Artykuł metodologiczny

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62326

⸱

17 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Centre for Atherothrombosis and Metabolic Disease, Hull York Medical School, University of Hull

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Streszczenie

Przewlekłe, niegojące się rany, które dotykają głównie osoby starsze i chore na cukrzycę, są znaczącym obszarem niezaspokojonych potrzeb klinicznych. Niestety, obecne metody leczenia ran przewlekłych są niewystarczające, a dostępne modele przedkliniczne słabo przewidują skuteczność kliniczną nowych terapii. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustowy, przedkliniczny model do oceny wielu aspektów reakcji naprawczej ludzkiej skóry. Rany o częściowej grubości powstały w ludzkiej skórze ex vivo i były hodowane w czasie gojenia. Biopsje rany skóry pobrano w utrwalaczu do procedury barwienia całego wierzchowca. Utrwalone próbki blokowano i inkubowano w przeciwciałie pierwszorzędowym, z wykrywaniem osiągniętym za pomocą fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego. Rany były barwione przeciwstawnie i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej przed obliczeniem procentowego zamknięcia rany (reepitelializacji) w każdej biopsji. Stosując ten protokół, ujawniamy, że rany wycinające o średnicy 2 mm utworzone w zdrowej skórze dawcy są w pełni ponownie nabłonkowane do 4-5 dnia po zranieniu. Wręcz przeciwnie, tempo zamykania się ran skóry cukrzycowej jest znacznie zmniejszone, czemu towarzyszy zaburzona reforma bariery. Połączenie ran skóry u ludzi z nowatorskim podejściem do barwienia całego mocowania pozwala na szybką i powtarzalną metodę ilościowego określania gojenia ran ex vivo. Reasumując, protokół ten stanowi cenną platformę do oceny skuteczności potencjalnych terapii ran, przekształcając badania przedkliniczne i walidację.

Wprowadzenie

Przewlekłe, niegojące się rany, które są często częste u osób starszych i chorych na cukrzycę, są głównie niedocenianym obszarem klinicznych niezaspokojonych potrzeb. Rany te stanowią poważne obciążenie fizyczne i psychiczne dla pacjentów i kosztują świadczeniodawców opieki zdrowotnej miliardy rocznie na leczenie1. Pomimo lepszego zrozumienia biologii ran i postępu technologicznego, do 40% ran przewlekłych nadal nie goi się zgodnie z najlepszymi standardami opieki2. Tak więc 14-26% pacjentów z owrzodzeniami stopy cukrzycowej wymaga następnie amputacji3, podczas gdy wskaźnik śmiertelności po 5 latach po amputacji wynosi około 70%4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych, skutecznych terapii w celu poprawy jakości życia pacjentów, przy jednoczesnym zmniejszeniu znacznego obciążenia opieki zdrowotnej wynikającego ze złego gojenia się ran. Słabo predykcyjne modele przedkliniczne pozostają istotną przeszkodą w opracowywaniu nowych, skutecznych terapii.

Naprawa ran to dynamiczny i wieloaspektowy proces obejmujący różnorodne typy komórek, niezliczone poziomy komunikacji i środowisko tkankowe, które jest czasowo przebudowywane. Gojenie się skóry opiera się na czterech głównych etapach naprawczych: hemostazie, zapaleniu, proliferacji i przebudowie macierzy. Etapy te ostatecznie zapobiegają utracie krwi i infekcji, zamykają powierzchnię rany (proces nazywany reepitelializacją) i przywracają skórę do stanu nieuszkodzonego5. Rany przewlekłe wiążą się z różnorodną etiologią i rozległymi zaburzeniami procesów gojenia6, co dodatkowo komplikuje identyfikację celów terapeutycznych. Niemniej jednak opracowano szeroką gamę modeli, aby zarówno wyjaśnić molekularne i komórkowe czynniki patologii ran, jak i przetestować nowe podejścia terapeutyczne7.

Najczęściej używanym modelem leczenia ran jest ostre zranienie u myszy. Myszy są bardzo podatne na badania mechanistyczne i dostarczają zweryfikowanych modeli starzenia się i cukrzycy8. Pomimo ogólnych podobieństw wykazanych między leczeniem myszy i ludzi, utrzymują się różnice między gatunkami w budowie skóry i dynamice gojenia. Oznacza to, że większość badań nad ranami mysimi nie przekłada się łatwo na clinic9. W związku z tym nastąpił nacisk na systemy in vitro i ex vivo o wysokiej stosowalności i translatowalności10,11.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół wykonywania ran wycinających częściową grubość w ludzkiej skórze ex vivo. Przedstawiamy również nasze podejście do barwienia całego wierzchowania jako wysoce powtarzalną metodę oceny gojenia się ludzkiej skóry ex vivo. Pokazujemy trajektorię naprawy naskórka (reepitelializacji) i późniejszego tworzenia bariery, oceniając szybkość zamykania się ran w zdrowej i cukrzycowej skórze ludzkiej. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób barwienie w całości można dostosować do stosowania z szeregiem przeciwciał w celu oceny różnych aspektów odpowiedzi leczniczej.

Protokół

Ludzka skóra została uzyskana od pacjentów poddawanych operacji rekonstrukcyjnej w Castle Hill Hospital i Hull Royal Infirmary (Hull, UK) na podstawie pełnej świadomej, pisemnej zgody pacjenta, wytycznych instytucjonalnych i zgody etycznej (LRECs: 17/SC/0220 i 19/NE/0150). Skórę bez cukrzycy pobrano od pacjentów poddawanych rutynowym zabiegom chirurgicznym (średni wiek = 68 lat). Skórę cukrzycową wybrano spośród dawców, u których stwierdzono cukrzycę typu II i owrzodzenia w wywiadzie (średni wiek = 81 lat). Próbki z operacji były transportowane w pożywkach hodowlanych i przetwarzane natychmiast po przybyciu do laboratorium. Wszystkie etapy eksperymentalne z wykorzystaniem nieutrwalonej tkanki ludzkiej przeprowadzono na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym klasy II.

1. Przygotowanie pożywek do hodowli skóry i odczynników barwiących

UWAGA: Wszystkie szczegóły dotyczące odczynników i materiałów eksploatacyjnych znajdują się w Tabeli materiałów. Upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt używany do przetwarzania i hodowli tkanek ludzkich są sterylne. Wysterylizuj narzędzia przed użyciem i odkaż środkiem dezynfekującym po kontakcie z tkanką. Przed utylizacją odkazić produkty przemiany materii w 1% środku dezynfekującym.

