Method Article

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

DOI:

10.3791/62353

⸱

May 17th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia nową, opłacalną i niezawodną platformę mikroprzepływową z potencjałem do generowania złożonych wielowarstwowych tkanek. Jako dowód słuszności koncepcji, wymodelowano uproszczoną i niezróżnicowaną skórę ludzką zawierającą przedział skórny (zrębowy) i naskórkowy (nabłonkowy). Aby to osiągnąć, opracowano wszechstronne i wytrzymałe urządzenie na bazie winylu podzielone na dwie komory, które przezwycięża niektóre wady obecne w urządzeniach mikroprzepływowych opartych na polidimetylosiloksanach (PDMS) do zastosowań biomedycznych, takich jak stosowanie drogiego i specjalistycznego sprzętu lub absorpcja małych, hydrofobowych cząsteczek i białek. Ponadto opracowano nową metodę opartą na przepływie równoległym, która umożliwia osadzanie in situ zarówno przedziałów skórnych, jak i naskórkowych. Konstrukt skóry składa się z macierzy fibrynowej zawierającej ludzkie fibroblasty pierwotne i monowarstwy unieśmiertelnionych keratynocytów usianych na wierzchu, która jest następnie utrzymywana w dynamicznych warunkach hodowli. Ta nowa platforma mikroprzepływowa otwiera możliwość modelowania chorób skóry u ludzi i ekstrapolacji metody w celu wygenerowania innych złożonych tkanek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio poczyniono postępy w kierunku rozwoju i produkcji modeli ludzkiej skóry in vitro do analizy toksyczności produktów kosmetycznych i farmaceutycznych1. Naukowcy z branży farmaceutycznej i pielęgnacji skóry wykorzystują zwierzęta, w tym myszy najpowszechniejsze, do testowania swoich produktów2,3,4,5. Jednak testowanie produktów na zwierzętach nie zawsze pozwala przewidzieć reakcję u ludzi, co często prowadzi do niepowodzenia leczenia lub działań niepożądanych u ludzi, a w konsekwencji do strat ekonomicznych5,6. Wielka Brytania była pierwszym krajem, który zakazał wykorzystywania zwierząt do testów kosmetycznych w 1998 roku. Później, w 2013 roku, UE zakazała testowania i zatwierdzania kosmetyków na zwierzętach (rozporządzenie UE w sprawie kosmetyków nr 1223/2009)7.

Ten zakaz jest również rozważany przez inne kraje, np. w 'The Humane Cosmetics Act' w USA8. Oprócz obaw etycznych, różnice anatomiczne między skórą zwierzęcą a ludzką sprawiają, że testy na zwierzętach są czasochłonne, kosztowne i często nieskuteczne. Ponadto oczekuje się, że wielkość globalnego rynku badań toksykologicznych in vitro osiągnie 26,98 mld USD do 2025 r.9. Z tych powodów istnieje potrzeba opracowania nowych metod i alternatyw dla badań in vitro, takich jak bioinżynieryjne modele ludzkiej skóry, które umożliwiają badanie bezpieczeństwa i toksycznego działania kosmetyków i leków bez udziału zwierząt.

Istnieją dwa różne rodzaje dostępnych na rynku modeli ludzkiej skóry in vitro. Pierwszy typ składa się z warstwowych odpowiedników naskórka zawierających wiele warstw różnicujących się keratynocytów, które są osadzone na różnych materiałach. Niektóre z nich zostały zatwierdzone przez Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) i zatwierdzone przez (Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (ECVAM) do badań działania i drażniącego na skórę, takich jak EpiDerm lub SkinEthic10,11,12. Drugi typ to pełnoskórne odpowiedniki z warstwą różnicujących się ludzkich keratynocytów umieszczonych na trójwymiarowym (3D) rusztowaniu zawierającym fibroblasty, takie jak T-Skin i EpiDerm-FT. Jednak modele te są hodowane w warunkach statycznych, co sprawia, że nie są w stanie dokładnie odwzorować warunków fizjologicznych człowieka.

