Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Podsumowanie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Streszczenie

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania krio-lameli z zamrożonych siatek ludzkich erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum, który można łatwo zaadaptować do innych próbek biologicznych. Podstawowe zasady przygotowywania próbek, mielenia i oglądania lameli są wspólne dla wszystkich przyrządów, a protokół może być przestrzegany jako ogólny przewodnik po przygotowaniu kriolameli w sieci do mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) i tomografii krioelektronowej (cryoET). Siatki mikroskopii elektronowej podtrzymujące komórki są zamrażane wgłębnie w ciekłym etanie chłodzonym azotem za pomocą ręcznej lub automatycznej zamrażarki wgłębnej, a następnie poddawane badaniom przesiewowym pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kriostolik. Zamrożone siatki są przenoszone do krioskaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w skupioną wiązkę jonów (cryoFIB-SEM). Siatki są rutynowo napylane przed frezowaniem, co pomaga w rozpraszaniu nagromadzonego ładunku podczas mielenia. Alternatywnie można użyć powlekarki rotacyjnej z wiązką elektroniczną do nałożenia warstwy węglowo-platynowej na kratki, której dokładna grubość może być dokładniej kontrolowana. Po wejściu do krioFIB-SEM na powierzchnię siatki nakładana jest dodatkowa powłoka ze związku platynowca organicznego za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS). Warstwa ta chroni przednią krawędź lameli podczas frezowania, której integralność ma kluczowe znaczenie dla uzyskania jednolicie cienkich lameli. Obszary zainteresowania są identyfikowane za pomocą SEM, a mielenie odbywa się w sposób krokowy, zmniejszając prąd wiązki jonów, gdy blaszka osiąga przezroczystość elektronów, aby uniknąć nadmiernego wytwarzania ciepła. Siatka z wieloma lamelami jest następnie przenoszona do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) w warunkach kriogenicznych w celu akwizycji serii pochylenia. Solidny i wolny od zanieczyszczeń przepływ pracy w zakresie przygotowania lameli jest niezbędnym krokiem dla dalszych technik, w tym krioEMU komórkowego, cryoET i uśredniania subtomogramowego. Rozwój tych technik, zwłaszcza w zakresie wyjmowania i mielenia zamrożonych próbek pod wysokim ciśnieniem, ma wysoki priorytet w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Tylko zawartość komórkowa próbek biologicznych o grubości <500 nm może być skutecznie zobrazowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w temperaturach kriogenicznych, ograniczając zakres próbek do wirusów, prokariontów, prostych organizmów jednokomórkowych i cieńszych regionów większych komórek eukariotycznych¹. Mielenie skupionej wiązki jonów (FIB) w siatce umożliwia rozrzedzanie grubszych próbek biologicznych zamrażanych wgłębnie do przezroczystych blaszek elektronowych w temperaturach kriogenicznych (< -150 °C). Powstałe blaszki są następnie przenoszone do TEM w celu wizualizacji i gromadzenia danych tomograficznych, umożliwiając rekonstrukcje 3D w wysokiej rozdzielczości cech komórkowych i molekularnych wewnątrz komórek (przeglądy patrz Rigort et al., 2012², Oikonomou et al., 2016³, oraz Wagner et al., 2020⁴).

Mielenie FIB wywodzi się z dziedziny materiałoznawstwa, gdzie próbki są rutynowo rozrzedzane, aby przygotować je do dalszej analizy⁵. Odbywa się to w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), który ma dwie kolumny optyczne: konwencjonalną optykę skaningowego mikroskopu elektronowego i drugą kolumnę zawierającą optykę zdolną do generowania i precyzyjnego kontrolowania skupionej wiązki jonów (FIB) - zwanej FIB-SEM. Pozwala to na ablację określonego obszaru próbki przez jony generowane przez źródło galu, usuwając nadmiar materiału i pozostawiając blaszkę⁶. Proces mielenia jest prowadzony przez obrazowanie SEM topografii próbki, które służy do lokalizowania obszarów zainteresowania i monitorowania postępu mielenia. W przypadku zastosowań biologicznych podstawowa konfiguracja jest w dużej mierze taka sama, ale mielenie odbywa się w temperaturach kriogenicznych. Wymagało to dostosowania standardowych FIB-SEM do stopni chłodzonych kriogenicznie, które utrzymują stałą temperaturę i niskie wskaźniki zanieczyszczenia powierzchni, a także śluz powietrznych ułatwiających przenoszenie próbek bez dewitryfikacji lub zanieczyszczenia. Transportery próbek zostały również zmodyfikowane, aby umożliwić montaż szeregu różnych nośników wewnątrz krioFIB-SEM, w tym siatek TEM, planszetek i kapilarni. Kilka kluczowych grup badaczy odegrało kluczową rolę w rozwoju tych metod i ciągłym postępie technologicznym w tej dziedzinie^{7,8,9,10,11,12}. Komercyjne rozwiązania są obecnie szerzej dostępne dla biologicznego mielenia FIB w temperaturze kriogenicznej, a mielenie lameli na siatce staje się coraz bardziej rutynowe, biorąc pod uwagę zoptymalizowaną próbkę.

Szereg technik temperatury pokojowej i krioEM może być używany do wizualizacji informacji komórkowych we wszystkich skalach życia, od całych organizmów wielokomórkowych w umiarkowanej rozdzielczości, przez zrozumienie kontekstu złożonych procesów na poziomie komórkowym i jeszcze bardziej szczegółowo, aż po określenie struktur molekularnych in situ^{13,14,15,16,17,18,19}. Klasyczne techniki stosowane w temperaturze pokojowej obejmują sekcje utrwalonych i wybarwionych, osadzonych w żywicy komórek i tkanek za pomocą ultramikrotomii w celu analizy morfologii komórkowej za pomocą TEM (przegląd patrz Studer et al., 2008²⁰). Opracowano alternatywne techniki wykorzystujące wtórne rozpraszanie elektronów przez SEM do obrazowania powierzchni bloków zachowanych komórek, przed stopniowym usuwaniem materiału za pomocą noża (obrazowanie czoła bloku szeregowego) lub skupionej wiązki jonów^21,22,23. Technika ta została również z powodzeniem wdrożona w temperaturach kriogenicznych (określanych jako obrazowanie krioobjętościowe) za pomocą cryoFIB-SEM na szklistych, niebarwionych blokach komórek lub tkanek²⁴. Alternatywnie, grubsze lamele (o grubości ~15 μm) mogą być frezowane i badane za pomocą obrazowania STEM²⁵. Korzystając z tych technik, całe bloki zawierające wiele komórek mogą być obrazowane w celu zebrania informacji o populacji lub cały narząd/organizm może być obrazowany i zrekonstruowany w 3D. Jednak, aby uzyskać dostęp do informacji molekularnych o wysokiej rozdzielczości z komórek, próbki muszą być zachowane w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego, a zatem muszą być przygotowane w warunkach kriogenicznych. Krioelektronowa mikroskopia skrawków ciała szklistego (CEMOVIS) to technika polegająca na cięciu zamrożonych bloków materiału biologicznego pod wysokim ciśnieniem w warunkach kriogenicznych za pomocą ultramikrotomu. W ten sposób powstają wstęgi kriosekcji (o grubości 40-100 nm)²⁶, które są dołączane do siatki EM i obrazowane w TEM. Jednak fizyczna interakcja noża z próbką ciała szklistego powoduje artefakty szczelinowania i kompresji, które mogą poważnie zniekształcić strukturę komórkową^27,28,29,30. Grube sekcje są bardziej podatne na te artefakty, co sprawia, że niepraktyczne jest używanie sekcji grubszych niż ~70 nm²⁶. To ograniczenie znacznie ogranicza widok 3D struktury biologicznej na tomogramie. Mielenie FIB w temperaturach kriogenicznych nie powoduje tych problemów, ale ma swoje własne artefakty spowodowane różnicami w tempie mielenia w różnych częściach próbki, co prowadzi do różnych grubości w lameli - zwanych kurtynami. Problem ten jest łagodzony przez nałożenie powłoki z metaloplatyny nakładanej za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS), który chroni przednią krawędź lameli podczas frezowania³¹. Górna granica grubości próbki dla mielenia FIB na siatce jest zdefiniowana przez zdolność do zamrożenia próbki metodą zanurzeniową przy jednoczesnym zachowaniu jej szklistej ³², chociaż wraz z wprowadzeniem technik kriogenicznego podnoszenia i dostosowanych nośników próbek dla próbek biologicznych, mielenie FIB może być również stosowane do przetwarzania próbek mrożonych pod wysokim ciśnieniem^31,33,34,35. Dodatkowo, próbki zamrożone wgłębnie nie mogą być zbyt cienkie, ponieważ musi być wystarczająco dużo materiału biologicznego, aby wytworzyć blaszkę o rozsądnej wielkości, która zapewni wystarczającą powierzchnię do zebrania serii pochyleń przy wymaganym powiększeniu. Problem ten można złagodzić poprzez mielenie grudek mniejszych komórek, takich jak bakterie lub drożdże. Ostateczna grubość lameli (~100-300 nm) jest zwykle podyktowana integralnością próbki i strategią mielenia. Cieńsze blaszki są lepsze do prac strukturalnych o wysokiej rozdzielczości, takich jak uśrednianie subtomogramowe, ale grubsze blaszki zawierają znacznie większe objętości komórkowe niż można osiągnąć za pomocą CEMOVIS, zapewniając większy kontekst komórkowy w próbce zachowanej niemal natywnie. Mielenie FIB może być również stosowane do rozrzedzania kryształów białek zamrożonych wgłębnie do badań dyfrakcji elektronów³⁶.

