Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Podsumowanie

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Streszczenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Pomimo poprawy strategii leczenia, rak z przerzutami ma złe rokowanie. Stoimy zatem przed pilną potrzebą zrozumienia mechanizmów stojących za powstawaniem przerzutów, a tym samym zaproponowania skutecznych metod leczenia zaawansowanego nowotworu. Nowotwory z przerzutami są trudne do leczenia, ponieważ biopsje są inwazyjne i niedostępne. Ostatnio pojawiło się duże zainteresowanie płynnymi biopsjami, w tym zarówno krążącym bezkomórkowym kwasem dezoksyrybonukleinowym (DNA), jak i krążącymi komórkami nowotworowymi z krwi obwodowej, a my ustaliliśmy kilka krążących linii komórek nowotworowych od pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego, aby wziąć udział w ich charakterystyce. Rzeczywiście, aby funkcjonalnie scharakteryzować te rzadkie i słabo opisane komórki, kluczowym krokiem jest ich ekspansja. Po ustaleniu, krążące linie komórek nowotworowych (CTC) mogą być następnie hodowane w warunkach zawiesiny lub przylegania. Na poziomie molekularnym linie CTC mogą być dalej wykorzystywane do oceny ekspresji określonych markerów będących przedmiotem zainteresowania (takich jak różnicowanie, nabłonkowe lub nowotworowe komórki macierzyste) za pomocą analizy immunofluorescencyjnej lub cytometrycznej. Ponadto linie CTC mogą być wykorzystywane do oceny wrażliwości leków na chemioterapię o najwyższym standardzie, a także na terapie celowane. Zdolność linii CTC do inicjowania nowotworów można również przetestować poprzez podskórne wstrzyknięcie CTC myszom z niedoborem odporności.

Wreszcie, możliwe jest przetestowanie roli konkretnych genów, które mogą być zaangażowane w rozprzestrzenianie się raka, poprzez edycję genów CTC, za pomocą krótkiego kwasu rybonukleinowego (shRNA) lub Crispr/Cas9. Zmodyfikowane CTC mogą być zatem wstrzykiwane do śledziony myszy z niedoborem odporności, aby eksperymentalnie naśladować część procesu rozwoju przerzutów in vivo.

Podsumowując, linie CTC są cennym narzędziem dla przyszłych badań i medycyny spersonalizowanej, gdzie pozwolą przewidzieć skuteczność leczenia przy użyciu tych samych komórek, które są pierwotnie odpowiedzialne za przerzuty.

Wprowadzenie

Pomimo ostatnich postępów we wczesnej diagnostyce raka i strategii terapeutycznej, ponad dziewięćdziesiąt procent zachorowalności na raka jest nadal spowodowane przerzutami¹. Proces przerzutowy to wieloetapowa kaskada, która rozpoczyna się od miejscowego oderwania komórek od guza pierwotnego i ich wejścia do krwiobiegu, gdzie stają się krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC), aby ostatecznie skolonizować odległe miejsca, takie jak wątroba i płuca, w przypadku raka jelita grubego (CRC)². Ostatnio coraz częściej zwraca się uwagę na biopsje płynne, które są nieinwazyjnym narzędziem do wykrywania i liczenia CTC w próbkach krwi pacjentów. Niejednorodność genetyczna wewnątrz guza jest główną przyczyną oporności na leki; W związku z tym wyizolowanie reprezentatywnych komórek z materiału nowotworowego stanowi obiecujące narzędzie dla medycyny spersonalizowanej³.

