Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół użycia sond napięcia opartych na DNA do obrazowania sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe. Takie podejście może mapować siły receptorowe >4,7pN w czasie rzeczywistym i może integrować siły w czasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sondy napięcia DNA do mapowania przejściowych sił receptora pikoningtona przez komórki odpornościowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siły mechaniczne przenoszone na styku dwóch sąsiednich komórek i na styku komórek z macierzą zewnątrzkomórkową są kluczowe dla regulacji wielu procesów, począwszy od rozwoju, a skończywszy na immunologii. Dlatego opracowanie narzędzi do badania tych sił w skali molekularnej ma kluczowe znaczenie. Nasza grupa opracowała zestaw czujników napięcia molekularnego do ilościowego określania i wizualizacji sił generowanych przez komórki i przekazywanych do określonych ligandów. Najbardziej czułą klasą czujników napięcia molekularnego są spinki do włosów z pętlą jądrową kwasu nukleinowego. Czujniki te wykorzystują pary fluorofor-wygaszacz do informowania o mechanicznym rozciąganiu i rozwijaniu spinek do włosów DNA pod wpływem siły. Jednym z wyzwań związanych z czujnikami napięcia spinki do włosów DNA jest to, że są one odwracalne z szybkim ponownym fałdowaniem spinki do włosów po zakończeniu napięcia, a zatem siły przejściowe są trudne do zarejestrowania. W tym artykule opisujemy protokoły przygotowania czujników napięcia DNA, które można "zablokować" i zapobiec ponownemu złożeniu, aby umożliwić "przechowywanie" informacji mechanicznej. Pozwala to na rejestrację wysoce przejściowych sił Piconewtona, które mogą być następnie "wymazane" przez dodanie komplementarnych kwasów nukleinowych, które usuwają blokadę. Ta zdolność do przełączania się między mapowaniem napięcia w czasie rzeczywistym a mechanicznym przechowywaniem informacji ujawnia słabe, krótkotrwałe i mniej obfite siły, które są powszechnie wykorzystywane przez limfocyty T jako część ich funkcji immunologicznych.
Wprowadzenie
Komórki odpornościowe bronią organizmu przed patogenami i komórkami nowotworowymi, nieustannie przemieszczając się i skanując powierzchnie komórek docelowych w poszukiwaniu antygenów, badając ich powierzchnię1,2. Rozpoznawanie antygenu inicjowane jest poprzez wiązanie się receptora limfocytów T (TCR) z kompleksem peptyd-główny kompleks zgodności tkankowej (pMHC) wykazanym na powierzchni komórek docelowych. Ponieważ rozpoznawanie TCR-pMHC zachodzi na styku dwóch mobilnych komórek, od dawna podejrzewano, że poddawane jest ono siłom mechanicznym. Doprowadziło to do opracowania modelu mechanosensora aktywacji TCR, według którego siły działające na TCR przyczyniają się do jego funkcji3,4. Aby zrozumieć, kiedy, gdzie i w jaki sposób siły mechaniczne wpływają na funkcję limfocytów T, niezbędne jest opracowanie narzędzi do wizualizacji sił molekularnych przekazywanych przez te komórki. Tradycyjnie do badania sił komórkowych stosuje się metody takie jak mikroskopia sił trakcyjnych (TFM) oraz macierze mikrosłupków5,6. Jednak czułość siłowa TFM i macierzy mikrosłupków znajduje się w skali nanoniutonowej (nN), co często okazuje się niewystarczające do badania molekularnych sił pikonewtonowych (pN) przekazywanych przez receptory komórkowe7. W celu poprawy rozdzielczości siłowej i przestrzennej detekcji, nasze laboratorium zapoczątkowało rozwój molekularnych sond napięcia, które początkowo syntetyzowano przy użyciu polimerów glikolu polietylenowego (PEG)7. Molekularne sondy napięcia składają się z rozciągliwej molekularnej „sprężyny” (PEG, białko, DNA) flankowanej przez fluorofor i wygaszacz, i są zakotwiczone na powierzchni. Siły przyłożone do końca sondy prowadzą do jej rozciągnięcia, oddzielając fluorofor od wygaszacza, co generuje silny sygnał fluorescencyjny (Rysunek 1A)8,9,10.
W ciągu ostatniej dekady opracowaliśmy bibliotekę różnych klas molekularnych sond napięcia z elementami sprężystymi wykonanymi z kwasów nukleinowych11, białek10 oraz polimerów8. Wśród nich sondy napięcia oparte na DNA zapewniają najwyższy stosunek sygnału do szumu oraz największą czułość na siłę, którą można łatwo dostroić w zakresie od kilku pN do ~20 pN11. Wykorzystaliśmy te sondy napięcia DNA do badania w czasie rzeczywistym sił molekularnych generowanych przez wiele różnorodnych typów komórek, w tym fibroblasty, komórki nowotworowe, płytki krwi i komórki odpornościowe11,12,13. Niniejsza praca opisuje protokoły syntezy i montażu sond napięcia DNA na powierzchni w celu mapowania sił receptorów molekularnych z rozdzielczością siły rzędu pN przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Choć obecna procedura obejmuje modyfikacje chemiczne kwasu nukleinowego w celu wprowadzenia fluorescencyjnego reportera (Rycina 1B), należy zauważyć, że wiele etapów modyfikacji i oczyszczania można zlecić zewnętrznym firmom zajmującym się syntezą DNA na zamówienie. Dzięki temu technologia sond napięcia DNA jest łatwa w obsłudze i dostępna dla szerszego grona badaczy z obszaru biologii komórki i mechanobiologii.
Krótko mówiąc, aby zmontować czujniki naprężeń DNA, spinka DNA jest hybrydyzowana z fluorescencyjną nicią ligandową na jednym ramieniu oraz z kotwiczącą nicią wygaszacza na drugim ramieniu, a następnie unieruchamiana na szklanym podłożu (Rysunek 1C, naprężenie w czasie rzeczywistym). W przypadku braku siły mechanicznej spinka pozostaje zamknięta, a w konsekwencji fluorescencja jest wygaszana. Jednak gdy przyłożona siła mechaniczna jest większa niż F1/2 (siła w stanie równowagi, która prowadzi do 50% prawdopodobieństwa rozfałdowania), spinka ulega mechanicznemu stopieniu i generowany jest sygnał fluorescencyjny.
Opierając się na czujniku napięcia DNA w czasie rzeczywistym, opisujemy również protokoły mapowania sił skumulowanych, co jest szczególnie przydatne w badaniu oddziaływań między receptorami na komórkach odpornościowych a ich naturalnymi ligandami. Wynika to z faktu, że receptory odpornościowe często tworzą krótkotrwałe wiązania3,14. Siły skumulowane obrazuje się przy użyciu nici „blokującej”, która wiąże się preferencyjnie z otwartymi spinkami DNA i pozwala na zapisywanie sygnałów fluorescencyjnych związanych z mechanicznymi zdarzeniami rozciągania (Rycina 1C, napięcie zablokowane). Nić blokująca jest zaprojektowana tak, aby wiązać kryptyczną stronę wiążącą, która odsłania się podczas mechanicznie indukowanego topnienia spinki, i blokować spinkę w stanie otwartym poprzez uniemożliwienie jej ponownego zwinięcia, przechowując w ten sposób sygnał napięcia i generując mapę napięcia skumulowanego. Co więcej, nić blokująca posiada ośmionukleotydowy region toehold, który umożliwia reakcję wypierania nici zapośredniczoną przez toehold z jej pełnym komplementem, czyli nicią „odblokowującą”. Po dodaniu nici odblokowującej, związana nić blokująca zostaje usunięta z konstruktu spinki, co kasuje zapisany sygnał napięcia i przywraca spinkę do stanu pomiaru w czasie rzeczywistym.
Rysunek 1: Schemat nowoczesnych sond napięcia molekularnego. (A) Ogólna konstrukcja sondy napięcia molekularnego do pomiarów w czasie rzeczywistym, (B) nici dla konstrukcji sondy napięcia opartej na DNA oraz (C) zaprojektowane sondy napięcia oparte na DNA i ich przełączanie między stanem czasu rzeczywistego a stanem zablokowanym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Główny protokół składa się z czterech głównych sekcji: przygotowania oligonukleotydów, przygotowania powierzchni, obrazowania oraz analizy danych. Protokół ten został pomyślnie zademonstrowany przez nasz zespół oraz inne grupy badawcze w naiwnych i aktywowanych komórkach T CD8+ OT-1, komórkach CD4+ OT-II, a także w hybridomach; może być stosowany do badania sił różnych receptorów komórek odpornościowych, w tym receptora limfocytów T, receptora programowanej śmierci komórki (PD1) oraz antygenu 1 związanego z funkcją limfocytów (LFA-1). W niniejszej pracy jako przykładowa linia komórkowa wykorzystano naiwne komórki T CD8+ OT-1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Transgeniczne myszy OT-1 są trzymane w Wydziale Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie Emory. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC).
1. Przygotowanie oligonukleotydów
- Rozpuść nić ligandową DNA w wodzie (rezystywność 18,2 MΩ, stosowana w całym protokole). Zwiruj i odwiruj roztwór za pomocą wirówki stołowej. Dostosuj objętość wody tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1 mM. Sprawdzić poprawność stężenia za pomocą spektrofotometru nanokropli do pomiaru absorbancji przy 260 nm i określić końcowe stężenie na podstawie współczynnika ekstynkcji oligonukleotydu.
UWAGA: Nić liganda ma modyfikację na każdym końcu, 5' aminy i 3' biotyny, w celu koniugacji z fluoroforem i przedstawienia biotynylowanego liganda. Grupa aminowa w nici liganda musi być sprzężona z fluoroforem. Barwnik Cy3B jest używany do tej koniugacji ze względu na jego wysoką jasność i fotostabilność, ale nie jest zwykle oferowany komercyjnie i wymaga koniugacji we własnym zakresie. W związku z tym w poniższej sekcji opisano koniugację między aminami a barwnikami estrowymi NHS. Dla użytkowników końcowych, którzy nie mają dostępu do urządzeń lub zasobów do modyfikacji kwasów nukleinowych, zmodyfikowane kwasy nukleinowe można zamiast tego kupić od niestandardowych dostawców syntezy DNA, którzy oferują jasne i fotostabilne barwniki, takie jak rodzina barwników Alexa i Atto. - Przygotuj 10x PBS i 1 M roztwory NaHCO3. Zmieszać 10 μl 1 mM roztworu nici ligandu aminowego (10 nmol) z 10 μl 10 PBS, 10 μl 1 MNaHCO3 i 60 μLH2O. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić 50 μg estru Cy3B NHS w 10 μl DMSO i dodać do mieszaniny na całkowitą objętość reakcyjną 100 μL. Na końcu dodać ester Cy3B NHS. Pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej na 1 godzinę lub 4 °C przez noc.
- Przygotuj nić blokującą Atto647N, sprzężając nić blokującą aminę z estrem Atto647N NHS. Przygotować 10x PBS i 1 M roztwór NaHCO3. Zmieszać 10 μl 1 mM roztworu nici blokującej aminy (10 nmol) z 10 μl 10 PBS, 10 μL 1 MNaHCO3 i 60 μL H2O. Rozpuść 50 μg estru Atto647N NHS w 10 μL DMSO bezpośrednio przed użyciem i dodaj do mieszaniny na całkowitą objętość reakcyjną 100 μL. Na końcu dodać ester Atto647N NHS. Pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej na 1 godzinę lub 4 °C przez noc.
- Po reakcjach usuń produkty uboczne, nadmiar barwnika i sole za pomocą filtracji żelu odsalającego P2. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjnąH2Odo całkowitej objętości 300 μl, która jest odpowiednia dla kolejnego etapu oczyszczania HPLC. Dodaj 650 μl uwodnionego żelu P2 do urządzenia odśrodkowego i wiruj do 18 000 x g przez 1 minutę. Usunąć ciecz z dolnej części urządzenia, dodać mieszaninę reakcyjną do kolumny zawierającej żel P2, odwirować do 18 000 x g przez 1 minutę i zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie urządzenia.
UWAGA: Żel P2 należy nawodnić co najmniej 4 godziny przed użyciem za pomocąH2O. - Oczyścić odsoloną mieszaninę reakcyjną za pomocą HPLC przy użyciu kolumny C18 przeznaczonej do oczyszczania oligonukleotydów, rozpuszczalnikiem A: 0,1 M TEAA wH2Oi B: ACN jako fazą ruchomą dla elucji o liniowym gradiencie 10-100% B przez 50 minut przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Wstrzyknąć odsoloną mieszaninę reakcyjną do HPLC z odwróconymi fazami za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 500 μl w celu oczyszczenia. Zebrać produkt, który ma pik absorbancji dla DNA (260 nm) i pik absorbancji dla fluoroforu (560 nm dla Cy3B i 647 nm dla Atto647N) i wysuszyć je w próżniowym koncentratorze odśrodkowym przez noc (patrz Rysunek 2A).
- Wysuszony produkt z oligobarwnikiem należy rozpuścić w 100 μl wody. Określić stężenie nici liganda Cy3B i nici blokującej Atto647N za pomocą spektrofotometru nanokroplowego. Upewnij się, że stosunek etykietowania barwnika jest zbliżony do 1:1. W razie potrzeby należy skorygować absorbancję barwnika wynoszącą 260 nm przy określaniu stężenia oligonukleotydów.
- Zwalidować oczyszczony produkt za pomocą MALDI-TOF-MS przy użyciu 3-HPA jako substratu w 50% ACN/H2O z 0,1% TFA i 5 mg/ml cytrynianu amonu przy użyciu 0,5 μL produktu w 1-5 μM do przygotowania próbki MALDI-TOF-MS. Przykładowe widmo masowe można znaleźć w Rysunek 2B.
- Rozpuścić pasmo spinki do włosów i pasmo kotwiczące hartownicy w wodzie i upewnić się, że stężenie roztworów podstawowych wynosi od 50 do 100 μM.
UWAGA: Pasmo spinki do włosów jest niezmodyfikowane i może być bezpośrednio syntetyzowane na zamówienie od dostawcy. Pasmo kotwiczne ma tiolową grupę kotwiącą i wygaszacz BHQ2 i może być bezpośrednio syntetyzowane na zamówienie od dostawcy. - Podwielokrotność wszystkich oligonukleotydów. W przypadku krótkotrwałego stosowania i przechowywania oligonukleotydy należy przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy je zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. W tym momencie wszystkie oligonukleotydy są gotowe do złożenia sondy napinającej DNA.
UWAGA: Powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania nie są problematyczne dla oligonukleotydów.
2. Przygotowanie powierzchni
UWAGA: Przygotowanie substratów sondy DNA do napinania spinek do włosów trwa dwa dni. Sonda napinająca spinkę do włosów DNA zostanie funkcjonalizowana na szklanych szkiełkach nakrywkowych.
- Dzień 1
- Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm na stojaku z politetrafluoroetylenu w zlewce o pojemności 50 ml. Każdy stojak może pomieścić do 8 szkiełek nakrywkowych. Opłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je trzykrotnie w wodzie.
- Dodać 40 ml roztworu etanolu zmieszanego z wodą w stosunku 1:1 (v:v) do zlewki zawierającej ruszt i szkiełka nakrywkowe i uszczelnić zlewkę folią parafinową.
- Sonikować zlewkę przez 15 minut w myjce ultradźwiękowej (częstotliwość robocza 35 KHz) w celu oczyszczenia szkiełek nakrywkowych. Po sonikacji wylać płyn i przepłukać zlewkę ze stojakiem i szkiełkami nakrywkowymi w niej wodą co najmniej 6 razy, aby usunąć resztki rozpuszczalnika organicznego.
- Przygotuj świeży roztwór piranii, mieszając kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1. Aby przygotować 40 ml roztworu piranii, najpierw dodaj 30 ml kwasu siarkowego do czystej zlewki o pojemności 50 ml, a następnie powoli dodaj 10 mlH2O2. Roztwór piranii szybko się nagrzewa i bulgocze po dodaniuH2O2. Delikatnie wymieszaj piranię za pomocą końcówki szklanej pipety.
- Następnie przenieś stojak, na którym znajdują się szkiełka nakrywkowe, do zlewki zawierającej delikatnie zmieszany roztwór piranii do trawienia (Rysunek 3A). Pozwól roztworowi piranii hydroksylować i czyść szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wytrawieniu piranii przenieś stojak za pomocą pęsety stalowej lub politetrafluoroetylenowej do czystej zlewki o pojemności 50 ml z wodą i ponownie spłucz wodą co najmniej 6 razy.
UWAGA: Duże ilości substancji organicznych mogą energicznie reagować z roztworem piranii i mogą spowodować wybuch. Bądź ostrożny i zawsze pracuj z roztworem Piranha w dygestorium. Upewnij się, że nosisz fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne. Nigdy nie przechowuj świeżego roztworu Piranha w szczelnie zamkniętym pojemniku.
UWAGA: Stosunek nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego powinien być utrzymywany poniżej 1:2 (v:v) i nigdy nie powinien przekraczać 1:1. Zanurzając stojak z szkiełkami nakrywkowymi w roztworze Piranha, umieszczaj je w roztworze powoli i ostrożnie. Nie wyrzucaj roztworu bezpośrednio po wytrawieniu, ponieważ jest on nadal aktywny i gorący. Pozostaw go w zlewce na noc przed wlaniem do pojemnika na odpady kwasowe. - Zanurz stojak z szkiełkami nakrywkowymi w zlewce o pojemności 50 ml z 40 ml etanolu, aby usunąć wodę. Wyrzuć etanol i powtórz 3 razy, aby upewnić się, że woda została usunięta.
- Następnie zanurz stojak w 3% aminopropylotrietoksysilanie (APTES) (v/v) w 40 ml etanolu, aby reagować z -OH na szkiełkach nakrywkowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (Rysunek 3B).
UWAGA: Etanol można zastąpić acetonem. - Spłucz powierzchnie 6 razy, zanurzając je w 40 ml etanolu, a następnie wysusz w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Po schłodzeniu wysuszone szkiełka nakrywkowe modyfikowane aminami należy przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (do 6 miesięcy).
- Przykryj dolną wewnętrzną stronę plastikowych szalek Petriego o średnicy 10 cm folią parafinową. Folia parafinowa zapobiega przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych wewnątrz szalki Petriego i pomaga w utrzymaniu roztworu do kolejnych etapów funkcjonalizacji na szkiełkach nakrywkowych. Umieścić schłodzone szkiełka nakrywkowe modyfikowane aminami na szalkach Petriego. Strona, która ma być funkcjonalizowana, powinna być skierowana do góry.
- Aby zmodyfikować grupy aminowe na szkiełkach nakrywkowych, dodaj 300 μl 0,5% w/v kwasu liponowego PEG NHS (LA-PEG-SC) i 2,5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) w 0,1 M NaHCO3 na każde szkiełko nakrywkowe i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (Rysunek 3C). Na każde szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm należy odważyć 1,5 mg LA-PEG-SC i 7,5 mg mPEG-SC. Odczynniki NHS należy rozpuścić bezpośrednio przed dodaniem do powierzchni, ponieważ mają one krótki okres półtrwania (~10 min) w roztworze wodnym o temperaturze pokojowej. Po reakcji spłukać powierzchnie 3 razy wodą.
UWAGA: Reakcję NHS można przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc. Odczynniki NHS mają dłuższy okres półtrwania przed hydrolizą w temperaturze 4 °C, czyli około 4-6 godzin. Spowoduje to trzydniową procedurę przygotowania powierzchni. - Dodać 100 μl 0,1 M NaHCO3 zawierającego 1 mg/ml octanu sulfo-NHS do zestawu szkiełek nakrywkowych typu "sandwich" (dwa szkiełka nakrywkowe skierowane do siebie z buforem reakcyjnym pomiędzy nimi). Pozostawić pasywację na co najmniej 30 minut. Aby zaoszczędzić odczynnik, ten krok można wykonać za pomocą 50 μl 1 mg/ml octanu sulfo-NHS. Po pasywacji spłukać trzykrotnie wodą.
- Dodaj 0,5 ml nanocząstek złota (AuNP, 8,8 nm, kwas garbnikowy, 0,05 mg/ml) do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 3D). Aby zaoszczędzić odczynnik, ten krok można wykonać, umieszczając również dwa szkiełka nakrywkowe. Upewnij się, że w systemie nie ma soli z poprzednich kroków, aby uniknąć agregacji nanocząstek złota. Nie pozostawiaj szkiełek nakrywkowych do wyschnięcia po tym kroku.
- Tymczasem wstępnie hybrydyzuj spinkę do włosów 4,7 pN, nić liganda Cy3B i nić kotwiczną BHQ2, które tworzą sondy napięcia DNA, konstruują w stosunku 1,1:1:1 w 1 M NaCl przy 300 nM w probówce PCR. Wyżarzać pasma, podgrzewając roztwór do 95 °C przez 5 minut, a następnie stopniowo schładzać, zmniejszając temperaturę do 20 °C w ciągu 30 minut w termocyklerze.
- Szkiełka nakrywkowe spłukać wodą trzy razy po 30 minutach inkubacji z nanocząstkami złota. Dodaj dodatkową nić kotwiczną BHQ2 (z zapasu 100 μM) do wyżarzonego roztworu DNA, aby uzyskać stosunek między nicią kotwiczącą BHQ2 a nicią liganda Cy3B 10:1. W tym momencie roztwór DNA powinien zawierać 300 nM konstrukcji sondy naprężającej i 2,7 μM nici BHQ2. Dodaj 100 μl na dwa szkiełka nakrywkowe, aby przygotować "kanapkę" (Rysunek 3E).
- Ostrożnie umieść mokrą kulkę tkanki laboratoryjnej na szalce Petriego (z dala od szkiełek nakrywkowych) i uszczelnij naczynie folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu roztworu. Przykryj naczynie folią i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.
- Dzień 2
- Zmyć nadmiar sond z szkiełek nakrywkowych za pomocą 1x PBS. Sprawdź jakość powierzchni sondy napięcia DNA pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
- Przygotować 40 μg/ml streptawidyny w 1x PBS i inkubować na szkiełkach nakrywkowych przez 30 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 3F). Zazwyczaj 100 μl wystarcza na szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm. Po inkubacji spłukać PBS 3 razy, aby zmyć nadmiar streptawidyny.
- Przygotować 40 μg/ml biotynylowanego przeciwciała/liganda w 1x PBS. Dodaj 50-100 μl na kanapkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 3G). Po inkubacji przepłukać PBS trzy razy, aby zmyć nadmiar biotynylowanego przeciwciała/ligandu.
- Ostrożnie zmontuj czyste komory obrazowania z powierzchniami. Powierzchnie mogą być łatwo pęknięte podczas dokręcania komór. Dodaj 0,5-1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do komór obrazowania i utrzymuj je w gotowości do obrazowania za pomocą komórek (Rysunek 3H).
3. Obrazowanie sił receptorów komórkowych
- Przygotuj komórki odpornościowe będące przedmiotem zainteresowania w HBSS w 1-2 x 106 komórek/ml.
UWAGA: Komórki naiwne OT-1 CD8 + są używane jako przykład w tym artykule. Oczyść naiwne limfocyty T OT-1 CD8 + a ze śledziony myszy ofiarowanych za pomocą zestawu do izolacji mysich limfocytów T CD8 + MACS z separatorem MACS zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizoluj i wzbogać limfocyty T CD8 +, usuwając wszelkie limfocyty T inne niż CD8 +, z którymi związany jest magnetyczny koktajl przeciwciał zubożających. Ponownie zawiesić oczyszczone limfocyty T nienawątkowe OT-1 CD8 + w HBSS w dawce 2 x 106 komórek/ml i przechowywać na lodzie przed użyciem. - Sprawdź jakość powierzchni sondy napinającej spinkę do włosów DNA pod mikroskopem fluorescencyjnym (obiektyw 100x) w celu kontroli jakości przed dodaniem ligandów lub posiewu komórek. Zobrazuj i określ ilościowo średnie natężenie tła w kanale Cy3B powierzchni sondy napinającej spinkę do włosów DNA z co najmniej 5 różnych pozycji i 3 powtórzeń. Utrzymuj spójne warunki akwizycji obrazu, aby wartość ta mogła być używana jako wiarygodny marker jakości powierzchni i gęstości sondy (Rysunek 4C).
UWAGA: Określ ilościowo liczbę nici DNA na nanocząstkę złota i liczbę nanocząstek złota na μm2 podczas pierwszych kilku etapów przygotowania powierzchni zgodnie z literaturą12, które mogą być używane jako kolejny wiarygodny marker jakości powierzchni. - Płytka ~ 4 x 104 - 10 x 104 komórki na każdej sondzie napięcia DNA funkcjonalizuje szkiełko nakrywkowe i pozwala im się przyczepić i rozprowadzać przez ~ 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Gdy komórki są umieszczane na sondach napinających spinkę do włosów DNA i zaczynają się rozprzestrzeniać, zobrazuj sygnały fluorescencyjne, które są generowane w kanale Cy3B za pomocą obiektywu 100x (Rysunek 3I).
- Po tym, jak komórki zaczną wytwarzać sygnał napięcia w czasie rzeczywistym na powierzchni sondy napinania spinki DNA w kanale Cy3B, uzyskaj obrazy zarówno w kanałach Cy3B, jak i Atto647N (mikroskopia TIRF daje lepszy stosunek sygnału do szumu niż epifluorescencja). Następnie dodać nić Atto647N do komór obrazowania w końcowym stężeniu 200 nM w celu mechanicznie selektywnej hybrydyzacji.
- Po 10 minutach inkubacji szybko i delikatnie usuń bufor zawierający fluorescencyjną nić blokującą Atto647N i zastąp ją świeżymi, zrównoważonymi solami Hanka. Ponownie zobrazuj oba kanały Cy3B i Atto647N i określ współczynnik korelacji Pearsona za pomocą Fiji software15.
- W momencie zainteresowania badania należy wprowadzić niefluorescencyjną nić blokującą do komórek w komorze obrazowania, aby przechowywać sygnał napięcia. Przygotować wywar z nici zamykającej (100 μM) i dodać do komórek w końcowym stężeniu 1 μM. Delikatnie odpipetować do wymieszania. Czas blokowania może się różnić, ale zalecany czas to 10 minut.
- W razie potrzeby pobieraj filmy poklatkowe lub obrazy punktów końcowych w epifluorescencji zarówno do jakościowego mapowania naprężeń, jak i analizy ilościowej (Rysunek 3J i Rysunek 5).
UWAGA: Jeśli pożądany jest pomiar naprężenia w wielu punktach czasowych, zainicjuj usuwanie zapisanych sygnałów naprężenia poprzez dodanie pasma odblokowującego. Aby uniknąć nadmiernego płukania, stosuje się wyższe końcowe stężenie nici odblokowującej przy 2 μM, aby zainicjować reakcję przemieszczenia nici za pośrednictwem palca z nicią blokującą na 3 minuty, co powoduje usunięcie zapisanych sygnałów ( Rysunek 3J). Delikatnie spłucz nadmiar oligonukleotydów za pomocą HBSS. Sonda naprężenia spinki DNA do włosów styka się z powierzchnią, a komórki są gotowe do kolejnej rundy magazynowania i mapowania napięcia. Odblokowanie sygnałów napięcia nie jest konieczne, jeśli w badaniu interesuje nas tylko jeden punkt czasowy.
4. Analiza danych
UWAGA: Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą oprogramowania Fidżi, a analiza ilościowa jest wykonywana za pomocą oprogramowania do analizy.
- Skoryguj wszelkie dryfy podczas akwizycji obrazu za pomocą polecenia Popraw dryf 3D w Rejestracji w menu Wtyczki.
- Usuń tło obrazu z kamery za pomocą polecenia Odejmij w menu Proces.
- Określ współczynnik korelacji Pearsona za pomocą funkcji Kolokalizacja w menu Analizuj.
- Uśrednij i odejmij fluorescencyjne tło wytwarzane przez nieotwarte sondy z trzech różnych lokalnych obszarów tła. Narysuj ROI komórek na obrazach odejmowanych od tła lub obrazach RICM (mikroskopia kontrastowa odbiciowa, interferencyjna) za pomocą narzędzia Image J Freehand Selections. Zmierz dowolny wskaźnik zainteresowania ROI, np. zintegrowaną intensywność fluorescencji i zajętość napięcia za pomocą narzędzia Zmierz w menu Analizuj (Rysunek 6).
- Eksport pomiarów do analizy ilościowej za pomocą oprogramowania analitycznego.
- Wykreśl dane za pomocą dowolnego oprogramowania analitycznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prezentujemy tutaj reprezentatywne obrazy kontroli jakości powierzchni (Rycina 4). Powierzchnia wysokiej jakości powinna charakteryzować się czystym tłem w kanale RICM (Rycina 4B) oraz jednorodną intensywnością fluorescencji w kanale Cy3B (Rycina 4C). Przy zastosowaniu tego samego sprzętu obrazującego i identycznych warunków akwizycji obrazowania fluorescencyjnego, intensywność fluorescencji tła powinna być spójna i powtarzalna przy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dzięki szczegółowym procedurom przedstawionym tutaj można przygotować podłoża sondy napinania spinki do włosów DNA, aby zmapować i określić ilościowo napięcie receptora wytwarzane przez komórki odpornościowe. Kiedy komórki są siane na podłożu sondy napinającej spinkę do włosów DNA, lądują, przyczepiają się i rozprzestrzeniają, gdy receptory wyczuwają ligandy zarówno chemicznie, jak i mechanicznie, z których ten ostatni jest wykrywany przez nasze sondy. Jednak w niektórych przypadkach komórki mogą nie rozprzestrzeniać się...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 i NSF CAREER 1350829. Dziękujemy NIH Tetramer Facility za ligandy pMHC. Badanie to było częściowo wspierane przez Emory Comprehensive Glycomics Core.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 3-hydroksypikolinowy (3-HPA) | Sigma | 56197 | matrix maldi-TOF-MS |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | przygotowanie powierzchni |
| (3-aminopropylo)trietoksysilan | Acros | AC430941000 | przygotowanie powierzchni |
| 10x Bufor do lizy czerwonych krwinek | Bufor Biolegend | 00-4333-57 | |
| 8,8 nm nanocząstki złota, kwas garbnikowy | Nanocomposix | niestandardowe zamówienie | przygotowanie powierzchni |
| Atto647N NHS ester Sigma | 18373-1MG-F | fluorofor, oligo prep | |
| Komora komórkowa Attofluor, do mikroskopii | Thermo Fisher Scientific | A7816 | obrazowanie |
| BD Strzykawki tylko z Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | |
| komórki biotynylowane anty-mysie CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | przeciwciało/ligand |
| Biotynylowana albumina jaja kurzego pMHC (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility na Uniwersytecie Emory | Przeciwciało/ligand | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | 735078001 | blokują niespecyficzne interakcje |
| Sitka komórkowe | Biologix | 15-1100 | komórek |
| Szkiełko nakrywkowe Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | przygotowanie powierzchni |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorofor, oligo prep |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) | Bufor | Corning | 21-031-CM |
| Sigma | 459836 | przygotowanie powierzchni | |
| Hank' s zrównoważone sole (HBSS) | Sigma | H8264 | bufor |
| nadtlenek wodoru | Sigma | H1009 | przygotowanie powierzchni |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | przygotowanie powierzchni |
| Zestaw startowy Midi MACS (LS) | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | |
| komórki myszy CD8 + zestaw do izolacji komórek T | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Urządzenia odśrodkowe Nanosep MF Przygotowanie | oligo | ODM02C35 | laboratorium Pall |
| nr 2 okrągłe szkiełka nakrywkowe | VWR | 48382-085 | przygotowanie powierzchni |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | przygotowanie powierzchni |
| Żel P2 | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| kwas sufurowy | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | przygotowanie powierzchni |
| Octan sulfo-NHS | Thermo Fisher Scientific | 26777 | przygotowanie powierzchni |
| Sprzęt | |||
| Agilent Kolumna oligonukleotydowa AdvanceBio C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 μ m | 653950-702 | preparat oligonukleotydowy | |
| Barnstead System oczyszczania wody Nanopure | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100 razy; NA 1.49 obiektyw | Mikroskopia Nikon | kostka | |
| Cy5 | CHROMA | Mikroskopia | |
| ewoluuje urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami (EMCCD) | Fotometria | ||
| Mikroskopia Wysokosprawna chromatografia cieczowa | Preparat oligonukleotydowy | Agilent 1100 | |
| Intensilight źródło epifluorescencji | Nikon | Mikroskopia | |
| Spektrometr mas czasu przelotu wspomagany matrycą laserową (MALDI-TOF-MS)Preparat | oligonukleotydowy | Voyager STR | |
| Spektrofotometr UV-Vis Nanodrop 2000 | Preparat oligonukleotydowy | Thermo Fisher | |
| Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti | Mikroskopia | Nikon | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Mikroskopia | |
| Oprogramowanie NIS Elements | Mikroskopia Nikon | Mikroskopia | |
| czterozakresowa kostka TIRF 405/488/561/647 Mikroskopia | CHROMA | ||
| Kostka RICM Mikroskopia | CHROMA | ||
| Wyrzutnia TIRF z 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) i 640 nm | Koherentna | koskopia | |
| TRITC | Mikroskopia CHROMA | ||
| <> nazwa silnego< / strong> | < strong>5' modyfikacja / 3' modyfikacja< / strong> | < strong>sequence (od 5 'do 3')< / strong> | Zastosowanie< / strong> |
| 15mer amina blokująca pasmo | < strong>5' Modyfikacja: < / strong> bez modyfikacji 3' Modyfikacja: < / mocny> / 3AmMO / | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | blokujący sygnał napięcia w czasie rzeczywistym |
| 15mer Atto647N pasmo blokujące | 5' Modyfikacja: < / mocny> Atto647N 3' Modyfikacja: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT CCT ACC | TA blokujący sygnał napięcia w czasie rzeczywistym |
| 15-merowa niefluorescencyjna nić | blokującaModyfikacja < > 5 ': < / strong> bez modyfikacji < strong>3 'Modyfikacja: < / strong> bez modyfikacji | AAA AAC ATT TAT AC | blokujący sygnał napięcia w czasie rzeczywistym do analizy ilościowej |
| 4,7 pN pasmo spinki do włosów | 5' Modyfikacja: bez modyfikacji 3' Modyfikacja: bez modyfikacji | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC | sonda do spinki do włosów |
| aminowe | 5' modyfikacja: /5AmMC6/ 3' Modyfikacja: /3Bio/ | CGCATCTGTGCGGGGGGGGGGGGGGGGbr/ CAGC CAGC | Sonda do spinki do włosów |
| BHQ2 pasmo kotwiczne BHQ2 | Modyfikacja < > 5 ': < / silna> / 5ThiolMC6-D / 3' modyfikacja: < / mocna> /3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | sonda spinki do włosów |
| Cy3B ligand strand | 5' modyfikacja: < / strong> Cy3B 3' modyfikacja: < / strong> / 3Bio / | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | sonda |
| spinki do włosów odblokowująca pasmo odblokowujące < | strong>5' Modyfikacja: bez modyfikacji 3' Modyfikacja: bez modyfikacji | TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | odblokowanie skumulowanego sygnału napięcia |
Bibliografia
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
- Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
- Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
- Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
- Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961(2019).
- Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
- Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167(2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
- Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