Mielenie komórek szklistych jest warte czasu i wysiłku, jeśli pytanie naukowe wymaga wysokiej rozdzielczości szczegółów molekularnych zbliżonych do rodzimych próbek in situ. Dzięki dostępowi do większej liczby urządzeń do rutynowej produkcji lameli, etapem ograniczającym szybkość jest często optymalizacja próbki przed mieleniem, gdzie należy poświęcić czas na upewnienie się, że próbka jest szklista i ma odpowiednią grubość do wytworzenia wytrzymałych i jednolicie cienkich lameli. Opisano tutaj optymalizację próbki pod kątem mielenia FIB zamrożonych wgłębnie ludzkich krwinek czerwonych zakażonych pasożytami Plasmodium falciparum, czynnikiem wywołującym malarię, ale podejście to można dostosować do dowolnej próbki.

Protokół

Ludzka krew została pobrana od anonimowych dawców za pośrednictwem brytyjskiego Krajowego Urzędu Krwi i Transplantacji i jest wykorzystywana w ciągu 2 tygodni od otrzymania. Do jego stosowania nie jest wymagana żadna aprobata etyczna.

1. Przygotowanie i zamrażanie wgłębne czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum

1. Wyizoluj dojrzałe schizonty przez odwirowanie (1,580 x g) na pożywce o gradientzie gęstości izotonicznej 70% (v/v) (standardowe procedury hodowli bezpłciowych stadiów krwi 3D7 Plasmodium falciparum w ludzkich erytrocytach patrz Blackman M.J., 1995³⁷).
2. Utrwalić wysuszone na powietrzu cienkie warstwy krwi na szkiełku ze 100% metanolem, aby sprawdzić jednorodność morfologiczną schizontów przed barwieniem 10% barwnikiem Giemsa w 6,7 mM buforze fosforanowym o pH 7,1,
   UWAGA: Aby wzbogacić przygotowanie do schizontów zatrzymanych w określonych punktach wyjścia, schizonty mogą być dalej synchronizowane z inhibitorami związku 2 i E64 (patrz Reprezentatywne wyniki i Rysunek 1 dla wyjaśnienia działania tych inhibitorów).
   UWAGA: Plasmodium falciparum jest ludzkim patogenem i może być przenoszony wyłącznie w odpowiednim pomieszczeniu przechowawczym, zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.
3. Delikatnie odwirować schizonty (240 x g) w celu ich osadzenia i ponownie zawiesić w 2 razy większej objętości osadu komórkowego pożywki RPMI, co daje 50% zawiesinę hematokrytu.
4. Na ręcznym urządzeniu do zamrażania wgłębnego nałóż 2,5 μl schizontów na węglową stronę rozładowanej jarzeniowej (użyj ustawień jednostki jarzeniowej 60 s, 30 mA w powietrzu, traktując tylko węglową stronę siatki) Siatka miedziana o siatce 200 mesh z 2/4 dziurawą folią węglową i osuszaj przez ~ 20 s z tyłu siatki za pomocą bibuły filtracyjnej klasy 1 z rozdartą krawędzią. Zanurz się w ciekłym ciekłym etanie chłodzonym azotem i przenieś kratki do magazynowania (patrz Tabela materiałów dla sprzętu używanego w tym badaniu).
   UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a siatki można przechowywać w ciekłym azocie na czas nieokreślony.
   UWAGA: Ciekły azot jest środkiem duszącym i powoduje odmrożenia; Z monitorowaniem tlenu należy obchodzić się ostrożnie w odpowiednim środowisku.
   UWAGA: Ciekły etan powoduje poważne oparzenia i jest łatwopalny; Stosować w dygestoria z dala od źródeł zapłonu.
   UWAGA: Zanurzane mrożone schizonty nie są już opłacalne. Ustalono to, inkubując ludzką krew z kilkoma złotymi siatkami rozmrożonych na powietrzu schizontów zamrożonych wgłębnie i obserwując brak wzrostu pasożyta po kilku dniach, w porównaniu z niezamrożonymi kontrolami. Zamrożone siatki schizontów są zatem bezpieczne do obchodzenia się z nimi poza obiektami przechowawczymi przy użyciu normalnych procedur bezpieczeństwa i odkażania (rękawice, sterylizacja powierzchni/narzędzi przy użyciu >70% etanolu i utylizacja siatek w >70% etanolu).
5. Przesiewaj siatki za pomocą kriostolika pod mikroskopem świetlnym, zwracając szczególną uwagę na gradient lodu w poprzek siatki. W cieńszych obszarach lodu sprawdź poszczególne kwadraty siatki pod kątem pokrycia komórek.
   UWAGA: Najlepsze kwadraty powinny mieć grubość jednej komórki w środku kwadratu siatki (Rysunek 2). Gwarantuje to, że lamelę można frezować w poprzek środka kwadratu bez uderzania o grubszy lód na krawędziach o pręty siatki. W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a siatki można przechowywać pod ciekłym azotem w nieskończoność. Jeśli komórki zawierają marker fluorescencyjny, siatki mogą być również przesiewane przez cryoCLEM w celu zlokalizowania interesujących pozycji X/Y, które można skorelować z lokalizacjami siatki w krioFIB-SEM w celu bezpośredniego mielenia.

