Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Summary

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Abstract

Wyściółka nabłonka jelitowego składa się z prostej warstwy wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych, które eksponują swoją wierzchołkową stronę światła i reagują na zewnętrzne sygnały. Niedawna optymalizacja warunków hodowli in vitro pozwala na odtworzenie niszy jelitowych komórek macierzystych i opracowanie zaawansowanych systemów hodowli trójwymiarowych (3D), które podsumowują skład komórkowy i organizację nabłonka. Organoidy jelitowe osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być utrzymywane przez długi czas i samoorganizujące się, aby wytworzyć dobrze zdefiniowany, spolaryzowany nabłonek, który obejmuje wewnętrzne światło i zewnętrzną odsłoniętą stronę podstawną. Ten restrykcyjny charakter organoidów jelitowych stanowi wyzwanie w dostępie do wierzchołkowej powierzchni nabłonka in vitro i ogranicza badania mechanizmów biologicznych, takich jak pobieranie składników odżywczych i interakcje między mikrobiotą a gospodarzem a gospodarzem i patogenem. W tym miejscu opisujemy dwie metody, które ułatwiają dostęp do wierzchołkowej strony nabłonka organoidowego i wspomagają różnicowanie określonych typów komórek jelitowych. Po pierwsze, pokazujemy, w jaki sposób usunięcie ECM indukuje odwrócenie polaryzacji komórek nabłonkowych i pozwala na generowanie wierzchołkowych organoidów 3D. Po drugie, opisujemy, jak generować dwuwymiarowe (2D) monowarstwy z zawiesin pojedynczych komórek pochodzących z organoidów jelitowych, składających się z dojrzałych i zróżnicowanych typów komórek. Techniki te dostarczają nowatorskich narzędzi do badania specyficznych dla wierzchołka interakcji nabłonka z zewnętrznymi sygnałami in vitro i promują wykorzystanie organoidów jako platformy ułatwiającej medycynę precyzyjną.

Introduction

Nabłonek jelitowy jest drugim co do wielkości nabłonkiem w ludzkim ciele i składa się ze spolaryzowanej warstwy komórkowej, która ułatwia pobieranie składników odżywczych i działa jako bariera przed szkodliwym wpływem środowiska¹. To rozróżnienie między stroną wierzchołkową i podstawno-boczną pozwala komórkom nabłonka pełnić swoje różnorodne funkcje. Przedział wierzchołkowy jest wystawiony na działanie światła i pośredniczy w interakcjach nabłonkowych z bodźcami środowiskowymi i mikroorganizmami, jednocześnie ułatwiając pobieranie składników odżywczych. Na powierzchni podstawno-bocznej znajdują się połączenia międzykomórkowe i zrosty macierzy komórkowej, jednocześnie łącząc się z komórkami układu odpornościowego i innymi tkankami². Połączenia te generują nieprzepuszczalną monowarstwę przyczepioną do błony podstawnej, która działa jak bariera i dostarcza wchłonięte składniki odżywcze do otaczającej tkanki ciała.

Stworzenie systemów hodowli, które są w stanie podsumować te funkcje jelitowe in vitro, było wyzwaniem³. Konwencjonalne modele in vitro wykorzystują przekształcone linie komórkowe ludzkiego raka jelita grubego, takie jak Caco-2, do generowania jednowarstwowych kultur 2D. Pomimo możliwości modelowania wielu funkcji przedziału absorpcyjnego, modele te nie są w stanie w pełni podsumować składu i funkcji nabłonka jelitowego, co ogranicza kluczowe cechy funkcjonalne i zastosowania^4,5.

Pojawienie się organoidów jako zaawansowanego systemu hodowli 3D generowanego z komórek macierzystych, które mogą się samoorganizować i różnicować do typów komórek specyficznych dla narządów, było przełomem w badaniu in vitro nabłonka jelitowego⁶. Organoidy jelitowe są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która przypomina blaszkę podstawną i tworzy połączenia komórka-macierz, które pozwalają tym kulturom zachować apikopodstawową polarność nabłonka. Organoidy wykazują zamkniętą architekturę, w której strona wierzchołkowa jest wystawiona na działanie przedziału świetlnego, naśladując w ten sposób strukturę jelita. Chociaż ta zamknięta organizacja oferuje możliwość badania funkcji specyficznych dla orientacji, ogranicza badania, które wymagają dostępu do wierzchołkowej strony nabłonka. Zastosowano różne podejścia do przezwyciężenia tych ograniczeń zarówno w 2D, jak i 3D, w tym fragmentację organoidów, mikroiniekcję organoidów i generowanie kultur jednowarstwowych⁷. Fragmentacja organoidów powoduje utratę organizacji strukturalnej i zniszczenie połączeń komórkowych, co pozwala na wystawienie wierzchołkowej powierzchni nabłonka na działanie pożywki. Technika ta wykorzystuje zdolność regeneracyjną fragmentów do reformowania organoidów po wysianiu do macierzy zewnątrzkomórkowej i została wykorzystana do modelowania chorób zakaźnych i interakcji gospodarz-patogen^8,9. Jednak jednoczesny dostęp zarówno do powierzchni wierzchołkowej, jak i podstawowej może również wywołać nieswoiste reakcje na zakażenie.

Alternatywne podejście, które umożliwia dostęp do powierzchni wierzchołkowej i zachowuje zarówno architekturę strukturalną, jak i połączenia komórkowe, jest reprezentowane przez mikroiniekcję czynników do światła organoidów. Metoda ta jest szeroko stosowana do badania interakcji gospodarz-patogen i modelowania wpływu Cryptosporidium¹⁰, H. pylori¹¹ i C. difficile¹² na nabłonek przewodu pokarmowego in vitro. Stosując podobne techniki, określono potencjał mutagenny szczepu pks+ E. coli na nabłonek jelitowy¹³. Chociaż mikroiniekcja organoidów jest skuteczna, jest pracochłonnym i nieefektywnym zadaniem, biorąc pod uwagę dużą liczbę organoidów, które należy wstrzyknąć, aby uzyskać mierzalne efekty, a zatem ogranicza jej zastosowanie w przypadku testów o wysokiej przepustowości.

Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie organoidów jelitowych dostarczyły również metod tworzenia jednowarstwowych kultur organoidowych 2D, odsłaniając w ten sposób ich powierzchnię wierzchołkową^14,15,16,17. Te monowarstwy pochodzące z organoidów podsumowują kluczowe właściwości nabłonka jelitowego in vivo. Wykazują one fizjologicznie istotny skład komórkowy, zawierający zarówno populacje komórek zróżnicowanych, jak i macierzystych, oraz modelują różnorodność na osi krypta-kosmki. Ponieważ polaryzacja apikopodstawowa jest zachowana, nieodłączne właściwości monowarstwowe pozwalają na łatwy dostęp zarówno do strony wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej, a wymiana pożywki może naśladować przepływ jelitowy i usuwanie odpadów, co pozwala na długotrwałą hodowlę. Te cechy sprawiają, że monowarstwy pochodzące z organoidów są podatne na badania koncentrujące się na oddziaływaniach luminalnych i zapewniają doskonały model integralności i przepuszczalności bariery nabłonkowej^18,19.

Badania wykazały, że polaryzacja komórek nabłonkowych jest ściśle regulowana przez białka ECM w sferoidach MDCK^20,21 i ostatnio w ludzkich organoidach jelitowych²². Usunięcie składników ECM lub zahamowanie receptora integryny, który pośredniczy w połączeniach komórka-macierz, powoduje odwrócenie polaryzacji organoidów jelitowych i wystawienie wierzchołkowej strony nabłonka na podłoże²². Takie podejście wzbudziło zainteresowanie naukowców zajmujących się chorobami zakaźnymi, ponieważ umożliwia łatwy dostęp do strony wierzchołkowej w 3D i sprawia, że jest ono podatne na testy o wysokiej przepustowości. Tutaj opisujemy zmodyfikowany protokół oparty na niedawnej pracy Amieva lab²², który ułatwia generowanie organoidów jelitowych 3D, które łatwo odsłaniają swoją wierzchołkową stronę. Przedstawiamy również protokół, który może wydajnie i powtarzalnie generować jelitowe monowarstwy 2D pochodzące z organoidów jelitowych.

Protocol

Wyprowadzanie kultur organoidów jelitowych ludzkich zostało przeprowadzone zgodnie z opisem w innym miejscu²³. Organoidy utrzymywano w hodowli zgodnie z opisem w karcie informacyjnej produktu (PIS) dla pożywki do ekspandowania organoidów jelitowych (patrz tabela materiałów).

1. Odwrócenie polaryzacji organoidów jelitowych

UWAGA: Ta sekcja przedstawi protokół odwracania polaryzacji organoidów jelitowych 3D. Protokół ten zawiera szczegółową procedurę tworzenia spolaryzowanych organoidów z odsłoniętą powierzchnią wierzchołkową w zawiesinie na płytce hodowlanej. Protokół ten ma na celu przeprowadzenie testu punktu końcowego, chociaż organoidy mogą być utrzymywane w tej konformacji przez ponad 2 tygodnie i utrzymywać małą populację komórek macierzystych, co pozwala im na ponowne ustanowienie organoidów wierzchołkowych po pasażu.

1. Powlekanie naczyń hodowlanych i probówek roztworem antyadhezyjnym
   UWAGA: Aby zmaksymalizować liczbę organoidów jelitowych wierzchołkowych i zapobiec niepożądanemu przyczepianiu się do kultur, zazwyczaj wymagane jest wstępne powlekanie kultur. Poniższa sekcja opisuje powlekanie kultur i wyrobów z tworzyw sztucznych roztworem zapobiegającym przywieraniu.
   1. Płytki do hodowli płaszczy, które należy stosować w części protokołu dotyczącej zawiesiny, są następujące.
      1. Dodać 0,5 ml roztworu przeciwadhezyjnego do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
      2. Zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na powierzchni i ściankach studzienek.
      3. Odwirować płytkę o sile 1 300 x g przez 10 minut.
      4. Usuń roztwór zapobiegający przywieraniu z każdej studzienki za pomocą aspiratora lub pipety o pojemności 1 ml.
      5. Umyj studzienki 1 ml DMEM/F-12 za pomocą 15mM HEPES (DMEM/F12).
      6. Napełnij każdą umytą płytkę dobrze 0,5 ml DMEM/F-12 i przechowuj płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do czasu użycia.
         UWAGA: Jeśli nie zostaną natychmiast zużyte, powlekane płytki można przechowywać w inkubatorze przez co najmniej 1 tydzień.
   2. Pokryj stożkowe probówki o pojemności 15 ml używane w tym protokole w następujący sposób.
      1. Dodać 4 ml roztworu przeciwadhezyjnego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      2. Zakręć rurką, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na powierzchni ścian.
      3. Odwirować probówkę o stężeniu 1 300 x g przez 10 minut.
      4. Usuń roztwór zapobiegający przywieraniu z tubki.