  1. Pożywka podtrzymująca: Uzupełnij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy w 2 mM L-glutaminy i 4% (v/v) roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy.
  2. Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) z antybiotykami: Dodaj 4% (v/v) roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy do HBSS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS): Przygotować DPBS, rozpuszczając 9,6 g proszku DPBS na litr wody destylowanej (dH2O). Autoklaw do sterylizacji i przechowywania w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  4. Pożywka dla wzrostu ludzkiej skóry: Uzupełnij DMEM o wysokiej zawartości glukozy 2 mM L-glutaminy, 1% (v / v) roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i 10% (v / v) płodową surowicę bydlęcą. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  5. Utrwalacz skóry: Do 450 ml dH2O dodać 40 ml roztworu formaldehydu, 10 ml lodowatego kwasu octowego, 4,5 g chlorku sodu i 0,25 g bromku alkilotrimetyloamoniowego. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) i zużyć w ciągu kilku dni.
    UWAGA: Utrwalacz jest niebezpieczny (drażniący i łatwopalny). Obchodź się z nimi ostrożnie i zutylizuj odpowiednią drogą.
  6. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Przygotować PBS do barwienia w całości, dodając 6 g chlorku sodu do 100 ml roztworu buforu fosforanowego i 900 ml dH2O.
  7. Bufor do płukania barwiący: Rozpuścić 0,5% (v/v) Triton X-100 w PBS.
  8. Bufor blokujący: Dodać 0,2% (w/v) azydku sodu i 2% (v/v) surowicy zwierzęcej do buforu do przemywania barwienia. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.
    UWAGA: Blokować w surowicy drugorzędowych gatunków przeciwciał gospodarza. Azydek sodu zapobiegnie rozwojowi bakterii podczas inkubacji.
  9. Roztwór roboczy DAPI: Przygotować zapas 5 mg/ml 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w dimetylosulfotlenku. Rozcieńczyć bulion w stosunku 1:1,000 w buforze do przemywania barwiącego, aby uzyskać roztwór roboczy DAPI o stężeniu 5 μg/mL.
  10. Blok peroksydazy: Dodać 0,3% (v/v) nadtlenku wodoru do buforu do barwienia. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Przechowywać w ciemności, aby zapobiec rozkładowi.
  11. Zestaw ABC-HRP:
    1. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP: 1 kropla biotynylowanej króliczej anty-koziej IgG w 5 ml buforu barwiącego. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.
      UWAGA: Użyty zestaw/wtórny będzie zależał od gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego.
    2. Odczynnik kompleksu awidyny-biotyny (ABC): 2 krople odczynnika A i 2 krople odczynnika B w 5 ml buforu do przemywania barwiącego. Odczynnik ABC należy przygotować co najmniej 30 minut przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
  12. Substrat peroksydazy: 3 krople odczynnika 1, 2 krople odczynnika 2, 2 krople odczynnika 3 i 2 krople nadtlenku wodoru w 5 ml dH2O. Substrat peroksydazy powinien być świeżo przygotowany bezpośrednio przed użyciem i nie może być przechowywany.

2. Przygotowanie skóry do zranienia

UWAGA: Te kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym klasy II.

  1. Zebrać skórę w pożywce i przetransportować do szafki BSL-2.
  2. Umieść skórę właściwą do dołu na sterylnej szalce Petriego o średnicy 90 mm i usuń tkankę tłuszczową sterylnymi nożyczkami.
  3. Umieść skórę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml HBSS z antybiotykami na 10 minut w temperaturze pokojowej. Wstrząsaj z przerwami, aby usunąć resztki krwi i tkanki tłuszczowej.
  4. Powtórz krok 2.3, używając nowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Umieścić skórę w świeżej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml HBSS, tym razem bez antybiotyków przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wstrząsnąć jak w kroku 2.3.
  6. Wykonaj ostatnie płukanie skóry, umieszczając skórę w nowej probówce z 25 ml DPBS. Skóra jest teraz gotowa do zranienia.

3. Tworzenie ran ex vivo ludzkiej skóry

UWAGA: Te kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym klasy II.

  1. Przygotuj naczynia z kulturami skóry przed zranieniem. Na szalce Petriego o średnicy 60 mm ułóż dwie sterylne wkładki chłonne i dodaj 4 ml podłoża do ludzkiej skóry przez bok szalki. Umieść sterylną nylonową membranę filtracyjną na stosie wkładów chłonnych.
    UWAGA: Media skórne mogą być zmieniane w zależności od wymaganych warunków leczenia. Na każdym kominie można hodować do trzech eksplantatów z ran
    2. .
  2. Osuszyć skórę od strony skóry na sterylnej gazie na szalce Petriego o średnicy 90 mm, aby usunąć resztki DPBS.
    UWAGA: Zapobiega to przesuwaniu się skóry podczas zranienia.
  3. Ułożyć skórę właściwą do dołu na czystym wieczku z szalką Petriego o średnicy 90 mm i osuszyć naskórek świeżą, sterylną gazą.
    UWAGA: Łatwiej jest owinąć skórę w pokrywie szalki Petriego niż w podstawie. Kolejne prace należy wykonać szybko, aby zapobiec wysuszeniu skóry.
  4. Trzymając skórę napiętą, dociśnij do skóry stemple biopsyjne o średnicy 2 mm i delikatnie przekręć. Nie przebijaj całkowicie skóry.
    UWAGA: Rany o częściowej grubości są przeznaczone do przebijania przez naskórek i częściowo do skóry właściwej. Może występować zmienność między dawcami i z miejsca na miejsce w zakresie siły wymaganej do powstania rany o częściowej grubości.
  5. Użyj zakrzywionych kleszczyków do tkanek zębatych, aby podnieść każdą stronę rany 2 mm i zaczepić zakrzywione nożyczki tęczówki pod raną 2 mm, aby równomiernie ją wyciąć.
  6. Biopsja wokół centralnej rany o średnicy 2 mm za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 6 mm w celu utworzenia eksplantatu o średnicy 6 mm z raną o częściowej grubości 2 mm pośrodku.
    UWAGA: Do nacięcia skóry można użyć stempla do biopsji o średnicy 6 mm, aby zaznaczyć, gdzie powinna znajdować się każda rana o średnicy 2 mm. Uważaj, aby nie przebić całkowicie tkanki. Utwórz eksplantaty ran w kształcie plastra miodu, aby zmniejszyć marnotrawstwo.
  7. Umieść nawinięte eksplantaty naskórkiem do góry na stosie nylonowej membrany filtracyjnej (przygotowanej w kroku 3.1).
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z eksplantatami z ran należy uważać, aby nie uszkodzić rany centralnej. Użyj małych kleszczy i podnieś każdą eksplantację po przeciwnych stronach.
  8. Inkubować rany w temperaturze 32-37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze (90-95%) przez 1-7 dni. Wymieniaj nośnik co 2-3 dni.