2. Mielenie FIB na siatce zamrożonych komórek wgłębnych

1. Zaznacz przód obrzeży automatycznej siatki specyficznych dla cryoFIB czarnym, niezmywalnym markerem, aby wskazać środek sekcji przekroju i przeciwną stronę obręczy (Rysunek 3). Ustaw stację klipsowania i przypnij kratki do oznaczonych pierścieni stroną węglową do dołu.
2. Załaduj siatki do czółenka cryoFIB-SEM (zwykle 2 siatki, w zależności od czółenka) stroną węglową do góry i nałóż platynową warstwę napylaną w atmosferze argonu (5 x ^10-2 mbar) (5 mA przez 60 s - grubość jest zmienna) lub powłokę obrotową węglowo-platynową wiązką elektronową (grubość ~4 nm) na powierzchnię komórek.
   UWAGA: Oba rodzaje powłok wspomagają rozpraszanie ładunku podczas obrazowania SEM. Zaletą powlekarki rotacyjnej e-beam jest możliwość określenia dokładnej grubości powłoki.
3. Załaduj wózek do cryoFIB-SEM i oceń rozkład ogniw w każdej sieci za pomocą SEM przy napięciu 5 kV (13 pA lub 25 pA). Zrób przegląd w małym powiększeniu (~100x), aby spojrzeć na gradienty lodu na siatce. Następnie wykonaj zdjęcia w większym powiększeniu (~5,000x), aby przyjrzeć się poszczególnym kwadratom siatki i zidentyfikować obszary siatki z widocznymi cechami komórkowymi i niskim zanieczyszczeniem powierzchni do zmielenia.
4. Nałożyć warstwę z żywicy organicznej o grubości >2 μm na powierzchnię każdej siatki za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS). W tym celu włóż igłę GIS do komory nad siatką i podgrzej źródło metaloplatynowca do ustalonej temperatury przez określony czas (na przykład ~27 °C przez 3-10 s), aby wytworzyć przepływ pary.
   UWAGA: Kąt aplikacji, temperatura i czas nakładania powłoki z metaloplatyny za pomocą igły GIS powinny być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować równomierną powłokę. Będzie to zależało od konkretnego zastosowanego krioFIB-SEM (więcej informacji na ten temat można znaleźć w reprezentatywnych wynikach).
5. Przechyl próbkę tak, aby płaszczyzna siatki znajdowała się ~10° od kąta padania wiązki jonów i przesuń środek odpowiedniego kwadratu siatki, aby był widoczny zarówno na obrazach SEM, jak i FIB.
6. Zbadaj siatkę za pomocą wiązki jonów o niskim natężeniu prądu (nominalnie 1,5 pA, 30 kV) i przejdź do wystarczająco dużego powiększenia (~7,000x), aby uwidocznić komórki w środku kwadratu siatki. Ustawić ostrość próbki przy pierwszym prądzie mielenia (300 pA) i skorygować astygmatyzm. Dostosuj jasność i kontrast, a następnie zaznacz dwa prostokątne wzory do frezowania, jeden powyżej, a drugi poniżej chronionego obszaru o grubości 3 μm, którego środek jest pożądanym miejscem końcowej blaszki.
   UWAGA: Wybrana szerokość wzorów będzie zależeć od topografii otaczającej warstwy komórek i rozmiaru komórki. 7-20 μm to odpowiednia szerokość dla schizontów, ale szersze lamele potrzebują więcej czasu na frezowanie. Wybrana wysokość wzorów dla pierwszego etapu mielenia zależy od grubości próbki i zaczyna się od około 6 μm; Może być konieczne dostosowanie tego podczas frezowania. Frezowanie odbywa się kierunkowo od zewnętrznej górnej i dolnej krawędzi wzorów w kierunku czoła lameli. Można to zrobić równolegle, gdzie oba wzory są frezowane równolegle lub sekwencyjnie, najpierw usuwając materiał z górnej części lameli, a następnie od spodu.
7. Rozpocznij frezowanie przy pierwszym prądzie; monitoruj postęp na żywo w widoku wiązki jonów i z przerwami za pomocą SEM (5 kV, 13 lub 25 pA). Sprawdź, czy wiązka jonów przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru. Jeśli nie, zwiększ wysokość prostokątnych wzorów, aby usunąć więcej materiału. Zatrzymaj się, gdy powierzchnia powyżej i poniżej lameli jest całkowicie gładka w widoku wiązki jonów.
   UWAGA: Wiązka jonów przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru, gdy wnętrze prostokątnych wzorów nie zawiera żadnych cech w płaszczyźnie ogniskowej. Niektóre funkcje, takie jak paski siatki, mogą być nieostre w tle.
8. Zmień na następny prąd mielenia (100 pA); ustaw ostrość i dostosuj jasność/kontrast. Zmniejsz odstęp między dwoma prostokątnymi wzorami do 1,5 μm i zmniejsz wysokość wzoru, aby pokryć tylko niefrezowany materiał. Rozpocznij frezowanie przy nowym prądzie, aż powierzchnia nad i pod lamelą będzie całkowicie gładka.
9. Powtarzaj ten proces krok po kroku, aż do osiągnięcia grubości 0,3 μm, za każdym razem zmniejszając prąd wiązki jonów zgodnie ze schematem mielenia w tabeli 1.
10. Frezować kilka lameli (ilość zależy od grubości próbki i dostępnego czasu) na jednej lub obu siatkach do grubości 0,3 μm, zapisać pozycję X/Y/Z każdej lameli i zarezerwować ~1-2 h na koniec sesji na wypolerowanie lameli do ich ostatecznej grubości (60-200 nm).
11. Zrób przegląd SEM w małym powiększeniu całej siatki i zaplanuj trasę polerowania, zaczynając od lameli z przodu siatki (bliżej źródła wiązki jonów) do lameli z tyłu siatki (najdalej od źródła wiązki jonów) (Rysunek 5).
    UWAGA: Zmniejsza to ponowne osadzanie się ablowanego materiału z powrotem na powierzchni polerowanych lameli.
12. Zmniejsz odstęp między dwoma prostokątnymi wzorami do 100-200 nm i rozpocznij ostatni etap polerowania przy prądzie wiązki jonów 30 pA. Monitoruj postęp za pomocą SEM przy napięciu 2-3 kV (13 pA, dwell = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s dla pełnej klatki) i przerwij polerowanie, gdy kontrast w blaszce zostanie utracony przez SEM lub gdy powłoka organicoorganiczna samej lameli zaczyna tracić integralność.
13. Przed usunięciem siatek należy uzyskać obraz SEM całej siatki w małym powiększeniu i zapisać obrazy każdej blaszki. Użyj ich, aby sprawdzić siatkę w dalszej części TEM. Przerwij eksperyment w tym miejscu i przechowuj siatki z lamelami pod ciekłym azotem - obchodź się z nimi ostrożnie.
    UWAGA: Siatki mogą być lekko napylane po wyjęciu z cryoFIB-SEM, co może pomóc w ograniczeniu dryftu i ładowania w TEM przy dużym powiększeniu, ale należy to robić ostrożnie, ponieważ zbyt duża powłoka napylająca może zasłaniać zawartość biologiczną wewnątrz lameli. Na tym etapie możliwe jest przesiewanie lameli pod kątem fluorescencji; Jednak uzyskanie wystarczającej ilości sygnału będzie zależało od obfitości znakowanego białka w grubości blaszki. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z kratkami, aby ograniczyć uszkodzenia lameli i zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni.

3. Akwizycja serii Tilt i ogólny przegląd przetwarzania danych

1. Załaduj siatki do TEM, wyrównując kierunek frezowania prostopadle do osi pochylenia stolika.
   UWAGA: Wyrównanie siatek odbywa się na oko za pomocą znaczników na obręczy automatycznej siatki. Dopuszczalny jest margines błędu ~10°, w przeciwnym razie ściany wykopu po obu stronach lameli mogą zasłaniać lamelę podczas nachylania siatki.
2. Zdobądź mapę w małym powiększeniu (~150x) całej siatki i zlokalizuj lamele; następnie zdobądź mapę w średnim powiększeniu (~1,500x, w zależności od wielkości lameli) każdej lameli i zlokalizuj obszary zainteresowania.
3. Wstępnie przechylić siatkę o ±10°, aby płaszczyzna lameli (nie siatki) była prostopadła do osi optycznej
   UWAGA: Kierunek wstępnego pochylenia można określić na podstawie położenia przedniej krawędzi lameli (szukając pozostałej powłoki metaloorganicznej) na mapach o małym i średnim powiększeniu. W przypadku zastosowanego tutaj TEM siatki wymagają wstępnego pochylenia +10°, jeśli przednie krawędzie lameli są skierowane w górę na mapach, i wymagają wstępnego pochylenia -10°, jeśli są skierowane w dół. Każda siatka może się różnić ze względu na sposób, w jaki zostały pobrane i włożone do automatycznego ładowania.
4. Uzyskaj symetryczne pod względem dawki tilt-series³⁸ (na przykład od -54° do +54° z krokiem co 3-5°) przy rozmiarze piksela, który pozwala zarówno na pole widzenia, jak i rozdzielczość wymaganą dla obszaru zainteresowania. Używaj zakresu wartości rozmycia od -2 do -5 μm. Zbieraj filmy z 3-10 klatkami w każdym kroku i w tym celu dostosuj te parametry w zależności od rozmiaru piksela, aby uzyskać całkowitą dawkę ~150 e^-/^{Å 2} (dla TEM 300 kV).
   UWAGA: Należy unikać pęknięć w blasze, ponieważ te obszary mogą dryfować. Należy również unikać zanieczyszczenia powierzchni, ponieważ może ono zasłaniać obszar zainteresowania lub obszar ostrości przy dużym nachyleniu.
5. Animacja filmów jest korygowana za pomocą programu takiego jak MotionCor2³⁹. Zastosuj filtr ważenia dawki do poprawionych obrazów (skumulowany e^-/image)⁴⁰ i oszacuj rozmycie każdego obrazu za pomocą programu, takiego jak CTFFIND4⁴¹.
6. Użyj wyrównania bez odniesienia (śledzenia łatek) w programie takim jak etomo (IMOD)⁴², aby obliczyć wyrównanie i relację kątową obrazów w serii pochylenia.
7. Wprowadź informacje o wyrównaniu i obrocie wraz z wartościami rozmycia do programu, który może zastosować trójwymiarową korekcję CTF, na przykład NovaCTF⁴³. Oblicz skorygowany tomogram, aby uzyskać tomogramy wyjściowe ze współczynnikami kategoryzacji istotnymi dla dalszej analizy.
8. Przeanalizuj rekonstrukcje i przygotuj się do dalszego przetwarzania, na przykład filtrowania, segmentacji lub uśredniania subtomogramu.

Wyniki

Przygotowanie P. falciparum schizonts do zamrażania wgłębnego
Inhibitory związków 2 i E64 są stosowane do zatrzymywania schizontów na różnych etapach wychodzenia, generując wzbogaconą populację schizontów do dalszych badań. Jest to ważne, ponieważ bez komplementarnej techniki korelacyjnej mielenie określonych celów subkomórkowych lub typów komórek jest trudne, ponieważ proces ten jest zasadniczo ślepy. Związek 2 jest inhibitorem kinazy białkowej, który hamuje wyjście przed pęknięciem wakuoli. Schizonty mogą być synchronizowane na związku 2 przez 4 godziny, a następnie przemywane pożywką wolną od związku 2 w celu usunięcia inhibitora, w którym to momencie schizonty dojrzeją i wyjdą po około 30 minutach. Alternatywnie, zsynchronizowane schizonty związku 2 można przemyć do E64, nieodwracalnego inhibitora proteazy cysteinowej o szerokim spektrum działania, i inkubować przez około 1 godzinę, aby zatrzymać wyjście po punkcie pęknięcia wakuoli, ale przed pęknięciem komórki gospodarza. Morfologię i jednorodność leczonych schizontów należy sprawdzić za pomocą rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy przed zamrożeniem wgłębnym (Ryc. 1). Schizontowie mogą być zamrożeni w każdym z tych stanów za pomocą metody opisanej w tej publikacji.

