Artykuł metodologiczny

Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

DOI:

10.3791/62335

⸱

26 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje metodę kontrolowania rytmu serca nienaruszonych mysich serc transgenicznych myszy z rodopsyną kanałową-2 (ChR2) za pomocą lokalnej fotostymulacji za pomocą mikro-LED i jednoczesnego optycznego mapowania potencjału błony nasierdziowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstoskurcze komorowe są główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Defibrylacja elektryczna za pomocą wstrząsów elektrycznych o wysokiej energii jest obecnie jedynym sposobem leczenia zagrażającego życiu migotania komór. Jednak defibrylacja może mieć skutki uboczne, w tym nieznośny ból, uszkodzenie tkanek i pogorszenie rokowania, co wskazuje na istotną potrzebę medyczną opracowania łagodniejszych strategii zarządzania rytmem serca. Oprócz metod elektrycznych redukujących energię, optogenetyka serca została wprowadzona jako potężne narzędzie do wpływania na czynność serca za pomocą światłoczułych kanałów jonowych błony i impulsów świetlnych. W niniejszym badaniu opisana zostanie solidna i ważna metoda skutecznej fotostymulacji perfundowanych nienaruszonych mysich serc Langendorffa w oparciu o stymulację wielomiejscową z zastosowaniem układu mikrodiod elektroluminescencyjnych 3 x 3 (micro-LED). Jednoczesne mapowanie optyczne fal napięciowych błony nasierdziowej pozwala na badanie efektów stymulacji specyficznej dla regionu i ocenę nowo wywołanej czynności serca bezpośrednio na miejscu. Uzyskane wyniki wskazują, że skuteczność defibrylacji jest silnie uzależniona od parametrów dobranych do fotostymulacji podczas arytmii serca. Zostanie wykazane, że oświetlony obszar serca odgrywa kluczową rolę w pomyślnym zakończeniu, a także w jaki sposób można osiągnąć ukierunkowaną kontrolę czynności serca podczas oświetlenia w celu modyfikacji wzorców arytmii. Podsumowując, technika ta daje możliwość optymalizacji manipulacji mechanizmem na miejscu na drodze do kontroli rytmu serca ze sprzężeniem zwrotnym w czasie rzeczywistym oraz, w odniesieniu do specyfiki regionu, nowych podejść do zmniejszania potencjalnych szkód dla układu sercowego w porównaniu z zastosowaniem niespecyficznych zastosowań elektrowstrząsowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne badania dynamiki przestrzenno-czasowej podczas arytmii wykazały, że złożone wzorce elektryczne podczas migotania serca są napędzane przez wirowe wirujące fale wzbudzenia1. Odkrycie to dostarczyło nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw arytmii, co z kolei doprowadziło do opracowania nowatorskich terapii przerywania czynności elektrycznych opartych na wielomiejscowym wzbudzeniu mięśnia sercowego2,3,4. Jednak zabiegi wykorzystujące stymulację polem elektrycznym są niemiejscowe i mogą unerwiać wszystkie otaczające pobudliwe komórki, w tym tkankę mięśniową, powodując uszkodzenia komórek i tkanek, a także nieznośny ból. W przeciwieństwie do terapii elektrycznych, podejścia optogenetyczne zapewniają specyficzną i chroniącą tkanki technikę wywoływania potencjałów czynnościowych kardiomiocytów z dużą precyzją przestrzenną i czasową. W związku z tym stymulacja optogenetyczna ma potencjał do minimalnie inwazyjnej kontroli chaotycznych wzorców aktywacji podczas migotania serca.

Wprowadzenie światłoczułego kanału jonowego rodopsyny-2 (ChR2) do komórek pobudliwych za pomocą manipulacji genetycznej5,6,7, umożliwiło depolaryzację potencjału błonowego komórek pobudliwych za pomocą fotostymulacji. Kilka zastosowań medycznych, w tym aktywacja sieci neuronowych, kontrola aktywności serca, przywracanie wzroku i słuchu, leczenie urazów rdzenia kręgowego i inne8,9,10,11,12,13,14 zostały opracowane. Zastosowanie ChR2 w kardiologii ma znaczny potencjał ze względu na milisekundowy czas reakcji15, dzięki czemu dobrze nadaje się do ukierunkowanej kontroli arytmicznej dynamiki serca.

W tym badaniu pokazano wielopunktową fotostymulację nienaruszonych serc transgenicznego modelu myszy. Podsumowując, transgeniczna linia myszy alfa-MHC-ChR2 została stworzona w ramach Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) i udostępniona dzięki uprzejmości prof. S. E. Lehnarta. Ogólnie rzecz biorąc, transgeniczny dorosły samiec C57 / B6 / J, wykazujący ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą alfa-MHC, sparowano w pary z samicą B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Ponieważ kaseta STOP serca została usunięta w drugim pokoleniu, potomstwo wykazało stabilną ekspresję MHC-ChR2 i było wykorzystywane do utrzymywania sercowych kolonii światłoczułych. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na dorosłych myszach obu płci w wieku 36 - 48 tygodni. Oświetlenie jest osiągane za pomocą matrycy mikro-LED 3 x 3, wykonanej zgodnie z opisem w16,17, z wyjątkiem tego, że obudowa na bazie krzemu i krótkie włókna szklane nie są zaimplementowane. Jego pierwsze użycie w aplikacji kardiologicznej można znaleźć w18. Liniowy układ mikro-LED oparty na podobnej technologii produkcji został zastosowany jako sonda penetrująca do stymulacji serca19. Mikrodiody LED są ułożone w układzie 3 x 3 o rozstawie 550 μm, zapewniając zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną, jak i wysoką moc promieniowania na bardzo małej powierzchni. Autorzy demonstrują w niniejszej pracy wszechstronną miejscową fotostymulację, która może otworzyć drogę do opracowania nowych metod terapii antyarytmicznej.

Następujący protokół eksperymentalny obejmuje retrogradację ex vivo Langendorffa, dla której kaniulowana aorta pełni funkcję wlotu perfuzji. Ze względu na zastosowane ciśnienie perfuzyjne i skurcz serca perfuzat przepływa przez tętnice wieńcowe, które rozgałęziają się od aorty. W prezentowanej pracy serce jest perfundowane przy użyciu stałego ciśnienia uzyskanego poprzez podniesienie zbiorników perfuzatu na wysokość 1 m, co odpowiada 73,2 mmHg, co daje natężenie przepływu 2,633 ± 0,583 ml/min. Podczas eksperymentu użyto dwóch rodzajów roztworu Tyrode'a jako perfuzatu. Roztwór Regular Tyrode wspomaga stabilny rytm zatokowy, podczas gdy roztwór Low-K+ Tyrode miesza się z Pinacidilem, aby umożliwić indukcję arytmii u mysich serc. Zastosowanie sześciokątnej kąpieli wodnej pozwala na obserwację serca przez sześć różnych płaskich okien, co pozwala na sprzężenie kilku elementów optycznych z mniejszymi zniekształceniami spowodowanymi załamaniem światła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty były ściśle zgodne z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, zgodnie z niemieckim ustawodawstwem, lokalnymi przepisami i zgodnie z zaleceniami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Wniosek o zgodę na eksperymenty na zwierzętach został zatwierdzony przez właściwy organ ds. dobrostanu zwierząt, a wszystkie eksperymenty zostały zgłoszone naszym przedstawicielom ds. dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie eksperymentu i materiały

  1. Konfiguracja mapowania optycznego
    UWAGA: Układ optyczny, jak również układ elektryczny, są pokazane na Rysunek 1. Wszystkie elementy użyte w układzie optycznym i elektrycznym są szczegółowo wymienione w tabeli materiałów.
    1. Użyj diod LED 1 i LED 2 do indukcji arytmii i defibrylacji zapasowej. Wybierz diody LED o dużej mocy o długości fali λniebieskiej w pobliżu 475 nm, która jest szczytem długości fali wzbudzenia ChR26. Aby jeszcze bardziej zawęzić spektrum optyczne, należy użyć filtra pasmowoprzepustowego 470 ± 20 nm.
      UWAGA: W tej pracy diody LED 1 i LED 2 mają typowy strumień promieniowania od 3,9 do 5,3 W, zgodnie z arkuszem danych20.
    2. Oświetl nasierdzie do mapowania optycznego czerwoną diodą LED o dużej mocy (LED 3 w Rysunek 1), która emituje światło o środkowej długości fali λczerwony = 625 nm i strumieniu promieniowania 700 mW21. Światło czerwone jest filtrowane filtrem pasmowo-przepustowym 628 ± 20 nm i odbijane przez długoprzepustowe zwierciadło dichroiczne (DM) o długości fali granicznej λDM = 685 nm.
    3. Użyj filtra emisyjnego zkrzywką filtra λ = 775 ± 70 nm przed obiektywem kamery, aby rejestrować tylko emisję fluorescencji czynności serca. Użyj jasnego obiektywu, który doskonale nadaje się do zastosowań przy słabym oświetleniu.
      UWAGA: Częstotliwość migotania serca myszy waha się od 20 do 35 Hz; dlatego użyj wystarczająco szybkiej kamery, aby nagrywać z częstotliwością od 1 do 2 kHz lub nawet wyższą.
  2. Matryca Micro-LED
    UWAGA: Zastosowane tutaj matryce micro-LED są realizowane przy użyciu przetwarzania mikrosystemów, jak opisano w innym miejscu16,17.
    1. Powłokę wirową warstwy poliimidu (PI) o grubości 5 μm na 4-calowych podłożach krzemowych (jednostronnie polerowanych, o grubości 525 μm).
    2. Utwardzić tę warstwę PI w maksymalnej temperaturze 450 °C w atmosferze azotu. Utrzymuj maksymalną temperaturę na stałym poziomie przez 10 minut.
    3. Osadzaj i modeluj fotorezyst odwracający obraz (PR) za pomocą litografii ultrafioletowej (UV) i rozpylaj rozpylić warstwę platyny (Pt) o grubości 250 nm.
    4. Zagęścić tę metalizację na bazie Pt poprzez galwanizację warstwy złota (Au) o grubości 1 μm z wzorzystym PR służącym jako warstwa maskująca.
    5. Przed wirowaniem drugiej warstwy PI należy wystawić płytkę z pierwszą warstwą PI i metalizacją galwaniczną Au na działanie plazmy tlenowej, która chemicznie aktywuje powierzchnię warstwy PI.
    6. Utwardzić drugą warstwę PI ponownie w temperaturze 450 °C, zastosować litografię UV w celu wymodelowania warstwy PR i otworzyć pola stykowe matrycy dla chipów micro-LED i współpracującej płytki drukowanej (PCB) przez reaktywne trawienie jonowe (RIE) przy użyciu wzorzystego PR jako warstwy maskującej.
      UWAGA: W tych etapach procesu RIE zaleca się stosowanie 200 W i 100 W odpowiednio przez 10 i 30 minut, aby zdefiniować otwory w podkładkach kontaktowych, a także zewnętrzny kształt dwuwymiarowej (2D) matrycy mikrodiod LED.
    7. Usuń PR za pomocą rozpuszczalników i wytrawiania plazmowego. Dalsze pogrubienie pól stykowych poprzez galwanizację dodatkowej warstwy złota o grubości 6 μm.
    8. Przymocuj chipy micro-LED do podkładek kontaktowych za pomocą łącznika typu flip-chip.
    9. Aktywuj powierzchnię PI w plazmie tlenowej i wypełnij chipy micro-LED klejem bezrozpuszczalnikowym. Następnie utwardzać klej przez 12 godzin w temperaturze 120 °C.
    10. Aby otoczyć chipy micro-LED, wykonaj kolejną obróbkę plazmową argonem i ręcznie nałóż cienką warstwę fluoropolimeru. Warstwę tę należy wstępnie utwardzić w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.
    11. Ręcznie nałóż silikon jako końcową warstwę enkapsulacyjną po wystawieniu matrycy micro-LED na działanie plazmy tlenowej, używanej do poprawy przyczepności krzemu do leżącej pod spodem warstwy fluoropolimeru. Warstwę silikonu utwardzić w temperaturze 80 °C i 180 °C przez 1 godzinę każda. Te końcowe etapy utwardzania również całkowicie utwardzają warstwę fluoropolimeru.
    12. pola stykowe podłoża PI do płytki obwodu drukowanego, która przenosi złącza paskowe do połączenia macierzy z zewnętrznym oprzyrządowaniem. Przykryj pola lutownicze na płytce drukowanej za pomocą kleju.
  3. Instalacja elektryczna
    1. Do ciągłego monitorowania aktywności elektrycznej serca należy używać elektrod odpowiednich do rejestrowania elektrokardiogramu (EKG), np. elektrod srebra/chlorku srebra lub elektrod monofazowego potencjału czynnościowego (MAP) oraz wzmacniacza EKG. Ponadto należy użyć odpowiedniego urządzenia akwizycyjnego (AD) do rejestrowania wszystkich uzyskanych sygnałów elektrycznych.
    2. Wybierz odpowiedni sterownik dla diod LED dużej mocy (LED 1, LED 2 i LED 3), który może zarządzać maksymalnym prądem przyłożonym do każdego urządzenia. Użyj generatora funkcji arbitralnych (AFG), aby dokładnie sterować wyjściem sterowników LED.
    3. Użyj wielokanałowego sterownika LED, aby sterować prądem przepływającym przez matrycę micro-LED. Do tego zadania nadaje się również AFG z wieloma wyjściami.
      UWAGA: Zaleca się wybór sterowników LED ograniczających prąd do maksymalnego prądu mikrodiody LED, w przeciwnym razie diody mogą ulec uszkodzeniu. Jeden z przykładów wielokanałowego sterownika micro-LED jest opisany w innym work18. W razie potrzeby AFG lub dowolny inny sterownik LED może być podłączony do komputera, aby zdalnie sterować ustawieniami micro-LED. W takim przypadku podłącz sterownik LED do komputera za pomocą wybranego protokołu komunikacyjnego, np. General Purpose Interface Bus (GPIB) lub połączenia szeregowego.

   

2. Procedury eksperymentalne

  1. Przygotowanie roztworu
    1. Przygotuj roztwór Tyrode'a: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 5,6 mM glukozy, 0,1% BSA/albumina.
    2. Przygotuj roztwór Tyrode o niskiej zawartości K+: Tyrode o niskiej zawartości K+ jest wytwarzany w taki sam sposób, jak zwykły roztwór Tyrode'a, z wyjątkiem tego, że dodaje się tylko połowę ilości KCl (2 mM zamiast 4 mM KCl).
      UWAGA: Do eksperymentu trwającego 3 godziny zwykle wystarczą 2-3 litry tyrolek o niskiej wartości K+ (dodatkowo zmieszane z Blebbitatyną (krok 2.1.5), jeśli wykonywane jest mapowanie optyczne) i 1-2 litry zwykłych tyrów
      3. .
    3. Dodać Pinacidil do roztworu Low-K+ Tyrode, aby ułatwić proces indukcji arytmii, zgodnie z opisem w22, aby uzyskać stężenie 100 mM. Podczas pracy z lekiem Pinacidil należy nosić ochronne rękawice laboratoryjne.
    4. Przygotuj 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ ze zwykłym roztworem Tyrode'a. Chroń barwnik przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu.
    5. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy Blebbistatyny. W celu mapowania optycznego zmieszać blibistatynę z 100 mM roztworem pinacidylu i tyroda (etap 2.1.3), aby otrzymać roztwór o stężeniu 5 μM. Podczas pracy z Blebbistatin.
      należy nosić ochronne rękawice laboratoryjne UWAGA: Odłóż zarówno barwnik, jak i roztwór blebbistatyny na bok do momentu rozpoczęcia mapowania optycznego.
  2. Perfuzja Langendorffa
    UWAGA: Konfiguracja składa się z dwóch zbiorników dla dwóch rozwiązań Tyrode. Są one połączone z pułapką bąbelkową za pomocą rurek z trójdrożnymi kurkami. Serce jest później mocowane do pułapki bąbelkowej za pomocą łącznika Luer lock, a następnie jest zawieszane w sześciokątnej kąpieli wodnej. Kąpiel wodna jest z kolei podłączona do pojemnika na odpady w celu zebrania zużytego roztworu Tyrode.
    1. Wyczyść wszystkie probówki przed każdym eksperymentem całkowicie zdemineralizowaną wodą.
    2. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy napowietrzyć oba roztwory Tyrode'a za pomocą karbogenu (5%CO2 i 95%O2) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dostosuj wartość pH roztworów Tyrode'a do 7,4 za pomocą NaOH.
    3. Napełnij 500 ml każdego roztworu Tyrode'a w odpowiednim zbiorniku i odpowietrzaj probówki oraz pułapkę pęcherzykową, przepuszczając roztwór Tyrode'a przez system perfuzyjny, aż nie będzie już widać uwięzionych pęcherzyków powietrza w probówkach lub w pułapce bąbelkowej.
    4. Kontynuuj napowietrzanie roztworów Tyrode'a podczas całego eksperymentu w zbiornikach z Carbogenem, aby upewnić się, że pH perfuzatu pozostaje stabilne później podczas perfuzji.
    5. Podgrzej system perfuzyjny do temperatury 37 °C za pomocą wodnej pompy ciepła. Utrzymuj stałą temperaturę perfuzatu w łaźni wodnej za pomocą dodatkowego elementu grzejnego, takiego jak wodoodporny grzejny.
      UWAGA: Podczas eksperymentu ważne jest, aby napełnić zbiorniki Tyrode, zanim się opróżnią. W przeciwnym razie pęcherzyki powietrza mogą dostać się do serca, co może zatkać naczynia i doprowadzić do niedokrwienia.
  3. Przygotowanie myszy
    1. Wstrzyknąć podskórnie 0,1 ml 500 I.E. Heparyny 30 minut przed zabiegiem izolacji serca.
    2. Napełnij 6-centymetrową szalkę Petriego i strzykawkę o pojemności 2 ml lodowatym roztworem Tyrode'a. Umieść pod mikroskopem stereoskopowym.
    3. Przeprowadzić krótkotrwałe znieczulenie myszy przez nasycone środowisko izofluranu przez 2 minuty, a następnie natychmiastowe zwichnięcie szyjki macicy.
      UWAGA: W celu sprawdzenia wystarczającego znieczulenia absolutnie konieczne jest sprawdzenie negatywnego odruchu międzypalcowego.
    4. Otwórz skrzynię, wyjmij serce, jak opisano w innym miejscu23 i umieść je na 6-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym roztworem Tyrode. Bicie serca zostanie zmniejszone z powodu spadku temperatury.
    5. Wykonaj dokładne przygotowanie pod mikroskopem stereoskopowym, jak opisano w innym miejscu23. Przymocuj aortę do igły i przymocuj naczynie materiałem do szycia.
    6. W ramach kontroli wstrzyknąć lodowaty roztwór Tyrode'a przez igłę do serca i sprawdzić, czy serce jest mocno osadzone. Ten krok wypłukuje również pozostałą krew z serca.
    7. Przenieś zamontowane serce do systemu perfuzyjnego. Upewnij się, że perfuzat płynie, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do serca podczas łączenia igły z pułapką bąbelkową. Sprawdź, czy serce jest pokryte roztworem Tyrode'a w kąpieli wodnej. Kroki 2.3.4, 2.3.5 i 2.3.7 są zilustrowane na rysunku Rysunek 2.
    8. Upewnij się, że serce zacznie bić w ciągu kilku minut. Pozwól sercu dostosować się do konfiguracji perfuzji przez 15 do 20 minut, a następnie przełącz na roztwór Tyrode'a o niskiej zawartości K+ z Pinacidilem (krok 2.1.3) lub roztwór Tyrode'a o niskiej zawartości K+ z pinacidilem i Blebbistatyną (krok 2.1.5), jeśli ma być wykonane mapowanie optyczne.
  4. Indukcja arytmii i defibrylacja optyczna
    1. Umieść jedną z elektrod EKG jak najbliżej powierzchni serca, aby zapewnić dobrą jakość sygnału. Zawiesić drugą elektrodę EKG w roztworze Tyrode. Upewnij się, że uzyskane EKG jest rejestrowane przez wybraną chorobę Alzheimera.
    2. Umieść matrycę micro-LED w obszarze zainteresowania badania, na przykład na lewej komorze.
    3. Zmień perfuzję na tyród o niskiej zawartości K+ za pomocą Pinacidil i perfuzuj serce przez 15 do 30 minut.
    4. Aby wywołać arytmię, oświetl serce diodami LED 1 i LED 2 ciągiem od 20 do 50 impulsów świetlnych o częstotliwości od 25 do 35 Hz, czasie trwania impulsu Wind od 2 do 15 ms i natężeniu światła LIopt_ind 2,8 mW mm-2.
    5. Powtarzaj proces, aż do wywołania arytmii.
      UWAGA: Arytmie są łatwe do zidentyfikowania w sygnale EKG, ponieważ częstotliwość i morfologia sygnału różnią się od normalnego rytmu zatokowego. Jeśli arytmia zakończy się w ciągu najbliższych 5 sekund, zaklasyfikuj ją jako samoczynną i rozpocznij nową próbę indukcji.
    6. Po wizualnym wykryciu utrzymującej się arytmii zastosuj serię impulsów o różnych szerokościach Wdef i częstotliwościach fdef, używając trzech, sześciu lub dziewięciu mikrodiod LED matrycy przy pulsującymprądzie I impulsie 15 mA, co daje natężenie światła LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2.
    7. Jeśli arytmia utrzymuje się po pięciu próbach defibrylacji opartej na matrycy micro-LED, należy sklasyfikować próbę jako nieudaną i rozpocząć defibrylację zapasową.
    8. Do defibrylacji zapasowej należy użyć diod LED 1 i LED 2 przy użyciu tych samych parametrów czasowych, które są ustawione dla matrycy micro-LED.
      UWAGA: Ponieważ serce jest narażone na stres niedokrwienny i metaboliczny przez cały okres eksperymentalny, możliwe jest, że próby przerwania arytmii nie powiodą się nawet przy defibrylacji zapasowej. Za każdym razem, gdy tak się stanie, zmień roztwór perfuzyjny na zwykły Tyrode i pozwól sercu dojść do siebie przez 5 do 10 minut. Gdy EKG powróci do rytmu zatokowego, powtórz ponownie protokół z kroku 2.4.3.
  5. Mapowanie optyczne
    1. Wykonać perfuzję serca roztworem Blebbistatyny przygotowanym w kroku 2.1.5 i poczekać, aż nastąpi mechaniczne rozprzęganie. Osiąga się to, gdy serce przestaje bić, ale sygnał EKG jest nadal mierzalny.
      UWAGA: Mieszanie roztworu Blebbitatyny do wspomnianego stężenia i utrzymywanie serca w stanie perfuzji tym roztworem utrzymuje mechaniczną aktywność serca niesprzężoną z aktywnością elektryczną podczas całego eksperymentu.
    2. Podać 1 ml barwnika napięciowego DI-4-ANBDQPQ (przygotowanego w kroku 2.1.4) jako bolus w pułapce pęcherzykowej perfuzji Langendorffa. Odczekaj od 5 do 10 minut, aby barwnik równomiernie przeniknął do serca.
      UWAGA: Unikaj fotowybielania barwnika, wyłączając czerwone światło, gdy nie jest nagrywane. Jeśli stosunek sygnału do szumu nagrania stanie się zbyt mały (uzyskany sygnał jest zbyt głośny), powtórz kroki 2.1.4 i 2.5.2.
    3. Ustaw ostrość kamerę na powierzchni serca, włącz diodę LED 3 i zastosuj moc optyczną 1.27 mW mm-2.
    4. Wyłącz światła laboratoryjne i rozpocznij nagrywanie. Upewnij się, że odbierany jest sygnał optyczny, porównując częstotliwość uzyskanego sygnału z częstotliwością zarejestrowanego EKG. Gwarantuje to, że uzyskany sygnał optyczny jest czysto związany z aktywnością elektryczną serca.
      UWAGA: Ponieważ światło fluorescencyjne emitowane przez barwnik jest bardzo tygodniowe, mapowanie optyczne odbywa się w ciemnym pomieszczeniu. Pozwala to uniknąć zakłóceń sygnału z innych źródeł światła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pozwala na indukcję komorowych zaburzeń rytmu serca u nienaruszonych mysich serc za pomocą impulsów fotostymulacji generowanych przez diody LED 1 i LED 2 (Rysunek 1) oczęstotliwości między 25 Hz a 35 Hz i czasie trwania impulsu Wind od 2 ms do 10 ms. Należy zauważyć, że celem tak szybkich impulsów świetlnych nie jest uchwycenie rytmu serca, ale raczej zachwianie równowagi czynności serca, tak aby można było generować nieregularne fale elektryczne, które następnie ułatwia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczne leczenie tachyarytmii serca jest kluczem do terapii kardiologicznej. Jednak mechanizmy biofizyczne leżące u podstaw inicjacji, utrwalenia i zakończenia arytmii nie są w pełni poznane. Dlatego badania kardiologiczne mają na celu optymalizację terapii wstrząsami elektrycznymi w kierunku łagodniejszego zakończenia arytmii, poprawiając w ten sposób jakość życia pacjentów 28,29,30,31. Pode...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Marion Kunze i Tinie Althaus za doskonałe wsparcie techniczne podczas eksperymentów. Badania, które doprowadziły do uzyskania wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej FP7/2007-2013 w ramach umowy o grant nr HEALTH-F2-2009-241526. Wsparcia udzieliło również Niemieckie Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym, DZHK e.V. (projekt MD28), ośrodek partnerski Goettingen, Niemiecka Fundacja Badawcza CRC 1002 (projekt C03) oraz Towarzystwo Maxa Plancka. Prace te były częściowo wspierane przez BrainLinks-BrainTools, klaster doskonałości finansowany przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG, numer grantu EXC 1086).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Składniki
BlebbistatynaTargetMolT603810 mM roztwór podstawowy
BSA/AlbuminaSigma-AldrichA4919
Chlorek wapniaSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalen50 l butelka
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Barwnik do mapowania optycznego
GlukozaSigma-AldrichD9434C6H12O6
HeparynaLEO PharmaHeparyna-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, dostępny tylko na receptę
Kwas solnyMerck1.09057.1000HCl, 1 M roztwór podstawowy
IsofluraneCP Pharma1 ml/ml, dostępny tylko na receptę
Magnez ChlorekMerck8.14733.0500MgCl2
Fosforan monopotasowySigma-Aldrich30407KH2PO4
Monohydrat pinacidyluSigma-AldrichP154-500mg10 mM roztwór podstawowy
Chlorek potasuSigma-AldrichP5405KCl
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761NaHCO3
Sód ChlorekSigma-AldrichS5886NaCl
Wodorotlenek soduMerck1.09137.1000NaOH, 1 M roztwór podstawowy
elektryczna
gromadzenia i analizy danychBiopac MP150Biopac SystemsMP150WSW
Niestandardowe EKG, alternatywne systemy ECG100CBiopacECG100CWzmacniacz elektrokardiogramu
Zbudowany na zamówienie podgrzewacz kąpieli wodnej za pomocą grzejnegoRMS System grzewczyHK-5,0-12grzejny 120W
Sześciokątna kąpiel
LED Sterownik ZasilaczThorlabsKPS10115 V, 2,4 A Zasilacz ze złączem Jack 3,5 mm dla jednego K- lub T-Cube.
Sterownik LED LEDD1BThorlabsLEDD1BT-Cube Sterownik LED, 1200 mA Max Drive Prąd
MAP, elektroda EKGHugo Sachs ElektronikBS4  73-0200Elektroda Mini-ECG do izolowanych serc
Sterownik micro-LED np. AFGAgilent InstrumentsA-2230Generator funkcji arbitralnych (AFG)
Generator sygnałówAgilent InstrumentsA-2230AFG
micro-LED Array Komponenty
Klej epoksydowyTechnologia epoksydowaEPO-TEK 353NDDwuskładnikowa żywica epoksydowa
Fluoropolimer  Asahi Glass Co., Sp. z o.o.Cytop 809MFluoropolimer o wysokiej przezroczystości
Fotorezystor odwracający obrazMerck KGaAAZ 5214ERezystancja odwrócenia obrazu dla
chipa LED  Cree Inc.C460TR2227-S2100Niebieski
fotorezystorMerck KGaAAZ 9260Grube dodatnie fotorezystu
PoliimidUBE Industries Ltd.U-Varnish SRoztwór poliimidu
SilikonNuSil Technology LLCMED-6215Elastomer silikonowy o niskiej lepkości
Klej bezrozpuszczalnikowyJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Żywica epoksydowa o niskiej lepkości
Mapowanie
Niebieski filtrChroma Technology CorporationET470/40xNiebieski filtr
Kaskadafotometryczna128 +Wysokowydajny obiektyw kamery EMCCD
NavitarDO-5095Szybkie obiektywy stałoogniskowe Navitar współpracują z kamerami CCD i CMOS
Lustro dichroiczneSemrockFF685-Di02-25x36krawędź 685 nm BrightLine® jednokrawędziowy standardowy epi-fluorescencyjny dichroiczny rozdzielacz wiązki
Filtr emmisyjnySemrockFF01-775/140-25775/140 nm Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine®
Radiator Zaawansowane rozwiązania termiczneATSEU-077A-C3-R0Radiatory - Radiator LED STAR LED, średnica 45mm, 68mm,/srebrny, niegwintowany Płyta podstawy Hardware
LED 1 i LED 2LED Engin OsramLZ4-00B208Diody LED dużej mocy - jednokolorowe niebieskie, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (min) Zamontowana dioda LED, 1000 mA
SoczewkiLED EnginOsram LLNF-2T06-HZespoły soczewek oświetleniowych LED LZ4 SOCZEWKA WĄSKA WIĄZKA POWODZIOWA
Fotodioda do miernika mocyThorlabsS120VCStandardowy czujnik mocy fotodiody
Miernik mocyThorlabsPM100DKompaktowy miernik mocy i energii
Czerwony filtrSemrockFF02-628/40-25BrightLine® jednopasmowy filtr pasmowo-przepustowy
chemiczneKonfiguracja System wodna o wysokiej rozdzielczości micro-LED optycznewzbudzenia kamery

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101(2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618(2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086(2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692(2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477(2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337(2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Optogenetyka sercatachyarytmia kom rmapowanie optycznemacierz mikro LEDperfuzja w uk adzie Langendorffadefibrylacja sercaepikardialne mapowanie napi ciaprzerywanie arytmii

Powiązane artykuły