4. Barwienie ran ex vivo w całości

UWAGA: Ta sekcja opisuje metody barwienia immunofluorescencji i immunoperoksydazy. Przed użyciem dobrze wymieszaj wszystkie odczynniki.

  1. Metoda barwienia fluorescencyjnego
    1. Zebrać eksplantaty ran w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl utrwalacza skórnego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Utrwalacz zastosowany w tym protokole działa dobrze na opisywane przeciwciała. Optymalizacja będzie wymagana w przypadku innych przeciwciał. Utrwalenie tkanki dłuższe niż 24 godziny może prowadzić do nadmiernej fiksacji.
    2. Następnego dnia usuń utrwalacz i zastąp go 1 ml buforu do przemywania barwień. Biopsje można przechowywać w buforze do barwienia w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed barwieniem.
      UWAGA: Na wszystkich etapach płukania buforem należy używać pipety serologicznej lub końcówki do pipet, uważając, aby nie uszkodzić rany.
    3. Zassać bufor do płukania barwiącego i przeprowadzić jeszcze jedno płukanie 1 ml buforu do płukania barwiącego.
    4. Obliczyć ilość buforu blokującego wymaganą dla etapów 4.1.5–4.1.6 (liczba próbek x 300 μl = ilość buforu blokującego w μl). W razie potrzeby wykonaj dodatkowy bufor.
    5. Do każdej próbki dodać 150 μl buforu blokującego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Na wszystkich etapach barwienia upewnij się, że każda próbka jest wystarczająco pokryta i że nie ma pęcherzyków pokrywających powierzchnię rany po biopsji.
      UWAGA: Ten krok i kolejne kroki można wykonać w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml lub na płytce 48-dołkowej. Jeśli używasz płytki 48-dołkowej, inkubuj rany zadrukowaną w dół w każdym dołku.
    6. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w pozostałym buforze blokującym.
      UWAGA: Anty-mysia keratyna 14 (K14) rozcieńczona 1:1,000 w buforze blokującym działa dobrze. Zoptymalizuj ten krok do użycia z innymi przeciwciałami lub wieloma sondami.
    7. Odessać bufor blokujący i dodać 150 μl przeciwciała pierwszorzędowego do studzienki/probówki mikrowirówkowej. Inkubować eksplantaty ran w przeciwciałie pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc.
    8. Następnego dnia odessać przeciwciało pierwszorzędowe i płukać w barwiącym buforze płuczącym zawierającym 0,2% azydku sodu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (500 μl na próbkę).
    9. Wykonaj trzy kolejne etapy płukania przy użyciu buforu do płukania barwiącego (30 minut na pranie, 500 μl na próbkę).
    10. Rozcieńczyć fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało drugorzędowe w barwiącym buforze do płukania (np. kozioł anty-mysz 488 w rozcieńczeniu 1:400).
    11. Obliczyć wymaganą ilość przeciwciał drugorzędowych (liczba próbek x 150 μL = ilość w μL).
    12. Dodać 150 μl przeciwciała wtórnego do każdej studzienki/probówki mikrowirówki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wykonać etapy inkubacji 4.1.10 - 4.1.16 w ciemności, ponieważ przeciwciało drugorzędowe jest wrażliwe na światło.
      UWAGA: W razie potrzeby ten krok można wykonać w temperaturze 4 °C przez noc. Zoptymalizuj stężenie przeciwciała drugorzędowego wymagane do uzyskania odpowiedniego sygnału i ograniczonego barwienia tła.
    13. Usunąć przeciwciało wtórne i przeprowadzić 3 płukania po 30 minut buforem do płukania barwiącego (500 μl na próbkę).
    14. Wyrzuć resztki buforu do płukania i oblicz wymaganą ilość roztworu roboczego DAPI (zgodnie z krokiem 4.1.11).
    15. Przeciwbarwić każdy eksplant 150 μl roztworu roboczego DAPI przez 10 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: DAPI zabarwi jądra komórkowe na niebiesko. Barwnik Hoechst może być stosowany jako alternatywa dla DAPI.
    16. Wykonaj dwa ostatnie 30-minutowe płukania buforem do przemywania barwiącego (500 μl na próbkę). Biopsje można przechowywać w buforze do barwienia w temperaturze 4 °C w ciemności do dwóch tygodni przed obrazowaniem.
  2. Metoda barwienia w jasnym polu.
    1. Wykonaj kroki 4.1.1 - 4.1.3.
    2. Stłumić endogenną aktywność peroksydazy blokiem peroksydazy w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Ten krok jest ważny w przypadku stosowania przeciwciała sprzężonego z HRP w celu zmniejszenia niespecyficznego barwienia tła z tkanki. Silnie unaczyniona tkanka będzie zawierała więcej endogennej aktywności peroksydazy.
    3. Wyrzuć blok peroksydazy i płucz dwukrotnie przez 30 minut w buforze do płukania barwiącego.
    4. Wykonaj kroki 4.1.4 - 4.1.8.
      UWAGA: Mycie po kroku 4.1.7 jest szczególnie ważne w celu usunięcia azydku sodu z próbek. Jeśli azydek sodu nie zostanie odpowiednio usunięty, dezaktywuje HRP i zakłóca wykrywanie barwienia.
    5. Dodać 150 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP do każdej studzienki/probówki do mikrowirówki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć przeciwciało wtórne i wykonać 3 x 30 minut płukania w barwiącym buforze do płukania.
    7. Dodać 150 μl odczynnika ABC do każdej studzienki/probówki do mikrowirówki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    8. Odessać odczynnik ABC i wykonać 3 x 30 minutowe płukanie w buforze do przemywania barwiącego.
    9. Dodaj 150 μl substratu peroksydazy do jednego eksplantatu i określ czas potrzebny do wykrycia zauważalnej zmiany koloru.
      UWAGA: Wybierz próbkę, w której spodziewane jest silne zabarwienie. W tym przypadku czerwony pierścień pokazujący migrujący naskórek (K14). 3,3'-diaminobenzydyna-4 lub jakikolwiek inny odpowiedni substrat chromogenny może być stosowany jako zamiennik tego substratu peroksydazy.
    10. Po zaobserwowaniu zmiany koloru usuń substrat peroksydazy i zastąp go 1 ml dH2O.
    11. Powtórzyć wykrywanie substratu peroksydazy dla pozostałych eksplantatów, inkubując przez czas określony w kroku 4.2.11.
    12. Przepłukać wszystkie eksplantaty 1 ml dH2O, aby usunąć resztki substratu peroksydazy. Chociaż eksplantaty mogą być przechowywane do tygodnia w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem, lepiej jest zobrazować je tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec wypłukiwaniu substratu peroksydazy do dH2O w miarę upływu czasu.