Rysunek 1: Morfologia schizontów P. falciparum schizontów złożonych 2 i E64 przez rozmazy krwi zabarwione Giemsą. (A) W obecności związku 2 parazytoforyczna wakuola (PV) jest gęsto upakowana merozoitami (fioletowymi kręgami) z pojedynczym skupiskiem kryształów hemozyiny (ciemnobrązowe kółko). Granica między PV a otaczającą hemoglobiną w czerwonych krwinkach gospodarza (hRBC) (szary pasek) jest dobrze określona, podobnie jak błona hRBC. (B) W obecności E64 membrana PV ulega rozerwaniu, a merozoity rozprzestrzeniają się w hRBC. Każdy schizont nadal zawiera pojedynczy klaster kryształów hemozyozy. Błona komórkowa gospodarza jest nieszczelna i częściowo zapadnięta, dlatego na obrzeżach komórki nie jest widoczna hemoglobina, a granica błony hRBC nie jest łatwo widoczna. Podziałka liniowa, 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Optymalizacja zamrażania wgłębnego
Podczas optymalizacji warunków blottingu dla czerwonych krwinek zakażonych P. falciparum przetestowano szereg siatek z otworami o różnych rozmiarach, w tym 2/2, 3/3, 3,5/1 i 5/2 (kwadratowy) dziurawy węgiel na siatkach ze złota i miedzi 200. Miedziane siatki szukacza o siatce 200 z 2/4 dziurawą folią węglową zapewniają odpowiednio grubą warstwę komórek do mielenia długich szklistych blaszek. Większe lub mniejsze zazwyczaj powodowały, że warstwy komórek były odpowiednio zbyt cienkie lub grube (Rysunek 2A-C). W przypadku węgla o średnicy 2/4 otworu, schizonty są przeciągane przez otwory o średnicy 2 μm poprzez osuszanie siatki od tyłu (strona niewęglowa), co powoduje, że komórki wystają ponad i poniżej warstwy węglowej. Odcinek węgla o grubości 4 μm między otworami powoduje, że pasek węgla biegnie przez środek większości powstałych lameli, co zwiększa wytrzymałość. Siatki szukacza są najbardziej odpowiednie do celów korelacyjnych i przesiewowych⁴⁴, ale należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że cyfry/litery w projekcie siatki nie są zbyt duże, ponieważ spowoduje to zablokowanie obszarów do frezowania.

Czas blottingu na ręcznym tłoku wynosi około 20 s, ale dokładny moment, w którym należy zatrzymać blot, był oceniany wzrokowo, kiedy kropla cieczy pobierana z siatki przestała rozchodzić się na bibule filtracyjnej. Potrzebna była rozdarta krawędź, aby przełamać napięcie powierzchniowe kropli, aby rozpocząć proces blottingu. W tym badaniu nie użyto automatycznej zamrażarki wgłębnej, ale rozsądnym punktem wyjścia dla tej próbki byłoby użycie tej samej objętości komórek i typu siatki, co w przypadku tłoka ręcznego, upewniając się, że kratki są osuszane od tyłu w warunkach wysokiej wilgotności (~70%) i temperatury otoczenia (~25 °C). Czasy i warunki blottingu musiałyby być zoptymalizowane pod kątem konkretnego zastosowanego systemu automatycznego.

Zanurzone zamrożone siatki schizontów P. falciparum zostały przebadane przez mikroskop świetlny wyposażony w kriostolik, a nie przez TEM, ponieważ próbka nie była przenoszona na elektrony. W przypadku cieńszych próbek, siatki mogą być przesiewane za pomocą TEM (cały atlas siatki przy ~150-krotnym powiększeniu) przed przeniesieniem próbki do cryoFIB-SEM, co może być warunkiem wstępnym dostępu do krajowego obiektu. Szczególną uwagę należy zwrócić na gradient grubości lodu w poprzek siatki, a także w obrębie poszczególnych kwadratów siatki. Dobre kwadraty siatki powinny mieć grubość jednej komórki lub uderzać w folię węglową w ich środku (Rysunek 2C). Pozwala to uniknąć mielenia grubszego lodu na prętach siatki wokół krawędzi kwadratu siatki i zapewni, że wiązka jonów przebije się powyżej i poniżej warstwy komórek, tworząc wolną blaszkę, a nie klin. Po zoptymalizowaniu powtarzalnych warunków blottingu i zamrażania wgłębnego, przesiewanie zwykle nie jest już konieczne przed frezowaniem FIB.

Rysunek 2. Analiza rozmieszczenia komórek na siatkach zamrożonych schizontów P. falciparum za pomocą mikroskopii krioświetlnej. (A) Przykład zbyt grubego lodu w poprzek kwadratu siatki pod mikroskopią krioświetlną, zasłaniającego komórki i film węglowy. Podziałka, 10 μm. (B) Przykład rozmiaru otworu (siatka miedziana o oczkach 300 z 5/2 kwadratową dziurawą folią węglową) jest zbyt duży dla komórek, co skutkuje bardzo cienką warstwą materiału biologicznego otoczoną pustymi obszarami bez lodu. Siatki takie jak ta wytwarzają bardzo krótkie, niestabilne blaszki. Podziałka, 10 μm. (C) Przykład dobrego rozmieszczenia ogniw na siatce miedzianej o siatce 200 z 2/4 dziurawą warstwą węglową. Schizony te leczono inhibitorem E64. Duże komórki (czerwona skrzynka, średnica ~5 μm) z dobrze zdefiniowanym obwodem to zakażone czerwone krwinki, które nadal mają nienaruszoną błonę wakuoli. Skupiska małych komórek (niebieska ramka, ~1 μm) to pojedyncze merozoity zawarte w częściowo zapadniętej czerwonej krwince gospodarza. Każdy schizont ma w środku czarną plamkę, wskazującą położenie kryształów hemozyny (Zobacz Rysunek 1, aby uzyskać dodatkowe szczegóły). Różnica w morfologii komórek nie jest tak łatwa do zauważenia po wejściu do cryoFIB-SEM; Dlatego wstępne badania przesiewowe za pomocą mikroskopii krioświetlnej są korzystne do momentu osiągnięcia powtarzalnych warunków blottingu. Pokrycie komórek wokół krawędzi kwadratu siatki obok pasków siatki (obszary z białymi przerywanymi) jest zbyt grube do frezowania. Cieńszy obszar w środku kwadratu siatki (obszar z żółtymi przerywakami) jest idealnym miejscem do frezowania, przedłużając blaszkę do otaczającej warstwy komórek. Podziałka skali, 6 μm. (D) Obraz obręczy automatycznej siatki specyficznej dla cryoFIB z dwoma czarnymi znakami, jednym w sekcji przekroju (nawias), a drugim naprzeciwko, na godzinie 12 i 6. strzałka reprezentuje kierunek frezowania. (E) Gdy siatki są ładowane do kasety automatycznego podajnika, znaczniki muszą znajdować się w równej odległości po obu stronach pęsety ładującej, co powoduje, że lamele leżą prostopadle do osi nachylenia stolika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oznaczanie felg autogrid specyficznych dla krioFIB do tomografii
Zazwyczaj kratki są wpinane w obrzeża automatycznej siatki przed frezowaniem, aby ułatwić obsługę i zapewnić sztywność, co chroni lamele przed uszkodzeniem podczas kolejnych etapów przenoszenia. Specyficzne dla CryoFIB obręcze z automatyczną siatką zostały zaprojektowane z funkcją wycinania, aby ułatwić dostęp do większej części powierzchni siatki podczas frezowania. Ważne jest, aby ustawić kierunek frezowania prostopadle do osi przechyłu TEM, tak aby akwizycja serii przechyłu przebiegała poprzez obracanie lameli wzdłuż jej długości. Dzięki temu wysokie ściany wykopu otaczające lamelę nie zasłaniają informacji biologicznej podczas przechylania siatki.

Zazwyczaj, obręcz automatycznej siatki jest oznaczona, aby pomóc w wizualnym wyrównaniu w wozisku cryoFIB-SEM, a później podczas ładowania TEM. W przypadku tych próbek na godzinie 12 i 6 nałożono dwa znaki nieusuwalnym markerem (patrz Tabela materiałów), jeden w środku przekroju pierścienia zaciskowego, a drugi dokładnie naprzeciwko (Rysunek 2D). Podczas ładowania do TEM (patrz Tabela Materiałów), oba znaki powinny być widoczne po obu stronach pęsety ładującej i wyrównane pod kątem 90° do krawędzi pęsety (Rysunek 2E). Należy zauważyć, że producent zaleca wyrównywanie siatek za pomocą wygrawerowanych kropek na obręczach automatycznej siatki, ponieważ niektóre atramenty znajdujące się w pobliżu wiązki jonów mogą zakłócać frezowanie.

Ścięte siatki mogą być badane za pomocą mikroskopii świetlnej z zmodyfikowaną kasetą do krioetapu, co może być korzystne dla sprawdzenia, czy proces przycinania nie zniszczył warstwy węglowej siatki. W zależności od kasety na próbkę, nieprzycięte siatki mogą być również mielone, ale należy zachować szczególną ostrożność podczas przenoszenia z krioFIB-SEM do TEM, aby ograniczyć jakiekolwiek zginanie siatki, ponieważ spowoduje to pęknięcie blaszek. Nieprzycięte kratki mogą być ładowane do TEM za pomocą uchwytów kriogenicznych z bocznym wejściem, ale istnieje duże prawdopodobieństwo, że lamele zostaną złamane, jeśli przycinanie zostanie przeprowadzone po mieleniu.

