STAR wykonaj:
  mapSTAR.sh bash
2. Dla mappera Bowtie2 wykonaj:
  bash mapBowtie2.sh
  UWAGA: Ostateczne wyniki to pliki binarnej mapy wyrównania (BAM) dla każdej próbki przechowywane w /home/transcriptome-pipeline/results/mapreads.
Dodawanie adnotacji do zmapowanych odczytów za pomocą narzędzia FeatureCounts w celu uzyskania nieprzetworzonych liczb dla każdego genu. Uruchom skrypty, które dodają adnotacje do reads.
UWAGA: Narzędzie FeatureCounts jest odpowiedzialne za przypisywanie zmapowanych odczytów sekwencjonowania do cech genomowych. Najważniejsze aspekty adnotacji genomu, które można zmienić w wyniku pytania biologicznego, obejmują wykrywanie izoform, wielokrotne zmapowane odczyty i połączenia ekson-ekson, odpowiadające parametrom, GTF.attrType="gene_name" dla genu lub nie określaj parametrów dla poziomu meta-cechy, allowMultiOverlap=TRUE i juncCounts=TRUE, odpowiednio.
1. Uzyskaj dostęp do folderu skryptów za pomocą wiersza poleceń:
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
2. Aby dodać adnotacje do zmapowanych odczytów w celu uzyskania nieprzetworzonych liczb na gen, wykonaj wiersz polecenia:
  Adnotacja w skrypcie. R
  UWAGA: Parametry użyte w procesie adnotacji to: skrócona nazwa genu zwrotu (GTF.attrType="gene_name"); zezwalaj na wielokrotne nakładanie się (allowMultiOverlap = TRUE); i wskaż, że biblioteka jest sparowana (isPairedEnd=TRUE). W przypadku strategii jednokońcowej należy użyć parametru isPairedEnd=FALSE. Wyniki zostaną zapisane w folderze /home/transcriptome-pipeline/countreads.
Normalizuj ekspresję genów.
UWAGA: Normalizacja ekspresji genów jest niezbędna do porównania wyników między wynikami (np. zdrowymi i zakażonymi próbkami). Normalizacja jest również wymagana do przeprowadzenia analiz koekspresji i stopnia molekularnego perturbacji.
1. Uzyskaj dostęp do folderu Skrypty za pomocą wiersza poleceń:
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
2. Normalizuj ekspresję genów. W tym celu wykonaj wiersz poleceń:
  Rscript normalizuje próbki. R
  UWAGA: Wyrażenie nieprzetworzonych liczb w tym eksperymencie zostało znormalizowane przy użyciu metod Trimmed Mean of M-values (TMM) i Count Per Million (CPM). Ten krok ma na celu usunięcie różnic w ekspresji genów spowodowanych wpływem technicznym, poprzez normalizację rozmiaru biblioteki. Wyniki zostaną zapisane w folderze /home/transcriptome-pipeline/countreads.