5. Obrazowanie i kwantyfikacja

  1. Obrazowanie fluorescencyjne
    UWAGA: Obrazowanie fluorescencyjne wykonuje się za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Jednak odwrócony mikroskop fluorescencyjny może być wystarczający do uzyskania obrazów 2D w celu ilościowego określenia szybkości zamykania ran. Wybierając przeciwciała drugorzędowe, należy upewnić się, że wybrane fluorochromy są zgodne z widmami wzbudzenia i emisji dostępnych urządzeń mikroskopowych.
    1. Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w obiektyw 2,5x, 10x i 20x, zmotoryzowany stolik x-y-z, kamerę cyfrową i oprogramowanie do akwizycji. Włącz detektor światła przechodzącego (TPMT), aby umożliwić łatwą wizualizację każdej biopsji i umożliwić pomiar całkowitego zamknięcia rany. Alternatywnie, zmierz każdą ranę za pomocą mikroskopii jasnego pola po obrazowaniu fluorescencyjnym.
    2. Umieść podstawę na szalce Petriego o średnicy 60 mm na platformie obrazowania i dodaj cienką warstwę (około 1 ml) DPBS.
      UWAGA: Jeśli zostanie użyta zbyt duża ilość DPBS, biopsja będzie się poruszać podczas obrazowania. Alternatywnie należy użyć płytki 48-dołkowej, jeśli dostępny jest uchwyt na płytkę.
    3. Za pomocą małych kleszczyków tkankowych przenieś eksplantaty ran z dołków/probówek do mikrowirówek na szalkę Petriego zawierającą DPBS. Umieścić ranę biopsyjną stroną do dołu na szalce Petriego.
    4. Użyj okularu i świetlówki, aby zlokalizować ranę i ustawić na niej ostrość. Jeśli pęcherzyki są uwięzione pod próbką w polu view, podnieś ranę kleszczami tkankowymi i zmień położenie.
    5. Skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania, zapewniając równy rozmiar otworu między kanałami w celu uzyskania optymalnej konfokalności. W tym celu sprawdź wartość jednej jednostki airy dla każdego kanału i wybierz największą wartość. Wybierz prędkość skanowania, jakość obrazu i uśrednianie.
      UWAGA: Fluorochromy sprzężonych przeciwciał drugorzędowych i wybranego barwnika przeciwstawnego (np. DAPI) będą dyktować wymagane kanały.
    6. Włącz oprogramowanie do akwizycji na żywo i dostosuj moc lasera i wzmocnienie każdego kanału do poziomów wymaganych do wizualizacji barwienia. Zmniejsz szum tła, zwiększając przesunięcie cyfrowe.
    7. Umieść ranę na środku płaszczyzny obrazowania.
      UWAGA: Jeśli rana nie wypełnia całego obrazu z powodu użycia mniejszego obiektywu lub utworzenia większej rany, należy wykonać panel obrazów i zszyć je ze sobą (ręcznie lub za pomocą funkcji kafelkowania w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania).
    8. Uzyskaj obrazy biopsji rany. Użyj tych samych ustawień obrazowania między eksplantatami.
      UWAGA: Obrazy o większej mocy pozwolą na ocenę struktur tkankowych oraz ekspresji i lokalizacji markerów komórkowych.
    9. Zbierz stosy serii Z przez ranę, zwłaszcza tam, gdzie tkanka nie jest całkowicie płasko przylegająca do szalki Petriego. Użyj oprogramowania analitycznego, aby zwinąć stos Z w jeden obraz projekcji o maksymalnej intensywności.
  2. Obrazowanie w jasnym polu
    UWAGA: Obrazowanie w jasnym polu biopsji barwionej immunoperoksydazą można wykonać na wiele sposobów.
    1. Obrazowanie za pomocą mikroskopu odwróconego: Przygotować eksplantaty ran do obrazowania, umieszczając je na szalce Petriego/studzience zgodnie z opisem w krokach 5.1.2-5.1.3. Uzyskuj obrazy cyfrowe w jasnym oświetleniu za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w kamerę cyfrową. W razie potrzeby zszyj ze sobą wiele obrazów.
    2. Bezprzewodowe obrazowanie mikroskopem cyfrowym: Użyj bezprzewodowego mikroskopu cyfrowego podłączonego do telefonu lub laptopa, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy w ekonomiczny sposób. Umieść eksplantaty nawinięte stroną do góry na jakiejś tkance i usuń wszelkie pozostałości dH2O (lub barwiący bufor do płukania) z przechowywania próbki. Umieść eksplantat rany w środku pola widzenia mikroskopu. Rejestruj obrazy za pomocą podłączonego aparatu.
  3. Kwantyfikacja
    UWAGA: Procentowe zamknięcie rany można określić ilościowo w dowolnym oprogramowaniu, które umożliwia rysowanie i mierzenie kształtów odręcznych. ImageJ może być używany do przeprowadzania kwantyfikacji w następujący sposób:
    1. Otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo, w oprogramowaniu ImageJ.
    2. Użyj narzędzia do kształtowania odręcznego, aby narysować na zewnątrz ponownie nabłonkowaną ranę w miejscu, w którym styka się ona z normalną skórą. Naciśnij M (lub Analizuj | Pomiar), aby uzyskać pomiar obszaru "zewnętrznego".
      UWAGA: Tekstura tkanki rany z ponownie nabłonkowanym różni się od normalnej skóry. Obrazy nie muszą być skalowane przed tego typu analizą.
    3. Użyj narzędzia do kształtowania odręcznego, aby narysować wokół otwartego obszaru rany. W tym miejscu otwarta rana styka się z wewnętrzną krawędzią tkanki ponownie nabłonkowej. Naciśnij M (lub Analizuj | Pomiaru), aby uzyskać pomiar powierzchni "wewnętrznej".
    4. Użyj poniższego równania, aby wywnioskować procentową reepitelializację/zamknięcie rany:
      % zamknięcia = (Zewnętrzny obszar rany - Wewnętrzny obszar rany) / (Zewnętrzny obszar rany) x 100
      UWAGA: Procentowe pokrycie obszaru przeciwciałami można wywnioskować w ten sam sposób (np. K14) lub jako procent całkowitej powierzchni rany. Intensywność procentowa może również dostarczyć półilościowych informacji o ekspresji markerów zainteresowania na poziomie tkankowym, podczas gdy obrazowanie o dużej mocy przedstawia dane dotyczące ekspresji na poziomie komórkowym.