      5. Przemyć probówkę 1x 5 ml DMEM/F-12 i odessać DMEM/F-12. Probówki są teraz gotowe do użycia.
         UWAGA: Jeśli nie zostanie natychmiast użyty, dodać 5 ml DMEM/F12 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Powlekane probówki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień.
2. Odwrócenie polarności organoidów jelitowych przez hodowlę zawiesiny
   UWAGA: Poniższe kroki przedstawiają inwersję organoidów jelitowych uprzednio hodowanych w standardowych warunkach kopuły ECM. Opisane tutaj procedury dotyczą jednego dołka na płytce 24-dołkowej. Jeśli używasz innych kultur, odpowiednio dostosuj głośność.
   1. Ostrożnie usuń i wyrzuć pożywkę z każdej studzienki zawierającej organoidy, nie naruszając kopuły macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej. Upewnij się, że rozmiar organoidów wynosi 150-250 μm średnicy (zwykle w 3-5 dniu) przed rozpoczęciem protokołu inwersji.
   2. Dodaj 1 ml lodowatego roztworu dysocjacyjnego do każdej studzienki.
   3. Inkubować w temperaturze pokojowej (15-25 °C) przez 1 minutę.
   4. Dodaj co najmniej 2 ml roztworu zapobiegającego przywieraniu do probówki o pojemności 15 ml, która ma być używana do powlekania plastikowych końcówek.
   5. Dodać co najmniej 2 ml DMEM/F-12 do probówki o pojemności 15 ml, która ma być użyta do mycia plastikowych końcówek przepłukanych roztworem zapobiegającym przywieraniu.
   6. Pokryć końcówkę pipety o pojemności 1 ml roztworem zapobiegającym przywieraniu, odpipetując trzykrotnie 1 ml roztworu do probówki roztworem zapobiegającym przywieraniu z kroku 1.2.4.
   7. Umyć końcówkę w zimnym DMEM/F-12, pipetując trzykrotnie 1 ml roztworu do probówki z DMEM/F-12 z kroku 1.2.5.
   8. Używając powlekanej końcówki, ostrożnie usuń kopułki, powoli pipetując. Uważaj, aby nie zakłócić ani nie rozdrobnić organoidów.
   9. Przenieść zawiesinę organoidu na płytkę potraktowaną roztworem zapobiegającym przywieraniu (od kroku 1.1.1).
   10. Umieścić płytkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C na 30 minut. Wytrząsarka żyroskopowa może być używana przy 70 obr.
       UWAGA: Unikaj silnego wstrząsania, takiego jak wirowanie próbki, ponieważ może to spowodować fragmentację organoidów. Tworzenie się pęcherzyków i piany może wskazywać na silne potrząsanie.
   11. Po 30 minutach wyjmij płytkę. Używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml pokrytej roztworem zapobiegającym przywieraniu, delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół.
   12. Umieścić płytkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C na 15 minut. Wytrząsarka żyroskopowa może być używana przy 70 obr./min.
   13. Usunąć płytkę i pozwolić organoidom osiąść grawitacyjnie (1-2 minuty w temperaturze pokojowej). Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby sprawdzić sedymentację organoidów.
       UWAGA: Należy unikać intensywnego poruszania płytką, ponieważ może to spowodować ponowne zawieszenie osiadłych organoidów.
   14. Po opadnięciu organoidów usuń jak najwięcej roztworu dysocjacyjnego i przemyj, dodając 1,5 ml DMEM/F-12.
   15. Pozwól organoidom osiąść i usuń jak najwięcej supernatantu. Powtórz krok prania jeszcze raz.
       UWAGA: Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby sprawdzić sedymentację organoidów przed wykonaniem jakiegokolwiek etapu mycia.
   16. Usuń jak najwięcej DMEM/F-12 i dodaj 0,5 ml pożywki do ekspandowania organoidów jelitowych. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   17. Następnego dnia wykonaj częściową wymianę podłoża, przechylając płytkę pod kątem od 25 do 30 stopni i usuwając pożywkę wzdłuż ściany studni. Usunąć 0,4 ml pożywki, uważając, aby nie usunąć zawieszonych organoidów.
   18. Dodaj 0,4 ml pożywki do ekspansywności organoidów jelitowych. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 3 dni.
       UWAGA: Po 3 dniach większość organoidów powinna mieć polaryzację wierzchołkową, ale mogły powstać duże agregaty.
   19. Jeśli utworzyły się agregaty, użyj pipety o pojemności 1 ml z końcówką pokrytą roztworem zapobiegającym przywieraniu (zgodnie z opisem w krokach 1.2.6 i 1.2.7), aby ścinać kruszywa, pipetując w górę i w dół 20 razy, jednocześnie wciskając koniec końcówki w dno płytki.
   20. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i następnego dnia przeprowadzić pełną wymianę pożywki z pożywką do ekspanderowania organoidów jelitowych (jak opisano w sekcji 1.2.17).
   21. Po 2 dniach (5 dzień w zawiesinie) organoidy wierzchołkowe jelita można zastosować w dalszych testach.

2. Tworzenie jednowarstwowych kultur 2D komórek jelitowych i ALI (Air-Liquid Interface) pochodzących z organoidów jelitowych 3D

UWAGA: Ta sekcja przedstawi protokół generowania jednowarstwowych kultur 2D z organoidów jelitowych. Technika ta ma tę zaletę, że tworzy zlewającą się, spolaryzowaną kulturę jednowarstwową z odsłoniętą powierzchnią wierzchołkową na płytce do hodowli tkankowej zawierającej wkładkę błony do hodowli komórkowej. Chociaż monowarstwa zacznie się różnicować w zanurzonym, jednowarstwowym formacie, dodatkowe zróżnicowanie monowarstwy można osiągnąć, przełączając się na kulturę ALI po osiągnięciu konfluencji. Zarówno monowarstwowe, jak i kolejne protokoły ALI są przeznaczone do oznaczania punktu końcowego i chociaż hodowla jednowarstwowa utrzymuje małą populację komórek macierzystych, żadna z nich nie może być skutecznie podzielona i pasażowana po ustaleniu.

1. Przygotowanie pożywek i płytek do jednowarstwowej hodowli jelitowej
   1. Przygotować pożywkę do różnicowania organoidów jelitowych zgodnie z zaleceniami producenta do hodowli jednowarstwowej (patrz Wykaz materiałów). Dodać Y-27632 tylko do objętości pożywki, która zostanie zużyta w ciągu 1 tygodnia w końcowym stężeniu 10 μM. W przypadku natychmiastowego użycia przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Wstępnie podgrzej trypsynę EDTA (0,05%) do 37 °C.
   3. Co najmniej 2 godziny przed wysiewem kultur jednowarstwowych należy przygotować 2% roztwór powlekający ECM w następujący sposób.
      1. Rozmrozić ECM na lodzie i dodać 1:50 do zimnego, sterylnego PBS, aby przygotować 2% roztwór. Przygotować wystarczające ilości, aby dodać 100 μl do górnej studzienki każdej wkładki membranowej do hodowli komórkowej o średnicy 6,5 mm (0,33^cm2), która ma być użyta. Dostosuj głośność odpowiednio do większych lub mniejszych kultur.
   4. Dodać 100 μl do każdej studzienki i inkubować każdą płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 do} momentu, gdy będzie potrzebna (co najmniej 2 godziny przed siewem).
2. Dysocjacja organoidów jelitowych do wytwarzania i hodowli jednowarstwowych
   1. Usunąć z inkubatora odpowiednią liczbę studzienek do hodowli organoidów. Zapoznaj się z tabelą 1, aby zapoznać się z zalecaną liczbą dołków do zebrania dla różnych kultur.
   2. Odessać całą pożywkę z kultur organoidów bez naruszania kopuły ECM.
   3. Dodaj 1 ml roztworu dysocjacyjnego do każdej studzienki.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej (15–25 °C) przez co najmniej 1 minutę.
   5. Używając pipety o pojemności 1 ml, energicznie pipetuj w górę i w dół, aby przerwać kopułę i uwolnić organoidy.
   6. Zawieszone organoidy z każdej studzienki umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie mieszając lub kołysząc. Na tym etapie można połączyć organoidy do wysiewu wielu studzienek, do 10 ml objętości w każdej probówce.
   7. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Dodaj 5 ml lodowatego DMEM/F-12 w celu ponownego zawieszenia organoidów.
   9. Wymieszać i ponownie odwirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   10. Odessać supernatant, usuwając jak najwięcej, uważając, aby nie naruszyć osadu.
       UWAGA: W osadzie może pozostać pewna ilość resztek ECM; Nie powinno to jednak znacząco wpłynąć na dysocjację organoidów.
   11. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) trypsyny-EDTA (0,05%) w celu ponownego zawieszenia organoidów. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierną zawiesinę. Dodaj do dodatkowego 1 ml trypsyny-EDTA dla dużej liczby komórek lub jeśli pozostaje znaczna ilość ECM.
   12. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
   13. Dokładnie wymieszaj pipetą o pojemności 1 ml, aby jak najbardziej rozbić organoidy. Organoidy powinny być całkowicie zdysocjowane na pojedyncze komórki lub małe fragmenty. Jeśli po dokładnym pipetowaniu pozostaną większe fragmenty lub całe organoidy, należy kontynuować inkubację z trypsyną-EDTA w temperaturze 37 °C przez kolejne 3-5 minut
       UWAGA: Nie inkubuj z trypsyną-EDTA dłużej niż 20 minut, ponieważ może to spowodować zwiększoną utratę żywotności komórek.
   14. Gdy organoidy zostaną wystarczająco zdysocjowane, dodaj równą objętość DMEM/F-12 (np. 1 ml DMEM/F-12 na ml trypsyny-EDTA) i pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać. Dezaktywuj trypsynę-EDTA, dodając 10% FBS do DMEM/F-12 w tym kroku.
   15. Odwirowywać fragmenty w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.
   16. Jeśli zdysocjowane organoidy nie ulegną osadzaniu, jest to powszechne i może być spowodowane nagromadzeniem śluzu uwalnianego przez zdysocjowane komórki. W takim przypadku należy dokładnie wymieszać komórki, pipetując w górę i w dół, a następnie ponownie odwirować je w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.
   17. Ostrożnie usuń jak najwięcej supernatantu, pozostawiając tylko osad komórkowy.
   18. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl pożywki do różnicowania organoidów jelitowych (z 10 μM Y-27632) dla każdej studzienki, która ma być wysiana. Dostosuj głośność odpowiednio do większych lub mniejszych rozmiarów studzienek.
   19. Wyjąć pokryte powłoką płytki z inkubatora (przygotowane w kroku 3.1.4) i usunąć nadmiar ECM z każdej studzienki.
   20. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do górnej studzienki każdej wkładki do hodowli komórkowej.
   21. Dodać 500 μl pożywki do różnicowania organoidów jelitowych do dolnej studzienki każdej wkładki do hodowli komórkowej.
   22. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
   23. Wymieniaj pożywkę zarówno w górnej, jak i dolnej studzience co 2 do 3 dni. Kultury jednowarstwowe powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 7 dni, a często osiągają konfluencję w ciągu 2-3 dni.
3. Ustanowienie kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI)
   UWAGA: W razie potrzeby dalsze różnicowanie zanurzonej hodowli monowarstwowej jelita można osiągnąć poprzez przejście zanurzonej kultury jednowarstwowej do kultury ALI. Ta metoda hodowli pozwoli na zwiększenie liczby zróżnicowanych typów komórek, w szczególności komórek linii wydzielniczej, takich jak komórki kubkowe i enteroendokrynne.
   1. Założyć hodowlę jednowarstwową we wstawce do hodowli komórkowej, jak opisano powyżej w krokach 2.2.1-2.2.23 i utrzymywać tę kulturę na poziomie 100% zbiegu przez co najmniej 4 dni.
   2. Aby założyć kulturę ALI, usuń pożywkę z górnej i dolnej studzienki. Dodaj świeżą pożywkę do różnicowania organoidów jelitowych (z Y-27632) do dolnej studzienki, pozostawiając górną pożywkę pustą.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   4. Wymieniaj pożywkę w dolnej studzience co 2-3 dni i pozwól monowarstwie rozróżnić się przez co najmniej 1 tydzień.
   5. W razie potrzeby spłucz górną studzienkę sterylnym PBS, aby usunąć nadmiar nagromadzonego śluzu.
      W tych warunkach kultura ALI może być utrzymywana przez co najmniej 2-3 tygodnie.

Results

Organoidy zostały wygenerowane z próbek biopsyjnych zgodnie z protokołem opisanym wcześniej²³ oraz w PIS dla pożywki do ekspansji organoidów jelitowych (zobacz Tabelę Materiałów). Rysunek 1A, lewy panel, pokazuje fenotyp organoidów jelitowych hodowanych w kopule z podłożem do ekspekspansji organoidów jelitowych. W tych warunkach hodowli organoidy wykazują torbielowatą morfologię zdefiniowaną przez cienki (10-25 μm) nabłonek, który otacza światło (Rysunek 1A, prawy panel). Na tym etapie wierzchołkowa strona nabłonka jelitowego jest skierowana w stronę światła, podczas gdy strona podstawno-boczna styka się z otaczającą macierzą zewnątrzkomórkową. Kiedy większość organoidów osiągnęła pożądany rozmiar, macierz zewnątrzkomórkowa została usunięta, a organoidy zostały następnie wyhodowane w zawiesinie. Utrata wiązania komórkowego z macierzą zewnątrzkomórkową wyzwala proces inwersji w organoidach, co powoduje odwrócenie polaryzacji nabłonka organoidów, wystawienie wierzchołkowej strony nabłonka na pożywkę wzrostową i internalizację strony podstawno-bocznej.

W niektórych kulturach organoidy w zawiesinie łączą się i łączą, efekt ten jest głębszy w ciągu pierwszych 3 dni (Rysunek 1B, lewy panel). Zastosowanie techniki ścinania pozwala na oderwanie organoidów i kontynuację kultur przez kilka dni przy minimalnej ponownej agregacji (Rysunek 1B, prawy panel).

Organoidy jelitowe hodowane w kopułach ECM nadal się rozrastają (Rysunek 1C, Lewy Panel) i wykazują spontaniczne tworzenie się drugorzędowych pączkujących struktur, przypominających małe krypty, na podstawno-bocznej stronie nabłonka otaczającego światło (Rysunek 1C, prawy panel). W tym samym czasie organoidy utrzymywane przez 5 dni przy braku macierzy zewnątrzkomórkowej nadal rozwijają się w zawiesinie (Rysunek 1D, lewy panel). Odwrócenie polaryzacji charakteryzuje się pogrubieniem (30-40 μm) nabłonka otaczającego rdzeń organoidów i pojawieniem się różnych morfologii: wydłużonej (Rysunek 1D, prawy panel i rysunek uzupełniający 1A), torbielowaty (rysunek uzupełniający 1B) i nieregularny (rysunek uzupełniający 1C). Często łączy się to z kurczeniem się przestrzeni świetlnej w organoidzie, co wpływa na ich ogólny rozmiar.

Efektywną inwersję można również potwierdzić analizując ekspresję specyficznych dla jelit markerów polaryzacji. Organoidy jelitowe wierzchołkowe wykazują wyraźną lokalizację jąder w kierunku światła organoidu, na co wskazuje sygnał 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Ekspresja markerów wierzchołkowych, takich jak VILLIN (Figura 2A) i ZO-1 (Figura 2B), jest wykrywana po zewnętrznej stronie nabłonka, który jest wystawiony na działanie pożywki. Ta lokalizacja jest w wyraźnym kontraście z tą obserwowaną w organoidach jelitowych hodowanych w ECM. Organoidy osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej barwione pod kątem jąder (DAPI), VILLIN (Figura 2C) i ZO-1 ( Figura 2D) wykazują polaryzację apikopodstawną, w której strona wierzchołkowa jest skierowana w stronę światła organoidu.

Całkowite usunięcie ECM jest niezbędne do uzyskania efektywnej inwersji polaryzacji organoidów jelitowych. Czasami część organoidów znalezionych w kulturach zawiesinowych otoczonych pozostałościami ECM wykazuje torbielowatą morfologię, która sugeruje niepowodzenie w odwróceniu polaryzacji nabłonka (rysunek uzupełniający 2A). Analiza barwienia immunofluorescencyjnego, przeprowadzona na tych organoidach, dostarcza dowodów na podstawno-boczne położenie jąder (DAPI) wzdłuż nabłonka i ekspresję ZO-1 po stronie wierzchołkowej, która jest skierowana w stronę światła organoidu (rysunek uzupełniający 2B), potwierdzając, że niepełne usunięcie ECM powoduje zachowanie polaryzacji wierzchołkowo-podstawnej w sposób podobny do organoidów osadzonych w ECM.

Protokół zakładania jednowarstwowych kultur jelitowych skutkuje konfluencyjną hodowlą jednowarstwową w ciągu 7 dni od wysiewu, a kultura często osiąga konfluencję w ciągu zaledwie 2-3 dni. Jednym z głównych wyznaczników sukcesu jest liczba i jakość komórek użytych do zasiewu monowarstwy. Rysunek 3A, Lewy Panel przedstawia przykład idealnej gęstości wysiewu około 150 000 komórek we wkładzie membranowym do hodowli komórkowych o średnicy 6,5 mm. Liczba ta nie jest stała i może być bardzo zmienna w zależności od dawcy i jakości źródłowej hodowli organoidów; Dlatego numer komórki powinien być zoptymalizowany na podstawie tych zmiennych. Jeśli gęstość wysiewu jest zbyt niska lub złej jakości (Rysunek 3A, prawy panel), może nie być wystarczającej liczby przyłączeń, aby utworzyć zlewającą się kulturę jednowarstwową.

Po ustanowieniu monowarstwy (Rysunek 3B), komórki tworzą ścisłe połączenia, tworząc wygląd kostki brukowej (Rysunek 3B, Lewy panel). Jeśli nie uda im się utworzyć zlewającej się monowarstwy (Rysunek 3B, prawy panel), wygląd monowarstwy będzie często "niejednolity", z obszarami dobrej jakości przyczepu komórek, ale z większymi przerwami między tymi obszarami. Kultury te nie zapewniają funkcjonalnej bariery między przedziałami podstawnymi i wierzchołkowymi i nie nadają się do opisanych testów. Zlewająca się monowarstwa orientuje swoją krawędź szczoteczki zawierającą VILLIN w kierunku wierzchołkowej strony nabłonka, z jądrem umieszczonym w kierunku podstawno-bocznego bieguna komórki (Ryc. 4B). Pomiędzy komórkami tworzą się połączenia międzykomórkowe składające się z kompleksów wielobiałkowych, w tym ZO-1 (Figura 4B). Ich obecność jest kluczem do zapewnienia funkcji barierowej kultury nabłonkowej.

Po zlaniu, przejście do kultury ALI powoduje dalsze zróżnicowanie kultury (Rysunek 3C). Pojawiają się małe, okrągłe komórki kubkowe, a sama monowarstwa nabiera bardziej pofałdowanego wyglądu. Chociaż komórki kubkowe są obecne w nabłonku zanurzonej hodowli (Ryc. 4A), są one bardziej widoczne po różnicowaniu ALI. Komórki kubkowe obecne w nabłonku wydzielają śluz, co prowadzi do zamglenia na wierzchu nabłonka. Komórki kubkowe i wydzielany śluz można uwidocznić poprzez barwienie wydzielanego białka mucyny, MUC2 (Figura 4A, C i D), a wzrost populacji komórek kubkowych można zmierzyć przez wzrost ekspresji MUC2 (rysunek uzupełniający 3A). Nie jest konieczne usuwanie tej żelowej warstwy śluzu i przyklei się ona do powierzchni nabłonka i pozostanie po wielokrotnym płukaniu. Jeśli konieczne jest usunięcie, przemycie kultury związkiem mukolitycznym, takim jak 10 mM N-acetylocysteiny lub 50 μg/ml DTT, usuwa nadmiar śluzu. Oprócz wzrostu populacji komórek kubkowych, interfejs ALI zwiększa również obecność komórek enteroendokrynnych (na co wskazuje ekspresja CHGA) (rysunek uzupełniający 3B) i dojrzałych enterocytów (na co wskazuje ekspresja KRT20) (figura uzupełniająca 3C).

Rysunek 1: Etapy powstawania organoidów wierzchołkowych jelitowych. (A) Reprezentatywne obrazy kopuły z organoidami o pożądanym rozmiarze w dniu 4 (lewy panel, podziałka = 500 μm). Organoidy są cienkościenne, z otwartą komorą luminalną (prawy panel, podziałka = 100 μm). (B) Reprezentatywny obraz studni z ekstensywną agregacją po 3 dniach w zawieszeniu (lewy panel, podziałka = 200 μm). Obraz fragmentów grudek bezpośrednio po ścinaniu (prawy panel, podziałka = 200 μm). (C) Reprezentatywny obraz organoidów jelitowych w kopule w dniu 7. Organoidy wykazują rozszerzone światło z tworzeniem małych pąków po podstawno-bocznej stronie nabłonka (lewe 20-krotne powiększenie, prawe 100-krotne powiększenie zaznaczonego obszaru, podziałka = 200 μm). (D) Reprezentatywny obraz organoidów jelitowych po usunięciu ECM, a następnie hodowli zawiesiny przez 5 dni. Organoidy uzyskują gęstą morfologię z pogrubionym nabłonkiem i wystawiają swoją wierzchołkową stronę na podłoże. (Lewy 20-krotny powiększenie, Prawy 100-krotny powiększenie zaznaczonego obszaru, podziałka = 200 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Barwienie immunofluorescencyjne dla markerów polaryzacji komórek w organoidach jelitowych. Organoidy jelitowe zorientowane wierzchołkowo (A,B) i wierzchołkowo (C,D) wybarwiono markerami wierzchołkowymi ZO-1 i VILLIN oraz markerem nabłonkowym E-CADHERIN (czerwony). DAPI (niebieski) został użyty do wizualizacji jąder. Lewy panel wyświetla obrazy wykonane przy 25-krotnym powiększeniu, a prawy panel wyświetla obrazy różnych organoidów przy 63-krotnym powiększeniu (tylko panel C wyświetla 25-krotne i 63-krotne powiększenie tego samego organoidu). (A) Organoidy jelitowe wierzchołkowe barwione VILLIN (kolor zielony) i E-CADHERIN (kolor czerwony) wskazują na ekspozycję strony wierzchołkowej na działanie pożywki. (B) Organoidy jelitowe wierzchołkowe barwione ZO-1 (zielony) i E-CADHERIN (czerwony) wykazują obecność ścisłych połączeń i odwrócenie polaryzacji wierzchołkowo-podstawnej. (C) Organoid jelitowy osadzony w Matrigelu barwiony VILLIN (na zielono) i E-CADHERIN (na czerwono), pokazujący wierzchołkową stronę skierowaną w stronę światła organoidu. (D) Organoidy jelitowe osadzone w Matrigelu barwione ZO-1 (kolor zielony) i E-CADHERIN (kolor czerwony) wskazujące na obecność ścisłych połączeń wierzchołkowych skierowanych w stronę światła organoidu. (Podziałka = 100 μm). Organoidy wybarwiono metodą immunofluorescencji i zobrazowano przy użyciu wcześniej opublikowanych protokołów^24,25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Tworzenie jednowarstwowych kultur jelitowych. (A) Reprezentatywny obraz organoidów 3D po leczeniu 0,05% Trypsiną-EDTA. Organoidy są dysocjowane na pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek w ramach przygotowań do wysiewu kultur jednowarstwowych. Lewy panel: przykład optymalnej gęstości wysiewu dla hodowli jednowarstwowej, około 150 000 komórek na 100 μl na wkładce membranowej do hodowli komórkowej o średnicy 6,5 mm. Prawy panel: przykład nieoptymalnej gęstości wysiewu przy <50 000 komórek na 100 μl na wkładce membranowej do hodowli komórkowej o średnicy 6,5 mm. (B) Reprezentatywny obraz w jasnym polu zanurzonej kultury jednowarstwowej. Lewy panel: 100% zlewająca się warstwa o charakterystycznym wyglądzie kostki brukowej. Prawy panel: około 50% zlewającej się monowarstwy. Luki widoczne w monowarstwie (oznaczone linią przerywaną) zamykają się z czasem z powodu ciągłej proliferacji jelitowych komórek macierzystych. (C) Reprezentatywny obraz w jasnym polu zróżnicowanej kultury ALI po 7 dniach. (Podziałka = 200 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Barwienie immunofluorescencyjne dla zróżnicowanych markerów komórkowych w hodowlach jednowarstwowych. (A) Obraz stosu Z barwienia immunofluorescencyjnego zanurzonej kultury jednowarstwowej dla białka mucyny MUC2, wskazujący na obecność komórek kubkowych w kulturze jednowarstwowej (zielony = MUC2, niebieski = DAPI). (B) Obraz stosu Z barwienia immunofluorescencyjnego zanurzonej monowarstwy. Barwienie VILLIN (zielone) wzdłuż wierzchołkowego końca nabłonka wskazuje na obecność obrzeża pędzla, a barwienie ZO-1 (czerwone) wskazuje na obecność ścisłych połączeń między komórkami (niebieski = DAPI). (C) Obraz stosu Z barwienia immunofluorescencyjnego kultury jednowarstwowej zróżnicowanej pod kątem ALI dla białka mucyny MUC2, wskazujący na obecność znacznie większej liczby komórek kubkowych w hodowli jednowarstwowej ALI (zielony = MUC2, niebieski = DAPI). (D) Kriosekcja kultury jednowarstwowej zróżnicowanej ALI, wybarwionej na obecność MUC2 (kolor zielony) i E-CADHERIN (kolor czerwony), wskazujący na obecność komórek kubkowych w nabłonku i wydzielanie śluzu wzdłuż wierzchołkowej strony hodowli jednowarstwowej. (Podziałka = 200 μm). Kultury jednowarstwowe wybarwiono metodą immunofluorescencji i zobrazowano przy użyciu wcześniej opublikowanych protokołów^26,27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Spektrum fenotypów organoidów jelitowych wierzchołkowych w zawiesinie hodowlanej. (A,B,C) Dodatkowe reprezentatywne obrazy morfologii organoidów jelitowych utrzymywanych w zawiesinie 5 dni po usunięciu ECM. Polaryzacja organoidów uległa odwróceniu. Organoidy stały się bardziej gęste z pogrubionym nabłonkiem, a wierzchołkowa strona organoidów jest skierowana na zewnątrz. Organoidy mogą wykazywać różne morfologie: wydłużone (A), torbielowate (B) i nieregularne (C). (Podziałka = 100 μm). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Organoidy jelitowe nie są w stanie odwrócić polarności w obecności pozostałości pożywki macierzy błony podstawnej w hodowlach zawiesinowych. (A) Reprezentatywny obraz niepełnego usunięcia ECM i niepowodzenia w odwróceniu polarności organoidów. Pozostałości Matrigelu są obecne wokół organoidów i przyczyniają się do utrzymania polaryzacji nabłonka zorientowanej wierzchołkowo. Organoidy wykazują torbielowatą morfologię z cienkim nabłonkiem otaczającym światło (pasek skali = 200 μm). (B) Reprezentatywny obraz nieodwróconego organoidu znalezionego w warunkach hodowli zawiesinowej. Jądra (niebieski = DAPI) i E-CADHERIN (czerwony) są umieszczone po stronie podstawno-bocznej, ZO-1 (zielony) jest wyrażony po stronie wierzchołkowej, która jest skierowana w stronę światła organoidu. (Podziałka = 100 μm). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Ekspresja genów zróżnicowanych markerów komórkowych w hodowlach jednowarstwowych. (A,B,C) Ekspresja MUC2, CHGA i KRT20 w zanurzonej i zróżnicowanej przez ALI kulturze jednowarstwowej wygenerowanej w pożywce do różnicowania organoidów jelitowych w stosunku do 3D kultury organoidowej wyhodowanej z pożywką do eksekspansji organoidów jelitowych ustaloną za pomocą qPCR. Ustanowienie zanurzonej kultury jednowarstwowej zwiększa ekspresję każdego zróżnicowanego markera komórkowego; jednak różnicowanie jako kultura ALI zwiększa wykładniczo ekspresję każdego markera. Słupki błędów = +/- SEM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

JEDNOWARSTWOWE NACZYNIA KULTUROWE	LICZBA STUDZIENEK ORGANOIDÓW JELITOWYCH DO ZBIORU (od 50 μl kopuły/na studzienkę do wysiewu)
Wkładka Transwell 6,5 mm	1 - 2 dołki
Wkładka Transwell 12 mm	3 - 4 dołki
Płytka 6-dołkowa	6 - 8 dołków
Płytka 24-dołkowa	3 - 4 dołki
Płytka 96-dołkowa	1 - 2 dołki

Tabela 1: Liczba dołków organoidów jelitowych do pobrania dla różnych kultur

Discussion

Modele organoidów nabłonkowych stały się potężnymi platformami, które można wykorzystać do modelowania organizacji tkanek, postępu choroby i identyfikacji środków terapeutycznych 23,28,29. Mikroiniekcja organoidów zwiększa możliwości organoidów w modelowaniu chorób zakaźnych, ponieważ umożliwia interakcję patogenu z wierzchołkową stroną nabłonka gospodarza. Ostatnie postępy w technikach mikroiniekcji zoptymalizowały szybkość wstrzykiwania organoidów i osiągnęły szybkość wstrzykiwania do 90 organoidów na godzinę. Funkcja barierowa w wstrzykiwanych organoidach została zachowana, a niskie stężenie tlenu wewnątrz światła pozwoliło na przeżycie bakterii poddanych obowiązkowej iniekcji beztlenowej³⁰. Jednak badania wykazały obecność heterogeniczności w populacjach organoidów w tej samej studni. Różnice te zaobserwowano w wielkości i kształcie³¹, poziomach ekspresji kluczowych genów³², a także tempie proliferacji³³. Opisano również zróżnicowane reakcje w obrębie tej samej populacji organoidów na związki takie jak forskolina i PGE2 lub na toksynę^28,33. Wyniki te podkreślają potrzebę wysokiej liczby organoidów w badaniach i ograniczają wykorzystanie iniekcji światła.

Konwencjonalna hodowla organoidów opiera się na kapsułkowaniu i rozmnażaniu organoidów w hydrożelu. Jednak hydrożele mogą ograniczać dyfuzję i wprowadzać gradienty stężeń, co może zwiększać niejednorodność³⁴. Co więcej, udokumentowano dużą zmienność, nie tylko między kulturami i dawcami, ale także w indywidualnych warunkach eksperymentalnych. Źródło dawcy, właściwości biochemiczne hydrożelu i wewnętrzna heterogeniczność organoidu jako systemu hodowli są ważnymi czynnikami, które mogą zwiększyć zmienność eksperymentalną i ograniczyć odtwarzalność wyników uzyskanych w dalszych zastosowaniach. Obie opisane tutaj metody zapewniają prosty sposób odsłaniania wierzchołkowej strony nabłonka, co pozwala na modelowanie interesujących związków i patogenów poprzez bezpośrednie dodanie ich do pożywki hodowlanej. Zmniejszenie wykorzystania hydrożelu może ograniczyć zmienność eksperymentalną wynikającą z technicznych źródeł błędów.

Organoidy jelitowe wierzchołkowe zachowują kluczowe cechy systemu modelu organoidowego, a ich skalowalność sprawia, że są one bardziej podatne na testy wysokoprzepustowe w porównaniu z monowarstwą 2D. Ponieważ jednak organoidy zachowują swoją strukturę 3D, dostępność strony podstawowej jest ograniczona i może utrudniać badania wymagające dostępu do obu stron jednocześnie.

Wykazaliśmy, że odwrócenie polaryzacji organoidów jelitowych opiera się na skutecznym i bezwzględnym usunięciu ECM, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej struktury organoidów. Zarówno zastosowanie roztworu dysocjacyjnego w celu usunięcia ECM, jak i roztworu zapobiegającego przywieraniu organoidów do wyrobów z tworzyw sztucznych przyczyniło się do poprawy ogólnej skuteczności protokołu opublikowanego przez Co, J. Y. i współpracowników²², w szczególności w odniesieniu do liczby organoidów wierzchołkowych produkowanych do dalszych zastosowań.

Ponadto zaobserwowaliśmy, że nasz protokół obsługuje bardziej wydajną inwersję organoidów mniejszych niż 250 μm, a użycie większych organoidów może skutkować zmniejszoną produkcją organoidów ze względu na fragmentację spowodowaną pipetowaniem. Końcówki o szerokim otworze, takie jak te wskazane w Tabeli Materiałów, mogą pozwolić na wykorzystanie większych organoidów. Jednak końcówki o szerokim otworze są mniej skuteczne w dysocjacji ECM w porównaniu ze standardowymi końcówkami ze względu na mniejszą przyłożoną siłę mechaniczną. W związku z tym może być konieczne powtórzenie kroków 1.2.9–1.2.11 w celu wystarczającego zakłócenia i całkowitego usunięcia wszystkich pozostałości ECM podczas pracy z większymi organoidami.

Organoidy w zawiesinie mogą przetrwać co najmniej 2 tygodnie. Po tym okresie czasu zaobserwowaliśmy zmiany morfologiczne i zwiększoną liczbę zgonów komórek. Obecność komórek proliferujących w organoidach wierzchołkowych²² pozwala na ponowne ustanowienie kultur organoidów wierzchołkowo-jelitowych. Można to osiągnąć poprzez dysocjację organoidów wierzchołkowych na pojedyncze komórki i osadzenie ich w ECM za pomocą pożywki do ekspandowania organoidów jelitowych.

Ograniczeniem często spotykanym w protokołach opisujących tworzenie organoidów jelitowych w kulturach zawiesinowych jest wytwarzanie dużych agregatów. Wpływa to na kilka zmiennych, takich jak wydajność, odtwarzalność cech morfologicznych, przepuszczalność dla związków i sygnalizacja parakrynna. Podobnie jak w protokole opublikowanym przez Co, J. Y. i współpracowników, tutaj potwierdzamy, że uzyskaliśmy odwrócenie polarności co najmniej 97% wszystkich zawieszonych organoidów bez ścinania po 3 dniach w zawiesinie. Jednak w przeciwieństwie do publikacji, wprowadziliśmy etap dysocjacji mechanicznej w celu ograniczenia powstawania dużych agregatów i zwiększenia plonu. Ponieważ procedura ta może uszkodzić nabłonek organoidów, przedłużyliśmy okres inkubacji organoidów o dodatkowe 2 dni, aby umożliwić pełną regenerację nabłonka i zapewnić wysoką jakość kultur do dalszych zastosowań. Wprowadzenie ciągłego mieszania za pomocą wytrząsarki inkubatora lub kolby obrotowej mogłoby potencjalnie zmniejszyć liczbę zdarzeń związanych z fuzją, zminimalizować fragmentację i zwiększyć natlenienie. Te alternatywne podejścia mogą utrzymywać hodowle przez dłuższy czas, zmniejszać śmierć komórek i pozwalać na dalsze różnicowanie organoidów jelitowych wierzchołkowych.

Ustanowienie monowarstwy 2D pochodzącej z organoidów ma kilka zalet i wad w porównaniu z organoidami o odwróconej polaryzacji. Opisany tutaj protokół pozwala na szybkie założenie zlewającej się kultury jednowarstwowej, zwykle w czasie krótszym niż 7 dni oraz opcję długoterminowego utrzymywania kultur przez dłuższy czas (do 10 tygodni). Zastosowany tu protokół i pożywki pozwalają również na skuteczne różnicowanie znacznej liczby komórek, co nie zawsze występuje w innych kulturach jednowarstwowych pochodzących z organoidów¹⁶. Ustanowienie monowarstwy na błonie wkładki do hodowli komórkowej pozwala na jednoczesny dostęp zarówno do wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej strony nabłonka, co czyni je idealnymi do badań nad integralnością bariery i transportem nabłonka. Ten uproszczony dostęp sprawia również, że są one bardziej podatne na badania nad infekcjami i leczeniem farmakologicznym. Co więcej, kultury te zachowują wiele cech charakterystycznych dla dawcy, zachowując ich znaczenie dla badań specyficznych dla pacjenta. Metoda hodowli ALI ułatwia również różnicowanie bardziej funkcjonalnego nabłonka składającego się zarówno z komórek wydzielniczych, jak i absorpcyjnych, dzięki czemu jest on bardziej reprezentatywny dla ludzkiego nabłonka jelitowego. Względna stabilność tych kultur pozwala również na ich utrzymanie przez dłuższy czas, co daje możliwość długoterminowych badań. Jednak ograniczeniami tego podejścia są duża liczba komórek wymaganych do utworzenia zlewającej się monowarstwy oraz konieczność utrzymania pełnej zbieżności w celu funkcjonalnego oddzielenia komory wierzchołkowej i podstawno-bocznej. Charakterystyczna architektura krypty, którą można modelować w kulturach organoidów 3D, jest również tracona po ustanowieniu kultury jednowarstwowej. Niemniej jednak eksperymentalnie przyjazny format kultury i łatwość, z jaką można uzyskać dostęp do wierzchołkowej i podstawno-bocznej strony nabłonka, sprawiają, że jest to potężne narzędzie do badania fizjologii jelit.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płyn do płukania zapobiegający przywieraniu	STEMCELL Technologies Inc.	7010	Do powlekania kultur kulturowych. Określany jako roztwór antyadhezyjny w tekście głównym.
Probówki stożkowe, 15 ml	STEMCELL Technologies Inc.	38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free	Corning	356231	Zewnątrzkomórkowa macierz (ECM) do utrzymania i tworzenia linii organoidów.
Wkładki Costar 6,5 mm lub 12 mm Transwell STEMCELL	Technologies Inc.	38023/38024	Do hodowli jednowarstwowej 2D.
Costar 24 Well  Płaska płytka z płaskim dnem poddana hodowli tkankowej	STEMCELL Technologies Inc.	38017	Do konserwacji i zakładania linii organoidowych.
D-PBS (bez Ca++ i Mg++)	STEMCELL Technologies Inc.	37350	Do prania
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Millipore Sigma	D2650	Rekonstytucja małych cząsteczek
DMEM/F-12 za pomocą 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies Inc.	36254	Do mycia
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek (GCDR)	STEMCELL Technologies Inc.	7174	Do usuwania Matrigel. Określany jako odczynnik dysocjacyjny w tekście głównym.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies Inc.	6010	Do ekspansji linii organoidów przed różnicowaniem. Określany jako pożywka do ekspandowania organoidów jelitowych w tekście głównym.
IntestiCult Pożywka do różnicowania organoidów (Human)	STEMCELL Technologies Inc.	100-0214	Do tworzenia monowarstw i różnicowania 3D. Określany jako pożywka różnicowania organoidów jelitowych w tekście głównym.
Trypsyna-EDTA (0,05%)	STEMCELL Technologies Inc.	7910	Do zakładania monowarstw 2D.
Y-27632	STEMCELL Technologies Inc.	72302	Inhibitor szlaku RHO / ROCK, hamuje ROCK1 i ROCK2. Służy do tworzenia monowarstw 2D.
Końcówki o szerokim otworze	Corning	#TF-1005-WB-R-S	Obsługa organoidów