Artykuł metodologiczny

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

DOI:

10.3791/62328

⸱

13 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania genomiki funkcjonalnej układu odpornościowego wymagają manipulacji genetycznych, które obejmują zarówno delecję docelowych genów, jak i dodawanie elementów do interesujących białek. Identyfikacja funkcji genów w modelach linii komórkowych jest ważna dla odkrywania genów i badania mechanizmów wewnętrznych komórek. Jednak manipulacje genetyczne komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T i linie komórkowe makrofagów, przy użyciu knock-in za pośrednictwem CRISPR/Cas9, są trudne ze względu na niską wydajność transfekcji tych komórek, zwłaszcza w stanie spoczynku. Aby zmodyfikować geny w komórkach odpornościowych, zwykle stosuje się selekcję lekooporności i wektory wirusowe w celu wzbogacenia komórek wyrażających system CRIPSR/Cas9, co nieuchronnie prowadzi do niepożądanej interwencji komórek. W poprzednim badaniu zaprojektowaliśmy podwójne reportery fluorescencyjne sprzężone z CRISPR/Cas9, które ulegały przejściowej ekspresji po elektroporacji. To rozwiązanie techniczne prowadzi do szybkiej delecji genów w komórkach odpornościowych; jednak knock-in genów w komórkach odpornościowych, takich jak limfocyty T i makrofagi, bez użycia selekcji lekooporności lub wektorów wirusowych, jest jeszcze większym wyzwaniem. W tym artykule pokazujemy, że wykorzystując sortowanie komórek do wspomagania selekcji komórek przejściowo eksprymujących konstrukty CRISPR / Cas9 ukierunkowane na locus Rosa26 w połączeniu z plazmidem dawcy, można osiągnąć knock-in genu zarówno w limfocytach T, jak i makrofagach bez wzbogacania oporności na leki. Jako przykład pokazujemy, jak wyrazić ludzki ACE2, receptor SARS-Cov-2, który jest odpowiedzialny za obecną pandemię Covid-19, w makrofagach RAW264.7, wykonując eksperymenty knock-in. Takie genowe komórki knock-in mogą być szeroko stosowane do badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki odpornościowe są kluczowe dla obrony przed patogenami. Zarówno odporność wrodzona, jak i nabyta są wymagane do usuwania czynników infekcyjnych i utrzymania homeostazy tkanek1,2. Modele linii komórkowych są niezbędnymi narzędziami do zrozumienia molekularnych podstaw układu odpornościowego ssaków; Są one stosowane w testach funkcjonalnych in vitro, takich jak te modelujące aktywację ludzkich limfocytów T, oraz do określania funkcji czynników genetycznych w aktywacji lub tłumieniu odpowiedzi immunologicznej3,4. Ważne jest, aby pamiętać, że układ odpornościowy ssaków jest niezwykle niejednorodny i, co równie ważne, ogromna liczba cząsteczek kontroluje różnicowanie, migrację i funkcję danego typu komórki5,6.

Narzędzia do edycji genomu Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 pozwalają na manipulację genetyczną określonymi typami komórek, co ułatwia funkcjonalną adnotację genów w precyzyjny sposób7,8. Kilka opublikowanych protokołów opisało dostarczanie CRISPR/Cas9 w postaci kompleksów RNA prowadzących Cas9, znanych jako rybonukleoproteiny (RNP) w komórkach HEK293, liniach komórkowych Jurkat, pierwotnych limfocytach T9,10, makrofagi11,12,13, komórki macierzyste14 i inne15,16. W tych protokołach znakowanie genów jest zwykle osiągane poprzez fuzję znacznika fluorescencyjnego z białkami endogennymi17,18. Podjęto jednak niewiele prób użycia podwójnych reporterów fluorescencyjnych, które są kompatybilne z sortowaniem pojedynczych komórek, aby ułatwić eksperymenty typu knock-in19,20, szczególnie w komórkach odpornościowych.

Dogłębne analizy mechanistyczne mające na celu zrozumienie funkcji nowego czynnika genetycznego w komórkach odpornościowych zazwyczaj wymagają specyficznej dla typu komórki delecji genu, genetycznych eksperymentów ratunkowych i najlepiej identyfikacji jego interaktorów. Mimo że opublikowano metody optymalizacji genetycznej delecji genów w komórkach odpornościowych9,15,21, opisano znacznie mniej metod wprowadzania alleli knock-in o wszechstronnych funkcjach w celu zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. Dlatego w tym protokole staramy się szczegółowo opisać skuteczny i wysoce powtarzalny protokół ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) w locus bezpiecznej przystani Rosa26 zarówno w ludzkich, jak i mysich liniach komórek odpornościowych. Zaprojektowaliśmy dwukolorowy system reporterowy, aby wzbogacić komórki transfekowane plazmidami eksprymującymi CRISPR/Cas9 (DsRed2) i rekombinowaną matrycą DNA (EBFP2), którą można wyizolować przez sortowanie komórek. Postępując zgodnie z tym protokołem, uzyskaliśmy wiele linii knock-in ludzkiej linii komórek T Jurkat i mysich makrofagów RAW264.7 do analiz funkcjonalnych słabo zbadanych białek.

Jako przykład, pokazujemy w tym protokole, jak uzyskać makrofagi RAW264.7 stabilnie eksprymujące ludzki ACE2 (receptor SARS-Cov-2)22. Ponieważ wrodzone komórki odpornościowe są zaangażowane w patogenezę Covid-1923,24, a ludzki ACE2 jest uważany za główny receptor wymagany do wniknięcia wirusa do komórek przed replikacją, makrofagi z knock-in ludzkiego ACE2 mogą służyć jako przydatne narzędzie do mechanistycznych badań namnażania się wirusa wewnątrz makrofagów. Równolegle prezentujemy również przykład knock-in genu w ludzkim locus ROSA26 w celu ekspresji białka RASGRP1, które zostało połączone na swoim końcu aminowym z powinowactwem Twin-Strep-tag (OST). Limfocyty T są kluczowymi komórkami docelowymi w terapiach immunologicznych, a coraz więcej badań koncentruje się na manipulacji ich reakcją na raka25,26. Ponieważ wiadomo, że Rasgrp1 jest kluczową cząsteczką sygnałową znajdującą się za receptorem limfocytów T, a jej interaktorzy nie są dobrze wyjaśnieni27, model knock-in OST-RASGRP1 stanowi podstawę do identyfikacji interaktorów regulujących odpowiedź komórek T na nowotwory i infekcje. Podsumowując, narzędzia te mogą być wykorzystywane do badań nad Covid-19 i odkrywania nowych cząsteczek oddziałujących z Rasgrp1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i budowa plazmidu sgRNA ukierunkowanych na locus rosa26

  1. Projektowanie przewodników RNA wokół pożądanego miejsca insercji
    1. Upewnij się, że miejsce insercji mysiego eksperymentu z wkłuciem Rosa26 (dalej oznaczonego jako mRosa26) znajduje się w pierwszym intronie mRosa26; to miejsce było używane w poprzednich badaniach28,29. W przypadku eksperymentów knock-in na komórkach ludzkich należy upewnić się, że miejsce insercji znajduje się w ludzkim locus ROSA26 (zwanym dalej hROSA26), który został zidentyfikowany jako ludzki homolog mRosa2630.
    2. Użyj sekwencji genomowych gatunków myszy i ludzi uzyskanych odpowiednio z Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) i Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html). Skopiuj 50 par zasad (bp) sekwencji genomowej locus mRosa26 lub hROSA26 po każdej stronie po bokach pożądanego miejsca insercji.
    3. Projektowanie przewodnika RNA za pomocą internetowego narzędzia internetowego CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Wklej 100 pz sekwencji wejściowej z 1.1.2. Wybierz dwa przewodnikowe RNA o wysokim wyniku swoistości, wysokim wyniku wydajności i niskiej aktywności poza celem. Ponadto wybieraj przewodniki RNA z wyższymi wynikami Doench i unikaj tych oznaczonych jako "Nieefektywne"32.
      UWAGA: Alternatywne narzędzia do projektowania CRISPR są również cenne i publicznie dostępne, na przykład narzędzie do projektowania CRISPR Benchling (https://benchling.com/crispr). Aby zwiększyć częstotliwość występowania zmutowanych komórek knock-in, w których pośredniczy CRISPR/Cas9, wybierz dwa prowadzące RNA w pobliżu żądanego miejsca insercji, jeśli to możliwe33.
    4. Dla locus mRosa26 użyj dwóch sąsiednich przewodnikowych RNA oznaczonych jako mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTCTCTAGAAGAT -3') i mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Rysunek 1A). Dla locus hROSA26 użyj dwóch sąsiednich przewodnikowych RNA, a mianowicie hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') i hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Rysunek 1B).
      UWAGA: Czynności edycji genomu mR26-sg1 i mR26-sg2 oraz hR26-sg1 i hR26-sg2 oceniano odpowiednio w komórkach RAW264.7 i komórkach Jurkat (patrz plik uzupełniający, rysunek S1).
  2. Klonowanie wektorów ekspresyjnych CRISPR zawierających sgRNA ukierunkowanych na locus Rosa26
    1. Synteza oligonukleotydów do przodu i do tyłu dla jednego przewodnika RNA (patrz plik uzupełniający).
      UWAGA: Zaleca się dodanie nukleotydu "G" na początku sekwencji prowadzącej, co pomaga w ekspresji sterowanej przez promotor U6. Na przykład, aby sklonować wspomniany mR26-sg1, przedni oligo to CACCGCTCCAGTCTCTCTAGAAGAGAT, a odwrotny oligo to AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Dodatkowe G w oligo do przodu i jego dopełnienie w odwróconym oligo są zaznaczone pogrubioną czcionką.
    2. Klonuj syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające przewodnikowym RNA do uniwersalnego wektora ekspresji CRISPR pX458-DsRed2 wygenerowanego w naszej poprzedniej pracy21 (Rysunek 1C) przy użyciu ogólnego protokołu klonowania gRNA opracowanego przez Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); jednak pomiń etap oczyszczania żelu i oczyść strawiony wektor za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W poprzednich protokołach przeprowadzano oczyszczanie żelu wektora strawionego przez BbsI; Jednak ten krok jest czasochłonny. W niniejszym protokole strawiony produkt jest oczyszczany przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR i stosowany bezpośrednio w dalszej reakcji ligacji, która na ogół wytwarza dodatnie kolonie o porównywalnej wydajności.
    3. Przekształć 10 μl produktu ligacji (krok 1.2.2) w 50 μl komórekEscherichia coli DH5α zgodnie z instrukcjami producenta. Losowo wybierz trzy kolonie z płytki agarowej LB ampicyliną (100 μg / ml) i zaszczep każdą z nich w 3 ml pożywki LB ampicyliną do hodowli przez noc.
    4. Użyć 1 ml nocnej kultury bakteryjnej do sekwencjonowania Sangera, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C, dopóki nie zostanie potwierdzone, że konstrukt jest prawidłowy: pDsR-mR26-sg1 i pDsR-mR26-sg2 dla locus mRosa26 oraz pDsR-hR26-sg1 i pDsR-hR26-sg2 dla locus hROSA26.
    5. Przygotować plazmidowe DNA o wysokim stężeniu (około 2 μg/μl) za pomocą zestawu maxiprep do oczyszczania plazmidu o stopniu transfekcji (patrz Tabela materiałów).

2. Projektowanie i budowa wektorów docelowych jako szablonów rekombinacji homologicznej

  1. Zaprojektuj szablon naprawy ukierunkowany na homologię
    1. Zaprojektuj wektor ukierunkowany, aby konstytutywnie wyrazić punkt POI za pomocą kasety wyrażeń zoptymalizowanej na podstawie poprzedniego badania29, która zawiera promotor hybrydy CAG, miejsce restrykcyjne AscI umożliwiające klonowanie cDNA POI, reporter IRES-EBFP2 i sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (bGH-polyA) (Rysunek 1B i plik uzupełniający).
    2. Zaprojektuj ramiona homologii (HA), które mają wspólną homologię z sekwencjami genomowymi locus mRosa26 lub hROSA26. Dołącz ~1 kb 5' HA odpowiadającego sekwencji genomowej poprzedzającej od żądanego miejsca insercji po lewej stronie kasety ekspresyjnej. Podobnie, dołącz ~1 kb 3' HA odpowiadającego sekwencji genomowej znajdującej się poniżej od miejsca insercji po prawej stronie kasety ekspresyjnej.
      UWAGA: Kaseta z wyrażeniami jest umieszczana jak najbliżej miejsc cięcia CRISPR/Cas934. Aby uniknąć ponownego cięcia docelowego allelu przez CRISPR/Cas9, włącz zmiany nukleotydów do sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (5'-NGG-3') w wektorze docelowym34,35.
    3. Aby umożliwić linearyzację wektora docelowego, należy wstawić unikalne miejsce EcoRI tuż przed 5' HA i unikalne miejsce BamHI tuż za HA 3'.
    4. Poproś komercyjnego dostawcę o zsyntetyzowanie wektorów docelowych i oznaczenie ich jako pKR26-iBFP i pKhR26-iBFP odpowiednio dla mRosa26 i hROSA26 knock-in.
  2. Skonstruuj wektor kierowania jako szablon naprawy ukierunkowany na homologię
    1. Aby wyrazić POI, uzyskaj sekwencję cDNA (sekwencję kodującą) z przeglądarki genomu Ensembl i wybierz transkrypt posiadający najdłuższą sekwencję białka. Na przykład cDNA ludzkiego genu ACE2 to ACE2-202 ENST00000427411.2, a cDNA ludzkiego genu RASGRP1 to RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Zsyntetyzuj cDNA punktu POI z pomocą komercyjnego dostawcy. Możliwe jest również sklonowanie cDNA poprzez amplifikację PCR (nie opisane tutaj). Umieść sekwencję GGCGCGCCACC (5' - 3'), która obejmuje miejsce restrykcyjne AscI (kursywa i pogrubienie) oraz miejsce inicjacji translacji konsensusu Kozaka (podkreślone), bezpośrednio przed kodonem inicjacji ATG cDNA i innym miejscem restrykcyjnym AscI (5'- GGCGCGCC -3') po kodonie stop cDNA.
    3. Strawić zsyntetyzowaną sekwencję za pomocą AscI i oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania PCR przeznaczonego do oczyszczania fragmentów DNA po trawieniu restrykcyjnym, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    4. Zlikulować oczyszczoną wstawkę cDNA do linearyzowanego wektora szkieletowego AscI pKR26-iBFP lub pKhR26-iBFP za pomocą ligazy DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Zweryfikuj ostateczny wektor kierowania, pKR26-POI-iBFP lub pKhR26-POI-iBFP, poprzez sekwencjonowanie. Użyj maxiprep do oczyszczenia zweryfikowanych konstruktów zgodnie z protokołem producenta.
    6. Strawić wektor docelowy za pomocą EcoRI lub BamHI i oczyścić produkt trawienia za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowuj zlinearyzowany wektor celowniczy (~0,8 μg/μL) w temperaturze -20 °C do momentu elektroporacji.

3. Elektroporacja makrofagów i linii limfocytów T

  1. Przygotowanie kultur komórkowych do elektroporacji
    1. Przygotuj Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) jako kompletną pożywkę wzrostową dla limfocytów T Jurkat. Przygotuj zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS do hodowli makrofagów RAW264.7. Uzupełnij wszystkie kompletne pożywki wzrostowe penicyliną o stężeniu 100 μg/ml i streptomycyną o stężeniu 100 μg/ml (Pen/Strep), z wyjątkiem pożywek stosowanych do inkubacji po transfekcji przed sortowaniem komórek.
    2. Wykonaj subkulturację limfocytów T RAW264.7 i Jurkat zgodnie z instrukcjami dostawcy (patrz tabela materiałów). Podczas subhodowli komórek RAW264.7 użyj roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do odłączenia komórek. Użyj FBS uzupełnionego 10% (v/v) DMSO jako pożywki do kriokonserwacji dla komórek RAW264.7 i Jurkat.
    3. Zbieraj komórki w ilości 250 × g przez 5 minut dla makrofagów RAW264.7 i 90 × g przez 8 minut dla limfocytów T Jurkat. Następnie przemyć 5-10 ml 1× DPBS (bez jonówCa2+ lubMg2+). Usuń DPBS.
    4. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml 1× DPBS. Użyj 10 μl komórek i wymieszaj z równą objętością 0,2% błękitu trypanowego, aby oszacować liczbę komórek i ich żywotność.
      UWAGA: Upewnij się, że hodowla komórkowa ma >90% żywotności w dniu transfekcji.
    5. W przypadku pojedynczego eksperymentu knock-in należy wykonać elektroporację za pomocą 10 μl końcówek nukleofekcyjnych z pięcioma powtórzeniami. Obliczyć objętość potrzebną na 2,0 × 106 komórek i zagnieździć komórki przez odwirowanie. Ponownie umyj osad komórkowy za pomocą 1× DPBS, jak opisano w kroku 3.1.3.
      UWAGA: W przypadku stosowania końcówek nukleofekcyjnych o pojemności 10 μl potrzeba 4,0 ×10 5 ogniw na elektroporację. W związku z tym przygotuj co najmniej 2,0 × 106 komórek na jeden eksperyment knock-in.
    6. Przygotować 24-dołkową płytkę z 0,5 ml kompletnego podłoża wzrostowego (przygotowanego w kroku 3.1.1) na dołek bez wstrzykiwacza/paciorkowca i ogrzać w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  2. Elektroporacja komponentów CRISPR/Cas9 i wektora docelowego
    1. Włącz system elektroporacji. Użyj parametrów elektroporacji zoptymalizowanych w poprzednim badaniu21: 1,400 V/20 ms/2 impulsy dla makrofagów RAW264.7 i 1350 V/20 ms/2 impulsy dla limfocytów T Jurkat.
    2. Biorąc pod uwagę ubytek próbki spowodowany pipetowaniem, należy przygotować mieszaninę do elektroporacji o objętości 55 μl w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zawierającą 2,5 μg każdego wektora CRISPR/Cas9, 2,4 μg zlinearyzowanego wektora docelowego i bufor do rezawieszania R.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, mieszaninę do elektroporacji można przygotować podczas wirowania (krok 3.1.5).
    3. Zawiesić 2,0 ×10 6 ogniw (przygotowanych w kroku 3.1.5) w mieszaninie do elektroporacji o objętości 55 μl z kroku 3.2.2.
    4. Odessać mieszaninę ogniwo/elektroporacja z kroku 3.2.3 za pomocą końcówki nukleofekcyjnej o pojemności 10 μl z pipetą.
      UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą spowodować awarię elektroporacji.
    5. Dodać próbkę do probówki wypełnionej 3 ml buforu E z zestawu do elektroporacji.
    6. Zastosuj parametry elektroporacji dla dwóch typów ogniw zgodnie z opisem w kroku 3.2.1.
    7. Przenieść próbkę do jednego dołka na 24-dołkowej płytce z podgrzanym podłożem z kroku 3.1.6.
    8. Powtórz kroki 3.2.4-3.2.7 dla pozostałych czterech powtórzeń, a także tylko dla kontrolek wektora docelowego i tylko wektora wyrażenia CRISPR.
      UWAGA: Zmień końcówkę nukleofekcji i rurkę podczas przełączania na inny typ komórki/plazmidowe DNA.
    9. Hodować transfekowane komórki przez 48-72 godziny, aby umożliwić odzysk po elektroporacji i ekspresji składników CRISPR/Cas9 przed analizą cytometrii przepływowej lub sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS). Zbadaj ekspresję DsRed2 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w czerwony kanał po 24 godzinach od transfekcji.
      UWAGA: Zaletą monitorowania ogniw fluorescencyjnych DsRed2 jest to, że można oszacować wydajność elektroporacji i przewidzieć przydatność do dalszego sortowania komórek.

4. Sortowanie komórek w celu wyizolowania przypuszczalnych komórek knock-in

  1. Przed sortowaniem FACS należy przemyć transfekowane komórki raz kompletną pożywką wzrostową. Komórki osadu należy odwirować zgodnie z opisem w kroku 3.1.3 i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżej pożywki.
  2. Ustaw sortownik komórek (umieszczony w szafie bezpieczeństwa biologicznego) z dyszą 85 μm i niskim natężeniem przepływu. Wybierz tryb "pojedynczej komórki" do sortowania i przetestuj wydajność i precyzję sortowania pojedynczych komórek, sortując 20-30 komórek na pokrywie 96-dołkowej mikropłytki. Jedna kropla zlokalizowana w środku każdej studzienki wskazuje na prawidłowe ustawienie instrumentu.
  3. Przenieść zawiesinę komórkową z kroku 4.1 do sterylnych probówek FACS i dodać SYTOX Red Dead Cell Stain do końcowego stężenia 1 nM.
  4. Analizuj próbki w sortowniku komórek. SYTOX Red i EBFP2 są wzbudzane przez laser 405 nm i wykrywane odpowiednio przez kanały V450/BV421 i APC. DsRed2 jest wzbudzany przez laser o długości fali 488 nm i wykrywany przez kanał PE. Użyj komórek nietransfekowanych oraz pojedynczych komórek dodatnich EBFP2 i DsRed2 jako kontroli kompensacji spektralnej.
  5. Sortuj 10 pojedynczych komórek do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki zawierającej 150 μl na studzienkę wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki wzrostowej. Użyj mikropłytek z okrągłym dnem do hodowli linii komórek zawiesinowych, takich jak limfocyty T Jurkat, i mikropłytek z płaskim dnem do przylegających makrofagów RAW264.7.
    UWAGA: Sortowanie 10 komórek na studzienkę jest zoptymalizowaną strategią poprawy przeżywalności komórek i zminimalizowania liczby 96-dołkowych mikropłytek, które muszą zostać wysiane, oraz liczby próbek, które muszą być badane za pomocą cytometrii przepływowej i genotypowania; W przypadku sortowania tylko jednej komórki na dołek, wymagane jest wysianie większej liczby mikropłytek, aby zwiększyć szansę na uzyskanie poprawnie edytowanych komórek.

5. Badanie przesiewowe i walidacja dodatnich komórek knock-in

  1. Badania przesiewowe w kierunku potencjalnych komórek knock-in za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Inkubować komórki z kroku 4.5 przez 10-15 dni i dodawać kompletną pożywkę wzrostową co 3 dni, aby zastąpić płyn utracony w wyniku parowania. W przypadku limfocytów T Jurkat przenieś komórki wyhodowane na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem na płaską płytkę, aby zoptymalizować proliferację komórek.
    2. Przenieś rozprężone posortowane komórki na płytki 48-dołkowe w celu dalszej ekspansji.
    3. Gdy komórki są bliskie konfluencji, użyj połowy kultury do badania przesiewowego ekspresji EBFP2 za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3). Zwykle połowa kultury w 48-dołkowej płytce po zlewającym się wzroście odpowiada 0,5-1,0 × 105 komórek, co jest wystarczające do analizy jednej próbki za pomocą cytometrii przepływowej.
    4. Przenieś pozostałe komórki na płytki 24-dołkowe w celu dalszej proliferacji.
    5. Zachowaj populacje komórek kandydujących posiadające wysoki odsetek komórek EBFP2-dodatnich do dalszych eksperymentów genotypowania.
      UWAGA: Ponieważ 10 komórek jest sortowanych do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki, możliwe jest, że komórki knock-in będą rosły z komórkami, które nie wyrażają genu knock-in. Dlatego normalne jest wykonanie dodatkowej rundy sortowania komórek w celu oddzielenia komórek EBFP2-dodatnich od komórek ujemnych.
  2. Badania przesiewowe w kierunku potencjalnych komórek knock-in metodą PCR i sekwencjonowania
    1. Zbierz 2 × 105 kandydujących komórek. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania DNA (patrz tabela materiałów).
    2. Aby sprawdzić, czy precyzyjna naprawa ukierunkowana na homologię (HDR) nastąpiła w locus mRosa26, a nie w losowych miejscach w genomie komórek kandydujących do knock-in, wykonaj PCR ze starterami obejmującymi każdą stronę HA (Figura 4). Wybierz jeden starter znajdujący się w regionie genomowym poza wektorem docelowym (oligo zewnętrzny) i drugi starter znajdujący się wewnątrz wektora docelowego (oligonugolaktykus wewnętrzny).
      UWAGA: Podobny schemat jest używany do weryfikacji HDR w locus hROSA26. Startery PCR można również łatwo zaprojektować do wykrywania wstawiania sekwencji POI. Ponadto genotypy alleli typu dzikiego i knock-in można jednocześnie wykryć za pomocą PCR z trzema starterami (patrz plik uzupełniający, rysunek S2).
    3. Sklonować produkty z dodatnim wynikiem PCR za pomocą zestawu do szybkiego klonowania (patrz tabela materiałów). Przekształć mieszaninę reakcyjną w komórki kompetentne DH5α.
    4. Losowo wybierz 8-10 pojedynczych kolonii bakteryjnych na transformację i zsekwencjonuj produkty PCR z kroku 5.2.3 za pomocą sekwencjonowania Sangera.
  3. Walidacja dodatnich komórek knock-in za pomocą analizy immunoblot i oczyszczania powinowactwa
    UWAGA: Komórki kandydujące są poddawane analizie immunoblot w celu walidacji insercji POI lub oczyszczania powinowactwa (AP) w celu zbadania interakcji białko-białko.
    1. Wykonaj analizę immunoblot zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciał. Patrz tabela materiałów, aby uzyskać informacje dotyczące stosowania przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych.
    2. Poddaj lizaty komórek knock-in wyrażających POI oznaczone OST AP za pomocą kulek Strep-Tactin Sepharose zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    3. Wykrywanie chemiluminescencji za pomocą imagera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem przeprowadzania eksperymentów knock-in w locus mRosa26 przy użyciu mysich makrofagów RAW264.7, zaprojektowaliśmy wektor ukierunkowany na ekspresję ludzkiego ACE2, receptora dla wirusa SARS-Cov-2 (Rysunek 2A). Korzystając z podobnego projektu, wygenerowaliśmy ludzkie limfocyty T Jurkat z knock-in białka fuzyjnego RASGRP1 znakowanego OST (Figura 2C). Po transfekcji trzech plazmidów, z których dwa użyto do ekspresji CRISPR/Cas9 (DsRed2; p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszych eksperymentach pokazaliśmy, jak przeprowadzić edycję knock-in w komórkach odpornościowych, od projektu konstruktu do badania przesiewowego i walidacji komórek knock-in, używając jako przykładów ludzkich limfocytów T Jurkat i mysich makrofagów RAW264.7. Zarówno limfocyty T, jak i linie komórkowe makrofagów są odporne na transfekcję36,37; jednak problem niskiej wydajności dostarczania CRISPR/Cas9 można przezwyciężyć za pomocą reporterów fluorescencyjnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy podstawowemu ośrodkowi cytometrii przepływowej Uniwersytetu Medycznego Xinxiang. Rozwój takiej technologii został wsparty grantami NSFC 81601360 dla LZ, 81471595 i 32070898 dla YL. Prace są również wspierane przez Fundację Komitetu Edukacyjnego Henan nr 21IRTSTHN030.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amersham Imager 600Ge Opieka zdrowotnaObrazowanie chemiluminescencji
Ampicylina, sól sodowaMP Biomedicals194526
Anty-królicza IgG,technologia sygnalizacji komórkowej7074w rozcieńczeniu 1/5000
Przeciwciało anty-RasGRP1, klon 10,1MerckMABS1461,0 i mu; g/ml stężenia roboczego
AscINew England BioLabsR0558S
β-aktyna (D6A8)Technologia sygnalizacji komórkowej8457w rozcieńczeniu 1/1000
BamHI-HFNowa Anglia BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Celometr Mini automatyczny licznik komórekNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Kompetentne komórkiTakara9057
DMSO (Dimethyl Suloxidide)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Zestawy tkanekQiagen69506odczynnik do hodowli komórkowych
DPBS (10X), bez wapnia, bez magnezuThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z Hyklonem o wysokiej zawartości glukozySH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Bioscienceswyposażony w szafę bezpieczeństwa biologicznego
Cytometr przepływowy FACS CantoBD Biosciences
Falcon 5 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnemBD Biosciences352003
Surowica bydlęca płodu (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo wersja 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP  Technologiasygnalizacji komórkowej5174w rozcieńczeniu 1/1000
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Drugorzędowe, HRPThermoFisher Scientific31430w rozcieńczeniu 1/5000
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembraneMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Siarczan kanamycynyMP Biomedicals194531
LB agar w proszkuThermoFisher Scientific 22700041
Pipeta wielokanałowa (30-300 μ L)Eppendorf lub podobny
system transfekcji neonowejThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfekcja, 10 μ Zestaw LThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Stożkowe sterylne probówki wirówkoweThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Gorący start Szybkie ładowanie® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)do szablonu o wysokim GC%
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Końcówka do pipety 0,1-20 i mikro; lEppendorf lub podobny0030 075.005
Końcówka do pipet 2-200µ lEppendorf lub podobny0030 075.021
Końcówka do pipet 50-1000µ lEppendorf lub podobny0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104oczyszcza plazmid z trawienia restrykcyjnego
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Rekombinowane przeciwciało anty-ACE2 [EPR4435(2)]Abcamab108252w rozcieńczeniu 1/1000
RPMI 1640 ŚredniHyklonSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose BeadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher Scientific15140122
SYTOX&handel; Barwienie martwych komórek na czerwono, do wzbudzenia 633 lub 635 nmThermoFisher ScientificS34859
T4 Ligaza DNANew England BioLabsM0202S
T4 Kinaza polinukleotydowaNew England BioLabsM0201S
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061
Roztwór trypsyny-EDTA (0,25%), z czerwienią fenolowąThermoFisher Scientific25200056
Fluorescencyjny obrazownik komórek ZOEBio-Rad
1,5 ml mikroprobówki, PCR-cleanEppendorf lub podobne0030 125.215
24-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TCCorning3524
96-dołkowe przezroczyste mikropłytki z płaskiego dna polistyrenu poddane działaniu TCCorning3599
96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna, mikropłytka z powłoką TCCorning3799
przeciwciał związanych z HRP mAb królika mAb królika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538(2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99(2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168(2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69(2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327(2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539(2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207(2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4(2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102(2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196(2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wprowadzenie CRISPR Cas9 knock inlinie kom rkowe makrofag wlocus Rosa26protok elektroporacjireportery fluorescencyjnerekombinacja homologicznacytometria przep ywowa

Powiązane artykuły