Wyniki

W niniejszym raporcie przedstawiamy nowatorskie podejście do ex vivo ranienia skóry i barwienia całego preparatu (whole-mount staining) w celu oceny czynników wpływających na odpowiedź naprawczą ludzkiej skóry. Rycina 1A przedstawia schemat postępowania, które może być realizowane w ciągu 3–10 dni, w zależności od czasu inkubacji rany. Rany o częściowej grubości są hodowane na stosach membran na granicy powietrze : membrana i mogą być pobierane do barwienia całego preparatu, zatapiane w parafinie lub medium OCT do ogólnych badań histologicznych lub mrożone w ciekłym azocie do analizy biochemicznej (Rycina 1B). Zazwyczaj tworzymy rany o częściowej grubości o rozmiarze 2 mm w centrum eksplantów o średnicy 6 mm. Jednak rozmiar rany i otaczającego ją eksplantu może być zmieniony w zależności od wymagań. Procedura whole-mount została z sukcesem zaadaptowana zarówno dla metod barwienia immunoperoksydazowego, jak i immunofluorescencyjnego (Rycina 1C).

Immunofluorescencja umożliwia badanie tkanki z wykorzystaniem wielu przeciwciał. W tym celu zaleca się stosowanie przeciwciał pierwotnych wytworzonych u różnych gatunków oraz dopasowanych gatunkowo, sprzężonych z fluorochromem przeciwciał wtórnych, aby ograniczyć reaktywność krzyżową międzygatunkową. Konieczna będzie optymalizacja stężeń przeciwciał oraz czasów inkubacji. W przypadku zaobserwowania barwienia tła należy zmniejszyć stężenia przeciwciał, zwiększyć liczbę etapów płukania oraz dodać bufor blokujący do przeciwciał wtórnych. Żywotność świeżej tkanki można ocenić bezpośrednio za pomocą komercyjnych barwników do oceny żywotności (patrz Tabela materiałów). Wykazujemy również, że tkankę można utrwalić po barwieniu żywotności i pomyślnie obrazować, jeżeli jest to praktycznie możliwe (Rycina 1D).

Proces gojenia ran skóry, schemat barwienia całego preparatu, analiza immunoperoksydazowa i immunofluorescencyjna.
Rysunek 1: Metoda zadawania ran ex vivo oraz barwienia całego preparatu skóry ludzkiej. (A) Schemat przedstawiający przebieg procedury od pobrania skóry i zadania ran ex vivo, aż po barwienie tkanki i analizę danych. (B) Schemat przedstawiający system hodowli ran skóry ludzkiej ex vivo wraz z rutynowo wykonywanymi analizami tkanki. (C) Barwienie całego preparatu może być wykonywane zarówno techniką immunoperoksydazową, jak i immunofluorescencyjną. K14 = keratyna 14. (D) Żywa tkanka może być barwiona komercyjnymi barwnikami żywotności i skutecznie obrazowana po utrwaleniu. Pasek skali = 100 µm. Barwienie wykonano na skórze osoby niediabetycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Najbardziej powszechnym zastosowaniem barwienia całych preparatów ran jest określanie szybkości gojenia rany w sposób bardziej powtarzalny niż w przypadku przekrojów histologicznych. Procentowe zamknięcie rany określono jako procent reepitelizacji powierzchni rany, co przedstawiono na Rysunku 2A. Procentowe pokrycie obszaru specyficznych markerów można mierzyć w stosunku do całkowitej powierzchni rany lub jako procent reepitelializowanej rany. Scharakteryzowano proces gojenia w skórze zdrowej (niediabetycznej) w porównaniu ze skórą cukrzycową w ciągu siedmiu dni, pobierając próbki ran każdego dnia po zranieniu (obrazy reprezentatywne, Rysunek 2B). Rany w skórze zdrowej zamykały się w czasie zgodnie z oczekiwaniami, przy czym pełne zamknięcie zaobserwowano w większości próbek do 4-5 dnia. W przeciwieństwie do nich, rany w skórze cukrzycowej nie zamknęły się całkowicie w siedmiodniowym okresie analizy (Rysunek 2C). Znaczące opóźnienie w zamknięciu ran zaobserwowano pomiędzy ranami skóry zdrowej i cukrzycowej podczas porównywania tempa gojenia w każdym punkcie czasowym po urazie (P < 0,001 do 6 dnia, P < 0,05 w 6 dniu oraz P < 0,05 do P < 0,001 w 7 dniu).

Po ocenie ogólnych wskaźników zamykania się rany zmierzyliśmy procent całkowitego obszaru rany (obszar zewnętrzny na Rysunku 2A), w którym można było zwizualizować komórki K14-dodatnie (zielone barwienie na Rysunku 2B). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że w zdrowych ranach skóry ex vivo barwienie K14 osiągało szczyt w 2. dniu, a następnie szybko spadało (istotność w każdym punkcie czasowym względem szczytu w 2. dniu, Rysunek 2D). Prawdopodobnie odzwierciedla to ponowne formowanie się wczesnej bariery epidermalnej, co wyklucza przenikanie przeciwciał K14 przez zróżnicowane warstwy naskórka (patrz schemat na Rysunku 2E). W procesie reepitelializacji keratynocyty warstwy podstawnej (K14+ve) migrują do wewnątrz nad otwartą raną, tak że naskórek bliżej zewnętrznej krawędzi rany formuje się wcześniej niż naskórek bliżej wewnętrznej krawędzi rany (front migrujący). Podczas gdy przednia krawędź nowo powstałego naskórka nadal migruje, aby zamknąć pozostałą otwartą ranę, naskórek na krawędzi zewnętrznej zaczyna się różnicować, aby odtworzyć pozostałe warstwy naskórka. W związku z tym w początkowej fazie gojenia spodziewalibyśmy się, że większość zreepitelializowanego obszaru składa się z komórek podstawnych (K14+ve), natomiast w późniejszej fazie naprawy barwienie K14 zanika w miarę różnicowania się naskórka od zewnątrz do wewnątrz (patrz obrazy całego preparatu na Rysunku 2E). Zatem spadek barwienia K14 pokazany na Rysunku 2D (strzałki w dół) koreluje ze zwiększonym różnicowaniem naskórka. Co ciekawe, widoczne barwienie K14 osiągnęło szczyt wcześniej w ranach zdrowych (2. dzień) niż w ranach cukrzycowych (4. dzień), co dodatkowo wykazuje, że reepitelializacja i następujące po niej różnicowanie naskórka są opóźnione w ranach skóry cukrzycowej.

