Artykuł metodologiczny

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

DOI:

10.3791/62334

⸱

17 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty T genetycznie zmodyfikowane do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) wykazały bezprecedensowe wyniki w kluczowych badaniach klinicznych dla pacjentów z nowotworami złośliwymi komórek B lub szpiczakiem mnogim (MM). Jednak liczne przeszkody ograniczają skuteczność i uniemożliwiają powszechne stosowanie terapii komórkami CAR T ze względu na słaby transport i infiltrację do miejsc nowotworu, a także brak trwałości in vivo. Ponadto poważne obawy stanowią zagrażające życiu toksyczności, takie jak zespół uwalniania cytokin lub neurotoksyczność. Wydajne i czułe obrazowanie i śledzenie limfocytów CAR T umożliwia ocenę transportu komórek T, ekspansji i charakterystyki in vivo, a także umożliwia opracowanie strategii przezwyciężenia obecnych ograniczeń terapii limfocytami CAR T. W artykule opisano metodologię włączania symportera jodku sodu (NIS) do limfocytów CAR T oraz obrazowania limfocytów CAR T za pomocą [18F]tetrafluoroborianowo-pozytonowej tomografii emisyjnej ([18F]TFB-PET) w modelach przedklinicznych. Metody opisane w tym protokole mogą być stosowane do innych konstruktów CAR i genów docelowych oprócz tych użytych w tym badaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkowa chimerycznym receptorem antygenowym T (CAR T) jest szybko rozwijającym się i potencjalnie leczniczym podejściem w nowotworach hematologicznych1,2,3,4,5,6. Nadzwyczajne wyniki kliniczne odnotowano po terapii limfocytami CAR T (CART19) skierowanym na CD19 lub antygenem dojrzewania komórek B (BCMA) CAR T2. Doprowadziło to do zatwierdzenia przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) komórek CART19 dla agresywnego chłoniaka z komórek B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 i lisocabtagene maraleucel)7, ostra białaczka limfoblastyczna (Tisa-Cel)5,8, chłoniak z komórek płaszcza (brexucabtagene autoleuce)9 i chłoniak grudkowy ( Axi-Cel)10. Ostatnio FDA zatwierdziła terapię komórkami CAR T skierowaną przez BCMA u pacjentów ze szpiczakiem mnogim (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Co więcej, terapia limfocytami CAR T w przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL) jest w późnej fazie rozwoju klinicznego i oczekuje się, że otrzyma zgodę FDA w ciągu najbliższych trzech lat1.

Pomimo bezprecedensowych wyników terapii komórkami CAR T, jej powszechne stosowanie jest ograniczone przez: 1) niewystarczającą ekspansję komórek CAR T in vivo lub słaby transport do miejsc nowotworowych, co prowadzi do niższych wskaźników trwałej odpowiedzi12,13 i 2) rozwój zagrażających życiu zdarzeń niepożądanych, w tym zespołu uwalniania cytokin (CRS)14,15. Cechy charakterystyczne CRS obejmują nie tylko aktywację immunologiczną skutkującą podwyższonym poziomem cytokin/chemokin zapalnych, ale także masową proliferację limfocytów T po infuzji limfocytów CAR T15,16. W związku z tym opracowanie zwalidowanej, klinicznej strategii obrazowania limfocytów CAR T in vivo umożliwiłoby 1) śledzenie komórek CAR T w czasie rzeczywistym in vivo w celu monitorowania ich transportu do miejsc nowotworowych i odkrycia potencjalnych mechanizmów oporności oraz 2) monitorowanie ekspansji komórek CAR T i potencjalne przewidywanie ich toksyczności, takich jak rozwój CRS.

Kliniczne cechy łagodnego CRS to wysoka gorączka, zmęczenie, ból głowy, wysypka, biegunka, bóle stawów, bóle mięśni i złe samopoczucie. W cięższym CRS u pacjentów może rozwinąć się tachykardia/niedociśnienie, nieszczelność naczyń włosowatych, dysfunkcja serca, niewydolność nerek/wątroby oraz rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe17,18. Ogólnie wykazano, że stopień podwyższenia cytokin, w tym interferonu gamma, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, interleukiny (IL)-10 i IL-6, koreluje z nasileniem objawów klinicznych17,19. Jednak szerokie zastosowanie monitorowania cytokin w surowicy "w czasie rzeczywistym" do przewidywania CRS jest trudne ze względu na wysokie koszty i ograniczoną dostępność. Aby wykorzystać korzystne właściwości terapii komórkami CAR T, nieinwazyjne obrazowanie adoptywnych limfocytów T może być potencjalnie wykorzystane do przewidywania skuteczności, toksyczności i nawrotu po infuzji komórek CAR T.

Kilku badaczy opracowało strategie korzystania z obrazowania opartego na radionuklidach z pozytonową tomografią emisyjną (PET) lub tomografią komputerową emisji pojedynczych fotonów (SPECT), która zapewnia wysoką rozdzielczość i wysoką czułość20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30 do wizualizacji in vivo i monitorowania transportu komórek CAR T. Wśród tych strategii obrazowania opartych na radionuklidach, symporter jodku sodu (NIS) został opracowany jako czuła metoda obrazowania komórek i wirusów za pomocą skanów PET31,32. Obrazowanie limfocytów T NIS + CAR za pomocą [18F]TFB-PET to czuła, wydajna i wygodna technologia do oceny i diagnozowania ekspansji komórek T CAR, transportu i toksyczności30. Protokół ten opisuje: 1) rozwój limfocytów T NIS + CAR poprzez podwójną transdukcję o wysokiej skuteczności oraz 2) metodologię obrazowania limfocytów T NIS + CAR za pomocą skanu [18F]TFB-PET. Limfocyty T BCMA-CAR dla MM są używane jako model potwierdzający słuszność koncepcji do opisania NIS jako reportera do obrazowania limfocytów CAR T. Jednak metodologie te można zastosować do każdej innej terapii komórkami CAR T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Kliniki Mayo, Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kliniki Mayo.

1. Produkcja komórek T NIS + BCMA-CAR

UWAGA: Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Kliniki Mayo (IRB 17-008762) i Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC Bios00000006.04).

  1. Produkcja lentiwirusów kodujących BCMA-CAR, NIS i lucyferazę-zielone białko fluorescencyjne (GFP).
    UWAGA: Konstrukt BCMA-CAR drugiej generacji został zsyntetyzowany de novo (patrz tabela materiałów) i sklonowany do wektora lentiwirusowego trzeciej generacji pod kontrolą promotora czynnika wydłużenia-1 alfa (EF-1α). Konstrukt BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) zawierał kostymulację 4-1BB i jednołańcuchowy fragment zmienny (scFv) pochodzący z klonu przeciwciała anty-ludzkiego BCMA C11D5.333,34. NIS jest pod kontrolą promotora EF-1α i wiąże się z genem oporności na puromycynę za pośrednictwem peptydów samorozszczepiających (P2A). Wektor lentiwirusowy kodujący lucyferazy-GFP (patrz tabela materiałów) służy do transdukcji komórek nowotworowych, które następnie wyrażają GFP i lucyferazy.
    1. Przygotować plazmidy wektorów lentiwirusowych: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) i pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      UWAGA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro i pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro zawierają gen oporności na puromycynę. W związku z tym, komórki transdukowane NIS lub lucyferazą-GFP mogą być wybierane z 1 μg/ml lub 2 μg/ml dichlorowodorku puromycyny, jak opisano wcześniej14,35.
    2. Wysiewy 20 ×10 6 komórek 293T w kolbie T175 i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Potwierdzić, że komórki 293T są równomiernie rozmieszczone na kolbie przy zbieganiu 70-90% poprzez bezpośrednią wizualizację pod mikroskopem.
    3. Przygotować mieszaninę wzorcową składającą się z 15 μg wektora ekspresji (np. CAR, NIS lub liniowego DNA lucyferazy-GFP), 7 μg wektora otoczki (VSV-G) i 18 μg wektora opakowania (gag, pol, rev i tat). Rozcieńczyć główną mieszaninę DNA w 4,5 ml pożywki transfekcyjnej, a następnie dodać 111 μl odczynnika do wstępnego kompleksowania (mieszaniny A).
    4. Przygotować nową probówkę i rozcieńczyć 129 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej w 4,5 ml pożywki do transfekcji (mieszanina B).
    5. Połącz mieszaniny A i B i przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Po inkubacji wystarczy odessać supernatant komórek bez odrywania komórek i dodać 16 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy. Następnie dodaj mieszaninę mieszanin A i B na komórki 293T kroplami. Na koniec inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
    7. W 1 i 2 dniu po transfekcji zebrać supernatant 293T, odwirować do 900 × g przez 10 minut i przefiltrować przez filtr nylonowy 0,45 μm. Zagęścić filtrat po 24 i 48 godzinach przez ultrawirowanie w temperaturze 112 700 × g przez 2 godziny i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  2. Izolacja limfocytów T ex-vivo ( Rysunek 1)
    UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym, stosując technikę aseptyczną i środki ochrony osobistej. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są pobierane ze zdrowych ochotników pobranych podczas aferezy36. Badania przesiewowe patogenów przeprowadzono na komórkach ludzkich wykorzystanych w tym badaniu.
    1. Użyj techniki gradientu gęstości standardowej, aby wyizolować PBMC.
      1. Delikatnie dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości (gęstość 1,077 g/ml) (zawierającej alfa-D-glukopiranozyd, homopolimer beta-D-fruktofuranozylu i sól monosodową kwasu 3-(acetyloamino)-5-(acetylometyloamino)-2,4,6-triodobenzoesowego) do probówki do separacji o gradiacji gęstości o objętości 50 ml bez tworzenia pęcherzyków powietrza (patrz tabela materiałów).
      2. Aby uniknąć uwięzienia komórek, rozcieńczyć próbkę krwi solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 0,2 g/l chlorku potasu, 0,2 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 8 g/l chlorku sodu i 1,15 g/l dwuzasadowego fosforanu sodu) zawierającym 2% FBS w stosunku objętościowym 1:1. Delikatnie przenieś rozcieńczoną krew na podłoże o gradiencie gęstości, nie przerywając granicy faz między nimi. Wiruj z prędkością 1 200 × g przez 10 minut przy RT.
        UWAGA: Probówka do separacji gradientu gęstości o pojemności 50 ml może być użyta do izolacji 4-17 ml próbki krwi. Probówka do separacji w gradiencie gęstości o pojemności 50 ml (patrz Tabela materiałów) stosowana w niniejszym protokole nie wymaga "wyłączenia hamulca" podczas wirowania. Jednak w przypadku stosowania standardowych probówek o pojemności 50 ml hamulec musi być wyłączony i wymaga 30-minutowego wirowania.
      3. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przemyć PBS + 2% FBS, napełniając do 50 ml, a następnie odwirować do 300 × g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 50 ml PBS + 2% FBS. Policz liczbę komórek, a następnie wiruj z prędkością 300 × g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz poprzedni krok, co daje w sumie 2 prania.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki do stężenia 50 × 106 komórek/ml z PBS + 2% FBS.
    3. Przeprowadzić izolację limfocytów T z PBMC za pomocą zestawu kulek magnetycznych o negatywnej selekcji.
      UWAGA: Idealny zestaw do selekcji negatywnej zawiera kulki magnetyczne przyczepione do przeciwciał przeciwko antygenom ulegającym ekspresji na komórkach innych niż limfocyty T. Powszechnie stosowany zestaw zawiera przeciwciała sprzężone z kulkami magnetycznymi przeciwko CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 i CD16 (patrz tabela materiałów).
      1. Przenieść PBMC do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 14 ml. Następnie umieść PBMC i koktajl przeciwciał selekcji negatywnej w pełni zautomatyzowanym separatorze komórkowym i przeprowadź izolację limfocytów T zgodnie z protokołem producenta.
  3. Stymulacja limfocytów T i ekspansja limfocytów T (Rysunek 1)
    1. Aby wyhodować izolowane limfocyty T, przygotuj pożywkę do ekspandowania limfocytów T (TCM) wykonaną z pożywki komórek krwiotwórczych bez surowicy uzupełnionej 10% albuminą surowicy ludzkiej i 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy14. Po izolacji limfocytów T policz komórki i hodowlę w stężeniu 2 × 106 komórek/ml za pomocą TCM.
    2. Umyj koraliki anty-CD3 / CD28 trzy razy za pomocą TCM przed hodowlą limfocytów T.
      1. Wymieszać fiolkę zawierającą kulki, mieszając. Następnie odpipetować wymaganą objętość kulek (3:1 kulki:komórka) (np. podczas stymulacji 1,0 ×10 6 komórek limfocytów T należy użyć 3,0 × 106 kulek anty-CD3/CD28) do sterylnej probówki mikrowirówkowej (1,5 ml) i ponownie zawiesić w 1 ml TCM.
    3. Umieść probówkę do mikrowirówki z koralikami na magnesie na 1 minutę i odessaj supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki w 1 ml TCM. Powtórz poprzednie dwa kroki, w sumie 3 prania.
    4. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml TCM i przenieść je do limfocytów T. Następnie rozcieńczyć limfocyty T do końcowego stężenia 1,0 × 106 komórek/ml za pomocą TCM. Przenieść zawiesinę limfocytów T/kulek na 6-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych i umieścić ją w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Miareczkowanie lentiwirusów (Rysunek 2)
    1. Przygotuj limfocyty T do testu miareczkowania. Upewnij się, że dostępne jest około 1,0 x 106 komórek do miareczkowania jednego typu wirusa.
    2. Stymulować limfocyty T zgodnie z opisem w punkcie 1.3.2.
    3. Płytka 1.0 × 105 komórek stymulowanych limfocytów T na 96-dołkowej płytce (płytka miana) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny (Rysunek 2A). Wyizolować i stymulować limfocyty T zgodnie z opisem w punkcie 1.2.
    4. Przygotować płytkę rozcieńczającą (płytkę 96-dołkową), dodając 100 μl TCM do studzienek wyznaczonych kolumn i nieodkształconych studzienek kontrolnych (Rysunek 2B).
    5. Rozmrozić jedną fiolkę z cząstkami lentiwirusa na lodzie i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Przenieść 50 μl supernatantu wirusa do studzienek w kolumnie 6 płytki 96-dołkowej (rozcieńczenie 3) (Rysunek 2B). Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.
    6. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia (2-krotne seryjne rozcieńczenia): przenieść 50 μl z dołka A6 do dołka B6, a następnie 50 μl z dołka B6 do dołka C6; powtórzyć do G6. Następnie dodać 50 μl rozcieńczonego wirusa do płytki mianowej (Rysunek 2B).
    7. Inkubować płytkę mianownika w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin i oznaczyć procentową zawartość komórek CAR, NIS lub GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2C).
      1. Umyć studzienki, obracając płytkę mianeczkową dwa razy w temperaturze 650 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.
      2. Wybarwić transdukowane limfocyty T zgodnie z opisem w krokach od 1.5.3 do 1.5.9.
      3. Określ miana na podstawie procentowej zawartości komórek CAR-, NIS lub GFP-dodatnich, używając wzoru (1):
        Miana = Procent limfocytów T BCMA-CAR+ lub NIS+ × liczba limfocytów T podczas transdukcji × określonym rozcieńczeniem / objętością (1)
  5. Transdukcja lentiwirusów i ekspansja limfocytów T NIS + BCMA-CAR
    1. Dwadzieścia cztery do 48 godzin po stymulacji limfocytów T wykonaj transdukcję lentiwirusową na stymulowanych limfocytach T (limfocyty T powinny tworzyć klastry).
      1. Rozmrozić zamrożone lentiwirusy kodujące CAR lub NIS w temperaturze 4 °C.
      2. Dobrze wymieszaj stymulowane limfocyty T, aby rozbić klastry i po prostu dodaj świeżo rozmrożonego wirusa przy wielokrotności infekcji (MOI) 5,0 (podczas transdukcji 1,0 × 106 limfocytów T użyj 5,0 × 106 soczewicy). Inkubować transdukowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      3. W dniach 3, 4 i 5 policz transdukowane limfocyty T za pomocą hematocytometru37 lub w pełni automatycznego licznika komórek38 i dostosuj stężenie komórek do 1,0 × 106 komórek/ml, dodając świeży, wstępnie podgrzany TCM. W przypadku limfocytów T transdukowanych przez NIS zawierających gen oporności na puromycynę, należy potraktować komórki 1 μg / ml dichlorowodorku puromycyny w dniach 3, 4 i 5.
    2. W dniu 6 usuń kulki anty-CD3/CD28 z transdukowanych limfocytów T (z kroku 1.3.4), dobrze mieszając w celu rozbicia klastrów limfocytów T i umieszczając je w magnesie na 1 minutę. Następnie po prostu umieść zebrane transdukowane limfocyty T z powrotem w hodowli w stężeniu 1,0 × 106 komórek/ml. Po usunięciu kulek z limfocytów T oceń ekspresję CAR i NIS za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Ponieważ jednołańcuchowy zmienny fragment BCMA-CAR pochodzi od myszy, może być barwiony kozim anty-mysim IgG (H + L) sprzężonym z Alexa Fluor 647. NIS można wykryć za pomocą anty-ludzkiego ETNL [syntetyczny peptyd odpowiadający aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. To przeciwciało rozpoznaje cytozolowy C-koniec NIS. Dlatego limfocyty T muszą być permeabilizowane przed inkubacją z przeciwciałem anty-ludzkim NIS.
    3. Wykonać barwienie powierzchni BCMA-CAR za pomocą koziego anty-mysiego IgG (H+L).
      1. Pobrać porcję kultury (np. 50 000 limfocytów T) i przemyć buforem przepływowym (PBS, 1% FBS i 1% azydku sodu). Następnie ponownie zawieś komórki 50 μl buforu przepływowego i wybarwij komórki 1 μl koziego przeciwciała anty-mysiego w celu wykrycia ekspresji CAR i 0,3 μl żywej martwej wody w celu wykluczenia martwych komórek.
      2. Inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, przemyć komórki dodając 150 μl buforu przepływowego i odwirować komórki w temperaturze 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    4. Po powierzchniowym barwieniu CAR utrwalić i przepuszczalnie komórki, dodając 100 μl pożywki utrwalającej (PBS z 4,21% formaldehydem) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki dwukrotnie 100 μl buforu zawierającego środek przenikający komórki, taki jak saponina (650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C).
    5. Ponownie zawiesić utrwalone/permeabilizowane komórki w 50 μl permeabilizującego buforu. Następnie dodać 0,3 ng przeciwciała anty-ludzkiego ETNL NIS do 50 μl buforu przepływowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    6. Dodać 150 μl buforu przepływowego i odwirować komórki w temperaturze 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Inkubować komórki z 2,5 μl drugorzędowego przeciwciała przeciw królikowi w 50 μl buforu przepływowego przez 30 minut w temperaturze 4 °C, przepłukać komórki dodając 150 μl buforu przepływowego, i odwirować przy 650 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    7. Na koniec ponownie zanurz 200 μl bufora przepływu i wykonaj cytometrię przepływową w celu określenia wydajności transdukcji (Rysunek 3A,B).
    8. W dniu 8 należy odliczyć i odwirować limfocyty T w ilości 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić limfocyty T za pomocą pożywki zamrażającej (90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) o stężeniu 10 ×10 6/ml, a następnie przenieść po 1 ml każdego z nich do znakowanych kriowialiów.
    9. Umieścić fiolki w zamrażarce w temperaturze -80 °C na 48 godzin. Po 48 godzinach (i do 10 dnia) przenieś limfocyty T do ciekłego azotu.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem produkcji ogniw T NIS+ CAR. Rysunek 3D przedstawia przykłady ekspansji limfocytów T ex vivo od trzech różnych dawców.

2. Obrazowanie komórek T NIS+ BCMA-CAR z [ 18F]Skan TFB-PET

UWAGA: Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB i IBC (Bios00000006.04). OPM-2 to linia komórkowa BCMA+ MM, która jest często używana jako docelowa linia komórkowa dla limfocytów T BCMA-CAR39,40.

  1. Ustal lucyferazy + BCMA + komórki OPM-2.
    1. Wysiewaj 500 000 komórek OPM-2 na 24-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej. Rozmrozić lentiwirusa kodującego lucyferazy-GFP w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać świeżo rozmrożonego wirusa o MOI 3,0 do komórek OPM-2 i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    3. Czterdzieści osiem godzin po transdukcji dodaj 2 μg/ml puromycyny, aby wybrać transdukowane komórki. Cztery dni po transdukcji oceń komórki GFP-dodatnie (lucyferazy-dodatnie) za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3E).
  2. Ustal modele myszy ksenoprzeszczepu BCMA+ OPM-2 (Rysunek 4).
    1. Policz komórki lucyferazy+ OPM-2 i odwiruj je dwukrotnie, aby usunąć całą pożywkę do hodowli komórek. Ponownie zawiesić komórki OPM-2 w stężeniu 10 × 106 komórek/ml za pomocą PBS.
    2. W dniu -21 wstrzyknij 100 μl (1,0 × 106 komórek) komórek lucyferazy + OPM-2 do ogonów 8-12-tygodniowych myszy z obniżoną odpornością NOD-scid IL2rγnull (NSG) (Figura 4).
    3. W 20 dniu po wstrzyknięciu komórek OPM-2 (dzień -1 wstrzyknięcia limfocytów CAR T) sprawdź obciążenie guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) (Rysunek 4).
      UWAGA: Komórki OPM-2 tworzą wolno rosnący guz, którego wszczepienie trwa zwykle 2-3 tygodnie.
    4. Podaj 10 μl / g D-lucyferyny myszom ksenoprzeszczepowym OPM-2 przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP). Po 10 minutach wykonaj BLI na myszach pod 2% izofluranem (Rysunek 5A). Po potwierdzeniu wszczepienia guza, losowo podziel myszy zgodnie z obciążeniem guza.
    5. W dniu -1 od wstrzyknięcia limfocytów CAR T rozmrozić limfocyty T NIS+BCMA-CAR i usunąć pożywkę zamrażającą przez odwirowanie (300 × g, 8 min, 4 °C). Następnie ponownie zawiesić komórki za pomocą TCM w temperaturze 2,0 × 106 komórek/ml i inkubować przez noc (37 °C, 5% CO2).
    6. W dniu 0 należy policzyć i odwirować limfocyty T NIS+BCMA-CAR (300 × g, 8 min, 4 °C). Ponownie zawiesić limfocyty T NIS + BCMA-CAR przy 50 × 106 komórkach / ml z PBS.
    7. Podaj 100 μL (5,0 × 106 komórek) limfocytów T NIS + BCMA-CAR przez wstrzyknięcie żyły ogonowej myszom ksenoprzeszczepu OPM-2. W dniach 7 i 15 zobrazuj myszy za pomocą skanu PET.
  3. Obrazowanie in vivo limfocytów T NIS+BCMA-CAR przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu BCMA+OPM-2.
    1. Zważ myszy przed obrazowaniem i usuń wszelkie metalowe kolczyki, aby wyeliminować artefakty związane z metalem.
    2. Przygotuj [18F]TFB zgodnie z wcześniejszym opisem41.
      UWAGA: [18F]TFB musi być wyprodukowany w dniu jego użycia. Czystość radiochemiczna powinna wynosić >99%, a aktywność molowa >5 GBq/mmol.
    3. Wstrzyknąć dożylnie 9,25 MBq [18F]TFB przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Odczekać, aby okres wychwytu wynosił ~40 minut, aby radioznacznik został rozprowadzony w organizmie i oczyścił krew.
    4. Znieczulić mysz za pomocą inhalacji izofluranu (2%).
      UWAGA: Izofluran jest preferowanym wziewnym środkiem znieczulającym, ponieważ ma szybki i niezawodny początek i powrót do zdrowia.
    5. Przed znieczuleniem myszy należy oczyścić wszystkie powierzchnie urządzenia do znieczulania środkami dezynfekującymi.
    6. Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Przekręć pokrętło parownika na 2% i poczekaj, aż mysz stanie się leżąca i przestanie reagować w ciągu 1-2 minut.
    7. Monitoruj mysz, aby uniknąć niewystarczającego znieczulenia lub nadmiernego obniżenia funkcji oddechowych. Krótko mówiąc, uszczypnij palec u nogi, aby potwierdzić niewystarczające znieczulenie.
      UWAGA: Normalna częstość oddechów wynosi do 180/min, a dopuszczalna szybkość upuszczania to 50%.
    8. Zastosuj maść okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki i urazu.
    9. Pozyskanie obrazów PET/CT 45 minut po wstrzyknięciu za pomocą znieczulonej myszy w stacji roboczej do obrazowania mikro PET/CT (patrz tabela materiałów). Następnie wykonuj statyczne obrazy PET przez 15 minut, a następnie akwizycję obrazu CT przez 5 minut z obrotem o 360° i 180 projekcjami przy 500 μA, 80 keV i ekspozycji 200 ms.
  4. Analiza pozyskanych danych obrazowych
    1. Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów PET (Rysunek 5B i dodatkowe wideo S1).
    2. Zdefiniuj wolumen zainteresowania (VOI).
    3. Obliczyć znormalizowaną wartość absorpcji (SUV) za pomocą wzoru (2).
      SUV w VOI = stężenie aktywności w VOI (MBq/ml) × masa ciała (g) / podana dawka (MBq) (2)
  5. Potwierdzenie transportu limfocytów T NIS+BCMA-CAR do miejsc nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Po obrazowaniu [18F]TFB-PET umieść mysz z powrotem w klatce. Po zaprzestaniu znieczulenia należy monitorować zwierzęta do momentu, aż będą zdolne do celowego poruszania się i zapewnić im dostęp do pożywienia i wody.
    2. Monitorować myszy aż do rozpadu wstrzykniętego [18F]TFB. Gdy radioizotop nie jest wykrywalny, należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO2 .
    3. Aby poddać się eutanazji, umieść myszy w klatce (nie więcej niż 5 myszy na klatkę).
    4. Wystaw myszy na działanie CO2 aż do całkowitego zaprzestania oddychania w ciągu około 5-10 min.
      UWAGA: Ta metoda eutanazji musi być zgodna z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt (wydanie 2020).
    5. Aby zapewnić śmierć myszy, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, chwytając tył głowy i podstawę ogona zwierzęcia, a następnie odsuwając ręce od siebie.
    6. Zbierz szpik kostny, aby potwierdzić, że limfocyty T NIS + BCMA-CAR skutecznie przemieszczają się do miejsca guza.
    7. Przenieś pobrane kości udowe i piszczelowe na 6-dołkową płytkę zawierającą 5 ml pożywki do hodowli komórkowych. Usuń mięśnie i ścięgna z kości udowych i piszczelowych i po prostu odetnij oba końce (powyżej stawów) kości udowej i piszczelowej.
    8. Napełnij strzykawkę insulinową pożywką do hodowli komórkowych i przepłucz szpik kostny na płytkę 6-dołkową. W przypadku kości udowych należy użyć igieł 22 G i strzykawek 5 ml, ponieważ średnica kości udowej jest większa niż kości piszczelowej.
    9. Użyj płaskiego końca tłoka, aby zmielić szpik kostny. Umieść sitko o wielkości 70 μm na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przefiltruj zmielony szpik kostny. Następnie napełnić probówkę buforem przepływowym i odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Odessać supernatant i ponownie zawiesić szpik kostny za pomocą 5 ml buforu przepływowego. Przenieś 200 μl szpiku kostnego na płytkę 96-dołkową. Odwirować płytkę o stężeniu 300 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 50 μl buforu przepływowego.
    11. Wybarwić szpik kostny przeciwciałami przepływowymi przeciwko 0,25 μg mysiego CD45, 0,03 μg ludzkiego CD45, 0,06 μg ludzkiego CD3, 0,24 μg ludzkiego BCMA i 0,3 μl żywej/martwej wody. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    12. Odwirować płytkę o stężeniu 300 × g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj 200 μl buforu przepływowego i uruchom na cytometrze przepływowym (Rysunek 5C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia etapy generowania komórek T NIS+BCMA-CAR. W dniu 0 wyizoluj PBMC, a następnie wyizoluj limfocyty T przez selekcję negatywną. Następnie stymuluj limfocyty T za pomocą kulek anty-CD3 / CD28. W dniu 1 transdukuj limfocyty T zarówno lentiwirusami NIS, jak i BCMA-CAR. W dniach 3, 4 i 5 policz limfocyty T i nakarm pożywką, aby dostosować stężenie do 1,0 ×10 6 / ml. W przypadku limfocytów T transdukowanych NIS dodaj 1 μg/ml puromycyny, aby wybrać komórki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metodologię włączania NIS do limfocytów CAR T i obrazowania infuzji komórek CAR T in vivo za pomocą [18F]tfb-PET. Jako dowód słuszności koncepcji, limfocyty T NIS+BCMA-CAR zostały wygenerowane za pomocą podwójnej transdukcji. Niedawno informowaliśmy, że włączenie NIS do limfocytów CAR T nie upośledza funkcji komórek CAR T i skuteczności in vivo , a umożliwia transport i ekspansję komórek CAR T30. Ponieważ terapie komórkami CAR T nadal rozs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK jest wynalazcą patentowym w immunoterapii CAR licencjonowanym przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis) i Mettaforge (poprzez Mayo Clinic). RS, MJC i SSK są wynalazcami patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Humanigen. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs i Lentigen. Figury zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) oraz Predolin Foundation (RS). Rysunki 1, 2 i 4 zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 22 GaugeCovidien8881250206
Strzykawka insulinowa o rozmiarze 28BD329461
96-dołkowa płytkaCorning3595
Anti-human (ETNL) NIS PrzeciwciałoImanisREA009wiąże cytozolowy C-koniec NIS
Anti-human BCMA, klon 19F2, PE-Cy7PrzeciwciałoBioLegend357507
Anty-ludzki CD45, klon HI30, BV421BioLegend304032Flow przeciwciało
Anty-mysie CD45, klon 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow przeciwciało
anty-królicze IgGR& DF0110Przeciwciało wtórne do barwienia NIS
Konstrukt BCMA-CAR, IDT drugiej generacji, Coralville, IA
BD  Zestaw roztworu do utrwalania/przepuszczalności Cytofix/CytopermBD554714
CD3 Przeciwciało monoklonalne (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652cytometr przepływowy
DimetylosulfotlenekMillipore SigmaD2650-100ML
Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-LokBD309646
D-Lucyferyna, sól potasowaZłoto BiotechnologiaLUCK-1G
D-PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)Gibco14190-144
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetyczny koncentrator cząstek)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnesSTEMCELL Technologies18002
Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySepSTEMCELL Technologies17951kulki magnetyczne selekcji negatywnej; 17951RF zawiera końcówki i bufor
Płodowa surowica bydlęcaMillipore SigmaF8067
Kozia anty-mysia IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Wielomodalny skaner PET/CTSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Izofluran w płyniePiramal Critical Care66794-017-10
IVIS System obrazowania Lumina S5PerkinElmerCLS148588
IVIS® System obrazowania Spectrum In VivoPerkinElmer 
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000InvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nmInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Filtr próżniowy Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,22 uM, sterylnyThermo Scientific450-0020
Filtr próżniowy Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,45 uM, sterylnyThermo Scientific450-0045
NOD. Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Wjl/SzJLaboratorium Jacksona05557
OPM-2DSMZCRL-3273linia komórkowa szpiczaka mnogiego
pBMN (CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389wektor lentiwirusowy kodujący lucyferazę-GFP
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x), płynGibco10378-016
oprogramowanie PMODPMODPBAS i P3D
innowacyjne badaniapochodzące z ludzkiego osocza ABIPLA-SERAB-H-100ML
Dichlorowodorek puromycynyMP Biomedicals, Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000W pełni automatyczny separator komórek
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450Probówki do separacji gradientu gęstości
Azek sodu, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
Kolba T175Corning353112
Terrell (izofluran, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Bezpoetyczne podłoże z komórek krwiotwórczychLonza04-418Q
ETNL Flow124262Połączone 0210055210

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973(2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064(2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629(2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209(2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Car T CellsPet Ct ImagingSodium Iodide SymporterT Cell TraffickingT Cell ExpansionFlow CytometryLentiviral TransductionT Cell IsolationBone Marrow EngraftmentBioluminescence Imaging

Powiązane artykuły