Powłoka z metaloorganicznej powłoki
Powlekanie ognioorganiczne odbywa się na jednej lub obu siatkach po ich załadowaniu do krioFIB-SEM. Iglicę systemu wtrysku gazu (GIS) wprowadza się do komory nad próbką w celu skierowania przepływu pary metaloorganicznej platyny po powierzchni siatki z podgrzanego źródła na określony czas. Para skrapla się na zimnych powierzchniach i tworzy stałą warstwę (o grubości ~2 μm). Integralność tej powłoki ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia frezowania jednolicie cienkich lameli. Optymalne warunki aplikacji powłoki z metaloplatyny są zwykle z góry określone przez producenta urządzenia, ale nadal może być wymagana pewna optymalizacja. Większość systemów ustawia igłę GIS blisko kierunku frezowania lub prostopadle do kierunku frezowania, w zależności od geometrii portów w komorze i granic obrotu stolika. Różne ustawienia można wypróbować, pokrywając siatkę, frezując mały obszar, przechylając stolik i mierząc grubość powłoki za pomocą SEM.

Oprócz samej konfiguracji cryoFIB-SEM, wiele innych czynników może wpływać na nakładanie powłoki organiczno-platynowej w tym: 1) topografia próbki, 2) zanieczyszczenie powierzchni siatki i 3) powtarzalność przepływu pary z igły GIS. Ponieważ przepływ GIS jest kierunkowy, nierówna topografia może spowodować, że obszary w cieniu komórek lub zanieczyszczenia powierzchniowe nie zostaną pokryte powłoką lub będą miały cieńszą powłokę. Może to prowadzić do zapadnięcia się warstwy metaloorganicznej podczas polerowania (Rysunek 3). Wybierając obszar do mielenia, należy zwrócić uwagę na otaczającą topografię, na przykład duże zanieczyszczenie powierzchni, grudki komórek lub połamany węgiel, które wystają z powierzchni siatki na odległość kilku kwadratów siatki, mogą blokować przepływ pary, tworząc cień cieńszej metaloorganicznej platyny, który może osłabić blaszkę. Ponadto należy również unikać bardzo małych cząstek zanieczyszczeń powierzchniowych w pobliżu przedniej krawędzi lameli, ponieważ mogą one odskakiwać podczas frezowania, pozostawiając osłabioną plamę gołego lodu, która może spowodować powstanie w lameli podczas polerowania. Na koniec, jeśli rozpoczęło się mielenie, a powłoka z metaloplatyny wygląda na niestabilną, pokryj ją ponownie, na dłużej lub zamień na siatkę zapasową.

Rysunek 3: Dobrej jakości powłoka z organoplatyny jest niezbędna do uzyskania cienkich, równomiernie zmielonych blaszek. (A) Mikrofotografia przedniej krawędzi blaszki, na której powłoka z metaloplatyny (OP, żółta) została nałożona zbyt cienko, co doprowadziło do powstania w przedniej krawędzi blaszki, która powstała podczas polerowania (zielone kółko) i nierównomiernego frezowania na całej szerokości blaszki (smugi). Powierzchnia metaloorganicznej plastyki została odcięta przez wiązkę jonów, co doprowadziło do rozpylenia materiału za przednią krawędzią powłoki (żółta linia przerywana). (B) Powłoka organiczna (OP) została nałożona grubo, co spowodowało bardziej równomiernie rozcieńczoną blaszkę. Integralność okrywy jest zachowana na całej szerokości blaszki, a granica między otoczką organoplatynową a zeszklonym materiałem biologicznym jest dobrze zaznaczona (linia żółta przerywana). Warstwę węgla można zobaczyć biegnącą przez tylną część lameli (kolor pomarańczowy). Podziałka liniowa, 1 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ocena jakości siatki w cryoFIB-SEM i procesie mielenia
Po przeniesieniu siatek do cryoFIB-SEM integralność filmu węglowego i rozmieszczenie komórek na siatkach może być przesiewane przez SEM (Rysunek 4A-C). Gradienty lodu, pozycje prętów siatki i położenie numerów siatek na siatkach szukacza można sprawdzić za pomocą SEM w małym powiększeniu przy napięciu 30 kV (Rysunek 4B), ale napięcie powinno zostać zmniejszone z powrotem do 5 kV podczas lokalizowania pozycji frezowania przy dużym powiększeniu i monitorowaniu procesu mielenia, aby zwiększyć kontrast z topografią powierzchni.

Rysunek 4: Ocena jakości sieci i lokalizacja obszarów do mielenia w cryoFIB-SEM. (A) Przegląd sieci o napięciu 5 kV w małym powiększeniu za pośrednictwem SEM. Przekrój obręczy automatycznej siatki jest widoczny u dołu obrazu. Podziałka liniowa, 0,5 mm. (B) Ta sama siatka przy napięciu 30 kV według SEM, pokazująca obszary grubszego lodu (ciemniejsze kwadraty siatki) i cieńszego lodu (jaśniejsze kwadraty siatki). Wstawka pokazuje region w polu, ze strzałkami wskazującymi numerację na siatce szukacza, która jest widoczna przy 30 kV. Podziałka liniowa, 0,5 mm. (C) Przegląd dwóch kwadratów siatki w średnim powiększeniu, oceniający rozmieszczenie komórek na folii węglowej i położenie prętów siatki. Podziałka liniowa, 50 μm. (D) Układ wzorów frezowania dla pierwszego cięcia przy dużym powiększeniu (widok wiązki jonów przy 1,5 pA i 30 kV). Czerwony obszar (o grubości 3 μm) jest chroniony, podczas gdy żółty obszar zostanie usunięty przez wiązkę jonów. Biała przerywana linia wskazuje położenie końcowej blaszki. Podziałka liniowa, 10 μm. (E) Widok w dużym powiększeniu przy napięciu 3 kV za pomocą SEM polerowanej lameli o grubości 200 nm (10 μm szerokości x 15 μm długości). Utrata kontrastu w obrębie lameli przy napięciu 3 kV wskazuje, że została osiągnięta odpowiednia grubość. Jasnobiała przednia krawędź to pozostała warstwa organiczno-platynowa, która jest nakładana na siatkę za pomocą GIS przed frezowaniem. Podziałka, 5 μm. (F) Ta sama blaszka z (E) oglądana przy użyciu wiązki jonów przy napięciu 30 kV i natężeniu 1,5 pA. Cienka biała linia w poprzek czarnego kwadratu (biała strzałka) to pozostała powłoka organiczno-platynowa na samej przedniej krawędzi blaszki. Podziałka skali, 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Region do frezowania jest wybierany poprzez ułożenie pary prostokątnych wzorów po obu stronach chronionego obszaru przy dużym powiększeniu (~7,000x dla schizontów) w widoku wiązki jonów (Rysunek 4D). Bardzo ważne jest, aby w pobliżu obszaru mielenia nie znajdowały się żadne cząstki zanieczyszczeń powierzchniowych, ponieważ mogły one utrudnić nałożenie ochronnej powłoki z metaloplatyny. Ważne jest również, aby topografia regionu była odpowiednia do podparcia boków lameli po osiągnięciu jej ostatecznej grubości.

Dla schizontów malarycznych (rozmiar komórki: ~5 μm średnicy x 2 μm grubości, kształt dysku) można frezować blaszki o szerokości 7-20 μm. Jeśli warstwa komórek jest odpowiednio gruba, blaszki zwykle osiągają długość ~10-15 μm, przechwytując wiele komórek powyżej i poniżej warstwy węgla (Rysunek 4E-F). Można się spodziewać frezowania 5-10 lameli w ciągu 8 godzin sesji (6-7 godzin frezowania i 1-2 godziny polerowania). Będzie się to różnić w zależności od grubości próbki i szerokości lameli, przy czym grubsze próbki i szersze lamele potrzebują więcej czasu na mielenie. Nawet uszkodzone siatki mogą być frezowane, ponieważ wymaga to tylko kilku dobrych kwadratów siatki, aby wygenerować zestaw lameli (Rysunek 5A). Dodatkowo, jeśli próbka jest cieńsza niż oczekiwano, na przykład z powodu nadmiernego blottingu lub zmian hematokrytu hodowli, krótsze blaszki można stosunkowo szybko zmielić; jednak ich krótsza długość ograniczy obszar dostępny do zbierania danych w TEM (Rysunek 5B).