Badanie zamykania rany z barwieniem K14; obrazy z mikroskopii, schematy, wykresy; analiza skóry zdrowej i cukrzycowej.
Rysunek 2: Barwienie całego preparatu (whole-mount) wykazuje zaburzone tempo gojenia w skórze cukrzycowej w porównaniu do zdrowej. (A) Metoda stosowana do ilościowego określenia zamykania rany na podstawie pomiarów zewnętrznej i wewnętrznej krawędzi rany. Obrazy w świetle przechodzącym pokazują barwienie keratyny 14 (K14) na czerwono. Pasek skali = 300 µm. (B) Reprezentatywne obrazy gojenia w czasie (dni po powstaniu rany) w skórze zdrowej i cukrzycowej. Pasek skali = 500 µm. K14 = zielony. DAPI = niebieskie jądra komórkowe. (C) Ilościowe określenie tempa zamykania ran (procent reepitelializacji), wykazujące, że rany ex vivo skóry zdrowej zamykają się znacznie szybciej niż rany ex vivo skóry cukrzycowej. H = zdrowa. Db = cukrzycowa. (D) Procent barwienia K14 osiąga szczyt wcześniej w skórze zdrowej niż w cukrzycowej, a następnie spada wraz ze wzrostem różnicowania naskórka (strzałki w dół). (E) Barwienie K14 (bazalne komórki naskórka) zanika w miarę różnicowania naskórka. D = zróżnicowane. ND = niezróżnicowane. Białe linie przerywane wyznaczają wewnętrzne i zewnętrzne krawędzie rany. Białe strzałki = kierunek migracji. n = 6 ran na dawcę, na punkt czasowy. Średnia +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 oraz *** = P < 0,001. Porównanie skóry zdrowej i cukrzycowej w każdym punkcie czasowym gojenia w punkcie C (wartość P dla najmniej istotnego porównania). Zmiana czasowa barwienia K14 w stosunku do szczytu dla każdego dawcy w punkcie D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Następnie zastosowaliśmy barwienie całych preparatów, aby zbadać ekspresję tkankową i lokalizację innych markerów istotnych dla gojenia ran w skórze niediabetycznej (Rysunek 3). Wszystkie użyte przeciwciała oraz ich stężenia robocze zostały podane w Tabeli Materiałów. Naczynia krwionośne w otwartej ranie barwiły się pozytywnie z przeciwciałem przeciwko alfa-aktynie mięśni gładkich (a-SMA), stosowanym w połączeniu z K14 w celu wyznaczenia krawędzi naskórka na obrazach przy niskim powiększeniu (Rysunek 3A). Macierz skóry właściwej została zabarwiona przeciwciałami przeciwko kolagenowi typu I (COL 1) i fibronektynie (Fn). Zaobserwowano tutaj obfite, grube włókna kolagenu, podczas gdy włókna fibronektyny były rzadkie, faliste i cienkie (Rysunek 3A). Nasza metoda barwienia całych preparatów pozwala również na uzyskanie rozdzielczości barwienia na poziomie pojedynczych komórek, co wykazano dla keratynocytów dodatnich pod względem K14 (Rysunek 3B).

Na koniec wykazujemy, że ludzkie rany ex vivo posiadają rezydentne komórki odpornościowe, przy czym komórki Langerhansa wykryto wokół nowo powstałego naskórka w 3. dobie po zranieniu (Rysunek 3C). Rzeczywiście, wyniki te sugerują, że barwienie całych preparatów może być wykorzystywane do badania kluczowych cech odpowiedzi gojenia, w tym stanu zapalnego, proliferacji oraz macierzy zewnątrzkomórkowej (Rysunek 4A). Podsumowując, nasze dane ujawniają, że połączona procedura zadawania ran skóry ex vivo oraz barwienia całych preparatów jest trafną metodą oceny różnych aspektów regeneracji zdrowej i cukrzycowej (patologicznej) skóry człowieka.

Analiza histologiczna: immunofluorescencja DAPI/K14/α-SMA, gojenie ran, rozdzielczość komórkowa.
Rycina 3: Optymalizacja metody barwienia całego preparatu (whole-mount) do zastosowania z innymi przeciwciałami. (A) Naczynia krwionośne barwiono przeciwciałami przeciwko aktynie gładkich mięśni (α-SMA, zielony) i keratinie 14 (K14, czerwony), natomiast włókna macierzy barwiono kolagenem I (COL 1, czerwony) i fibronektyną (Fn, zielony). (B) Procedura whole-mount zapewnia rozdzielczość lokalizacji na poziomie pojedynczych komórek (K14, zielony; K1, czerwony). (C) Komórki Langerhansa CD1a+ (zielone) zaobserwowane w nowo powstałym naskórku. DAPI = niebieskie jądra. Pasek skali = 100 µm. Białe linie przerywane wyznaczają wewnętrzne i zewnętrzne krawędzie rany oraz oddzielają ranę od naskórka. Barwienie wykonano na skórze niecukrzycowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces gojenia rany; diagramy porównujące barwienie całego preparatu z barwieniem histologicznym; analiza naskórka.
Rysunek 4: Wiarygodność procedury barwienia całego preparatu w ocenie gojenia ran. (A) Ilustracja przedstawiająca sposób, w jaki technika barwienia całego preparatu pozwala oceniać procesy związane z gojeniem ran. Użyte przeciwciała = czerwony tekst. K14 = keratyna 14. COL 1 = kolagen 1. Fn = fibronektyna. (B) Procedura barwienia całego preparatu (niebieskie strzałki) wprowadza mniejszą zmienność do pomiarów zamykania się rany niż standardowa analiza histologiczna (czerwone strzałki). S1 = przekrój 1. WE = krawędź rany. Pasek skali = 300 µm. Barwienie wykonano w skórze niediabetycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole eksperymentalnym opisujemy zoptymalizowaną metodę oceny zamykania ran w ludzkiej skórze ex vivo za pomocą barwienia tkanek całych. Jest to ważne źródło umożliwiające krytyczną ocenę potencjalnych metod leczenia ran i zapewniające lepsze zrozumienie reakcji na gojenie ran u ludzi. Opublikowaliśmy ocenę gojenia się ran skóry ex vivowcześniej 12,13, jednak w tych raportach nie zastosowano podejścia opartego na barwieniu całej góry do pomiaru zamknięcia rany. Barwienie w całości jest znacznie łatwiejsze i wymaga mniejszego doświadczenia technicznego niż standardowa histologia, która obejmuje zatapianie i cięcie próbek parafiną lub OCT. Procedura pełnego mocowania zmniejsza również zmienność eksperymentalną, umożliwiając ilościowe określenie całej rany, a nie tylko pojedynczego przekroju poprzecznego w określonym miejscu w tkance (patrz rysunek 4B w celu zilustrowania porównawczego). W pełni popieramy znaczenie ilościowego określenia gojenia całej niesymetrycznej struktury rany, co zostało wyraźnie podkreślone przez Rhea i Dunnwald w przypadku ostrych ran u myszy14. Autorzy ci wykazali, jak ważne jest seryjne cięcie ran wycinających in vivo dla powtarzalnych i precyzyjnych pomiarów morfologii rany. Seryjne sekcje mogą być równie dobrze stosowane do ludzkich ran ex vivo; Jednak w celu dokładnego ilościowego określenia zamknięcia rany i ponownego nabłonkowania preferowaną metodą powinno być barwienie całokształtowe o wysokiej przepustowości. Zwracamy uwagę, że ten protokół barwienia całego montażu powinien być również kompatybilny z późniejszym przetwarzaniem (woskiem lub OCT) do tradycyjnej analizy histologicznej.