4. Geny o zróżnicowanej ekspresji i geny o współekspresji

Zidentyfikuj geny o zróżnicowanej ekspresji przy użyciu pakietu EdgeR typu open source. Wiąże się to ze znalezieniem genów, których ekspresja jest wyższa lub niższa w porównaniu z kontrolą.
1. Uzyskaj dostęp do folderu Skrypty za pomocą wiersza poleceń:
  cd /home/potok-transkryptomu/skrypty
2. Aby zidentyfikować gen o zróżnicowanej ekspresji, wykonaj skrypt DEG_edgeR R za pomocą wiersza poleceń:
  Rscript DEG_edgeR.R
  UWAGA: Wyniki zawierające geny o zróżnicowanej ekspresji zostaną zapisane w folderze /home/transcriptome-pipeline/results/degs. Dane mogą być przesyłane do komputera osobistego.
Pobierz dane z kontenera csblusp/transcriptome.
1. Przenieś przetworzone dane z potoku /home/transcriptome-pipeline do folderu /opt/transferdata (komputer lokalny).
2. Skopiuj wszystkie pliki na komputer lokalny, wykonując wiersz poleceń:
  cp -rf /home/potok-transkryptomu/wyniki /opt/transferdata/pipeline
  cp -rf /home/potok-transkryptomu/dane /opt/transferdata/pipeline
  UWAGA: Teraz przejdź do komputera lokalnego, aby upewnić się, że wszystkie wyniki, zestawy danych i dane są dostępne do pobrania w ścieżce hosta.
Zidentyfikuj moduły współwyrażeń.
1. Wejdź na stronę internetową narzędzia do identyfikacji modułów koekspresji (CEMiTool) (tabela
  Materiały). To narzędzie identyfikuje moduły współwyrażeń na podstawie zestawów danych wyrażeń dostarczonych przez użytkowników. Na stronie głównej kliknij Uruchom w prawym górnym rogu. Spowoduje to otwarcie nowej strony do przesłania pliku wyrażenia.
2. Kliknij Wybierz plik poniżej sekcji Plik wyrażeń i prześlij znormalizowaną macierz ekspresji genów "tmm_expression.tsv" ze ścieżki hosta.
  UWAGA: Krok 4.4. nie jest obowiązkowe.
Poznaj biologiczne znaczenie modułów koekspresji.
1. Kliknij Wybierz plik w sekcji Przykładowe fenotypy i prześlij plik z przykładowymi fenotypami metadata_cemitool.tsv z kroku pobierania danych 4.2.2., aby przeprowadzić analizę wzbogacenia zestawu genów (GSEA).
2. Naciśnij Wybierz plik w sekcji Interakcje genów, aby przesłać plik z interakcjami genów (cemitool-interactions.tsv). Możliwe jest skorzystanie z pliku interakcji genów dostarczonego jako przykład przez webCEMiTool. Interakcje mogą być interakcjami białko-białko, czynnikami transkrypcyjnymi i ich transkrybowanymi genami lub szlakami metabolicznymi. Ten krok tworzy sieć interakcji dla każdego modułu współwyrażenia.
3. Kliknij na Wybierz plik w sekcji Zestawy genów, aby przesłać listę genów funkcjonalnie powiązanych w pliku w formacie Gene Matrix Transposed (GMT). Plik Gene Set umożliwia narzędziu przeprowadzenie analizy wzbogacenia dla każdego modułu koekspresji, tj. analizy nadreprezentacji (ORA).
  UWAGA: Ta lista genów może obejmować szlaki, terminy GO lub geny docelowe miRNA. Badacz może użyć modułów transkrypcji krwi (BTM) jako zestawów genów do tej analizy. Plik BTM (BTM_for_GSEA.gmt).
Ustaw parametry do wykonywania analiz koekspresji i uzyskaj jej wyniki.
1. Następnie rozwiń sekcję Parametr, klikając znak plus, aby wyświetlić parametry domyślne. W razie potrzeby zmień je. Zaznacz pole Zastosuj VST.
2. Wpisz wiadomość e-mail w sekcji E-mail, aby otrzymać wyniki jako wiadomość e-mail. Ten krok jest opcjonalny.
3. Naciśnij przycisk Uruchom CEMiTool.
4. Pobierz pełny raport z analizy, klikając przycisk Pobierz pełny raport w prawym górnym rogu. Spowoduje to pobranie skompresowanego pliku cemitool_results.zip.
5. Wyodrębnij zawartość cemitool_results.zip za pomocą programu WinRAR.
  UWAGA: Folder z wyodrębnioną zawartością zawiera kilka plików ze wszystkimi wynikami analizy i ich ustalonymi parametrami.

5. Określenie molekularnego stopnia perturbacji próbek

Molekularny stopień perturbacji (MDP) wersja internetowa.
1. Aby uruchomić MDP, wejdź na stronę MDP (Spis materiałów). MDP oblicza odległość molekularną każdej próbki od punktu odniesienia. Kliknij przycisk Uruchom.
2. Za pomocą linku Wybierz plik przekaż plik wyrażenia tmm_expression.tsv. Następnie przekaż plik danych fenotypowych metadata.tsv z kroku pobierania danych 4.2.2. Możliwe jest również przesłanie pliku adnotacji ścieżki w formacie GMT w celu obliczenia wyniku perturbacji szlaków związanych z chorobą.
3. Po przekazaniu danych zdefiniuj kolumnę Klasa, która zawiera informacje fenotypowe używane przez MDP. Następnie zdefiniuj klasę formantu, wybierając etykietę odpowiadającą klasie kontrolki.
  UWAGA: Istnieje kilka opcjonalnych parametrów, które będą miały wpływ na sposób obliczania wyników próbki. W razie potrzeby użytkownik jest w stanie zmienić metodę średniej statystycznej, odchylenie standardowe i najwyższy procent zaburzonych genów.
4. Następnie naciśnij przycisk Uruchom MDP, a zostaną wyświetlone wyniki MDP. Użytkownik może pobrać rysunki, klikając przycisk Pobierz wykres na każdej działce, a także wynik MDP na przycisku Pobierz plik z wynikami MDP.
  UWAGA: W przypadku pytań dotyczących sposobu przesyłania plików lub działania MDP, po prostu przejdź przez strony internetowe Samouczek i Informacje.

6. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego

Utwórz jedną listę DEG regulowanych w dół, a drugą DEG regulowanych w górę. Nazwy genów muszą być zgodne z symbolami genów Entrez. Każdy gen z listy musi być umieszczony w jednym wierszu.
Zapisz listę genów w formacie txt lub tsv.
Wejdź na stronę internetową Enrichr (Tabela materiałów), aby przeprowadzić analizę funkcjonalną.
Wybierz listę genów, klikając Wybierz plik. Wybierz jedną z listy stopni i naciśnij przycisk Prześlij.
Kliknij Pathways (Ścieżki) u góry strony, aby przeprowadzić analizę wzbogacenia funkcjonalnego z zastosowaniem podejścia ORA.
Wybierz bazę danych ścieżek. Baza danych ścieżek "Reactome 2016" jest szeroko stosowana w celu uzyskania biologicznego znaczenia danych dotyczących ludzi.
Kliknij ponownie nazwę bazy danych ścieżek. Wybierz opcję Wykres słupkowy i sprawdź, czy jest on posortowany według rankingu wartości p. Jeśli nie, klikaj wykres słupkowy, aż zostanie posortowany według wartości p. Ten wykres słupkowy zawiera 10 pierwszych ścieżek według wartości p.
Naciśnij przycisk Konfiguracja i wybierz kolor czerwony dla analizy genów regulowanych w górę lub niebieski kolor dla analizy genów regulowanych w dół. Zapisz wykres słupkowy w kilku formatach, klikając svg, png i jpg.
Wybierz Tabela i kliknij Eksportuj wpisy do tabeli w lewym dolnym rogu wykresu słupkowego, aby uzyskać wyniki analizy wzbogacenia funkcjonalnego w pliku txt.
UWAGA: Ten plik wyników wzbogacania funkcjonalnego zawiera w każdym wierszu nazwę jednego szlaku, liczbę nakładających się genów między przesłaną listą DEG a szlakiem, wartość p, skorygowaną wartość p, iloraz szans, łączny wynik oraz symbol genu genów obecnych na liście DEG, które uczestniczą w szlaku.
Powtórz te same kroki z innymi listą stopni.
UWAGA: Analiza z DEG regulowanymi w dół zapewnia szlaki wzbogacone dla genów regulowanych w dół, a analiza z genami regulowanymi w górę zapewnia ścieżki wzbogacone o geny regulowane w górę.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Środowisko obliczeniowe do analiz transkryptomu zostało stworzone i skonfigurowane na platformie Docker. Takie podejście pozwala początkującym użytkownikom Linuksa na korzystanie z systemów terminali Linux bez wiedzy na temat zarządzania a priori. Platforma Docker wykorzystuje zasoby systemu operacyjnego hosta do stworzenia kontenera usługi, który zawiera narzędzia określonych użytkowników (Rysunek 1B). Stworzono kontener oparty na dystrybucji Linux OS Ubuntu 20.04, który został w pełni skon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie bibliotek sekwencjonowania jest kluczowym krokiem w kierunku jak najlepszego odpowiedzi na pytania biologiczne. Rodzaj transkrypcji będących przedmiotem zainteresowania badania wskaże, jaki rodzaj biblioteki sekwencjonowania zostanie wybrany, i będzie napędzał analizy bioinformatyczne. Na przykład na podstawie sekwencjonowania interakcji patogenu i gospodarza, w zależności od rodzaju sekwencjonowania, możliwe jest zidentyfikowanie sekwencji z obu lub tylko z transkryptów gospodarza.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HN jest finansowany przez FAPESP (numery grantów: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 i 2013/08216-2) oraz CNPq (313662/2017-7).

