Artykuł metodologiczny

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62350

⸱

5 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Streszczenie

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania krio-lameli z zamrożonych siatek ludzkich erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum, który można łatwo zaadaptować do innych próbek biologicznych. Podstawowe zasady przygotowywania próbek, mielenia i oglądania lameli są wspólne dla wszystkich przyrządów, a protokół może być przestrzegany jako ogólny przewodnik po przygotowaniu kriolameli w sieci do mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) i tomografii krioelektronowej (cryoET). Siatki mikroskopii elektronowej podtrzymujące komórki są zamrażane wgłębnie w ciekłym etanie chłodzonym azotem za pomocą ręcznej lub automatycznej zamrażarki wgłębnej, a następnie poddawane badaniom przesiewowym pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kriostolik. Zamrożone siatki są przenoszone do krioskaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w skupioną wiązkę jonów (cryoFIB-SEM). Siatki są rutynowo napylane przed frezowaniem, co pomaga w rozpraszaniu nagromadzonego ładunku podczas mielenia. Alternatywnie można użyć powlekarki rotacyjnej z wiązką elektroniczną do nałożenia warstwy węglowo-platynowej na kratki, której dokładna grubość może być dokładniej kontrolowana. Po wejściu do krioFIB-SEM na powierzchnię siatki nakładana jest dodatkowa powłoka ze związku platynowca organicznego za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS). Warstwa ta chroni przednią krawędź lameli podczas frezowania, której integralność ma kluczowe znaczenie dla uzyskania jednolicie cienkich lameli. Obszary zainteresowania są identyfikowane za pomocą SEM, a mielenie odbywa się w sposób krokowy, zmniejszając prąd wiązki jonów, gdy blaszka osiąga przezroczystość elektronów, aby uniknąć nadmiernego wytwarzania ciepła. Siatka z wieloma lamelami jest następnie przenoszona do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) w warunkach kriogenicznych w celu akwizycji serii pochylenia. Solidny i wolny od zanieczyszczeń przepływ pracy w zakresie przygotowania lameli jest niezbędnym krokiem dla dalszych technik, w tym krioEMU komórkowego, cryoET i uśredniania subtomogramowego. Rozwój tych technik, zwłaszcza w zakresie wyjmowania i mielenia zamrożonych próbek pod wysokim ciśnieniem, ma wysoki priorytet w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Tylko zawartość komórkowa próbek biologicznych o grubości <500 nm może być skutecznie zobrazowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w temperaturach kriogenicznych, ograniczając zakres próbek do wirusów, prokariontów, prostych organizmów jednokomórkowych i cieńszych regionów większych komórek eukariotycznych1. Mielenie skupionej wiązki jonów (FIB) w siatce umożliwia rozrzedzanie grubszych próbek biologicznych zamrażanych wgłębnie do przezroczystych blaszek elektronowych w temperaturach kriogenicznych (< -150 °C). Powstałe blaszki są następnie przenoszone do TEM w celu wizualizacji i gromadzenia danych tomograficznych, umożliwiając rekonstrukcje 3D w wysokiej rozdzielczości cech komórkowych i molekularnych wewnątrz komórek (przeglądy patrz Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, oraz Wagner et al., 20204).

Mielenie FIB wywodzi się z dziedziny materiałoznawstwa, gdzie próbki są rutynowo rozrzedzane, aby przygotować je do dalszej analizy5. Odbywa się to w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), który ma dwie kolumny optyczne: konwencjonalną optykę skaningowego mikroskopu elektronowego i drugą kolumnę zawierającą optykę zdolną do generowania i precyzyjnego kontrolowania skupionej wiązki jonów (FIB) - zwanej FIB-SEM. Pozwala to na ablację określonego obszaru próbki przez jony generowane przez źródło galu, usuwając nadmiar materiału i pozostawiając blaszkę6. Proces mielenia jest prowadzony przez obrazowanie SEM topografii próbki, które służy do lokalizowania obszarów zainteresowania i monitorowania postępu mielenia. W przypadku zastosowań biologicznych podstawowa konfiguracja jest w dużej mierze taka sama, ale mielenie odbywa się w temperaturach kriogenicznych. Wymagało to dostosowania standardowych FIB-SEM do stopni chłodzonych kriogenicznie, które utrzymują stałą temperaturę i niskie wskaźniki zanieczyszczenia powierzchni, a także śluz powietrznych ułatwiających przenoszenie próbek bez dewitryfikacji lub zanieczyszczenia. Transportery próbek zostały również zmodyfikowane, aby umożliwić montaż szeregu różnych nośników wewnątrz krioFIB-SEM, w tym siatek TEM, planszetek i kapilarni. Kilka kluczowych grup badaczy odegrało kluczową rolę w rozwoju tych metod i ciągłym postępie technologicznym w tej dziedzinie7,8,9,10,11,12. Komercyjne rozwiązania są obecnie szerzej dostępne dla biologicznego mielenia FIB w temperaturze kriogenicznej, a mielenie lameli na siatce staje się coraz bardziej rutynowe, biorąc pod uwagę zoptymalizowaną próbkę.

Szereg technik temperatury pokojowej i krioEM może być używany do wizualizacji informacji komórkowych we wszystkich skalach życia, od całych organizmów wielokomórkowych w umiarkowanej rozdzielczości, przez zrozumienie kontekstu złożonych procesów na poziomie komórkowym i jeszcze bardziej szczegółowo, aż po określenie struktur molekularnych in situ13,14,15,16,17,18,19. Klasyczne techniki stosowane w temperaturze pokojowej obejmują sekcje utrwalonych i wybarwionych, osadzonych w żywicy komórek i tkanek za pomocą ultramikrotomii w celu analizy morfologii komórkowej za pomocą TEM (przegląd patrz Studer et al., 200820). Opracowano alternatywne techniki wykorzystujące wtórne rozpraszanie elektronów przez SEM do obrazowania powierzchni bloków zachowanych komórek, przed stopniowym usuwaniem materiału za pomocą noża (obrazowanie czoła bloku szeregowego) lub skupionej wiązki jonów21,22,23. Technika ta została również z powodzeniem wdrożona w temperaturach kriogenicznych (określanych jako obrazowanie krioobjętościowe) za pomocą cryoFIB-SEM na szklistych, niebarwionych blokach komórek lub tkanek24. Alternatywnie, grubsze lamele (o grubości ~15 μm) mogą być frezowane i badane za pomocą obrazowania STEM25. Korzystając z tych technik, całe bloki zawierające wiele komórek mogą być obrazowane w celu zebrania informacji o populacji lub cały narząd/organizm może być obrazowany i zrekonstruowany w 3D. Jednak, aby uzyskać dostęp do informacji molekularnych o wysokiej rozdzielczości z komórek, próbki muszą być zachowane w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego, a zatem muszą być przygotowane w warunkach kriogenicznych. Krioelektronowa mikroskopia skrawków ciała szklistego (CEMOVIS) to technika polegająca na cięciu zamrożonych bloków materiału biologicznego pod wysokim ciśnieniem w warunkach kriogenicznych za pomocą ultramikrotomu. W ten sposób powstają wstęgi kriosekcji (o grubości 40-100 nm)26, które są dołączane do siatki EM i obrazowane w TEM. Jednak fizyczna interakcja noża z próbką ciała szklistego powoduje artefakty szczelinowania i kompresji, które mogą poważnie zniekształcić strukturę komórkową27,28,29,30. Grube sekcje są bardziej podatne na te artefakty, co sprawia, że niepraktyczne jest używanie sekcji grubszych niż ~70 nm26. To ograniczenie znacznie ogranicza widok 3D struktury biologicznej na tomogramie. Mielenie FIB w temperaturach kriogenicznych nie powoduje tych problemów, ale ma swoje własne artefakty spowodowane różnicami w tempie mielenia w różnych częściach próbki, co prowadzi do różnych grubości w lameli - zwanych kurtynami. Problem ten jest łagodzony przez nałożenie powłoki z metaloplatyny nakładanej za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS), który chroni przednią krawędź lameli podczas frezowania31. Górna granica grubości próbki dla mielenia FIB na siatce jest zdefiniowana przez zdolność do zamrożenia próbki metodą zanurzeniową przy jednoczesnym zachowaniu jej szklistej 32, chociaż wraz z wprowadzeniem technik kriogenicznego podnoszenia i dostosowanych nośników próbek dla próbek biologicznych, mielenie FIB może być również stosowane do przetwarzania próbek mrożonych pod wysokim ciśnieniem31,33,34,35. Dodatkowo, próbki zamrożone wgłębnie nie mogą być zbyt cienkie, ponieważ musi być wystarczająco dużo materiału biologicznego, aby wytworzyć blaszkę o rozsądnej wielkości, która zapewni wystarczającą powierzchnię do zebrania serii pochyleń przy wymaganym powiększeniu. Problem ten można złagodzić poprzez mielenie grudek mniejszych komórek, takich jak bakterie lub drożdże. Ostateczna grubość lameli (~100-300 nm) jest zwykle podyktowana integralnością próbki i strategią mielenia. Cieńsze blaszki są lepsze do prac strukturalnych o wysokiej rozdzielczości, takich jak uśrednianie subtomogramowe, ale grubsze blaszki zawierają znacznie większe objętości komórkowe niż można osiągnąć za pomocą CEMOVIS, zapewniając większy kontekst komórkowy w próbce zachowanej niemal natywnie. Mielenie FIB może być również stosowane do rozrzedzania kryształów białek zamrożonych wgłębnie do badań dyfrakcji elektronów36.

Mielenie komórek szklistych jest warte czasu i wysiłku, jeśli pytanie naukowe wymaga wysokiej rozdzielczości szczegółów molekularnych zbliżonych do rodzimych próbek in situ. Dzięki dostępowi do większej liczby urządzeń do rutynowej produkcji lameli, etapem ograniczającym szybkość jest często optymalizacja próbki przed mieleniem, gdzie należy poświęcić czas na upewnienie się, że próbka jest szklista i ma odpowiednią grubość do wytworzenia wytrzymałych i jednolicie cienkich lameli. Opisano tutaj optymalizację próbki pod kątem mielenia FIB zamrożonych wgłębnie ludzkich krwinek czerwonych zakażonych pasożytami Plasmodium falciparum, czynnikiem wywołującym malarię, ale podejście to można dostosować do dowolnej próbki.

Protokół

Ludzka krew została pobrana od anonimowych dawców za pośrednictwem brytyjskiego Krajowego Urzędu Krwi i Transplantacji i jest wykorzystywana w ciągu 2 tygodni od otrzymania. Do jego stosowania nie jest wymagana żadna aprobata etyczna.

1. Przygotowanie i zamrażanie wgłębne czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum

  1. Wyizoluj dojrzałe schizonty przez odwirowanie (1,580 x g) na pożywce o gradientzie gęstości izotonicznej 70% (v/v) (standardowe procedury hodowli bezpłciowych stadiów krwi 3D7 Plasmodium falciparum w ludzkich erytrocytach patrz Blackman M.J., 199537).
  2. Utrwalić wysuszone na powietrzu cienkie warstwy krwi na szkiełku ze 100% metanolem, aby sprawdzić jednorodność morfologiczną schizontów przed barwieniem 10% barwnikiem Giemsa w 6,7 mM buforze fosforanowym o pH 7,1,
    UWAGA: Aby wzbogacić przygotowanie do schizontów zatrzymanych w określonych punktach wyjścia, schizonty mogą być dalej synchronizowane z inhibitorami związku 2 i E64 (patrz Reprezentatywne wyniki i Rysunek 1 dla wyjaśnienia działania tych inhibitorów).
    UWAGA: Plasmodium falciparum jest ludzkim patogenem i może być przenoszony wyłącznie w odpowiednim pomieszczeniu przechowawczym, zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.
  3. Delikatnie odwirować schizonty (240 x g) w celu ich osadzenia i ponownie zawiesić w 2 razy większej objętości osadu komórkowego pożywki RPMI, co daje 50% zawiesinę hematokrytu.
  4. Na ręcznym urządzeniu do zamrażania wgłębnego nałóż 2,5 μl schizontów na węglową stronę rozładowanej jarzeniowej (użyj ustawień jednostki jarzeniowej 60 s, 30 mA w powietrzu, traktując tylko węglową stronę siatki) Siatka miedziana o siatce 200 mesh z 2/4 dziurawą folią węglową i osuszaj przez ~ 20 s z tyłu siatki za pomocą bibuły filtracyjnej klasy 1 z rozdartą krawędzią. Zanurz się w ciekłym ciekłym etanie chłodzonym azotem i przenieś kratki do magazynowania (patrz Tabela materiałów dla sprzętu używanego w tym badaniu).
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a siatki można przechowywać w ciekłym azocie na czas nieokreślony.
    UWAGA: Ciekły azot jest środkiem duszącym i powoduje odmrożenia; Z monitorowaniem tlenu należy obchodzić się ostrożnie w odpowiednim środowisku.
    UWAGA: Ciekły etan powoduje poważne oparzenia i jest łatwopalny; Stosować w dygestoria z dala od źródeł zapłonu.
    UWAGA: Zanurzane mrożone schizonty nie są już opłacalne. Ustalono to, inkubując ludzką krew z kilkoma złotymi siatkami rozmrożonych na powietrzu schizontów zamrożonych wgłębnie i obserwując brak wzrostu pasożyta po kilku dniach, w porównaniu z niezamrożonymi kontrolami. Zamrożone siatki schizontów są zatem bezpieczne do obchodzenia się z nimi poza obiektami przechowawczymi przy użyciu normalnych procedur bezpieczeństwa i odkażania (rękawice, sterylizacja powierzchni/narzędzi przy użyciu >70% etanolu i utylizacja siatek w >70% etanolu).
  5. Przesiewaj siatki za pomocą kriostolika pod mikroskopem świetlnym, zwracając szczególną uwagę na gradient lodu w poprzek siatki. W cieńszych obszarach lodu sprawdź poszczególne kwadraty siatki pod kątem pokrycia komórek.
    UWAGA: Najlepsze kwadraty powinny mieć grubość jednej komórki w środku kwadratu siatki (Rysunek 2). Gwarantuje to, że lamelę można frezować w poprzek środka kwadratu bez uderzania o grubszy lód na krawędziach o pręty siatki. W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a siatki można przechowywać pod ciekłym azotem w nieskończoność. Jeśli komórki zawierają marker fluorescencyjny, siatki mogą być również przesiewane przez cryoCLEM w celu zlokalizowania interesujących pozycji X/Y, które można skorelować z lokalizacjami siatki w krioFIB-SEM w celu bezpośredniego mielenia.

2. Mielenie FIB na siatce zamrożonych komórek wgłębnych

  1. Zaznacz przód obrzeży automatycznej siatki specyficznych dla cryoFIB czarnym, niezmywalnym markerem, aby wskazać środek sekcji przekroju i przeciwną stronę obręczy (Rysunek 3). Ustaw stację klipsowania i przypnij kratki do oznaczonych pierścieni stroną węglową do dołu.
  2. Załaduj siatki do czółenka cryoFIB-SEM (zwykle 2 siatki, w zależności od czółenka) stroną węglową do góry i nałóż platynową warstwę napylaną w atmosferze argonu (5 x 10-2 mbar) (5 mA przez 60 s - grubość jest zmienna) lub powłokę obrotową węglowo-platynową wiązką elektronową (grubość ~4 nm) na powierzchnię komórek.
    UWAGA: Oba rodzaje powłok wspomagają rozpraszanie ładunku podczas obrazowania SEM. Zaletą powlekarki rotacyjnej e-beam jest możliwość określenia dokładnej grubości powłoki.
  3. Załaduj wózek do cryoFIB-SEM i oceń rozkład ogniw w każdej sieci za pomocą SEM przy napięciu 5 kV (13 pA lub 25 pA). Zrób przegląd w małym powiększeniu (~100x), aby spojrzeć na gradienty lodu na siatce. Następnie wykonaj zdjęcia w większym powiększeniu (~5,000x), aby przyjrzeć się poszczególnym kwadratom siatki i zidentyfikować obszary siatki z widocznymi cechami komórkowymi i niskim zanieczyszczeniem powierzchni do zmielenia.
  4. Nałożyć warstwę z żywicy organicznej o grubości >2 μm na powierzchnię każdej siatki za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS). W tym celu włóż igłę GIS do komory nad siatką i podgrzej źródło metaloplatynowca do ustalonej temperatury przez określony czas (na przykład ~27 °C przez 3-10 s), aby wytworzyć przepływ pary.
    UWAGA: Kąt aplikacji, temperatura i czas nakładania powłoki z metaloplatyny za pomocą igły GIS powinny być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować równomierną powłokę. Będzie to zależało od konkretnego zastosowanego krioFIB-SEM (więcej informacji na ten temat można znaleźć w reprezentatywnych wynikach).
  5. Przechyl próbkę tak, aby płaszczyzna siatki znajdowała się ~10° od kąta padania wiązki jonów i przesuń środek odpowiedniego kwadratu siatki, aby był widoczny zarówno na obrazach SEM, jak i FIB.
  6. Zbadaj siatkę za pomocą wiązki jonów o niskim natężeniu prądu (nominalnie 1,5 pA, 30 kV) i przejdź do wystarczająco dużego powiększenia (~7,000x), aby uwidocznić komórki w środku kwadratu siatki. Ustawić ostrość próbki przy pierwszym prądzie mielenia (300 pA) i skorygować astygmatyzm. Dostosuj jasność i kontrast, a następnie zaznacz dwa prostokątne wzory do frezowania, jeden powyżej, a drugi poniżej chronionego obszaru o grubości 3 μm, którego środek jest pożądanym miejscem końcowej blaszki.
    UWAGA: Wybrana szerokość wzorów będzie zależeć od topografii otaczającej warstwy komórek i rozmiaru komórki. 7-20 μm to odpowiednia szerokość dla schizontów, ale szersze lamele potrzebują więcej czasu na frezowanie. Wybrana wysokość wzorów dla pierwszego etapu mielenia zależy od grubości próbki i zaczyna się od około 6 μm; Może być konieczne dostosowanie tego podczas frezowania. Frezowanie odbywa się kierunkowo od zewnętrznej górnej i dolnej krawędzi wzorów w kierunku czoła lameli. Można to zrobić równolegle, gdzie oba wzory są frezowane równolegle lub sekwencyjnie, najpierw usuwając materiał z górnej części lameli, a następnie od spodu.
  7. Rozpocznij frezowanie przy pierwszym prądzie; monitoruj postęp na żywo w widoku wiązki jonów i z przerwami za pomocą SEM (5 kV, 13 lub 25 pA). Sprawdź, czy wiązka jonów przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru. Jeśli nie, zwiększ wysokość prostokątnych wzorów, aby usunąć więcej materiału. Zatrzymaj się, gdy powierzchnia powyżej i poniżej lameli jest całkowicie gładka w widoku wiązki jonów.
    UWAGA: Wiązka jonów przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru, gdy wnętrze prostokątnych wzorów nie zawiera żadnych cech w płaszczyźnie ogniskowej. Niektóre funkcje, takie jak paski siatki, mogą być nieostre w tle.
  8. Zmień na następny prąd mielenia (100 pA); ustaw ostrość i dostosuj jasność/kontrast. Zmniejsz odstęp między dwoma prostokątnymi wzorami do 1,5 μm i zmniejsz wysokość wzoru, aby pokryć tylko niefrezowany materiał. Rozpocznij frezowanie przy nowym prądzie, aż powierzchnia nad i pod lamelą będzie całkowicie gładka.
  9. Powtarzaj ten proces krok po kroku, aż do osiągnięcia grubości 0,3 μm, za każdym razem zmniejszając prąd wiązki jonów zgodnie ze schematem mielenia w tabeli 1.
  10. Frezować kilka lameli (ilość zależy od grubości próbki i dostępnego czasu) na jednej lub obu siatkach do grubości 0,3 μm, zapisać pozycję X/Y/Z każdej lameli i zarezerwować ~1-2 h na koniec sesji na wypolerowanie lameli do ich ostatecznej grubości (60-200 nm).
  11. Zrób przegląd SEM w małym powiększeniu całej siatki i zaplanuj trasę polerowania, zaczynając od lameli z przodu siatki (bliżej źródła wiązki jonów) do lameli z tyłu siatki (najdalej od źródła wiązki jonów) (Rysunek 5).
    UWAGA: Zmniejsza to ponowne osadzanie się ablowanego materiału z powrotem na powierzchni polerowanych lameli.
  12. Zmniejsz odstęp między dwoma prostokątnymi wzorami do 100-200 nm i rozpocznij ostatni etap polerowania przy prądzie wiązki jonów 30 pA. Monitoruj postęp za pomocą SEM przy napięciu 2-3 kV (13 pA, dwell = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s dla pełnej klatki) i przerwij polerowanie, gdy kontrast w blaszce zostanie utracony przez SEM lub gdy powłoka organicoorganiczna samej lameli zaczyna tracić integralność.
  13. Przed usunięciem siatek należy uzyskać obraz SEM całej siatki w małym powiększeniu i zapisać obrazy każdej blaszki. Użyj ich, aby sprawdzić siatkę w dalszej części TEM. Przerwij eksperyment w tym miejscu i przechowuj siatki z lamelami pod ciekłym azotem - obchodź się z nimi ostrożnie.
    UWAGA: Siatki mogą być lekko napylane po wyjęciu z cryoFIB-SEM, co może pomóc w ograniczeniu dryftu i ładowania w TEM przy dużym powiększeniu, ale należy to robić ostrożnie, ponieważ zbyt duża powłoka napylająca może zasłaniać zawartość biologiczną wewnątrz lameli. Na tym etapie możliwe jest przesiewanie lameli pod kątem fluorescencji; Jednak uzyskanie wystarczającej ilości sygnału będzie zależało od obfitości znakowanego białka w grubości blaszki. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z kratkami, aby ograniczyć uszkodzenia lameli i zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni.

3. Akwizycja serii Tilt i ogólny przegląd przetwarzania danych

  1. Załaduj siatki do TEM, wyrównując kierunek frezowania prostopadle do osi pochylenia stolika.
    UWAGA: Wyrównanie siatek odbywa się na oko za pomocą znaczników na obręczy automatycznej siatki. Dopuszczalny jest margines błędu ~10°, w przeciwnym razie ściany wykopu po obu stronach lameli mogą zasłaniać lamelę podczas nachylania siatki.
  2. Zdobądź mapę w małym powiększeniu (~150x) całej siatki i zlokalizuj lamele; następnie zdobądź mapę w średnim powiększeniu (~1,500x, w zależności od wielkości lameli) każdej lameli i zlokalizuj obszary zainteresowania.
  3. Wstępnie przechylić siatkę o ±10°, aby płaszczyzna lameli (nie siatki) była prostopadła do osi optycznej
    UWAGA: Kierunek wstępnego pochylenia można określić na podstawie położenia przedniej krawędzi lameli (szukając pozostałej powłoki metaloorganicznej) na mapach o małym i średnim powiększeniu. W przypadku zastosowanego tutaj TEM siatki wymagają wstępnego pochylenia +10°, jeśli przednie krawędzie lameli są skierowane w górę na mapach, i wymagają wstępnego pochylenia -10°, jeśli są skierowane w dół. Każda siatka może się różnić ze względu na sposób, w jaki zostały pobrane i włożone do automatycznego ładowania.
  4. Uzyskaj symetryczne pod względem dawki tilt-series38 (na przykład od -54° do +54° z krokiem co 3-5°) przy rozmiarze piksela, który pozwala zarówno na pole widzenia, jak i rozdzielczość wymaganą dla obszaru zainteresowania. Używaj zakresu wartości rozmycia od -2 do -5 μm. Zbieraj filmy z 3-10 klatkami w każdym kroku i w tym celu dostosuj te parametry w zależności od rozmiaru piksela, aby uzyskać całkowitą dawkę ~150 e-/Å 2 (dla TEM 300 kV).
    UWAGA: Należy unikać pęknięć w blasze, ponieważ te obszary mogą dryfować. Należy również unikać zanieczyszczenia powierzchni, ponieważ może ono zasłaniać obszar zainteresowania lub obszar ostrości przy dużym nachyleniu.
  5. Animacja filmów jest korygowana za pomocą programu takiego jak MotionCor239. Zastosuj filtr ważenia dawki do poprawionych obrazów (skumulowany e-/image)40 i oszacuj rozmycie każdego obrazu za pomocą programu, takiego jak CTFFIND441.
  6. Użyj wyrównania bez odniesienia (śledzenia łatek) w programie takim jak etomo (IMOD)42, aby obliczyć wyrównanie i relację kątową obrazów w serii pochylenia.
  7. Wprowadź informacje o wyrównaniu i obrocie wraz z wartościami rozmycia do programu, który może zastosować trójwymiarową korekcję CTF, na przykład NovaCTF43. Oblicz skorygowany tomogram, aby uzyskać tomogramy wyjściowe ze współczynnikami kategoryzacji istotnymi dla dalszej analizy.
  8. Przeanalizuj rekonstrukcje i przygotuj się do dalszego przetwarzania, na przykład filtrowania, segmentacji lub uśredniania subtomogramu.

Wyniki

Przygotowanie schizontów P. falciparum do mrożenia gwałtownego
Związek 2 oraz inhibitory E64 są wykorzystywane do zatrzymania schizontów na różnych etapach wyjścia z komórki, co pozwala na uzyskanie wzbogaconej populacji schizontów do dalszych badań. Jest to istotne, ponieważ bez zastosowania komplementarnej techniki korelacyjnej, precyzyjne cięcie konkretnych celów subkomórkowych lub typów komórek jest trudne, gdyż proces ten odbywa się w zasadzie „na ślepo”. Związek 2 jest inhibitorem kinazy białkowej, który zatrzymuje proces wyjścia przed pęknięciem wakuoli. Schizonty można synchronizować w obecności związku 2 przez 4 h, a następnie przemyć podłożem wolnym od związku 2 w celu usunięcia inhibitora; w tym momencie schizonty dojrzeją i opuszczą komórkę po około 30 min. Alternatywnie, schizonty zsynchronizowane związkiem 2 można przemyć i przenieść do E64, nieodwracalnego inhibitora cysteinowych proteaz o szerokim spektrum działania, i inkubować przez około 1 h, aby zatrzymać proces wyjścia po pęknięciu wakuoli, ale przed pęknięciem komórki gospodarza. Morfologię i homogeniczność potraktowanych schizontów należy sprawdzić za pomocą rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy przed mrożeniem gwałtownym (Rysunek 1). Schizonty w obu tych stanach można poddać mrożeniu gwałtownemu zgodnie z metodą opisaną w niniejszej publikacji.

Schemat merozoitów malarii i obrazy mikroskopowe; inwazja krwinki czerwonej, wakuola pasożytnicza.
Rysunek 1: Morfologia schizontów P. falciparum w obecności związku 2 oraz po zahamowaniu przez E64 na rozmazach krwi barwionych metodą Giemsy. (A) W obecności związku 2 wakuola pasożytnicza (PV) jest gęsto wypełniona merozoitami (fioletowe okręgi) z pojedynczą skupiskiem kryształów hemozoiny (ciemnobrązowy okrąg). Granica między PV a otaczającą hemoglobiną w krwince czerwonej gospodarza (hRBC) (szary pas) jest wyraźnie zdefiniowana, podobnie jak błona hRBC. (B) W obecności E64 błona PV jest przerwana, a merozoity są rozproszone wewnątrz hRBC. Każdy schizont nadal zawiera pojedyncze skupisko kryształów hemozoiny. Błona komórki gospodarza jest nieszczelna i częściowo zapadnięta, w związku z czym w obrębie peryferii komórki nie widać hemoglobiny, a granica błony hRBC nie jest łatwo dostrzegalna. Pasek skali: 5 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Optymalizacja szybkiego mrożenia w ciekłym etanie (plunge freezing)
Podczas optymalizacji warunków transferu na błonę przetestowano szereg siatek o różnych rozmiarach otworów dla P. falciparum zainfekowane erytrocyty, w tym na siatkach miedzianych i złotych o gęstości 200 mesh z folią węglową z otworami (holey carbon) o rozmiarach 2/2, 3/3, 3.5/1 i 5/2 (kwadratowe). Miedziane siatki pomocnicze (finder grids) o gęstości 200 mesh z folią węglową z otworami 2/4 zapewniają odpowiednio grubą warstwę komórek do frezowania długich lamel witryfikowanych. Większe lub mniejsze otwory zazwyczaj prowadziły do powstania warstw komórek odpowiednio zbyt cienkich lub zbyt grubych (Rycina 2A-C). Przy zastosowaniu folii węglowej z otworami 2/4, schizonty są przeciągane przez 2 µm otwory poprzez osuszanie siatki od tyłu (od strony bezzwęglowej), w wyniku czego komórki wystają powyżej i poniżej błony węglowej. 4 µm fragment węgla pomiędzy otworami tworzy pas węgla przebiegający przez środek większości otrzymanych lameli, co zwiększa ich wytrzymałość. Siatki typu finder są najodpowiedniejsze do celów korelacyjnych i przesiewowych44należy jednak zadbać o to, aby cyfry/litery w projekcie siatki nie były zbyt duże, ponieważ mogłoby to zablokować obszary przeznaczone do frezowania.