Barwienie w całości nie jest pozbawione wad. Chociaż zapewnia większą powtarzalność w eksperymentach z gojeniem się ran, wymaga użycia większej ilości tkanki do analizy niż standardowe techniki histologiczne. Może to stanowić problem, gdy dostęp do tkanek jest ograniczony, szczególnie gdy konieczne jest oszacowanie wielu przeciwciał. Alternatywnym podejściem byłoby zastosowanie metody ran ciętych, w której szerokość rany jest względnie jednolita, a zmienność zmniejszona (jak pokazano w przypadku ran u myszy i ludzi 15,16). Jednak rany wycinające mają większe zastosowanie w przypadku większości patologicznych typów ran17.

W tym badaniu utworzono rany o częściowej grubości 2 mm w środku eksplantatów skóry o średnicy 6 mm. Metoda ta może być zoptymalizowana pod kątem alternatywnych rozmiarów ran wycinających i eksplantatów na różnych głębokościach skóry18. Ponadto siła wymagana do wytworzenia ran będzie się różnić w zależności od dawcy, przy czym starzejąca się skóra będzie wymagała mniejszej siły do biopsji. Unikalibyśmy również używania skóry z widocznymi rozstępami lub innymi zmianami strukturalnymi. Przeprowadziliśmy walidację szeregu przeciwciał, aby uwzględnić różne aspekty odpowiedzi leczniczej ex vivo. Protokół ten może być również stosowany z innymi przeciwciałami istotnymi dla skóry, w przypadku których konieczne będzie zoptymalizowanie stężenia przeciwciał i czasu inkubacji. Niemniej jednak uważamy, że nasz protokół jest najbardziej odpowiedni do bezwzględnej kwantyfikacji całkowitego zamknięcia rany, a następnie do oceny przestrzennej określonych białek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy całościowe mocowanie zapewnia zmniejszoną rozdzielczość immunolokalizacji w porównaniu ze standardową analizą histologiczną skrawków tkanki, zapewnia dodatkowe informacje 3D, których brakuje w standardowej histologii 2D.

Jednym z zastrzeżeń związanych z oceną gojenia skóry ex vivo w porównaniu z modelami in vivo jest to, że brakuje odpowiedzi ogólnoustrojowej. Ważnym aspektem gojenia się ran jest stan zapalny i późniejsza ziarnina tkanek, która jest spowodowana napływem komórek zapalnych i komórek śródbłonka z układu krwionośnego19. Pomimo tego ograniczenia, skóra ex vivo nadal zapewnia lepszą rekapitulację gojenia klinicznego niż testy ran oparte na komórkach. Eksperymenty in vitro na ogół obejmują monowarstwy lub kokultury pojedynczych typów komórek hodowane na plastikowych kulturach tkankowych, podczas gdy skóra ex vivo zapewnia natywne środowisko do badania zachowania komórek. Ostatnio pojawiło się wiele systemów równoważnych dla skóry, w których skóra jest hodowana w warunkach laboratoryjnych ze sztucznej matrycy i izolowanych komórek skóry20,21. Chociaż modele te naśladują ludzką skórę lepiej niż większość podejść in vitro, nadal nie symulują w pełni rodzimego środowiska tkankowego i są na ogół zbyt delikatne, aby można je było ponownie uszkodzić. Ponadto wykazaliśmy (i inni), że ludzka tkanka skórna ex vivo zachowuje rezydujące komórki odpornościowe, które bez wątpienia przyczynią się do naprawy22,23. Przyszłe prace powinny teraz koncentrować się na rozszerzeniu żywotności i kompetencji immunologicznych modelu ex vivo do oceny gojenia na późnym etapie24. Jedną z opcji jest dalszy rozwój obiecujących technologii narządów na chipie, które są w stanie przedłużyć żywotność tkanek i utrzymać natywną architekturę skóry przez okres do dwóch tygodni w hodowli25. Modele ex vivo zaczęły również uwzględniać znaczenie reakcji zapalnej skóry poprzez skuteczne włączanie komórek odpornościowych, takich jak neutrofile, do tkanki gospodarza26 lub wstrzykiwanie do tkanki gospodarza przeciwciał w celu wywołania reakcji immunologicznej27. Oczekujemy, że odkrycia te utorują drogę do opracowania bardziej wyrafinowanych i tłumaczalnych metod w przyszłości.

Główną korzyścią płynącą z zastosowania skóry ex vivo do pomiaru zamykania ran jest możliwość porównania szybkości gojenia w tkankach zdrowych (np. bez cukrzycy) i patologicznych (np. cukrzycowych lub starych). Tutaj wykazaliśmy, że reepitelializacja i tworzenie bariery są rzeczywiście upośledzone w przypadku ran cukrzycowych w porównaniu ze zdrowymi ranami ex vivo. W rzeczywistości zapewnia to drogę do przedklinicznej oceny patologicznej naprawy, w której starzenie się i cukrzyca są głównymi czynnikami ryzyka rozwoju ran przewlekłych1. Chociaż istnieją modele patologiczne in vitro, takie jak komórki wyizolowane ze starzejącej się tkanki i cukrzycowej lub komórki hodowane w wysokiej glukozie w celu naśladowania hiperglikemii28,29, komórki te mogą szybko stracić swój fenotyp po usunięciu z mikrośrodowiska in vivo. Ważnym składnikiem zewnętrznego patologicznego środowiska gojenia jest macierz skórna, która ulega zmianie zarówno w procesie starzenia się, jak i cukrzycy30. Rzeczywiście, ta zaburzona matryca wpływa na zachowanie rezydentnych i naiwnych fibroblastów31,32. W związku z tym nie można lekceważyć znaczenia badania komórek w środowisku tkankowym gospodarza.