Rysunek 5: Określanie, kiedy osiągnięto ostateczną grubość lameli podczas frezowania. (A) Przegląd siatki w małym powiększeniu przez SEM przy 5 kV, pokazujący uszkodzenia węgla podczas przycinania. Nieuszkodzone obszary zawierały bardzo cienką próbkę z powodu nadmiernego osuszania; jednak nadal możliwe było frezowanie sześciu lameli na tej siatce (obszar w obrębie białego przerywanego konturu) podczas całodniowej sesji na krioFIBSEM. Podziałka liniowa, 0,5 mm. (B) Krótka blaszka (~10 μm szerokości x 3 μm długości, bez warstwy metaloorganicznej) wytworzona z tej siatki (SEM przy 3 kV), która nadal zapewniała dwa obszary, z których można było zbierać serie pochyleń. Podziałka, 25 μm. (C) Seria obrazów SEM (3 kV) blaszki podczas końcowego etapu polerowania, pokazująca, w jaki sposób blaszka jest tracona w wyniku rozcieńczenia (przesuwanie od lewej do prawej). Ciemna linia biegnąca przez środek lameli na wszystkich zdjęciach to pasek folii węglowej z siatki. Komórki przed tym obszarem zostały zeszklone powyżej warstwy węglowej, a komórki za tym obszarem zostały zeszklone poniżej warstwy węglowej. Mielenie zostało przerwane, gdy powłoka organiczna po lewej stronie przedniej krawędzi lameli była bliska utraty integralności strukturalnej. Ten punkt zatrzymania przypadł na czas, zanim cała blaszka została doprowadzona do równej grubości, dlatego w tylnej części lameli znajduje się jeszcze materiał o wyższym kontraście. (D) Przykład trasy polerowania bazującej na blaszkach frezowanych na siatce pokazanej w (A). Trasa polerowania powinna rozpoczynać się od lameli znajdujących się bliżej źródła FIB, oddalając się od źródła FIB, aby ograniczyć ponowne osadzanie się zmielonego materiału na powierzchni lameli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podczas polerowania, ostateczna grubość blaszki będzie zależała od struktury próbki w obszarze frezowanym, integralności powłoki organoplatinum i dostępnego czasu. Idealnie byłoby, gdyby próbka była rozcieńczana aż do utraty kontrastu na całej powierzchni lameli przez SEM przy napięciu 3 kV, co sugeruje, że jest ona równomiernie przezroczysta elektronowo i ma grubość około 150-200 nm (Rysunek 5C). Jednak może być konieczne przerwanie frezowania przed tym momentem, jeśli w warstwie metaloorganicznej pojawi się lub blaszka zacznie się wyginać. W takim przypadku blaszka może być nadal wystarczająco cienka z przodu i pozostać przydatna do tomografii. I odwrotnie, możliwe jest przerzedzenie etapu utraty kontrastu, jeśli blaszka wygląda stabilnie, dzięki czemu jest jeszcze cieńsza, przesuwając wzory frezowania bliżej siebie (~100 nm lub mniej). Będzie to zależało od grubości, jeśli jest to wymagane w dalszym przepływie pracy. Obraz SEM o małym powiększeniu jest wymagany do zaplanowania trasy polerowania, zaczynając bliżej źródła wiązki jonów i pracując dalej (Rysunek 5D). Kierunek trasy polerowania jest ważny, aby zapobiec ponownemu osadzaniu się ablowanego materiału na już zakończonych lamelach.

Zbieranie i przetwarzanie danych serii pochylenia
Po załadowaniu do TEM, pełny montaż siatki o małym powiększeniu (~150x) określi pozycje lameli, które można skorelować z obrazem SEM o małym powiększeniu wykonanym pod koniec frezowania. W przypadku schizontów zamrażanych wgłębnie, większość siatki nie jest przezroczysta dla elektronów, więc pozycje lameli pojawiają się jako białe nacięcia na czarnym tle (Rysunek 6A). Należy zwrócić uwagę na kąt nachylenia lameli w stosunku do osi nachylenia mikroskopu, ponieważ odległość większa niż ~10° od prostopadłej może utrudnić rejestrację serii pochylenia. Montaż w średnim powiększeniu (~1,500x) w miejscu każdej lameli da przegląd zawartości biologicznej i sprawdzi, czy nie ma uszkodzeń transferowych, krystalicznego lodu lub nadmiernego zanieczyszczenia powierzchni (Rysunek 6B-D). Należy to również sprawdzić przy dużym nachyleniu, aby upewnić się, że żadne zanieczyszczenie powierzchni nie zasłania obszaru akwizycji lub ostrości. Wybór regionu pozyskiwania będzie zależał nie tylko od cech biologicznych, ale także od integralności strukturalnej lodu w otaczającym regionie, na przykład od unikania pęknięć, ponieważ obszary te będą dryfować, lub obszarów z nadmiernym zasłonięciem, gdzie blaszka będzie miała zmienną grubość. Przed uzyskaniem serii pochylenia do siatki przykładane jest wstępne pochylenie ±10°, aby płaszczyzna lameli (nie siatki) była prostopadła do osi optycznej. Kierunek wstępnego pochylenia można określić na podstawie położenia przedniej krawędzi lameli (w poszukiwaniu pozostałej powłoki z metaloplatyny) w montażu w średnim powiększeniu. W przypadku zastosowanego tutaj TEM (Titan Krios 300 kV), jeśli przednie krawędzie lameli były skierowane do góry na mapie, wymagało to wstępnego pochylenia +10°, a jeśli były skierowane w dół, wymagało to wstępnego pochylenia -10°. Każda siatka może być inna ze względu na orientację, w jakiej zostały podniesione do pęsety i włożone do automatycznego podajnika (przekrój skierowany w lewo lub w prawo, powoduje obrót o 180°). Ostatnią kwestią jest rozmiar w pikselach. Rutynowo serie pochylenia są zbierane około 2,5-7 A/piksel, biorąc pod uwagę rozmiar interesującej nas cechy, docelową rozdzielczość wynikowych danych tomograficznych oraz powierzchnię blaszki, co może ograniczać wielkość obszaru akwizycji. Możliwe jest użycie mniejszego rozmiaru piksela w celu uzyskania informacji o wysokiej rozdzielczości, a najmniejszy, którego z powodzeniem użyliśmy w tych próbkach, to 1,4 A/piksel (dane nie pokazane). Dryf będzie bardziej widoczny przy mniejszym rozmiarze piksela i jest odpowiedni tylko dla cienkich (<100 nm) lameli, w przypadku których maksymalizacja rozdzielczości ma znaczenie w badaniu.