Ostatnie zainteresowanie skupiło się na generowaniu modeli skóry in vitro 3D w formatach wstawiania do hodowli komórkowych (CCI) z dynamiczną perfuzją13,14,15,16,17,18,19. Systemów tych nie można jednak uznać sensu stricto za mikroprzepływowe typu skin-on-chips zgodnie z ich klasyczną definicją w tej dziedzinie. Definicja narządów na chipie według Ingbera mówi, że narząd musi być umieszczony wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, co jest warunkiem, że tylko kilka urządzeń spełnia20,21. Do tej pory skin-on-chips modelowały głównie prosty nabłonek jako warstwy jednokomórkowe i/lub warstwy komórek skóry właściwej oddzielone porowatą błoną22,23. Chociaż poczyniono pewne postępy w modelowaniu skóry w układach mikroprzepływowych16,24, obecnie nie ma literatury pokazującej system narządów na chipie, który pasowałby do definicji Ingbera, zdolny do wytwarzania wielowarstwowej skóry in situ i zawierający zarówno składniki nabłonkowe, jak i zrębowe.

W tej pracy prezentowana jest nowa, opłacalna, solidna, oparta na winylu platforma mikroprzepływowa do zastosowań typu skin-on-a-chip. Platforma ta została stworzona przez mikroobróbkę, która zapewnia większą prostotę procesu produkcyjnego, a także zwiększoną elastyczność i wszechstronność w układzie urządzenia, pokonując niektóre ograniczenia PDMS25. Zaprojektowano również sposób na wprowadzenie uproszczonej konstrukcji skóry poprzez równoległy przepływ sterowany za pomocą pomp strzykawkowych. Przepływ równoległy umożliwia perfuzję dwóch płynów o bardzo różnych lepkościach (w tym przypadku buforu i fibryny wstępnej żelu) przez kanał bez mieszania się ze sobą. Jako dowód słuszności koncepcji, do urządzenia wprowadzono konstrukt skórno-naskórkowy zawierający fibroblasty osadzone w macierzy fibrynowej naśladującej skórę właściwą, na którą nałożono monowarstwę keratynocytów w celu naśladowania niezróżnicowanego naskórka. Wysokość komory skórnej można modulować, modyfikując natężenie przepływu. Główną nowością tej pracy, w porównaniu z poprzednio opisanymi modelami22,26,27,28,29, jest opracowanie konstrukcji 3D wewnątrz mikrokomory za pomocą mikrofluidyki. Chociaż w tym artykule przedstawiono uproszczoną, niezróżnicowaną skórę, długoterminowym celem jest wygenerowanie i scharakteryzowanie w pełni zróżnicowanego konstruktu skóry, aby zademonstrować jego żywotność i funkcjonalność do celów testów lekowych i kosmetycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie układów scalonych i parametry mikroobróbki

  1. Zaprojektuj warstwy chipów mikroprzepływowych za pomocą oprogramowania do projektowania FreeCAD o otwartym kodzie źródłowym; patrz Tabela 1, aby zapoznać się z wymiarami kanałów. W projekcie uwzględnij cztery otwory o średnicy 2,54 mm, aby użyć niestandardowego alignera do prawidłowej superpozycji warstw.
osób szt. osób szt.
Długość (μm)Szerokość (μm)
Dolna komora28 400800
Komora górna31 000800

Tabela 1: Wymiary górnego i dolnego kanału urządzenia.

  1. Pokrój samoprzylepne, przezroczyste arkusze winylu o grubości 95 μm na kwadraty o wymiarach 30 cm x 30 cm, aby odpowiednio pasowały do plotera.
  2. Użyj oprogramowania Brother CanvasWorkspace, aby stworzyć przestrzeń roboczą o wymiarach 30 cm x 30 cm i wypełnij ją zaprojektowanymi wzorami dla różnych warstw chipa (Rysunek 1A). Przechowuj go w pliku .svg.
  3. Wytnij arkusze winylu o wymiarach 30 cm x 30 cm za pomocą plotera krawędziowego (Rysunek 1B-D).
    1. Przyklej arkusz winylowy do maty samoprzylepnej o niskiej przyczepności i w razie potrzeby wyeliminuj wszystkie pęcherzyki powietrza.
    2. Prześlij plik .svg do plotera i ustaw parametry cięcia: ostrze tnące: poziom 3; ciśnienie cięcia: poziom 0; prędkość cięcia: poziom 1. Umieść matę samoprzylepną z winylem w ploterze i rozpocznij proces cięcia.
  4. Wytnij wzór górnego kanału na dwustronnej taśmie winylowej o grubości 12 μm, wykonując poprzednie kroki.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Projektowanie układów scalonych i proces mikroobróbki. (A) Układ oprogramowania pokazujący przestrzeń roboczą wypełnioną zarówno górnymi, jak i dolnymi wzorami zaprojektowanymi dla chipa. (B) Ploter krawędziowy podczas procesu cięcia; Pokazane jest ostrze tnące, cały arkusz winylowy i mata samoprzylepna. (C) Wzorzysty winyl odłączany od ciętego arkusza. (D) Próbka warstwy kleju winylowego z wzorem górnego kanału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wytwarzanie warstw PDMS

  1. Wymieszaj PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v) i umieść mieszaninę w próżni na 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wlać 55 ml mieszaniny do naczynia hodowlanego o powierzchni 55cm2 kwadratowych, aby uzyskać warstwę o grubości 2 mm. Usuń bąbelki za pomocą igły.
  2. Utwardzić mieszaninę (etap 2.1) w piecu przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C. Wyjmij PDMS z formy i pokrój go na prostokąty o wymiarach wiórów. Wykonaj otwory na rurkę za pomocą igły strzykawkowej 18 G.

3. Montaż chipów

UWAGA: Aby uzyskać lepsze zrozumienie, zobacz Rysunek 2.

  1. Zmontuj całe urządzenie za pomocą wyrównywacza, aby prawidłowo wyregulować kanały, wloty i wyloty. Ułóż cztery warstwy winylu (z odpowiednim dolnym mikrowzorem) w celu montażu dolnego kanału, zachowując taśmę zakrywającą dolnej warstwy, aby uniknąć przyklejania się do nakładki.
  2. Wytnij i umieść porowatą membranę poliwęglanową (PC) na górze dolnego kanału, aby oddzielić ją od górnego. Uważaj, aby nie zakryć wlotów dolnego kanału.
  3. Dodaj dziesięć warstw winylu z konstrukcją górnej komory. Przyklej warstwę winylu z dwustronną taśmą z wzorem górnego kanału na górze. Wyjmij chip z nakładki i przyklej go do szkiełka podstawowego.
  4. Umieść arkusz PDMS o grubości 2 mm na wierzchu warstwy winylowej z dwustronnej taśmy, aby zapewnić odpowiednie zakotwiczenie rurki i uniknąć wycieków. Pozostaw ciężarek na wierzchu chipa na noc, aby upewnić się, że chip jest całkowicie wodoszczelny. Wysterylizuj chip, przepłukując 70% v/v etanolem przez 5 minut, a następnie umyj destylowanymH2O.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Mikroprzepływowy układ scalony. (A) Ogólny schemat montażu urządzenia. Dolna i górna komora składają się odpowiednio z czterech i jedenastu nałożonych na siebie arkuszy winylu. (B) Widok z góry i z boku chipa mikroprzepływowego. Górny i dolny kanał są reprezentowane odpowiednio na różowo i niebiesko. (C) Obraz zespołu chipów przy użyciu specjalnie wykonanego alignera. (D) Obraz chipa po całkowitym montażu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Połączenia pompy

UWAGA: Graficzna reprezentacja połączeń pomp jest pokazana w Rysunek 3.

  1. Podłączyć pompę 1 do wlotu górnej komory 1 (UCi1).
  2. Podłączyć pompę 2 do wlotu górnej komory 2 (UCi2).
  3. Podłączyć pompę 3 do wlotu dolnej komory (LCi).
  4. Podłącz wylot górnej komory (UCo) i wylot dolnej komory (LCo) do rurki odpływowej.
  5. Podłączyć strzykawki do każdego wlotu za pomocą rurek z politetrafluoroetylenu (PTFE) i łączników ze stali nierdzewnej 18 G.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Lokalizacja przyłączy pomp i wlotów/wylotów. (A) Schemat przedstawiający połączenie trzech różnych pomp z ich odpowiednimi wlotami. Gniazda łączą się z pojemnikiem na odpady. (B) Obraz chipa z oznaczonymi wlotami i wylotami. Skróty: LCi = dolny wlot komory; LCo = wylot dolnej komory; UCi1 = wlot do górnej komory 1; UCi2 = wlot do górnej komory 2; UCo = wylot górnej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Hodowla komórkowa

UWAGA: Linia komórkowa HaCaT ma komercyjne pochodzenie. Pierwotne fibroblasty ludzkie pochodzą od zdrowych dawców i zostały uzyskane z kolekcji próbek biologicznych pochodzenia ludzkiego zarejestrowanych w "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".

  1. Pracuj w kapturze do hodowli komórkowej, uprzednio wysterylizowanym w świetle ultrafioletowym i przetartym etanolem.
  2. Rozmrozić komórki H2B-GFP-HaCaT (ludzkie unieśmiertelnione keratynocyty skóry, hKC) i pierwotne fibroblasty GFP-ludzkie (hFB) w temperaturze 37 °C, dodać 2 ml pożywki hodowlanej i wirować przez 7 minut w temperaturze 20 °C w temperaturze 250 × g.
    UWAGA: Komórki H2B-GFP-HaCaT to ludzkie unieśmiertelnione keratynocyty zmodyfikowane do ekspresji hybrydowego histonu H2B-zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), zapewniając ich jądrom zieloną fluorescencję. GFP-hFB to ludzkie pierwotne fibroblasty transformowane za pomocą wektora pLZRS-IRES-EGFP w celu ekspresji cytoplazmatycznej zielonej fluorescencji. Komórki te zostały zmodyfikowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami30,31
  3. Hodowla zarówno hKC, jak i hFB w 1x DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% roztworem antybiotykowym/przeciwgrzybiczym. Przed użyciem należy wstępnie ogrzać pożywkę hodowlaną w temperaturze 37 °C.
  4. Odłączyć komórki, przemłukując je 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 2 ml trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubując je przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Dezaktywuj trypsynę, dodając 4 ml pożywki hodowlanej. Ponownie zawiesić komórki i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Usunąć 10 μl, aby policzyć komórki w komorze Neubauera i określić odpowiednie stężenie.
  6. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml przez 7 minut w temperaturze 20 °C i temperaturze 250 × g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w pożądanym stężeniu: hFB w 50 000 komórek/ml i hKC w 5·× 106 komórek/ml.

6. Przygotowanie fibrynogenu do żelu

  1. Aktywować trombinę, dodając 1 ml CaCl2 (1% w/v w NaCl) do fiolki.
  2. Dodać następujące składniki, aby uzyskać 1 ml hydrożelu fibrynowego o końcowym stężeniu fibryny 3,5 mg/ml: 59 μl aktywowanej trombiny (10 jednostek NIH/ml), 59 μl kwasu traneksamowego (tabela materiałów, 100 mg/ml), 764 μl pożywki hodowlanej zawierającej 50 000 hFB/ml, 118 μl fibrynogenu (20 mg/ml w NaCl (0,9% w/v)).
    UWAGA: Fibrynogen należy dodać w ostatniej chwili.

7. Protokół przepływu równoległego

  1. Pompować 1x PBS z pompą 3 przez LCi z prędkością 50 μL/min podczas całego procesu.
  2. Pompować płyn protektorowy (1x PBS) za pomocą pompy 2 przez UCi2 z prędkością 100 μl/min.
  3. Załaduj strzykawkę wstępnie nałożonym żelem, szybko umieść ją w pompie 1 i uruchom z prędkością 200 μl/min (Rysunek 4A).
  4. Zatrzymaj pompy 1 i 2, gdy żel wstępny opuści UCo.
  5. Pozostawić wiór bez wyjmowania rurki w temperaturze 37 °C na co najmniej 10 minut, aby umożliwić żelowanie.
  6. Pompować pożywkę hodowlaną z prędkością 50 μl/h za pomocą pompy 3 przez UCi2 przez noc.
  7. Zablokuj UCi1 za pomocą nasadki.

8. Siewy jednowarstwowe hKCs

  1. Sprawdź pod mikroskopem, czy hFB rozprzestrzeniają się 24 godziny po wytworzeniu kompartmentu skórnego.
  2. Wprowadzić hKC z pompą 2 przez UCi2 w 5 ×·106 komórek/ml przy 40 μl/min przez 1 minutę (Rysunek 4B).
  3. Pozostaw chip na noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze nasyconym wilgocią w celu przyłączenia komórek.
  4. Pompować świeżą pożywkę hodowlaną za pomocą pompy 3 tylko przez LCi z prędkością 50 μl/min (Rysunek 4C).

figure-protocol-4
Rysunek 4: Protokół mikroprzepływowy do generowania konstruktu skórno-naskórkowego. (A) Przekrój poprzeczny pokazujący równoległy proces przepływu do wytworzenia komory skórnej. (B) Wysiew jednowarstwowy keratynocytów 24 godziny po wytworzeniu kompartmentu skórnego. (C) Utrzymanie hodowli komórkowych wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego. (D) Odtworzenie przekroju poprzecznego skóry wewnątrz chipa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Test żywotności komórek

UWAGA: Zestaw Live/Dead barwi komórki zieloną lub czerwoną fluorescencją w zależności od ich stanu żywego lub martwego. W celu prawidłowego zróżnicowania żywotności na tym etapie należy użyć niefluorescencyjnych hKC i hFB. Wszystkie etapy procedury są wykonywane przez UCi2 z pompą 2.

  1. Przemyć górny kanał 1x PBS przez 5 minut przy 50 μl/min w celu usunięcia pożywki hodowlanej.
  2. Pompować powietrze, aby usunąć 1x PBS z prędkością 50 μL/min.
  3. Przygotuj roztwór Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (żywy/martwy), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Pompować żywy/martwy roztwór o stężeniu 50 μl/min przez 2 minuty.
  5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  6. Przemyć górny kanał, pompując 1x PBS z prędkością 50 μl/min przez 2 minuty, aby usunąć pozostały odczynnik.
  7. Obserwować próbkę pod mikroskopem konfokalnym. Użyj długości fali wzbudzenia 495/590 nm i długości fali emisji 519/617 nm odpowiednio dla żywych i martwych komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowany chip składa się z dwóch komór fluidycznych oddzielonych membraną PC o wielkości porów 5 μm, która umożliwia wzrost komórki, umożliwiając przejście cząsteczek stymulujących wzrost z dolnej komory. W górnej komorze znajduje się konstrukt tkankowy, w tym przypadku monowarstwa hKC na hydrożelu fibrynowym zawierającym hFB.

Wysokość kanałów jest określana przez liczbę arkuszy samoprzylepnych dodanych do każdego kanału. Dolna komora składa się z 4 warstw (380 μm), a górna z 10 jednostr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Motywacją do opracowania tej metody była chęć modelowania chorób skóry oraz badania efektów nowych i innowacyjnych terapii na platformie wysokoprzepustowej. Do tej pory laboratorium to wytwarza te dermo-naskórkowe odpowiedniki poprzez odlewanie - ręcznie lub za pomocą technologii biodruku 3D - żelu fibrynowego z fibroblastami do płytki wprowadzającej do hodowli komórkowej i umieszczanie na niej keratynocytów. Gdy keratynocyty osiągną zbieg, kultura 3D jest wystawiana na działanie granicy faz powietrze-ciecz, która induku...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy dr Javierowi Rodríguezowi, dr Maríi Luisie López, Carlosowi Matellánowi i Juanowi Francisco Rodríguezowi za bardzo pomocne sugestie, dyskusje i/lub wstępne dane. Serdecznie dziękujemy również Sergio Férnandezowi, Pedro Herrerosowi i Larze Stolzenburg za wkład w ten projekt. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Marty Garcíi za hFB i hKC z oznaczeniem GFP. Na koniec doceniamy doskonałą pomoc techniczną ze strony Guillermo Vizcaíno i Angélicy Corral. Prace te były wspierane przez "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Prace te były również wspierane przez "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmchafibrynaRottafarmKwas traneksamowy
Antybiotyk/PrzeciwgrzybiczyThermo Scientific HyClone
Chlorek wapniaSigma Aldrich
Płytki hodowlaneFisher
DMEMInvitrogen Life Technologies
Taśma dwustronna vynilATP Systemy klejoweGM 107CC, 12 i mikro; m gruby
Ploter krawędziowyBrotherScanncut CM900
FBSThermo Scientific HyClone
FibrinogenSigma AldrichEkstrahowany z ludzkiego osocza
SzkiełkoThermo Scientific
GFP-Ludzkie fibroblasty skórne-Podstawowe. Prezent od dr Marty Garcí
linia komórkowa H2B-GFP-HaCaTATCCUnieśmiertelnione keratynocyty. Prezent od dr Marty Garcí
zestaw Live/deadInvitrogen
PBSSigma Aldrich
Membrana poliwęglanowaMerk TM5 µ m wielkość porów
PolidimetylosiloksanDow CorningSylgard 184
Chlorek soduSigma Aldrich
StrzykawkiTerumo5 ml
TrombinSigma Aldrich10 NIH/fiolka
Przezroczysty klej winylowyMactacJT 8500 CG-RT, 95 µ m grube
Trypsin/EDTASigma Aldrich
IDEXTeflon, 1/16" Średnica zewnętrzna, 0,020" Id
: rurki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
  2. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  3. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
  4. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  5. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
  6. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  7. Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. Pronko et al. Reply. Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387(2001).
  8. H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016).
  9. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018).
  10. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
  11. OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
  12. Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
  13. vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
  14. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  15. Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
  16. Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
  17. Materne, E. -M., et al. The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526(2015).
  18. Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43(2018).
  19. Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
  20. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  21. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471(2016).
  23. Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
  24. Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898(2020).
  25. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  26. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  27. Huh, D. A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
  28. Beckwitt, C. H., et al. Liver ' organ on a chip '. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
  29. Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. Human-gut-microbiome on a chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).
  30. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  31. Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
  32. Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
  33. Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
  34. Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006(2016).
  35. Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
  36. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
  37. Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535(2016).
  38. Marx, U., et al. Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
  39. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  40. Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
  41. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
  42. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  43. O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
  44. Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Skin On A ChipMicrofluidic PlatformThree Dimensional SkinVinyl MicrofluidicsParallel Flow MethodDermal CompartmentEpidermal CompartmentFibrin MatrixHuman Primary FibroblastsKeratinocyte Monolayer

Related Articles