Podsumowując, nasz protokół stanowi ważną platformę do ilościowego określania reepitelializacji ran u ludzi, badania czynników regulacyjnych oraz testowania ważności i skuteczności potencjalnych terapii12,13. Podczas gdy badania przedkliniczne nadal wymagają podejść in vivo, połączona strategia wykorzystująca tkanki ludzkie ex vivo i zranienia myszy in vivo powinna udoskonalić ścieżkę przedkliniczną, ograniczając wykorzystanie zwierząt przy jednoczesnym zwiększeniu translatywalności międzygatunkowej.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Panom Paolo Matteuci i Panu George'owi Smithowi za dostarczenie tkanek pacjenta. Jesteśmy również wdzięczni Pani Amber Rose Stafford za pomoc w pobraniu tkanek oraz Daisy Appeal za udostępnienie sprzętu laboratoryjnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 ml Falcon TubesFalcon352070Do mycia skóry
1.5  ml Probówki do mikrowirówek TubeOne, naturalne (sterylne)StarlabS1615-5510Do barwienia całego mocowania
48-dołkowa płytka CytoOne, z powłoką TCStarlabCC7682-7548Do barwienia całościowego
Kwas octowy GlacialFisher ChemicalA/0400/PB15Część utrwalacza
bromekalkilotrimetyloamoniowySigma-AldrichM7635Część utrwalacza
Przeciwciało anty-alfa aktynowe mięśni gładkich [1A4]Abcamab7817Barwi naczynia krwionośnePrzeciwciało
anty-kolagenowe IAbcamab34710Stains collagen
Anti-Cytokeratin 14 Przeciwciało [LL002]Abcamab7800Plamy naskórka
Przeciwciało CD1A (CTB6)Santa Cruz Biotechnologysc-5265Barwie Komórki Langerhansa
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo Fisher Scientific62247Przeciwbarwienie do jąder komórkowych
Falcon 60mm szalki PetriegoFalcon353004Ludzka hodowla ex vivo
Fibronektyna Przeciwciało (EP5)Santa Cruz Biotechnologysc-8422Barwie fibronektyna
Formaldehyd, ekstra czysta, roztwór 37-41%, SLRFisher ChemicalF/1501/PB17Część utrwalacza
wacików z gazyMedisaveCS1650Do oczyszczania skóry
Gibco™ Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyThermo Fisher Scientific15240062Human ex vivo culture
Gibco DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminyThermo Fisher Scientific11960044Ludzka hodowla ex vivo
Gibco Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10500064Ludzka hodowla ex vivo
Gibco HBSS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific14170088Ludzka hodowla ex vivo
Gibco L-Glutamina (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081Hodowla człowieka ex vivo
Nadtlenek wodoruSigma-AldrichH1009-100MLem>Do barwienia immunoperoksydazą
ImageJ SoftwareNational Institutes of ZdrowieN/ADo analizy obrazu
Invitrogen IgG (H+L) Adsorbowany krzyżowo kozio-anty-mysz, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001Stosowane przeciwciało drugorzędowe zależy od wymaganych fluorochromów i przeciwciała pierwszorzędowego
Invitrogen IgG (H+L) Adsorbowany krzyżowo kozioł anty-królik, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA11012Stosowane przeciwciało drugorzędowe zależy od wymaganych fluorochromów i przeciwciała pierwszorzędowego
Invitrogen ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssakówThermo Fisher ScientificL3224Do oceny żywotności tkanek
Kleszcze do irysów, 10 cm, zakrzywione, 1x2 zębyWorld Precision Instruments15917Do tworzenia ran
Nożyczki do irysów, 11 cm, zakrzywione, SuperCut, Precyzyjne instrumenty z węglika wolframu501264Do tworzenia ran
Nożyczki do irysów, 11 cm, proste, SuperCut, Precyzyjne instrumenty z węglika wolframu501263Do usuwania tkanki tłuszczowej
Przeciwciało poliklonalne Keratyna 1, oczyszczoneBiolegend905201Plamy naskórka
Przeciwciało poliklonalne keratyny 14, oczyszczoneBiolegend905301Plami naskórek
LSM 710 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyCarl ZeissWycofaneDo obrazowania fluorescencyjnego
Merck Millipore Wkładki chłonneMerck MilliporeAP10045S0Ludzka kultura ex vivo
Merck Millipore Nylon Hydrofilowe filtry membranoweMerck MilliporeHNWP04700Ludzka kultura ex vivo< / em>
Normalny roztwór surowicy koziejVector LaboratoriesS-1000-20 Stosowana surowica zwierzęca zależy od przeciwciała drugorzędowego< / em>
Fosforanowy roztwór buforowySigma-AldrichP3619Do buforu do mycia
Azydku soduSigma-AldrichS2002Do blokowania buforu
Chlorek soduFisher BioodczynnikiBP358-212Część utrwalacza
Woreczki do sterylizacjiMedisaveSH3710Do sterylizacji narzędzi
Stiefel Stemple do biopsji 2 mmMedisaveBI0500Do ran o częściowej grubości
Stiefel Stemple do biopsji 6 mmMedisaveBI2000Do eksplantatu zewnętrznego
Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm szalki PetriegoThermo Fisher Scientific101VR20Do przygotowania skóry
Triton X-100Fisher ChemicalT/3751/08Do mycia buforu
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroksydaza (IgG królika)Wektor LaboratoriaPK-6101Do barwienia immunoperoksydazą; Używany zestaw HRP zależy od przeciwciała pierwotnego
Vector NovaRED Substrate Kit, peroksydaza (HRP)Vector LaboratoriesSK-4800Do barwienia immunoperoksydazą
Bezprzewodowy mikroskop cyfrowyJiusionN/ADo obrazowania w jasnym polu
<

Bibliografia

  1. Lindholm, C., Searle, R. Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency. International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).
  2. Guest, J. F., et al. Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service. International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).
  3. Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes. International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).
  4. López-Valverde, M. E., et al. Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation. Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).
  5. Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. The role of estrogen in cutaneous ageing and repair. Maturitas. 103, 60-64 (2017).
  6. Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the treatment of chronic wounds. Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).
  7. Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes. Open Biology. 10 (9), 200223(2020).
  8. Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it. Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).
  9. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  10. Mazio, C., et al. Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature. Biomaterials. 192, 159-170 (2019).
  11. Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model. Frontiers in Microbiology. 9, 1450(2018).
  12. Wilkinson, H. N., et al. Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2. Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).
  13. Wilkinson, H. N., et al. Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22. The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).
  14. Rhea, L., Dunnwald, M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. Journal of Visualized Experiments. 162, e61616(2020).
  15. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  16. Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies. Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).
  17. Olsson, M., et al. The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).
  18. Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy. Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).
  19. Brownhill, V. R., et al. Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing. Advances in Wound Care. , (2020).
  20. Diekmann, J., et al. A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin. Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).
  21. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system. Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283(2019).
  22. Dijkgraaf, F. E., et al. Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin. Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).
  23. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).
  24. Pupovac, A., et al. Toward immunocompetent 3D skin models. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405(2018).
  25. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  26. Kim, J. J., et al. A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments. Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).
  27. Jardet, C., et al. Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model. Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).
  28. Chen, J. L., et al. Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance. Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).
  29. Demirovic, D., Rattan, S. I. Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro. Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).
  30. Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing. Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).
  31. Fisher, G. J., et al. Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin. The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).
  32. Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function. Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja ludzkiej skóryzamykanie ranymikroskopia konfokalnarana o grubości częściowejróżnicowanie naskórkarany skórne w cukrzycyreepitelializacjabarwienie immunofluorescencyjne
Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.