Pomimo niskiej częstości występowania CTC we krwi (1 CTC na 10⁶ - 10⁷ leukocytów)⁴, opracowano kilka technik wykrywania i izolacji w oparciu o różnice w właściwościach między CTC a innymi składnikami krwi⁵. Sama liczba CTC w próbkach krwi pacjenta może dostarczyć informacji o stadium złośliwości, odpowiedzi na leczenie i postępie choroby^6,7. W związku z tym izolacja CTC jest kluczowym narzędziem w badaniach translacyjnych w celu oceny heterogeniczności genetycznej lub przeprowadzania badań przesiewowych leków, a także w badaniach podstawowych w celu scharakteryzowania tych inwazyjnych komórek, ponieważ są one kluczowymi aktorami indukcji przerzutów^8,9. Rzeczywiście, w porównaniu z komercyjnie ustalonymi liniami komórek rakowych, które z czasem zgromadziły tysiące mutacji, świeże CTC mają główne cechy pierwotnego guza pierwotnego, w tym silną zdolność do przerzutów, i są lepszym odzwierciedleniem choroby. Cechy te sprawiają, że są one solidnym narzędziem do badań podstawowych, zwłaszcza w eksperymentach z nokautem przewidywanych kluczowych czynników zaangażowanych w przerzuty. Wyniki tych eksperymentów można zweryfikować in vivo na myszach, jak opisano poniżej.

Po wyizolowaniu CTC, mogą one być rozwijane w warunkach hodowli nieprzylegającej, a następnie mogą być manipulowane tak jak każda dostępna linia komórek rakowych, tzn. mogą być równie dobrze hodowane w warunkach przylegających lub osadzone w Matrigel, w zależności od pytania naukowego¹⁰. Na przykład, aby przetestować ekspresję i lokalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania, kulki CTC mogą być hodowane w stanie zawiesiny i osadzone w Histogel w celu przeprowadzenia immunofluorescencji na odcinkach kuli. Ponadto, jeśli białko jest błoniaste, jego ekspresję na żywych komórkach można zmierzyć za pomocą cytometrii.

Do badań funkcjonalnych, w celu sprawdzenia roli interesującego białka, które może odgrywać rolę w kolonizacji wątroby, CTC z genami edytowanymi przez shRNA lub CRISPR/Cas9 można wstrzyknąć do śledziony myszy z niedoborem odporności. Ten ostatni eksperyment jest potężnym modelem naśladującym kolonizację przerzutów do wątroby¹¹.

Zdolność CTC do inicjowania nowotworów może być oceniona poprzez wstrzyknięcie bardzo małej liczby komórek myszom z niedoborem odporności. Ponieważ inicjacja guza jest cechą charakterystyczną rakowych komórek macierzystych (CSC), test ten wskaże procent CSC w liniach CTC. Ten fenotyp komórek macierzystych sprawia, że krążące linie komórek nowotworowych są odporne na niektóre złote standardy terapii przeciwnowotworowych. Rozszerzone CTC mogą być zatem wykorzystywane do badań przesiewowych leków i określania najlepszego potencjalnego skutecznego leczenia dla pacjenta; Odpowiedź CTC na leczenie można badać in vitro, na przykład za pomocą testu żywotności luminescencji.

W perspektywie długoterminowej, badania przesiewowe leków na świeżo wyizolowanych i amplifikowanych CTC mogłyby być wykorzystane jako nowe narzędzie dla medycyny spersonalizowanej, aby pomóc w wyborze najbardziej efektywnego i dostosowanego leczenia dla pacjentów.

W niniejszym artykule szczegółowo opisane są protokoły hodowli linii CTC, barwienia określonych białek za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii, przeprowadzania testów cytotoksyczności, a także eksperymentów in vivo z ksenoprzeszczepami z CTC.

Protokół

Wszystkie protokoły in vivo zostały zatwierdzone przez agencje etyczne ds. zwierząt.