Czas osuszania (blottingu) przy użyciu ręcznego tłoka wynosi około 20 s, jednak dokładny moment zakończenia tej czynności oceniano wizualnie, gdy kropla cieczy wciągana z siatki przestała rozprzestrzeniać się na papierze filtracyjnym. Aby przełamać napięcie powierzchniowe kropli i rozpocząć proces osuszania, konieczne było użycie naderwanego brzegu papieru. W badaniu tym nie wykorzystano zautomatyzowanego mroźnika z tłokiem, lecz rozsądnym punktem wyjścia dla tej próbki byłoby zastosowanie tej samej objętości komórek i rodzaju siatki, co w przypadku tłoka ręcznego, pamiętając o osuszaniu siatek od tyłu w warunkach wysokiej wilgotności (~70%) i temperaturze otoczenia (~25 °C). Czas i warunki osuszania należałoby zoptymalizować pod kątem konkretnego systemu zautomatyzowanego.

Zamrożone siatki z schizontami P. falciparum przesiewano za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w kriostolik, a nie za pomocą TEM, ponieważ próbka nie była przepuszczalna dla elektronów. W przypadku cieńszych próbek siatki można przesiewać za pomocą TEM (atlas całej siatki przy powiększeniu ~150x) przed przeniesieniem próbki do urządzenia cryoFIB-SEM, co może być wymogiem dostępu do placówki krajowej. Szczególną uwagę należy zwrócić na gradient grubości lodu na całej siatce, a także w obrębie poszczególnych kwadratów siatki. Dobrze przygotowane kwadraty siatki powinny mieć grubość jednej komórki lub stykać się z folią węglową w ich centrum (Rysunek 2C). Pozwala to uniknąć frezowania w grubszym lodzie przy prętach siatki wokół krawędzi kwadratu i zapewni, że wiązka jonów przebije się powyżej i poniżej warstwy komórek, tworząc wolną lamellę zamiast klina. Po zoptymalizowaniu powtarzalnych warunków odsączania i zamrażania przez zanurzenie, przesiewanie przed frezowaniem metodą FIB zazwyczaj nie jest już konieczne.

Krioelektronowa tomografia, obrazy mikroskopowe struktury komórkowej, szczegół uchwytu próbek, konfiguracja eksperymentu.
Rysunek 2. Analiza rozmieszczenia komórek na siatkach zamrożonych metodą plunge frozen schizontów P. falciparum przy użyciu kriomikroskopii świetlnej. (A) Przykład zbyt grubego lodu w obrębie pola siatki w kriomikroskopii świetlnej, co przesłania komórki i błonę węglową. Pasek skali, 10 µm. (B) Przykład sytuacji, w której rozmiar otworu (miedziana siatka 300 mesh z dziurkową błoną węglową 5/2) jest zbyt duży dla komórek, co skutkuje bardzo cienką warstwą materiału biologicznego otoczoną pustymi obszarami bez lodu. Takie siatki dają bardzo krótkie, niestabilne lamelki. Pasek skali, 10 µm. (C) Przykład dobrego rozmieszczenia komórek na miedzianej siatce 200-mesh z dziurkową błoną węglową 2/4. Schizonty te zostały potraktowane inhibitorem E64. Duże komórki (czerwona ramka, średnica ~5 µm) z wyraźnie zdefiniowaną peryferią to zainfekowane erytrocyty, które nadal posiadają nienaruszoną błonę wakuoli. Gromady małych komórek (niebieska ramka, ~1 µm) to pojedyncze merozoity zawarte w częściowo zapadniętym erytrocycie gospodarza. Każdy schizont ma czarną plamkę w centrum, wskazującą położenie kryształów hemozoiny (dodatkowe szczegóły patrz Rysunek 1). Różnice w morfologii komórek nie są tak łatwe do zauważenia wewnątrz cryoFIB-SEM; dlatego wstępna analiza za pomocą kriomikroskopii świetlnej jest korzystna do momentu uzyskania powtarzalnych warunków blotowania. Pokrycie komórkami przy krawędziach pola siatki obok prętów siatki (obszary zaznaczone białą przerywaną linią) jest zbyt grube do frezowania. Cieńszy obszar w centrum pola siatki (obszar zaznaczony żółtą przerywaną linią) jest idealnym miejscem do frezowania, co pozwala na wysunięcie lamelki w sąsiednią warstwę komórek. Pasek skali, 6 µm. (D) Obraz krawędzi autosiatki specyficznej dla cryoFIB z dwiema czarnymi oznaczeniami, jednym w sekcji wyciętej (czarny nawias), a drugim po przeciwnej stronie, na godzinie 12 i 6. Czarna strzałka wskazuje kierunek frezowania. (E) Podczas ładowania siatek do kasety autoloadera, oznaczenia muszą znajdować się w równej odległości po obu stronach pęsety ładującej, tak aby lamelki leżały prostopadle do osi nachylenia stolika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zaznaczanie krawędzi autogridów specyficznych dla cryoFIB do tomografii
Zazwyczaj siatki są zaciskane w krawędziach autogridów przed frezowaniem w celu ułatwienia manipulacji i zapewnienia sztywności, co chroni lamelle przed uszkodzeniem podczas kolejnych etapów transferu. Krawędzie autogridów specyficznych dla cryoFIB zostały zaprojektowane z elementem wycięcia, aby ułatwić dostęp do większej powierzchni siatki podczas frezowania. Ważne jest, aby zorientować kierunek frezowania prostopadle do osi nachylenia TEM, tak aby akwizycja serii nachyleń odbywała się poprzez obracanie lamelli wzdłuż jej długości. Zapewnia to, że wysokie ściany rowu otaczającego lamellę nie zasłonią informacji biologicznych podczas przechylania siatki.

Zazwyczaj krawędź autokratki (autogrid) jest znakowana, aby ułatwić wizualne wyrównanie wewnątrz uchwytu cryoFIB-SEM oraz później podczas ładowania do TEM. W przypadku tych próbek naniesiono dwa oznaczenia na godzinie 12 i 6 za pomocą nierozmazywalnego markera (patrz Tabela materiałów), jeden wewnątrz wyciętej sekcji pierścienia zaciskowego, a drugi bezpośrednio naprzeciwko (Rycina 2D). Podczas wprowadzania do TEM (patrz Tabela materiałów), oba oznaczenia powinny być widoczne po obu stronach pęsety ładującej i wyrównane 90° do krawędzi pęsety (Rycina 2E). Należy zauważyć, że producent zaleca wyrównywanie siatek z wykorzystaniem wygrawerowanych kropek na krawędziach autosekcji (autogrid), ponieważ niektóre tusze znajdujące się w pobliżu wiązki jonowej mogą zakłócać proces trawienia.

Przycięte siatki można badać za pomocą mikroskopii świetlnej z wykorzystaniem zmodyfikowanej kasety do stolika kriogenicznego, co pozwala sprawdzić, czy proces przycinania nie uszkodził filmu węglowego siatki. W zależności od kasety z próbkami można również frezować siatki nieprzycięte, jednak podczas przenoszenia z cryoFIB-SEM do TEM należy zachować szczególną ostrożność, aby ograniczyć wyginanie siatki, gdyż może to doprowadzić do złamania lamel. Siatki nieprzycięte można wprowadzać do TEM za pomocą kriouchwytów z wejściem bocznym, istnieje jednak duże prawdopodobieństwo złamania lamel, jeśli przycinanie zostanie wykonane po frezowaniu.

Powlekanie organoplatyną
Powlekanie organoplatyną wykonuje się na jednej lub obu siatkach po ich wprowadzeniu do urządzenia cryoFIB-SEM. Igła systemu wtrysku gazów (GIS) zostaje wprowadzona do komory nad próbką, aby skierować strumień par organoplatyny z podgrzanego źródła na powierzchnię siatki przez określony czas. Pary kondensują na zimnych powierzchniach, tworząc warstwę stałą (o grubości ~2 µm). Integralność tej powłoki jest kluczowa dla umożliwienia frezowania jednorodnie cienkich lamelli. Optymalne warunki nakładania powłoki organoplatynowej są zazwyczaj określane przez producenta urządzenia, jednak nadal może być wymagana pewna optymalizacja. W większości systemów igła GIS jest ustawiona albo blisko kierunku frezowania, albo prostopadle do niego, w zależności od geometrii portów w komorze oraz ograniczeń rotacyjnych stolika. Różne ustawienia można testować poprzez powlekanie siatki, frezowanie niewielkiego obszaru, przechylenie stolika i pomiar grubości powłoki za pomocą SEM.

Oprócz samej konfiguracji urządzenia cryoFIB-SEM, na nakładanie powłoki z platynowców może wpływać szereg innych czynników, w tym 1) topografia próbki, 2) zanieczyszczenia powierzchni na siatce oraz 3) powtarzalność przepływu par z igły GIS. Ponieważ przepływ GIS jest kierunkowy, nierówna topografia może spowodować, że obszary znajdujące się w cieniu komórek lub zanieczyszczenia powierzchni pozostaną niepokryte lub będą miały cieńszą powłokę. Może to doprowadzić do zapadnięcia się warstwy platynowców podczas polerowania (Rycina 3). Przy wyborze obszaru do frezowania należy zwrócić uwagę na otaczającą topografię; na przykład duże zanieczyszczenia powierzchni, skupiska komórek lub odłamki węgla wystające z powierzchni siatki w odległości nawet kilku pól siatki mogą blokować przepływ par, tworząc cień cieńszej warstwy platynowców, co może osłabić lamelę. Dodatkowo należy unikać bardzo małych cząstek zanieczyszczeń powierzchni znajdujących się blisko przedniej krawędzi lameli, ponieważ mogą one odpaść podczas frezowania, pozostawiając osłabiony fragment gołego lodu, co może doprowadzić do powstania otworu w lameli podczas polerowania. W końcu, jeśli frezowanie zostało rozpoczęte, a powłoka z platynowców wydaje się niestabilna, należy powtórzyć proces nakładania powłoki przez dłuższy czas lub przejść do zapasowej siatki.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa pokazująca rozkład nanocząsteczek na fazie organicznej węgla.
Rysunek 3: Wysoka jakość powłoki z platyny organicznej jest kluczowa dla uzyskania cienkich, równomiernie frezowanych lamelli. (A) Mikrograf przedniej krawędzi lamelli, gdzie powłoka z platyny organicznej (OP, żółta) została nałożona zbyt cienko, co doprowadziło do powstania otworu na przedniej krawędzi lamelli podczas polerowania (zielone koło) oraz nierównomiernego frezowania na całej szerokości lamelli (smugi). Powierzchnia platyny organicznej została ścięta przez wiązkę jonową, co spowodowało rozprysk materiału za przednią krawędzią powłoki (żółta przerywana linia). (B) Powłoka z platyny organicznej (OP) została nałożona grubiej, co zaowocowało bardziej równomiernym zwężeniem lamelli. Integralność powłoki jest zachowana na całej szerokości lamelli, a granica między powłoką z platyny organicznej a witryfikowanym materiałem biologicznym jest wyraźnie zdefiniowana (żółta przerywana linia). Warstwa węgla jest widoczna w tylnej części lamelli (pomarańczowa). Paski skali, 1 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Ocena jakości siatek w cryoFIB-SEM oraz proces frezowania
Po przeniesieniu siatek do cryoFIB-SEM za pomocą SEM można sprawdzić integralność błony węglowej oraz rozkład komórek na siatkach (Rycina 4A-C). Gradienty lodu, położenie prętów siatki oraz lokalizacja numerów na siatkach pomocniczych (finder grids) mogą być weryfikowane przy użyciu SEM przy niskim powiększeniu i napięciu 30 kV (Rycina 4B), jednak podczas wyznaczania pozycji frezowania przy dużym powiększeniu i monitorowania procesu frezowania napięcie należy obniżyć do 5 kV, aby zwiększyć kontrast topografii powierzchni.

Analiza krio-mikroskopii elektronowej; obrazy przedstawiają procesy przygotowania siatek i witryfikacji.
Rysunek 4: Ocena jakości siatki i lokalizacja obszarów do frezowania w cryoFIB-SEM. (A) Przegląd siatki przy niskim powiększeniu przy 5 kV za pomocą SEM. Przekrój krawędzi autogrid jest widoczny w dolnej części obrazu. Pasek skali: 0,5 mm. (B) Ta sama siatka przy 30 kV w SEM, pokazująca obszary grubszego lodu (ciemniejsze kwadraty siatki) i cieńszego lodu (jaśniejsze kwadraty siatki). Wstawka pokazuje region w ramce, a strzałki wskazują numerację na siatce orientacyjnej (finder grid), widoczną przy 30 kV. Pasek skali: 0,5 mm. (C) Przegląd dwóch kwadratów siatki przy średnim powiększeniu, służący do oceny rozmieszczenia komórek na błonie węglowej i lokalizacji prętów siatki. Pasek skali: 50 µm. (D) Układ wzorów frezowania dla pierwszego cięcia przy dużym powiększeniu (widok wiązki jonowej przy 1,5 pA i 30 kV). Region czerwony (grubość 3 µm) jest chroniony, natomiast regiony żółte zostaną usunięte przez wiązkę jonową. Biała przerywana linia wskazuje pozycję końcowej lamelli. Pasek skali: 10 µm. (E) Widok przy dużym powiększeniu przy 3 kV za pomocą SEM wypolerowanej lamelli o grubości 200 nm (szerokość 10 µm x długość 15 µm). Utrata kontrastu wewnątrz lamelli przy 3 kV wskazuje, że osiągnięto odpowiednią grubość. Jasnobiała krawędź przednia to pozostała warstwa organoplatyny, która jest nanoszona na siatkę za pomocą GIS przed frezowaniem. Pasek skali: 5 µm. (F) Ta sama lamella z (E) oglądana za pomocą wiązki jonowej przy 30 kV i 1,5 pA. Cienka biała linia przechodząca przez czarny kwadrat (biała strzałka) to pozostała powłoka z organoplatyny na samym przednim brzegu lamelli. Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obszar do frezowania wybiera się poprzez wyznaczenie pary prostokątnych wzorów po obu stronach chronionego obszaru przy dużym powiększeniu (~7 000x dla schizontów) w widoku wiązki jonowej (Rycina 4D). Kluczowe jest, aby w pobliżu obszaru frezowania nie znajdowały się cząstki zanieczyszczeń powierzchniowych, ponieważ mogą one przesłaniać nałożoną ochronną powłokę organoplacynową. Ważne jest również, aby topografia obszaru pozwalała na podparcie krawędzi lamelli po osiągnięciu jej końcowej grubości.

W przypadku schizontów malarii (rozmiar komórki: ~5 µm średnicy x 2 µm grubości, kształt dysku) można frezować lamele o szerokości od 7-20 µm. Jeśli warstwa komórek jest odpowiednio gruba, lamele będą zazwyczaj miały długość ~10-15 µm, obejmując wiele komórek powyżej i poniżej warstwy węglowej (Rysunek 4E-F). Można spodziewać się wyfrezowania 5-10 lameli w ciągu 8-godzinnej sesji (6-7 h frezowania i 1-2 h polerowania). Liczba ta będzie różnić się w zależności od grubości próbki i szerokości lameli, przy czym grubsze próbki i szersze lamele wymagają dłuższego czasu frezowania. Można frezować nawet uszkodzone siatki, ponieważ do wygenerowania zestawu lameli wystarczy zaledwie kilka dobrych pól siatki (Rysunek 5A). Ponadto, jeśli próbka jest cieńsza niż oczekiwano, na przykład z powodu zbyt silnego blotowania lub zmienności hematokrytu w kulturze, krótsze lamele można wyfrezować stosunkowo szybko; jednak ich mniejsza długość ograniczy obszar dostępny do zbierania danych w TEM (Rysunek 5B).

Proces frezowania wiązką skupionego jonu (FIB); obrazy SEM; analiza mikrostruktury; przekrój materiału.
Rycina 5: Określanie momentu osiągnięcia końcowej grubości lamelli podczas frezowania. (A) Przegląd siatki przy niskim powiększeniu wykonany za pomocą SEM przy 5 kV, pokazujący uszkodzenia węglowe podczas przycinania. Obszary nieuszkodzone zawierały bardzo cienką próbkę z powodu nadmiernego osuszania; mimo to w ramach całodniowej sesji na cryoFIBSEM udało się wyfrezować sześć lamelli na tej siatce (obszar wewnątrz białego przerywanego obrysu). Pasek skali, 0,5 mm. (B) Krótka lamella (~10 µm szerokości x 3 µm długości, nie licząc warstwy organoplatyny) wykonana z tej siatki (SEM przy 3 kV), która nadal dostarczyła dwa regiony umożliwiające zebranie serii nachyleń. Pasek skali, 25 µm. (C) Seria obrazów SEM (3 kV) lamelli podczas końcowego etapu polerowania, pokazująca utratę kontrastu w lamelli w miarę jej cieńczenia (ruch od lewej do prawej). Ciemna czarna linia przechodząca przez środek lamelli na wszystkich obrazach to pasek folii węglowej z siatki. Komórki przed tym regionem zostały witryfikowane powyżej folii węglowej, a komórki za tym regionem poniżej folii węglowej. Frezowanie przerwano, gdy powłoka z organoplatyny po lewej stronie przedniej krawędzi lamelli prawie straciła integralność strukturalną. Punkt zatrzymania ten nastąpił przed doprowadzeniem całej lamelli do równomiernej grubości, dlatego w tylnej części lamelli wciąż znajduje się materiał o wyższym kontraście. (D) Przykład ścieżki polerowania w oparciu o lamelle wyfrezowane na siatce pokazanej na (A). Ścieżka polerowania powinna zaczynać się od lamelli znajdujących się bliżej źródła FIB i przesuwać się w kierunku oddalenia od źródła FIB, aby ograniczyć ponowne osadzanie wyfrezowanego materiału na powierzchni lamelli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Podczas polerowania końcowa grubość lamelli zależy od struktury próbki w obszarze trawienia, integralności powłoki z organoplatyny oraz dostępnego czasu. W idealnym przypadku próbkę należy odchudzać do momentu utraty kontrastu na całej powierzchni lamelli w obrazowaniu SEM przy 3 kV, co sugeruje, że jest ona równomiernie przezroczysta dla elektronów i ma grubość około 150-200 nm (Rysunek 5C). Może być jednak konieczne przerwanie trawienia przed tym etapem, jeśli w warstwie organoplatyny pojawi się otwór lub lamella zacznie się wyginać. W takim przypadku lamella może być wciąż wystarczająco cienka z przodu i pozostać użyteczna do tomografii. I odwrotnie, jeśli lamella wydaje się stabilna, możliwe jest dalsze odchudzanie poza etap utraty kontrastu, aby uczynić ją jeszcze cieńszą poprzez przybliżenie wzorów trawienia do siebie (~100 nm lub mniej). Zależne jest to od grubości wymaganej w dalszym etapie procedury. Do zaplanowania ścieżki polerowania wymagany jest obraz SEM o niskim powiększeniu; proces należy rozpocząć bliżej źródła wiązki jonowej i przesuwać się w kierunku przeciwnym (Rysunek 5D). Kierunek ścieżki polerowania jest istotny, aby zapobiec redepozycji materiału ablacyjnego na lamelle, które zostały już obrobione.

Gromadzenie i przetwarzanie danych z serii nachyleń
Po załadowaniu do TEM, montaż całej siatki przy niskim powiększeniu (~150x) pozwoli zidentyfikować położenie lamelli, które można skorelować z obrazem SEM o niskim powiększeniu wykonanym po zakończeniu procesu frezowania. W przypadku schizontów mrożonych metodą plunge-freezing większość siatki nie jest przezroczysta dla elektronów, dlatego położenia lamelli objawiają się jako białe wcięcia na czarnym tle (Rycina 6A). Należy odnotować kąt lamelli względem osi nachylenia mikroskopu, ponieważ odchylenie o więcej niż ~10° od prostopadłości może utrudnić akwizycję serii nachyleń. Montaż o średnim powiększeniu (~1,500x) w miejscu każdej lamelli zapewni przegląd treści biologicznej oraz pozwoli sprawdzić, czy nie doszło do uszkodzeń podczas transferu, czy nie występuje lód krystaliczny lub nadmierne zanieczyszczenie powierzchni (Rycina 6B-D). Należy to sprawdzić również przy dużym nachyleniu, aby upewnić się, że żadne zanieczyszczenia powierzchniowe nie przysłaniają obszaru akwizycji lub ogniskowania. Wybór obszaru akwizycji zależy nie tylko od cech biologicznych, ale także od integralności strukturalnej lodu w obszarze otaczającym; należy na przykład unikać pęknięć, ponieważ obszary te będą dryfować, oraz obszarów z nadmiernym efektem zasłaniania (curtaining), gdzie lamella będzie miała zmienną grubość. Przed rozpoczęciem akwizycji serii nachyleń, do siatki stosuje się wstępne nachylenie (pre-tilt) ±10°, aby płaszczyzna lamelli (a nie siatki) była prostopadła do osi optycznej. Kierunek wstępnego nachylenia można określić na podstawie położenia przedniej krawędzi lamelli (szukając pozostałości powłoki organoplatynowej) na montażu o średnim powiększeniu. W przypadku użytego tutaj TEM (300 kV Titan Krios), jeśli przednie krawędzie lamelli były skierowane w górę na mapie, wymagało to wstępnego nachylenia +10°, a jeśli były skierowane w dół, wymagało to wstępnego nachylenia -10°. Każda siatka może być inna ze względu na orientację, w jakiej została chwycona pęsetą i włożona do autoladera (przekrój skierowany w lewo lub w prawo powoduje obrót o 180°). Ostatnią kwestią jest rozmiar piksela. Rutynowo serie nachyleń zbierane są przy wartościach około 2,5-7 Å/pixel, biorąc pod uwagę rozmiar interesującej cechy, docelową rozdzielczość wynikających z tego danych tomograficznych oraz powierzchnię lamelli, która może ograniczać rozmiar obszaru akwizycji. Możliwe jest zastosowanie mniejszego rozmiaru piksela w celu uzyskania informacji o wysokiej rozdzielczości; najmniejszą wartością, którą z sukcesem zastosowano w tych próbkach, było 1,4 Å/pixel (dane nie przedstawione). Dryf będzie bardziej widoczny przy mniejszym rozmiarze piksela, co jest właściwe jedynie dla cienkich (<100 nm) lamelli, gdzie maksymalizacja rozdzielczości ma kluczowe znaczenie dla badania.

Analiza mikroskopowa materiałów, zdiagramowany schemat przedstawiający komponenty strukturalne (SC, CR).
Rycina 6: Wybór dostępnych obszarów zainteresowania do pozyskania serii pochyleń (A) Fragment mapy TEM przy niskim powiększeniu, pokazujący obszar zawierający lamelle, widoczne jako sześć białych wcięć na czarnym tle (czerwone strzałki). Białe kwadraty to pęknięta błona węglowa. (B) Mapa przy średnim powiększeniu uszkodzonej i odwitrifikowanej lamelli. Na przedniej krawędzi lamelli (FE) powłoka z organoplatyny odprysnęła (1). W centrum lamelli znajduje się wyraźny obszar lodu krystalicznego (2). Wiązka jonów nie zdołała przebić się na tylnej krawędzi lamelli (BE), ponieważ lód w pobliżu prętów siatki jest zbyt gruby. Tylko niewielka część lamelli jest wolna od otaczającego lodu przy BE (3), co tworzy kształt klina. Grubość spowodowała również wycięcie półek nad lamellą (4), co najprawdopodobniej zablokuje widok komórek przy dużym nachyleniu w TEM. (C) Montaż przy średnim powiększeniu całej lamelli widzianej w TEM. Typowe problemy lub obszary, których należy unikać podczas zbierania serii pochyleń z lamelli, to obszary: pokryte zanieczyszczeniami powierzchniowymi (SC), pokryte powłoką z organoplatyny (OP, żółty), w pobliżu pęknięć (CR i czarne strzałki), z efektem „kurtynowania” wynikającym ze zmian gęstości w materiale biologicznym (CU i obszar w niebieskich nawiasach) oraz obszary osłabione przez przerwy w powłoce z organoplatyny (zielone koło). Jedynymi obszarami dostępnymi do pozyskania serii pochyleń są obszary w dwóch czarnych przerywanych ramkach (oznaczonych jako 1 i 2). Widok musi zostać sprawdzony przy dużym nachyleniu, aby upewnić się, że zanieczyszczenia powierzchniowe nie zasłaniają obszaru zainteresowania lub obszaru ostrzenia. (D) Montaż przy średnim powiększeniu znacznie czystszej lamelli, która wciąż posiada pęknięcia (CR) spowodowane pocienieniem powłoki z organoplatyny (zielone koło) podczas polerowania. Tutaj obszar zainteresowania jest wyróżniony przez typ komórek zaobserwowanych w lamelli, którymi w tym przypadku są poszczególne merozoity, znajdujące się za warstwą węglową (pomarańczowy) w stronę tyłu lamelli (czarna przerywana ramka). Paski skali, 3 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krioelektronowa mikroskopia ujawniająca struktury błonowe; schematy podkreślają profile lipidowe.
Rysunek 7: Pozyskiwanie danych cryo-ET z lamelli przygotowanej metodą FIB. (A) Mikrograf obszaru lamelli zawierającego krwinkę czerwona, która została niedawno zainfekowana przez merozoit P. falciparum. Na (B) ten sam obraz jest opisany, aby pokazać granicę krwinki czerwonej (czerwony), szereg dwuściennych pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (fioletowy i niebieski odpowiednio dla błony wewnętrznej i zewnętrznej) oraz merozoit (zielony) otoczony drugą błoną pochodzącą z komórki gospodarza (żółty). Czarna ramka wskazuje obszar, w którym wykonano serię nachyleń (tilt-series). Pasek skali, 500 nm. (C) Średnia z 20 centralnych przekrojów oglądanych w płaszczyźnie XY z tomogramu poddanego binningowi 8x (2,4 Å/pixel) pozyskanego na końcu apikalnym merozoita oraz w (D) jego opis, pokazujący dwie błony otaczające komórkę (zielona i żółta) oraz cztery błony ułożone warstwowo w części apikalnej merozoita (niebieski), które są powiązane z gęstą elektronowo strukturą w kształcie grzyba (fioletowy). Czerwona strzałka wskazuje miejsce połączenia stosów błon w części apikalnej i struktury w kształcie grzyba (pokazano również w części F, i). Czarna strzałka wskazuje zdarzenie fuzji między błoną plazmatyczną merozoita a jednym z wielowarstwowych pęcherzyków wewnątrz pasożyta (pokazano również w części F, ii). Pokazana jest błona krwinki czerwonej gospodarza (czerwony), a czarna przerywana linia wskazuje pozycję przekroju oglądanego w płaszczyźnie XZ, pokazanego w (E). Elementy na przekroju (E) są pokolorowane i opisane tak samo jak w części (D), z kolorowymi strzałkami wskazującymi na błony. Czarna strzałka wskazuje pozycję warstwy naniesionej metodą rozpylania (sputter coat) na lamellę po frezowaniu; zaznaczono również grubość lamelli. Dla części (C-E) pasek skali wynosi 500 nm. (F) Bardziej szczegółowy widok elementów wskazanych czerwonymi i czarnymi grotami strzałek w części (C), pokazujący rozdzielczość dwuwarstw lipidowych w stosie błon w części apikalnej merozoita (i) oraz zdarzenie fuzji między pęcherzykiem wielowarstwowym a błoną plazmatyczną merozoita. Pasek skali, 75 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Głównym celem pracy jest analiza ścieżki wyjścia merozoitów w P. falciparum, jednak ze względu na to, że populacja komórek wykorzystanych w badaniu nigdy nie może być w pełni jednorodna, często obserwowano inne stadia rozwoju komórek w obrębie lamelli. Przykład przedstawiony tutaj (Rysunek 7) zawiera erytrocyt, który został niedawno zainfekowany przez pasożyta P. falciparum (merozoit). Użyta lamella miała grubość 240 nm, a siatka została lekko pokryta platyną metodą rozpylania w atmosferze argonu przed umieszczeniem w TEM, co skutkowało nieco mniejszym kontrastem, niż można by normalnie oczekiwać. Membranę erytrocyta można było prześledzić w całości, otaczającą komórkę. Wewnątrz erytrocyta znajdowały się trzy zamknięte struktury ograniczone błoną: dwa pęcherzyki, z których każdy był otoczony podwójną membraną, oraz struktura w kształcie żarówki (1,2 μm x 0,9 μm w najszerszych częściach), co jest spójne z budową merozoita (Rysunek 7A-B). Zawartość obu pęcherzyków wydawała się mieć podobny kontrast co zawartość erytrocyta, co sugeruje, że pęcherzyki te mogą zawierać hemoglobinę. Obecność pęcherzyków wewnątrz gospodarza erytrocyta po inwazji była obserwowana wcześniej45. Uważa się, że powstają one w wyniku sekrecji lipidów i innych czynników wirulencji z organelli wydzielniczych zwanych rhoptriami w merozoicie, które uwalniają ich zawartość do czerwonej krwinki gospodarza podczas inwazji. Merozoit jest otoczony dwiema ściśle powiązanymi membranami: najbardziej wewnętrzna jest prawdopodobnie rodzimą błoną plazmatyczną merozoita, na której nie widać powłoki powierzchniowej, a najbardziej zewnętrzna musi pochodzić z błony erytrocyta gospodarza, która otacza merozoita podczas inwazji. Cytoplazma merozoita zawiera wiele wielowarstwowych pęcherzyków oraz elektronogęstą strukturę w kształcie grzyba, sąsiadującą ze stosem membran w części apikalnej. Seria przechyłów nabyta w tym obszarze (2,4 Å/pixel) pokazuje, że zawiera ona stos czterech membran, które wydają się być połączone ze strukturą w kształcie grzyba (Rysunek 7C-E). Uderzające jest to, że morfologia ta znacząco różni się od normalnego układu organelli i struktur komórkowych w części apikalnej dojrzałego merozoita. Aby to ocenić, uzyskano porównawczą serię przechyłów (2,74 Å/pixel) nad końcem apikalnym dojrzałego merozoita z schizonta, który został poddany działaniu E64 przed mrożeniem szokowym i frezowaniem (Rysunek 8). Pokazuje to, że koniec apikalny merozoita zawiera dwie wyraźne, maczugowate organelle wydzielnicze zwane rhoptriami, umieszczone w zestawie trzech pierścieni polarnych w wierzchołku apikalnym komórki i otoczone liczbą mniejszych organelli wydzielniczych zwanych mikronemami. Najbardziej wewnętrzny pierścień polarny jest przytwierdzony do struktury podwójnej błony znajdującej się pod błoną plazmatyczną merozoita, zwanej wewnętrznym kompleksem błonowym (IMC), który zawiera białka motorowe napędzające inwazję. Wykazano, że podczas inwazji zawartość organelli wydzielniczych jest uwalniana na powierzchnię merozoita i do erytrocyta gospodarza, co ułatwia przytwierdzenie merozoitów do czerwonych krwinek gospodarza i inicjuje kompleks motorowy napędzający inwazję45. Przedstawione tutaj dane pokazują, że po inwazji merozoit nie zawiera obserwowalnych struktur przypominających rhoptrie, mikronemy lub pierścienie polarne, co sugeruje, że morfologia końca apikalnego merozoita zmienia się drastycznie. Fuzja rhoptri przed inwazją została wykazana wcześniej za pomocą TEM w sekcjach utrwalonych w temperaturze pokojowej46, co jest spójne z powstaniem struktury w kształcie grzyba, którą obserwujemy w merozoicie w stanie po inwazji. Stosy membran połączone z tą strukturą nie były wcześniej obserwowane i ponieważ nie ma oznak obecności IMC w nowo zainfekowanym merozoicie, hipotezujemy, że stosy błon mogą być pozostałościami aparatury IMC pozostałymi po zakończeniu inwazji, jednak wymaga to jeszcze potwierdzenia.

Schematy ultrastruktury komórki i mikrografie przedstawiające organelle związane z inwazją merozoitów.
Rycina 8: Koniec apikalny dojrzałych merozoitów w obrazowaniu cryo-ET lamelli przygotowanej metodą FIB oraz w TEM przekrojów w plastiku. (A) Średnia z 20 centralnych przekrojów z tomogramu o binowaniu 8x (2,74 Å/pixel) z lamelli o grubości 230 nm, ukazująca typową morfologię końca apikalnego dojrzałego merozoitu. Schizonty zostały potraktowane E64 przed zamrażaniem w ciekłym etanie, w związku z czym błona PV pękła, a merozoity znajdują się wewnątrz erytrocyta gospodarza. (B) obraz przedstawia to samo co w (A), ale z oznaczeniami wskazującymi błonę erytrocyta gospodarza (RCM, czerwona), błonę plazmatyczną merozoitu (zielona), kompleks błony wewnętrznej (IMC, fioletowa), pierścienie polarne (PR, czarne), mikronemy (M, żółte), rhoptry (R, szare) oraz otoczkę jądrową (NE, niebieska). Sąsiedni merozoit, znajdujący się poza płaszczyzną w tym regionie tomogramu, został zaznaczony zielonym trójkątem. Pasek skali, 200 nm. (C) Cechy komórkowe zaobserwowane w cryo-ET są zgodne z cechami widocznymi w TEM schizontów utrwalonych w przekrojach w plastiku. Podobne cechy komórkowe zaznaczono w dojrzałym merozicie ze schizontu potraktowanego związkiem 2, co zatrzymało proces wyjścia przed pęknięciem błony PV. Pasek skali, 500 nm. (D) Opisany schemat merozoitu przedstawiający cechy komórkowe ukazane w częściach (A-C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Grubość obszaru chronionego pomiędzy prostokątnymi wzorami frezowania (µm)Nominalny prąd wiązki jonowej (pA) przy 30 kV
3300
1.5100
0.7550
0.330
0,2 - 0,06 (polerowanie końcowe)30*

Tabela 1: Strategia frezowania w celu wytworzenia cienkiej lamelli. Frezowanie etapowe przeprowadza się poprzez redukcję prądu wiązki jonowej zgodnie z grubością obszaru chronionego. Ogranicza to nagrzewanie próbki, zapobiegając dewitryfikacji. *Polerowanie powinno być wykonywane równolegle, aby równomiernie rozprowadzić ciepło na lamelle z obu stron, co zmniejsza ryzyko ich wyginania lub łukowania w miarę osiągania ostatecznej grubości. Pozostałe etapy mogą być wykonywane sekwencyjnie: najpierw frezowanie wzoru powyżej lamelli, a następnie poniżej, przed przejściem do następnego natężenia prądu wiązki. Przegląd siatki w celu ustalenia pozycji frezowania powinien być przeprowadzany przy prądzie wiązki 1,5 pA, aby zminimalizować nagrzewanie próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Podczas gdy mielenie krioFIB staje się coraz bardziej rutynowe, przygotowanie optymalnych próbek do mielenia nie; w związku z tym większość krytycznych etapów w tym protokole ma miejsce, zanim próbka dotrze do cryoFIB-SEM. Optymalizacja próbki poprzez wiele rund przygotowania komórek, zamrażanie wgłębne oraz przesiewanie za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej jest wymagana w celu uzyskania najlepszej możliwej próbki przed próbą mielenia. Posiadanie najlepszej możliwej próbki nie tylko zwiększa szanse na sukces, ale także optymalizuje wykorzystanie sprzętu. Z tego powodu większość krajowych zakładów wymaga dowodu, że przed przyznaniem czasu na ich maszynach przeprowadzono wystarczającą optymalizację. Po wejściu do cryoFIB-SEM maksymalizacja skuteczności powłoki z metaloorganicznej platyny ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia jednolicie cienkich blaszek. Wreszcie, cierpliwość i dobre obchodzenie się z próbką jest umiejętnością niezbędną od użytkownika, który będzie musiał siedzieć przez wiele dni produkując, a następnie przenosząc siatki zawierające delikatne blaszki. Może się to zmienić wraz z wprowadzeniem zautomatyzowanych strategii mielenia47,48, ale jak dotąd cały proces mielenia w większości zakładów jest nadal w dużej mierze ręczny.

Chociaż prace koncentrowały się wyłącznie na P. falciparum schizonts, przedstawioną tutaj metodę można łatwo zmodyfikować w celu optymalizacji przygotowania siatki i mielenia dla innych typów komórek. Ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, są gęstość komórek nakładanych na siatkę, rodzaj siatki (miedź jest toksyczna dla niektórych komórek), rozmiar i odstępy między otworami w folii węglowej, czas blottingu oraz metoda blottingu (jednostronna/dwustronna, ręczna lub automatyczna). Dodatkowo, jeśli komórki są hodowane na siatkach (zwykle złotych siatkach z dziurawym filmem węglowym), zbieganie można sprawdzić za pomocą mikroskopii świetlnej przed osuszeniem i zamrożeniem. Strategia mielenia zależy od tego, w jaki sposób komórki są osadzane na siatce. W przypadku czerwonych krwinek zakażonych malarią siatka jest zasadniczo pokryta nieprzerwaną warstwą komórek, grubszą w niektórych obszarach i cieńszą w innych. Mielenie odbywa się w wielu punktach w jednym regionie wzdłuż tego gradientu, gdzie grubość lodu generuje blaszki o odpowiedniej wielkości dla tomografii. Takie podejście działa dobrze w przypadku mniejszych komórek, ponieważ można wytworzyć blaszki zawierające plasterek przez wiele komórek. W przypadku większych komórek lub skupisk komórek może się zdarzyć, że jedna komórka lub zlepek komórek może wytworzyć jedną blaszkę.

Obsługa siatki i transfer próbek pozostają jednym z głównych wyzwań tego przepływu pracy. Lamele mogą zostać utracone z powodu pęknięć lub pęknięć, artefaktów kurtynowych zasłaniających biologię, nadmiernego zanieczyszczenia powierzchni, a także problemów z orientacją siatki w TEM, co wymaga dodatkowego kroku w celu zmiany położenia siatki. Stopień strat różni się w zależności od dnia na dzień i od sieci do sieci, ale z czasem ulega poprawie dzięki praktyce i doświadczeniu w obsłudze. W tym badaniu stwierdzono, że kratki mogą być wielokrotnie ostrożnie orientowane w automatycznej ładowarce bez niszczenia lameli, co czasami ma tę zaletę, że zmywa lód powierzchniowy. Innym głównym ograniczeniem tego przepływu pracy jest czas potrzebny na wyprodukowanie lameli. Ponieważ produkcja jest powolna, bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednio zoptymalizowaną próbkę, dzięki której mielenie będzie tak wydajne, jak to tylko możliwe.

W ostatnim czasie wprowadzono szereg adaptacji do mielenia FIB szklistych próbek biologicznych. Przełomem jest zastosowanie w komorze cryoFIB-SEM chłodzonych kriogenicznie narzędzi do wyciągania, które umożliwiają mielenie większych bloków materiału z zamrożonych próbek pod wysokim ciśnieniem. Bloki można przymocować do metalowego pręta lub podnieść w chwytaku i przesunąć do drugiej pozycji próbki, zawierającej specjalnie zmodyfikowaną siatkę EM. Bloki można następnie pokryć ognioorganicznymi platynami i zmielić w celu wytworzenia lameli. Zdolność do mielenia blaszek z zamrożonego materiału pod wysokim ciśnieniem oznacza, że można przetwarzać znacznie większe komórki i tkanki, w szczególności celując w obszary za pomocą korelacyjnej mikroskopii fluorescencyjnej12. Inne niedawne adaptacje metody mielenia FIB obejmują redukcję artefaktów kurtyny poprzez wstępne mielenie klinowe próbki16, kriofiksację mikroprzepływową49 oraz fotomikrowzorcowanie siatek mikroskopii elektronowej w celu poprawy rozmieszczenia komórek50. Wykazano również, że frezowanie szczelin mikrodylatacyjnych po obu stronach blaszki może złagodzić ściskanie przez otaczającą próbkę, gdy osiąga ona swoją końcową cienkość51. Może to być szczególnie przydatne podczas frezowania ciągłych warstw komórek, takich jak próbka w tym badaniu, gdzie czasami obserwuje się wyginanie lameli podczas końcowego etapu polerowania.

Przyszłością mikroskopii elektronowej będzie prawdopodobnie oznaczanie struktur molekularnych in situ za pomocą uśredniania subtomogramowego, a mielenie FIB jest ważnym narzędziem, które ułatwi produkcję szklistych próbek biologicznych dla tego typu przepływów pracy. Podczas gdy mielenie FIB jest wciąż w powijakach dla zastosowań biologicznych, rozwój metod odbywa się w szybkim tempie dzięki ciężkiej pracy naukowców, zarówno akademickich, jak i w ośrodkach krajowych, a także komercyjnym inwestycjom w rozwój technologii cryoFIB-SEM w celu wspierania badań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane w całości lub w części przez Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję CC BY na podstawie praw autorskich do każdej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez Autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Ten projekt, dla którego ta metoda została opracowana, został sfinansowany z grantu Rady Badań Medycznych MR/P010288/1 przyznanego Helen R. Saibil, Rolandowi A. Fleckowi i Michaelowi J. Blackmanowi. Kultury P. falciparum zostały wyhodowane w Instytucie Francisa Cricka, przy wsparciu członków grupy Michaela J. Blackmana. Autorzy chcieliby podziękować dr Ser Ying (Michele) Tan za dostarczenie obrazów schizontów traktowanych związkiem 2 i E64 w cienkich rozmazach krwi. Większość lameli została wyprodukowana przy wsparciu pracowników eBIC i jesteśmy wdzięczni za dostęp do dwuwiązkowego krioFIB-SEM Scios w ramach projektu badawczego NT21004. Autorzy doceniają również wsparcie programu stypendialnego Royal Society Industry Fellowship (INF\R2\202061) w kontynuowaniu rozwoju techniki mielenia FIB w ramach CUI. Autorzy chcieliby również podziękować Helen R. Saibil za użyteczne dyskusje w odniesieniu do tej pracy metodologicznej i nadzór nad projektem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
c-clipsThermo Fisher Scientific1036171
Stacja do przycinaniaThermo Fisher Scientificn/aBezpośrednia wycena z Thermo
Clipping stationSub-angstromCSA-01
Związek 2n/an/aZsyntetyzowany przez dr Simona A. Osborne'a,
LifeArc Cryo-FIB specyficzne dla obręczy z automatyczną siatkąThermo Fisher Scientific
E64SigmaE3132
Emitech K100X jednostka wyładowcza jarzeniowaKworumn/a
Gibco RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific12633012Preparat stosowany do hodowli jest wykonany na zamówienie (REF 041-91762 A) i zawiera Albumax, glutaminę, HEPES i suplementy hipoksantyny
Giemsa StainVWR International350864X
Szkiełkaszklane Thermo Fisher Scientific11562203
Skrzynki rusztoweSub-angstromPBDo kratek przyciętych
Skrzynki kratoweThermo Fisher Scientificn/aDo kratek przyciętych - bezpośrednia wycena z Thermo Fisher Scientific
Skrzynki siatkoweAgar ScientificAGG3727
Domowa ręczna zamrażarka wgłębnan/anie dotyczyZ izolowanym zbiornikiem etanowym (pianka o dużej gęstości) i kąpielą w ciekłym azocie (polistyren) na blacie stołu w obiekcie przechowawczym.
Krew ludzkaniedotyczy nie dotyczybrytyjskiej Narodowej Służby Krwi i Transplantacji
JEOL 4700F Z JSM z systemem chłodzenia stopnia Leica VCT500JEOLn/aFIB-SEM
Leica EM ACE600 z kriostopniem VCT500Leicabeznapylania napylającego
Leica EM ACE900Leican/apowlekarka rotacyjna z wiązką elektroniczną. W pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
Stolik kriogeniczny Linkam do mikroskopu świetlnegoLinkamModel nr. CMS196Kasety do siatek przyciętych i nieprzyciętych. W pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
MetanolSigma179957
Mikroskop świetlny Nikon Eclipse E200Nikonn/aze stolikiem kriogenicznym Linkam w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
PercollVWR International17-0891-01Roztwór do poduszki perkolu to 35 ml 10 ml PBS, 150 ml RPMI 1640 media i 315 ml Percoll
Quantifoil miedź 200 mesh 2/4 dziurawy węgiel Siatki EM FinderQuantifoilN1-C17nCuH2-01100 sztuk
Quantifoil miedź 200 mesh 2/4 dziurawe siatki węglowe EMQuantifoilN1-C17nCu20-01100 sztuk
Komora przygotowawcza Quorum PP3010 Quorumnie dotyczynapylarki
Scios dwubelkowej wyposażonej w stopień transferowy Quorum PP3010.FEIn/aFIB-SEM
Staedtler Lumocolor cienki marker permanentnyViking DirectND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEMThermo Fisher Scientificn/aTEM wyposażony w kamerę K2 lub K3.
Bibuła filtracyjna Whatmann grade 1SigmaWHA1001150
Mikroskop świetlny Zeiss Axio Scope A1Zeissn/aze stolikiem kriogenicznym Linkam w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
1205101

Bibliografia

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601(2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173(2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885(2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528(2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), Tokyo. 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, Pt 2 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer. Berlin Heidelberg. 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, Academic Press. London, UK. 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 - anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488(2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286(2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133(2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389(2019).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography
Posted by JoVE Editors on 9/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. The Authors section was updated from:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

to:

Claudine Bisson1,2
Corey W. Hecksel3,4
James B. Gilchrist3
M. Alejandra Carbajal1
Roland A. Fleck1
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

Tagi

Przygotowanie lamelli kriogenicznejdwuwi zkowy mikroskop elektronowysiatki mro one metod plunge freezingskupiona wi zka jon wPlasmodium falciparumkrwinki czerwonepow oka organoplatynowatransmisyjny mikroskop elektronowyu rednianie subtomogram w
Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.