Jesteśmy szczególnie wdzięczni następującym grantom dla stypendystów: ANAG (Proces FAPESP 2019/13880-5), VEM (Proces FAPESP 2019/16418-0), IMSC (Proces FAPESP 2020/05284-0), APV (Proces FAPESP 2019/27146-1) oraz, RLTO (Proces CNPq 134204/2019-0).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
CEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	1.12.2	Odkrywanie i analiza modułów genów koekspresji w sposób w pełni automatyczny, przy jednoczesnym dostarczaniu przyjaznego dla użytkownika raportu HTML z wysokiej jakości wykresami.
	EdgeR Bioconductor (Opiekun: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])	3.30.3	Różnicowa analiza ekspresji profili ekspresji RNA-seq z replikacją biologiczną
EnhancedVolcano	Bioconductor (Opiekun: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])	1.6.0	Gotowe do publikacji wykresy wulkaniczne z ulepszonym kolorowaniem i etykietowaniem
FastQC	Babraham Bioinformatics	0.11.9	Ma na celu zapewnienie prostego sposobu przeprowadzania kontroli jakości surowych danych sekwencyjnych pochodzących z sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
FeatureCounts	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Przypisywanie zmapowanych odczytów sekwencjonowania do określonych cech genomowych
MDP	Computational Systems Biology Laboratory	1.8.0	Molekularny stopień perturbacji oblicza wyniki dla próbek danych transkryptomu na podstawie ich perturbacji z kontroli
R	R Core Group	4.0.3	Język programowania i środowisko wolnego oprogramowania do obliczeń statystycznych i grafiki
Zakład Bioinformatyki STAR	, Instytut Badań Medycznych Waltera i Elizy Hall	2.7.6a	Aligner zaprojektowany, aby sprostać wielu wyzwaniom związanym z mapowaniem danych sekwencyjnych RNA przy użyciu strategii uwzględniania dopasowań splicingów
Bowtie2	Uniwersytet Johnsa Hopkinsa	2.4.2	Ultraszybkie i wydajne pod względem pamięci narzędzie do wyrównywania odczytów sekwencjonowania do długich sekwencji referencyjnych
Trimmomatic	THE USADEL LAB	0.39	Przycinanie zadań sekwencji adaptera dla sparowanych i pojedynczych danych Illumina
Pobierz Docker	Docker	20.10.2	Tworzenie środowiska bioinformatycznego powtarzalnego i przewidywalnego (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-Kernel	Windows	NA	https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Pobierz Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Repozytorium Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
Strona internetowa MDP	Laboratorium Biologii Systemów Obliczeniowych	NA	https://mdp.sysbio.tools
Enrichr Strona internetowa	MaayanLab	NA	https://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool	Laboratorium Biologii Systemów Obliczeniowych	NA	https://cemitool.sysbio.tools/
gProfiler	Grupa Bioinformatyki, Algorytmiki i Eksploracji Danych	NA	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseq	Bioconductor (Opiekun: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])	NA	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
Badanie NCBI	NCBI NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weaver, S. C., Charlier, C., Vasilakis, N., Lecuit, M. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual Review of Medicine. 69, 395-408 (2018).
Burt, F. J., et al. Chikungunya virus: an update on the biology and pathogenesis of this emerging pathogen. The Lancet. Infectious Diseases. 17 (4), 107-117 (2017).
Hua, C., Combe, B. Chikungunya virus-associated disease. Current Rheumatology Reports. 19 (11), 69(2017).
Suhrbier, A., Jaffar-Bandjee, M. -C., Gasque, P. Arthritogenic alphaviruses-an overview. Nature Reviews Rheumatology. 8 (7), 420-429 (2012).
Nakaya, H. I., et al. Gene profiling of chikungunya virus arthritis in a mouse model reveals significant overlap with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 64 (11), 3553-3563 (2012).
Michlmayr, D., et al. Comprehensive innate immune profiling of chikungunya virus infection in pediatric cases. Molecular Systems Biology. 14 (8), 7862(2018).
Soares-Schanoski, A., et al. Systems analysis of subjects acutely infected with the Chikungunya virus. PLOS Pathogens. 15 (6), 1007880(2019).
Alexandersen, S., Chamings, A., Bhatta, T. R. SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication. Nature Communications. 11 (1), 6059(2020).
Wang, D., et al. The SARS-CoV-2 subgenome landscape and its novel regulatory features. Molecular Cell. 81 (10), 2135-2147 (2021).
Wilson, J. A. C., et al. RNA-Seq analysis of chikungunya virus infection and identification of granzyme A as a major promoter of arthritic inflammation. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006155(2017).
Gonçalves, A. N. A., et al. Assessing the impact of sample heterogeneity on transcriptome analysis of human diseases using MDP webtool. Frontiers in Genetics. 10, 971(2019).
Russo, P. S. T., et al. CEMiTool: a Bioconductor package for performing comprehensive modular co-expression analyses. BMC Bioinformatics. 19 (1), 56(2018).
Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool. PloS One. 12 (12), 0190152(2017).
Seyednasrollah, F., Laiho, A., Elo, L. L. Comparison of software packages for detecting differential expression in RNA-seq studies. Briefings in Bioinformatics. 16 (1), 59-70 (2015).
Zhang, B., Horvath, S. A general framework for weighted gene co-expression network analysis. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 4, Article17 (2005).
Cheng, C. W., Beech, D. J., Wheatcroft, S. B. Advantages of CEMiTool for gene co-expression analysis of RNA-seq data. Computers in Biology and Medicine. 125, 103975(2020).
Cardozo, L. E., et al. webCEMiTool: Co-expression modular analysis made easy. Frontiers in Genetics. 10, 146(2019).
de Lima, D. S., et al. Long noncoding RNAs are involved in multiple immunological pathways in response to vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 17121-17126 (2019).
Prada-Medina, C. A., et al. Systems immunology of diabetes-tuberculosis comorbidity reveals signatures of disease complications. Scientific Reports. 7 (1), 1999(2017).
Chen, E. Y., et al. Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool. BMC Bioinformatics. 14, 128(2013).
Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
Raudvere, U., et al. g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update). Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).
Young, M. D., Wakefield, M. J., Smyth, G. K., Oshlack, A. Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias. Genome Biology. 11 (2), 14(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles