Artykuł metodologiczny

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62349

⸱

4 kwietnia 2021

 , 
1Harvard Medical School, 2Brigham and Women’s Hospital, 3Massachusetts General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Streszczenie

Niewydolność wątroby jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a śmiertelność z powodu przewlekłej choroby wątroby gwałtownie rośnie w Stanach Zjednoczonych. Zdrowe wątroby są zdolne do regeneracji po uszkodzeniach toksycznych, ale w zaawansowanej chorobie wątroby naturalna zdolność wątroby do regeneracji jest upośledzona. Danio pręgowany stał się potężnym systemem eksperymentalnym do badania regeneracji. Są idealnym modelem do badania regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii, procedurze o bezpośrednim znaczeniu klinicznym, w której część wątroby jest usuwana chirurgicznie, pozostawiając resztę nienaruszoną. Nie ma standardowego protokołu częściowej hepatektomii; Poprzednie badania wykorzystujące ten model wykorzystywały nieco inne protokoły i przedstawiały rozbieżne wyniki. Opisano tutaj skuteczny, powtarzalny protokół wykonywania częściowej hepatektomii u dorosłych danio pręgowanego. Używamy tej techniki, aby wykazać, że danio pręgowany jest zdolny do epimorficznej regeneracji wyciętego płata. Protokół ten może być wykorzystany do dalszego badania mechanizmów wymaganych do regeneracji wątroby u danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Wśród organów stałych u ludzi, wątroba jest jedynym organem zdolnym do regeneracji1. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ wątroba jest niezbędnym organem, odpowiedzialnym za kluczowe funkcje metaboliczne, magazynowanie energii, detoksykację krwi, wydzielanie białek osocza i produkcję żółci2. Hepatocyty utracone w wyniku uszkodzeń toksycznych lub zapalnych są zastępowane głównie przez podział pozostałych hepatocytów1. Jednym z klasycznych eksperymentalnych modeli badania regeneracji wątroby jest częściowa hepatektomia, w której usuwa się pojedyncze płaty wątroby, pozostawiając pozostałe płaty nienaruszone3. Procedura ta została początkowo opracowana u szczurów, u których usuwa się około dwóch trzecich masy wątroby. Po częściowej hepatektomii u ssaków następuje regeneracja kompensacyjna w pozostałych płatach, aż wątroba odzyska swoją początkową masę. Warto zauważyć, że wątroba ssaków nie zastępuje brakujących płatów.

Danio pręgowany (Danio rerio) stanowi praktyczny model do badania regeneracji dorosłych organów4. Wątroba danio pręgowanego, choć strukturalnie różni się od wątroby ssaków, składa się z tych samych typów komórek i pełni tę samą funkcję, co u ssaków2. Składa się z trzech płatów, z dwoma płatami grzbietowymi i pojedynczym płatem brzusznym, które są spłaszczone wzdłuż jelita. Częściowa hepatektomia była wcześniej wykonywana u danio pręgowanego, ze sprzecznymi relacjami co do dokładnego sposobu regeneracji. Zazwyczaj jedną trzecią częściowej hepatektomii wykonuje się poprzez usunięcie całego płata brzusznego. Wstępne doniesienia wskazywały, że po usunięciu płata brzusznego został on w pełni zregenerowany w ciągu tygodnia5,6,7, co sugeruje, że w przeciwieństwie do wątroby ssaków, wątroba danio pręgowanego jest zdolna do regeneracji epimorficznej. Późniejsze badania wykazały, że usunięcie płata brzusznego skutkowało regeneracją kompensacyjną w płatach grzbietowych, a nie regeneracją brakującego płata brzusznego, a ostatecznie odzyskaniem masy wątroby w ciągu tygodnia8,9. Profilowanie transkryptomiczne płatów grzbietowych po resekcji płata brzusznego ujawniło istotne zmiany związane z regeneracją kompensacyjną10. Biorąc pod uwagę, że sposób regeneracji wątroby może się różnić w zależności od stopnia urazu8, spekulowaliśmy, że rozbieżności w wynikach mogą wynikać z technicznych różnic w protokole częściowej hepatektomii między grupami badawczymi.

Ten protokół opisuje procedurę wykonywania jednej trzeciej częściowej hepatektomii u dorosłego danio pręgowanego poprzez usunięcie płata brzusznego. Technika ta będzie cenna dla oceny mechanizmów regeneracji wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital (2016N000405). Dorosłe rybki danio pręgowanego były poszczone przez 24 godziny przed rozpoczęciem protokołu. Woda systemowa odnosi się do wody w zbiornikach z rybami pręgowanymi w obiekcie wodnym.

1. Przygotowanie i znieczulenie

  1. Przygotować 0,016% roztwór trikainy w wodzie systemowej.
    UWAGA: Trikaina działa drażniąco, jeśli wejdzie w kontakt z oczami, skórą lub drogami oddechowymi.
  2. Przygotuj gąbkę do trzymania znieczulonego danio pręgowanego podczas protokołu sekcji. Pokrój pełną gąbkę na ćwiartki. Za pomocą żyletki usuń cienki klin gąbki, który biegnie równolegle do długiej osi ćwiartki gąbki.
    1. Szczelina powinna być wystarczająco długa, aby pomieścić dorosłą rybę (będzie się to różnić w zależności od różnych rozmiarów ryb). Na przykład w przypadku dorosłej ryby o długości 35 mm długość szczeliny powinna wynosić 20 mm. Głowa i tułów są dobrze trzymane w gąbce, ale ogon biegnie poza krawędź gąbki (Rysunek 1B).
  3. Namocz gąbkę w 0,016% roztworze trikainy.
  4. Umieścić dorosłego danio pręgowanego (samca lub samicę) w 625 ml 0,016% roztworu trikainy.
  5. Inkubować przez 6 minut lub do momentu, gdy ryba przestanie reagować na dotyk.
  6. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij rybę ze zbiornika Tricaine i umieść rybę brzuszną stroną do góry w rowku gąbki (Rysunek 1A - B).
  7. Umieść gąbkę pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem od góry do dołu.

2. Chirurgia

  1. Za pomocą cienkich kleszczy uszczypnij skórę i łuski przyśrodkowo, tuż za sercem (Ryc. 1B).
  2. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie pod kleszczami, aby utworzyć otwór w jamie ciała (Rysunek 1C - D). Należy uważać, aby nie uszkodzić serca ani głównego naczynia krwionośnego, ponieważ spowoduje to zwiększoną śmiertelność.
  3. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie o średnicy 3-4 mm wzdłuż brzucha, przetwarzając z tyłu, aż nacięcie dotrze do płetw brzusznych (Rysunek 1D - E). W tym momencie płat brzuszny wątroby może być widoczny przez nacięcie.
  4. Ściśnij boki gąbki jedną ręką, aby wypchnąć narządy trzewne z jamy ciała. Płat brzuszny wątroby będzie widoczny na górze jelita (Rysunki 1F,2A-B). Wątroba pojawi się jako różowa lub pomarańczowa struktura rozłożona na złotobrązowym jelicie. Zwierzęta wyznaczone do kontroli pozorowanej są na tym etapie odzyskiwane.
  5. Ściśnij cienkie kleszcze tak, aby dwa zęby się stykały. Wywierając nacisk na gąbkę, wsuń zęby cienkich kleszczyków między wątrobę a jelito (Rysunek 1G). Uważaj, aby nie przebić jelita, ponieważ spowoduje to zwiększoną śmiertelność.
  6. Powoli rozluźnij nacisk na kleszcze, tak aby zęby odsunęły się od siebie (Rysunek 1H). To działanie ślizgowe przecina liczne przyczepy żyły wrotnej między płatem brzusznym a jelitem (Ryc. 2B) i jest konieczne do czystego usunięcia płata brzusznego. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie połączenia wrotne między wątrobą a jelitem zostaną zerwane.
  7. Oderwij płat brzuszny od jelita za pomocą cienkich kleszczy i odetnij płat brzuszny od reszty wątroby (Rysunek 1I).
  8. Procedura ta prowadzi do częściowej hepatektomii w jednej trzeciej (Ryc. 1J).

3. Odzyskiwanie

  1. Ostrożnie wyjmij rybę z gąbki i umieść ją w zbiorniku z wodą systemową.
  2. Pipetą podlewaj skrzela pipetami przez kilka minut, aż ryba zacznie samodzielnie pływać (Rysunek 1K).
  3. Monitoruj ryby przez 2-4 godziny przed umieszczeniem ich z powrotem w systemie. Nie należy karmić ryb przez pełne 24 godziny po zabiegu.
  4. Monitoruj ryby codziennie przez cały czas trwania eksperymentu.
  5. Z czasem nacięcie w ścianie ciała zagoi się naturalnie, bez konieczności zakładania szwów (Rysunek 1L,2C).

4. Analiza długości płata brzusznego do jelita

  1. Poddać eutanazji wszystkie zwierzęta przeznaczone do analizy w lodowatej wodzie przez 10 minut, aż ustaną wszystkie ruchy operkularne.
  2. Wyjmij rybę z lodowatej wody i umieść ją brzuszną stroną do góry w rowku gąbki.
  3. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w brzusznej ścianie ciała w przednim i tylnym położeniu serca. Następnie wykonaj dwa kolejne nacięcia, które biegną wzdłuż osi przednio-tylnej od pierwszego nacięcia aż do płetw brzusznych. (Rysunek 2A).
  4. Zdejmij skórę i mięśnie, aby odsłonić narządy trzewne (Rysunek 2A).
  5. Uzyskaj jasne pole i fluorescencyjne obrazy narządów trzewnych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. To pole widzenia będzie obejmowało obszar, w którym płat brzuszny został wycięty. Ponieważ zwierzęta są poddawane eutanazji przed analizą, ten rodzaj analizy wyklucza długoterminowe obrazowanie tych samych ryb.

5. Analiza stosunku wątroby do masy ciała

  1. Poddać eutanazji wszystkie zwierzęta przeznaczone do analizy w lodowatej wodzie przez 10 minut, aż ustaną wszystkie ruchy operkularne.
  2. Umieść rybę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  3. Dodaj 25 ml 4% paraformaldehydu w 1x PBS i 0,3% Tween do probówki.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny, a roztwory zawierające formaldehyd należy zawsze przetwarzać w okapie chemicznym.
  4. Nutować przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
  5. Wykonaj cztery 10-minutowe prania w 1x PBS i 0,3% Tween.
  6. Wyciągnij ryby kleszczami i osusz na ręczniku papierowym.
  7. Zapisz wagę całej ryby.
  8. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w brzusznej ścianie ciała w przednim i tylnym położeniu serca. Następnie wykonaj dwa kolejne nacięcia, które biegną wzdłuż osi przednio-tylnej od pierwszego nacięcia aż do płetw brzusznych. (Rysunek 2A).
  9. Zdejmij skórę i mięśnie, aby odsłonić narządy trzewne (Rysunek 2A).
  10. Uzyskaj obrazy wątroby w jasnym polu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
  11. Wypreparuj wątrobę, umieszczając kawałki wątroby na łodzi do ważenia.
  12. Zapisz wagę wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać potencjał regeneracyjny wątroby dorosłego danio pręgowanego, przeprowadziliśmy częściową hepatektomię (PHX) u dorosłego danio pręgowanego. Ogólnie rzecz biorąc, wybrano duże dorosłe osobniki (30-40 mm długości) w wieku od 1,5 do 2,5 roku. W ramach indywidualnych eksperymentów zwierzęta zostały wybrane z tego samego zbiornika i były dopasowane pod względem wieku i wielkości. Jako odpowiednią kontrolę zastosowaliśmy pozorowane operacje, w których zwierzę zostało zarówno znieczulone, jak i otrzymało duże nacięcie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różnice anatomiczne między modelami danio pręgowanego i ssaków do regeneracji wątroby stanowią wyjątkowe wyzwanie dla resekcji wątroby. Wątroba danio pręgowanego znajduje się w bliskiej odległości od serca i jelita; Nieumyślne uszkodzenie któregokolwiek z narządów powoduje zwiększoną śmiertelność. Wątroba danio pręgowanego nie jest otoczona, co utrudnia oddzielenie jej od jelita. Wątroba otrzymuje bogatą w składniki odżywcze krew z jelita przez żyły wrotne. U ssaków żyły opuszczające jelito zbiegają się w pierwotnej żyle...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

I.M.O. jest wspierany przez NIAAA (F32AA027135). W.G. jest wspierany przez R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 oraz Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. jest stypendystą Pew w dziedzinie nauk biomedycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% wodny roztwór paraformaldehydu,mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences15700
50 ml probówki wirówkowe Falcon, polipropylen, sterylneCorning352098
AS 82/220.R2 PLUS Waga analitycznaBay State Scale & Systems, INC.WL-104-1051
Dumont #55 KleszczeNarzędzia do nauki11295-51
EMS Kuehne Kleszcze do szkła nakrywkowego/próbekMikroskopia elektronowa Nauki72997-07
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissDiscovery.V8
Mastertop Gąbka do czyszczenia celulozyAmazonB07CBSM53Z
PBS10X Płynny Conc 4LEMD Millipore6505-4L
Super cienkie mikronożyczki, 3 1/4 "prosteBiomedyczne instrumenty badawcze11-1020
Metanosulfonian trikainySyndelTRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagentsFischer ScientificBP337-500

Bibliografia

  1. Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
  2. Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
  3. Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
  4. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
  5. Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
  6. Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
  7. Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
  8. Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
  9. Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
  10. Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979(2015).
  11. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
  12. Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regeneracja w trobymodel ryby danio ostrop etwejusuni cie p ata brzusznegostosunek masy w troby do masy cia amikroskopia fluorescencyjnamikroskop stereoskopowynarz dzia genetycznechoroby w troby

Powiązane artykuły