Rysunek 6: Wybieranie dostępnych obszarów zainteresowania, z których można uzyskać serię tilt-series (A) Fragment mapy TEM o małym powiększeniu, pokazujący obszar zawierający blaszki, pojawiające się jako sześć białych nacięć na czarnym tle (czerwone strzałki). Białe kwadraty to przerwana folia węglowa. (B) Mapa w średnim powiększeniu uszkodzonej i zdewitryfikowanej blaszki. Na przedniej krawędzi blaszki (FE) oderwała się powłoka organiczna (1). W środku blaszki (2) znajduje się przezroczysta plama krystalicznego lodu. Wiązka jonów nie przebiła się przez tylną krawędź lameli (BE), ponieważ lód jest zbyt gruby obok prętów siatki. Tylko niewielka część blaszki jest wolna od otaczającego lodu w BE (3), tworząc klin. Grubość spowodowała również wycięcie półek nad lamelą (4), co najprawdopodobniej zasłania widok komórek przy dużym nachyleniu w TEM. (C) Montaż w średnim powiększeniu całej blaszki oglądanej w TEM. Typowymi problemami lub obszarami, których należy unikać podczas zbierania serii pochyleń z lameli są: obszary: pokryte zanieczyszczeniem powierzchniowym (SC), pokryte powłoką organiczno-platynową (OP, żółta), w pobliżu pęknięć (CR i czarne strzałki), z zasłonięciem spowodowanym zmianami gęstości materiału biologicznego (CU i obszar w niebieskich nawiasach) oraz obszary osłabione przez pęknięcia powłoki organicznej (zielone kółko). Jedynymi obszarami dostępnymi do akwizycji serii pochylenia są obszary w dwóch czarnych przerywanych polach (oznaczonych 1 i 2). Widok musi być sprawdzany przy dużym nachyleniu, aby upewnić się, że zanieczyszczenie powierzchni nie zasłania obszaru zainteresowania lub obszaru ostrości. (D) Montaż w średnim powiększeniu znacznie czystszej blaszki, jednak która ciągle posiada pęknięcia (CR) spowodowane przerzedzeniem powłoki organiczno-platynowej (zielone kółko) podczas polerowania. W tym przypadku obszar zainteresowania jest podkreślony przez typ komórek obserwowany w blasce, którymi w tym przypadku są pojedyncze merozoity, umieszczone za warstwą węgla (pomarańczowy) w kierunku tyłu blaszki (pole z czarnymi przerywanymi ramkami). Podziałka skali, 3 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Pozyskiwanie danych cryo-ET z blaszek frezowanych FIB. (A) Mikrofotografia obszaru blaszki zawierającej czerwoną krwinkę, która została niedawno zaatakowana przez merozoit P. falciparum. W (B) ten sam obraz jest opatrzony adnotacją, aby pokazać granicę czerwonej krwinki (czerwonej), liczby dwuściennych pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (fioletowych i niebieskich odpowiednio dla błony wewnętrznej i zewnętrznej) oraz merozoitu (zielony) otoczonego drugą błoną pochodzącą z komórki gospodarza (żółty). ramka pokazuje obszar, w którym uzyskano serię pochylenia. Podziałka skali, 500 nm. (C) Średnio 20 centralnych wycinków oglądanych w płaszczyźnie XY z 8x binowanego tomogramu (2,4 A / piksel) uzyskanego na wierzchołkowym końcu merozoitu i w (D) jego adnotacji, pokazującej dwie błony otaczające komórkę (zieloną i żółtą) oraz cztery błony ułożone w wierzchołku merozoitu (niebieski), które są związane z gęstą elektronowo cechą w kształcie grzyba (fioletowy). Czerwona strzałka wskazuje połączenie stosów błon w wierzchołku i cechę w kształcie grzyba (pokazaną również w części F, i). strzałka wskazuje na zdarzenie fuzji między błoną plazmatyczną merozoitu a jednym z wielowarstwowych pęcherzyków w obrębie pasożyta (pokazanym również w części F, ii). Błona krwinek czerwonych gospodarza jest pokazana (czerwona), a przerywana linia pokazuje położenie przekroju poprzecznego oglądanego w płaszczyźnie XZ, pokazanej w (E). Elementy w przekroju (E) są pokolorowane i oznaczone tak samo jak w części (D), z kolorowymi strzałkami wskazującymi membrany. strzałka wskazuje położenie warstwy napylającej nałożonej na lamelę po frezowaniu oraz grubość lameli we wskazanej. Do części (CE), podziałka liniowa, 500 nm. (F) Bardziej szczegółowy widok cech wskazanych przez czerwone i czarne groty strzałek w części (C), pokazujący definicję w dwuwarstwach lipidowych stosu błonowego w wierzchołku merozoitu (i) oraz zdarzenie fuzji między wielowarstwowym pęcherzykiem a błoną plazmatyczną merozoitu. Podziałka skali, 75 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Głównym celem pracy jest zbadanie ścieżki ucieczki merozoitu u P. falciparum, ale biorąc pod uwagę, że populacja komórek użyta w badaniu nigdy nie może być w pełni jednorodna, często obserwowano inne etapy rozwoju komórek w obrębie blaszek. Pokazany tutaj przykład (Rysunek 7) zawiera czerwoną krwinkę, która została niedawno zaatakowana przez pasożyta P. falciparum (merozoit). Zastosowana blaszka miała grubość 240 nm, a siatka została lekko pokryta platyną w atmosferze argonu przed włożeniem do TEM, co spowodowało nieco mniejszy kontrast niż można by się normalnie spodziewać. Błonę czerwonych krwinek można prześledzić w całości otaczającej komórkę. Wewnątrz czerwonej krwinki znajdowały się trzy zamknięte struktury związane z błoną, dwa pęcherzyki, każdy otoczony podwójną błoną i elementem w kształcie żarówki (1,2 μm x 0,9 μm w najszerszych częściach), co jest zgodne z tym, że jest to merozoit (Ryc. 7A-B). Zawartość dwóch pęcherzyków wydawała się być podobna do zawartości czerwonych krwinek, co sugeruje, że pęcherzyki te mogą zawierać hemoglobinę. Obecność pęcherzyków w krwinkach czerwonych gospodarza po inwazji zaobserwowano wcześniej⁴⁵. Uważa się, że powstają one w wyniku wydzielania lipidów i innych czynników wirulencji z organelli wydzielniczych zwanych rhoptriami w merozoicie, które uwalniają się do krwinek czerwonych gospodarza podczas inwazji. Merozoit jest otoczony dwiema ściśle powiązanymi błonami, z których najbardziej wewnętrzna jest prawdopodobnie natywną błoną plazmatyczną merozoitu, na której nie ma widocznej powłoki powierzchniowej, a najbardziej zewnętrzna musi pochodzić z błony czerwonych komórek gospodarza, która otacza merozoit podczas inwazji. Cytoplazma merozoitu zawiera wiele wielowarstwowych pęcherzyków i gęstą od elektronów cechę w kształcie grzyba przylegającą do stosu błon na wierzchołku. Seria nachylenia uzyskana w tym obszarze (2,4 A/piksel) pokazuje, że zawiera on stos czterech błon, które wydają się być połączone z elementem w kształcie grzyba (Rysunek 7C-E). Co uderzające, ta morfologia jest zupełnie inna niż normalny układ organelli i struktur komórkowych na wierzchołkowym końcu dojrzałego merozoitu. Aby to ocenić, uzyskano porównawczą serię nachylenia (2,74 A / piksel) nad końcem wierzchołkowym dojrzałego merozoitu ze schizontu, który został potraktowany E64 przed zamrażaniem i mieleniem wgłębnym (Rysunek 8). Pokazuje to, że wierzchołkowy koniec merozoitu zawiera dwa wydatne organelle wydzielnicze w kształcie maczugi zwane rhoptriami, umieszczone w zestawie trzech polarnych pierścieni na wierzchołkowym końcu komórki i otoczone wieloma mniejszymi organellami wydzielniczymi zwanymi mikronemami. Najbardziej wewnętrzny pierścień polarny jest przyłączony do podwójnej struktury błony, która leży u podstaw błony plazmatycznej merozoitu, zwanej kompleksem błony wewnętrznej, która zawiera białka motoryczne napędzające inwazję. Wykazano, że podczas inwazji zawartość organelli wydzielniczych jest odprowadzana na powierzchnię merozoitu i do czerwonych krwinek gospodarza, ułatwiając przyłączanie merozoitów do czerwonych krwinek gospodarza i inicjując kompleks motoryczny, który napędza inwazję⁴⁵. Przedstawione tu dane pokazują, że po inwazji merozoit nie zawiera obserwowalnych struktur przypominających rhoptrie, mikronemy lub pierścienie polarne, co sugeruje, że morfologia wierzchołkowego końca merozoitu dramatycznie się zmienia. Fuzja rhoptrii przed inwazją została wcześniej pokazana przez TEM stałych sekcji temperatury pokojowej⁴⁶, co jest zgodne z produkcją cechy w kształcie grzyba, którą obserwujemy w naszym merozoicie w stanie po inwazji. Stosy membran połączonych z tą cechą nie były wcześniej obserwowane, a ponieważ nie ma żadnych przesłanek wskazujących na obecność IMC w nowo zaatakowanym merozoicie, stawiamy hipotezę, że stosy membran mogą być pozostałościami po maszynerii IMC pozostałej po zakończeniu inwazji, ale pozostaje to do potwierdzenia.

Rysunek 8: Wierzchołkowy koniec dojrzałych merozoitów za pomocą cryo-ET blaszki frezowanej FIB i TEM plastikowych sekcji. (A) Średnio 20 centralnych warstw z 8x binned tomogramu (2,74 A/piksel) z blaszki o grubości 230 nm pokazujący typową morfologię wierzchołkowego końca dojrzałego merozoitu. Schizonty potraktowano E64 przed zamrożeniem wgłębnym, w wyniku czego membrana PV pękła, a merozoity są zawarte w krwinkach czerwonych gospodarza. (B) pokazuje to samo co w (A), ale z adnotacjami wskazującymi błonę czerwonych krwinek gospodarza (RCM, czerwony), błonę plazmatyczną merozoitu (zielony), wewnętrzny kompleks błonowy (IMC, fioletowy), pierścienie polarne (PR,), mikronomy (M, żółty), rhoptrie (R, szary) i otoczkę jądrową (NE, niebieski). Sąsiedni merozoit, który znajduje się poza płaszczyzną w tym rejonie tomogramu, jest oznaczony zielonym trójkątem. Podziałka liniowa, 200 nm. (C) Cechy komórkowe zaobserwowane przez krioET są zgodne z cechami TEM schizontów zachowanych w skrawkach tworzywa sztucznego. Podobne cechy komórkowe są wskazane w dojrzałym merozoicie ze schizontu, który został potraktowany związkiem 2, zatrzymując wyjście przed pęknięciem membrany PV. Podziałka skali, 500 nm. (D) Opisany schemat merozoitu pokazujący cechy komórkowe w częściach (A-C). Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. pkt. Rozdział

Grubość chronionego obszaru między prostokątnymi wzorami frezowania (μm)	Nominalny prąd wiązki jonów (pA) przy 30 kV
3	300
1,5	100
0,75	50
0,3	Rozdział 30
0,2 - 0,06 (polerowanie końcowe)	30*

Tabela 1: Strategia frezowania w celu uzyskania cienkiej lameli. Mielenie krokowe odbywa się poprzez zmniejszenie prądu wiązki jonów odpowiadającego grubości chronionego obszaru. Ogranicza to nagrzewanie się próbki, zapobiegając dewitryfikacji. *Polerowanie powinno odbywać się równolegle, aby równomiernie rozgrzać lamele z obu stron, zmniejszając ryzyko ich wygięcia lub wygięcia po osiągnięciu ostatecznej grubości. Inne kroki można wykonać sekwencyjnie, frezując wzór nad lamelą, a następnie pod lamelą, przed przejściem do następnego prądu wiązki. Pomiary siatki w celu zlokalizowania pozycji frezowania powinny być przeprowadzane przy prądzie wiązki 1,5 pA, aby zminimalizować nagrzewanie się próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Podczas gdy mielenie krioFIB staje się coraz bardziej rutynowe, przygotowanie optymalnych próbek do mielenia nie; w związku z tym większość krytycznych etapów w tym protokole ma miejsce, zanim próbka dotrze do cryoFIB-SEM. Optymalizacja próbki poprzez wiele rund przygotowania komórek, zamrażanie wgłębne oraz przesiewanie za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej jest wymagana w celu uzyskania najlepszej możliwej próbki przed próbą mielenia. Posiadanie najlepszej możliwej próbki nie tylko zwiększa szanse na sukces, ale także optymalizuje wykorzystanie sprzętu. Z tego powodu większość krajowych zakładów wymaga dowodu, że przed przyznaniem czasu na ich maszynach przeprowadzono wystarczającą optymalizację. Po wejściu do cryoFIB-SEM maksymalizacja skuteczności powłoki z metaloorganicznej platyny ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia jednolicie cienkich blaszek. Wreszcie, cierpliwość i dobre obchodzenie się z próbką jest umiejętnością niezbędną od użytkownika, który będzie musiał siedzieć przez wiele dni produkując, a następnie przenosząc siatki zawierające delikatne blaszki. Może się to zmienić wraz z wprowadzeniem zautomatyzowanych strategii mielenia^47,48, ale jak dotąd cały proces mielenia w większości zakładów jest nadal w dużej mierze ręczny.

Chociaż prace koncentrowały się wyłącznie na P. falciparum schizonts, przedstawioną tutaj metodę można łatwo zmodyfikować w celu optymalizacji przygotowania siatki i mielenia dla innych typów komórek. Ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, są gęstość komórek nakładanych na siatkę, rodzaj siatki (miedź jest toksyczna dla niektórych komórek), rozmiar i odstępy między otworami w folii węglowej, czas blottingu oraz metoda blottingu (jednostronna/dwustronna, ręczna lub automatyczna). Dodatkowo, jeśli komórki są hodowane na siatkach (zwykle złotych siatkach z dziurawym filmem węglowym), zbieganie można sprawdzić za pomocą mikroskopii świetlnej przed osuszeniem i zamrożeniem. Strategia mielenia zależy od tego, w jaki sposób komórki są osadzane na siatce. W przypadku czerwonych krwinek zakażonych malarią siatka jest zasadniczo pokryta nieprzerwaną warstwą komórek, grubszą w niektórych obszarach i cieńszą w innych. Mielenie odbywa się w wielu punktach w jednym regionie wzdłuż tego gradientu, gdzie grubość lodu generuje blaszki o odpowiedniej wielkości dla tomografii. Takie podejście działa dobrze w przypadku mniejszych komórek, ponieważ można wytworzyć blaszki zawierające plasterek przez wiele komórek. W przypadku większych komórek lub skupisk komórek może się zdarzyć, że jedna komórka lub zlepek komórek może wytworzyć jedną blaszkę.

Obsługa siatki i transfer próbek pozostają jednym z głównych wyzwań tego przepływu pracy. Lamele mogą zostać utracone z powodu pęknięć lub pęknięć, artefaktów kurtynowych zasłaniających biologię, nadmiernego zanieczyszczenia powierzchni, a także problemów z orientacją siatki w TEM, co wymaga dodatkowego kroku w celu zmiany położenia siatki. Stopień strat różni się w zależności od dnia na dzień i od sieci do sieci, ale z czasem ulega poprawie dzięki praktyce i doświadczeniu w obsłudze. W tym badaniu stwierdzono, że kratki mogą być wielokrotnie ostrożnie orientowane w automatycznej ładowarce bez niszczenia lameli, co czasami ma tę zaletę, że zmywa lód powierzchniowy. Innym głównym ograniczeniem tego przepływu pracy jest czas potrzebny na wyprodukowanie lameli. Ponieważ produkcja jest powolna, bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednio zoptymalizowaną próbkę, dzięki której mielenie będzie tak wydajne, jak to tylko możliwe.

W ostatnim czasie wprowadzono szereg adaptacji do mielenia FIB szklistych próbek biologicznych. Przełomem jest zastosowanie w komorze cryoFIB-SEM chłodzonych kriogenicznie narzędzi do wyciągania, które umożliwiają mielenie większych bloków materiału z zamrożonych próbek pod wysokim ciśnieniem. Bloki można przymocować do metalowego pręta lub podnieść w chwytaku i przesunąć do drugiej pozycji próbki, zawierającej specjalnie zmodyfikowaną siatkę EM. Bloki można następnie pokryć ognioorganicznymi platynami i zmielić w celu wytworzenia lameli. Zdolność do mielenia blaszek z zamrożonego materiału pod wysokim ciśnieniem oznacza, że można przetwarzać znacznie większe komórki i tkanki, w szczególności celując w obszary za pomocą korelacyjnej mikroskopii fluorescencyjnej¹². Inne niedawne adaptacje metody mielenia FIB obejmują redukcję artefaktów kurtyny poprzez wstępne mielenie klinowe próbki¹⁶, kriofiksację mikroprzepływową⁴⁹ oraz fotomikrowzorcowanie siatek mikroskopii elektronowej w celu poprawy rozmieszczenia komórek⁵⁰. Wykazano również, że frezowanie szczelin mikrodylatacyjnych po obu stronach blaszki może złagodzić ściskanie przez otaczającą próbkę, gdy osiąga ona swoją końcową cienkość⁵¹. Może to być szczególnie przydatne podczas frezowania ciągłych warstw komórek, takich jak próbka w tym badaniu, gdzie czasami obserwuje się wyginanie lameli podczas końcowego etapu polerowania.

Przyszłością mikroskopii elektronowej będzie prawdopodobnie oznaczanie struktur molekularnych in situ za pomocą uśredniania subtomogramowego, a mielenie FIB jest ważnym narzędziem, które ułatwi produkcję szklistych próbek biologicznych dla tego typu przepływów pracy. Podczas gdy mielenie FIB jest wciąż w powijakach dla zastosowań biologicznych, rozwój metod odbywa się w szybkim tempie dzięki ciężkiej pracy naukowców, zarówno akademickich, jak i w ośrodkach krajowych, a także komercyjnym inwestycjom w rozwój technologii cryoFIB-SEM w celu wspierania badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
c-clips	Thermo Fisher Scientific	1036171
Stacja do przycinania	Thermo Fisher Scientific	n/a	Bezpośrednia wycena z Thermo
Clipping station	Sub-angstrom	CSA-01
Związek 2	n/a	n/a	Zsyntetyzowany przez dr Simona A. Osborne'a,
LifeArc Cryo-FIB specyficzne dla obręczy z automatyczną siatką	Thermo Fisher Scientific
E64	Sigma	E3132
Emitech K100X jednostka wyładowcza jarzeniowa	Kworum	n/a
Gibco RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	12633012	Preparat stosowany do hodowli jest wykonany na zamówienie (REF 041-91762 A) i zawiera Albumax, glutaminę, HEPES i suplementy hipoksantyny
Giemsa Stain	VWR International	350864X
Szkiełka	szklane Thermo Fisher Scientific	11562203
Skrzynki rusztowe	Sub-angstrom	PB	Do kratek przyciętych
Skrzynki kratowe	Thermo Fisher Scientific	n/a	Do kratek przyciętych - bezpośrednia wycena z Thermo Fisher Scientific
Skrzynki siatkowe	Agar Scientific	AGG3727
Domowa ręczna zamrażarka wgłębna	n/a	nie dotyczy	Z izolowanym zbiornikiem etanowym (pianka o dużej gęstości) i kąpielą w ciekłym azocie (polistyren) na blacie stołu w obiekcie przechowawczym.
Krew ludzka	nie	dotyczy nie dotyczy	brytyjskiej Narodowej Służby Krwi i Transplantacji
JEOL 4700F Z JSM z systemem chłodzenia stopnia Leica VCT500	JEOL	n/a	FIB-SEM
Leica EM ACE600 z kriostopniem VCT500	Leica	bez	napylania napylającego
Leica EM ACE900	Leica	n/a	powlekarka rotacyjna z wiązką elektroniczną. W pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
Stolik kriogeniczny Linkam do mikroskopu świetlnego	Linkam	Model nr. CMS196	Kasety do siatek przyciętych i nieprzyciętych. W pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
Metanol	Sigma	179957
Mikroskop świetlny Nikon Eclipse E200	Nikon	n/a	ze stolikiem kriogenicznym Linkam w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
Percoll	VWR International	17-0891-01	Roztwór do poduszki perkolu to 35 ml 10 ml PBS, 150 ml RPMI 1640 media i 315 ml Percoll
Quantifoil miedź 200 mesh 2/4 dziurawy węgiel Siatki EM Finder	Quantifoil	N1-C17nCuH2-01	100 sztuk
Quantifoil miedź 200 mesh 2/4 dziurawe siatki węglowe EM	Quantifoil	N1-C17nCu20-01	100 sztuk
Komora przygotowawcza Quorum PP3010 Quorum		nie dotyczy	napylarki
Scios dwubelkowej wyposażonej w stopień transferowy Quorum PP3010.	FEI	n/a	FIB-SEM
Staedtler Lumocolor cienki marker permanentny	Viking Direct	ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM	Thermo Fisher Scientific	n/a	TEM wyposażony w kamerę K2 lub K3.
Bibuła filtracyjna Whatmann grade 1	Sigma	WHA1001150
Mikroskop świetlny Zeiss Axio Scope A1	Zeiss	n/a	ze stolikiem kriogenicznym Linkam w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.