1. Amplifikacja CTC w warunkach hodowli 3D

1. Aby wyhodować CTC w zawiesinie, pierwsze nasiona CTC w studzienkach 24-dołkowej płytki o ultra-niskim przyłączeniu (ULA) o maksymalnym stężeniu 5 komórek/μl i w 1 ml pożywki M12 (tj. zaawansowany DMEM-F12 uzupełniony 2 mM l-glutaminą, 100 jednostkami/ml penicyliny i streptomycyny, suplementem N2, 20 ng/ml naskórkowym czynnikiem wzrostu i 10 ng/ml czynnikiem wzrostu fibroblastów¹⁰).
2. Aby umożliwić tworzenie się kuli i ekspansję komórek, inkubuj komórki w warunkach niedotlenienia (2%_O2) od 6 do 10 dni.
3. Gdy kule są wystarczająco duże (100 μm), aby zapobiec martwicy, należy je rozdzielić w celu amplifikacji.
   1. Umieścić zawiesinę komórek w probówce o pojemności 2 ml lub probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
   2. Usunąć supernatant i dodać 500 μl delikatnego odczynnika dysocjacyjnego (np. Accumax) do osadu.
   3. Delikatnie wirować i inkubować zawiesinę komórkową z delikatnym odczynnikiem dysocjacyjnym przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Przekroczenie czasu inkubacji w delikatnym odczynniku dysocjacyjnym (Accumax) może spowodować nienormalne zwiększenie śmiertelności komórek.
   4. Dodać 1,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirować probówkę przez 5 minut przy 300 x g.
   5. Odlej sklarat i ponownie zawieś osad w świeżym podłożu M12, aby osiągnąć gęstość 1-5 komórek na μl.
   6. Wysiewać zawiesinę komórek w nowych dołkach z płytki o bardzo niskim przyłączeniu: 10 ml dla kolb T75, 2 ml dla płytek 6-dołkowych i 100 μl dla płytek 96-dołkowych

2. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) na przekrojach sfery CTC

1. Odwirować kulki CTC do probówki o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut, odessać supernatant i dwukrotnie przepłukać osad PBS.
2. Zawiesić osad z 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 20 minut na lodzie. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 x g i przemyć dwukrotnie 5 ml PBS.
3. Zawiesić osad za pomocą (tj. 15 do 20 μl) gorącego i płynnego Histogelu. Za pomocą pipety pobrać całą zawiesinę i zrobić kroplę na wstępnie schłodzonej powierzchni w temperaturze 4 °C i pozostawić do polimeryzacji przez 5 do 10 minut.
   UWAGA: Pracuj szybko, aby uniknąć polimeryzacji zawiesiny w końcówce.
4. Odłącz stałą kroplę za pomocą ostrza skalpela i włóż ją do kasety do zatapiania z przegródkami.
5. Wykonaj następujące kroki: inkluzja parafiny, sekcja parafiny, ponowne uwodnienie sekcji, pobranie antygenu i inkubacja przeciwciał. Kroki te są takie same, jak w przypadku każdego guza lub narządu zanurzonego w parafinie i przetworzonego w celu barwienia immunofluorescencyjnego¹².
   UWAGA: Kaseta może być przechowywana w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia parafiny.

3. Analiza cytometryczna

1. Odwirować kulki CTC do probówki o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut i dwukrotnie przepłukać osad PBS.
2. Odessać supernatant i dodać 500 μl delikatnego odczynnika dysocjacyjnego do osadu.
3. Delikatnie wirować i inkubować zawiesinę komórkową z delikatnym odczynnikiem dysocjacyjnym przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Przekroczenie 40 minut inkubacji w odczynniku do delikatnej dysocjacji (Accumax) może spowodować nienormalne zwiększenie śmiertelności komórek.
4. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 300 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu blokującego (tj. PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)).
5. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby wyeliminować pozostałe kulki.
6. Po zliczeniu umieść 200 000 komórek w trzech probówkach do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), odwiruj przy 300 x g przez 5 minut i usuń supernatant. Użyj jednej z trzech probówek FACS jako kontrolki, która nie otrzyma żadnych odczynników barwiących.
7. Zgodnie z arkuszem danych dodaj odpowiednie przeciwciało do dwóch pozostałych probówek FACS (tj. jednego sprzężonego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, jednego sprzężonego wzorca izotypowego).
8. Po upływie zalecanego czasu inkubacji dodać 300 μl buforu blokującego w celu przepłukania komórek, odwirować 3 probówki o stężeniu 300 x g i odessać supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie. Następnie ponownie zawiesić osad z buforem blokującym z odczynnikiem do barwienia żywotności komórek (z wyjątkiem kontroli probówki FACS bez barwienia).
9. Trzymaj probówki na lodzie do czasu analizy FACS. Najpierw użyj probówki bez barwienia, aby zidentyfikować bramkę dla żywotności komórek i barwienia przeciwciałami. Następnie przeanalizuj probówkę FACS ze sprzężonym przeciwciałem przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, aby określić ilościowo procent CTC wyrażającego interesujące białko. Rurka FACS ze sprzężoną kontrolą izotypu nie powinna wskazywać przesunięcia. Potwierdza to, że przesunięcie jest specyficzne dla docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
   UWAGA: Jeśli to możliwe, należy użyć linii komórkowej wyrażającej wysoki poziom białka będącego przedmiotem zainteresowania jako kontroli dodatniej oraz linii komórkowej, która nie wykazuje ekspresji białka, jako kontroli ujemnej.

4. Test żywotności luminescencji (CellTiter-Glo)

1. Zawiesić zdysocjowane CTC (jak opisano w sekcji 1.4.5) w pożywce M12. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 200 000 komórek/ml.
2. Na 96-dołkowej płytce ULA wysiewaj 10 000 zdysocjowanych CTC na dołek w 50 μl i inkubuj płytkę w hipoksji (2%_O2) przez 24 godziny.
3. Następnego dnia należy dodać 50 μL badanego leku do CTC. Wcześniej zaleca się wykonanie miareczkowania stężenia leku, w celu określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50). Traktuj niektóre studzienki nośnikiem tylko w celu określenia żywotności komórek podstawnych.
   UWAGA: Liczba zasianych komórek może się różnić między liniami CTC, w zależności od czasu ich podwojenia. Ponadto komórki powinny być wysiewane w trzech egzemplarzach, aby zminimalizować zmienność wyników.
4. Inkubować płytki w hipoksji przez kolejne 48 godzin.
5. W dniu 3 umieścić hodowane płytki oraz bufor żywotności komórek luminescencyjnych i substrat w temperaturze pokojowej i rozpuścić substrat w odpowiedniej objętości buforu, zgodnie z protokołem producenta.
6. Dodać 70 μl mieszanki żywotności luminescencji do każdej płytki hodowlanej. Umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej na 20 minut w celu wywołania lizy komórek, a następnie przenieść 100 μl mieszaniny na nieprzezroczystą płytkę wielodołkową, kompatybilną z luminometrem.
7. Pozostaw płytkę do odpoczynku w temperaturze pokojowej, przykryj ją folią aluminiową w celu ustabilizowania sygnału luminescencyjnego.
   UWAGA: Sygnał luminescencyjny jest stabilny do 3 godzin.
8. Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek (np. Tecan Infinite 200 Pro).
9. Na potrzeby analizy danych należy obliczyć średnią z trzykrotnej względnej jednostki światła RLU dla każdego warunku. Aby ocenić procent żywotności w zależności od każdego potrzebnego stężenia leku: (RLU komórek poddanych działaniu substancji/RLU komórek nieleczonych) x 100.

5. Zastrzyki podskórne

1. W probówce do mikrowirówek ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnego PBS. Jeśli liczba wstrzykniętych komórek jest niska, ponownie zawieś komórki w 1:1 PBS/Matrigel, o zmniejszonej zawartości czynników wzrostu, aby skoncentrować komórki razem i przyspieszyć inicjację guza.
   UWAGA: Gęstość komórek może wynosić od 10 komórek (w celu zakwestionowania zdolności inicjacji guza) do 1 miliona komórek, w zależności od pytania naukowego i celu eksperymentu.
2. Pobrać pełną objętość w strzykawce insulinowej.
3. U myszy z niedoborem odporności uszczypnij skórę boku między palcem wskazującym a serdecznym i delikatnie wbij igłę u podstawy skóry.
   UWAGA: Ta procedura nie jest bolesna i jest wykonywana na przytomnych myszach.
4. Powoli wstrzyknij objętość w to samo miejsce, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się komórek. Spowoduje to powstanie małego pęcherzyka pod skórą.
5. Delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec cofaniu się objętości.
6. Monitoruj wzrost guza co drugi dzień za pomocą suwmiarki.
7. Uśmierc zwierzę, jeśli guz przekracza 1500 mm³. W zależności od dostępności materiału, myszy należy poddać eutanazji poprzez wdychanie dwutlenku węgla lub gazów znieczulających lub zwichnięcie szyjki macicy.

6. Wstrzyknięcie dośledzionowe

1. Przed rozpoczęciem należy autoklawować narzędzia chirurgiczne (nożyczki i kleszcze) w temperaturze 124 °C przez 15 minut i oczyścić wszystkie powierzchnie przestrzeni roboczej 70% etanolem.
2. W probówce do mikrowirówki ponownie zawieś komórki w 50 μl sterylnego PBS i przechowuj je na lodzie. Gęstość komórek może wynosić od 0,5 do 1 miliona komórek. Większa liczba komórek może powodować rozwój skrzepów w krążeniu krwi.
3. Przed wstrzyknięciem komórek należy wstrzyknąć podskórnie 100 μl buprenorfiny o stężeniu 0,015 mg/ml w celu złagodzenia bólu.
4. Umieść mysz w komorze indukcyjnej, w której izofluran utrzymuje się na poziomie 3%, przez 2-3 minuty. Kiedy zwierzę przestaje reagować na ruch, połóż je na prawym boku na poduszce grzewczej i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz z obwodem oddychania, która dostarcza mieszaninę gazów_O2 i izofluranu.
5. Nałóż lubrykant do oczu na każde oko, aby uniknąć wysuszenia oczu podczas zabiegu. Zdezynfekować okolicę klatki piersiowej roztworem jodu powidonu (tj. betadyną).
6. Po stronie grzbietowo-brzusznej wykonaj małe nacięcie 0,5 cm za pomocą nożyczek poniżej 10. fałszywego żebra.
7. Delikatnie wyjmij śledzionę i połóż ją na sterylnej gazie. Za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć 50 μl CTC w końcówkę śledziony. Upewnij się, że strzykawka jest trzymana w pozycji pionowej i odczekaj 3-5 minut, aby uniknąć przepływu wstecznego, a następnie wyjmij igłę.
8. Podwiązać naczynia śledziony z dwóch stron (tętnic i żył) i usunąć śledzionę, przecinając bezpośrednio nad dwoma ligaturami. Śledziona jest usuwana, aby zapobiec niepożądanemu tworzeniu się guza w tym narządzie.
9. Zszyj otrzewną brzuszną, a następnie skórę za pomocą 5.0 degradowalnych sterylnych szwów.
10. Utrzymuj mysz w cieple, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
11. Monitoruj mysz 3 dni w tygodniu pod kątem nieprawidłowych funkcji organizmu, nieprawidłowych ruchów i postawy oraz utraty wagi.
12. Zwierzę należy złożyć w ofierze, gdy osiągną humanitarne punkty końcowe (około 6 tygodni po operacji), aby przeanalizować przerzuty do wątroby.

Wyniki

Zarówno wyrażenia EpCAM, jak i CD26 zaobserwowane odpowiednio przez IF (Rysunek 1A prawy panel) i FACS (Rysunek 1B) wskazują, że linia CTC jest nabłonkowa i wykazują jedną z cech charakterystycznych CSC¹⁰. Ta cecha nabłonkowa może być dodatkowo scharakteryzowana przez barwienie przeciwciałami skierowanymi przeciwko innym markerom nabłonkowym i mezenchymalnym. W ten sposób można w przybliżeniu określić, gdzie znajduje się ...

Dyskusja

Opisany powyżej protokół był początkowo stosowany do charakterystyki funkcjonalnej CTC jelita grubego, ale może być stosowany w przypadku innych rodzajów raka, takich jak rak piersi i może być dostosowany do modeli mysich.

Prawdziwym czynnikiem ograniczającym jest liczba CTC obecnych w próbce krwi oraz skuteczność techniki zastosowanej do ich izolacji i namnażania. Opisano kilka technik izolacji CTC w oparciu o specyficzne właściwości CTC, takie jak Parsortix, urządzenie mikroprzepływowe, któr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rozwiązanie Accumax	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Test żywotności komórek luminescencyjnych	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Wielokrotne Płytki studzienne,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium klasa	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium klasa	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-glutamina (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Suplement	Gibco
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/ml)	Gibco	15070063