Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62353

⸱

17 maja 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Streszczenie

Ta praca przedstawia nową, opłacalną i niezawodną platformę mikroprzepływową z potencjałem do generowania złożonych wielowarstwowych tkanek. Jako dowód słuszności koncepcji, wymodelowano uproszczoną i niezróżnicowaną skórę ludzką zawierającą przedział skórny (zrębowy) i naskórkowy (nabłonkowy). Aby to osiągnąć, opracowano wszechstronne i wytrzymałe urządzenie na bazie winylu podzielone na dwie komory, które przezwycięża niektóre wady obecne w urządzeniach mikroprzepływowych opartych na polidimetylosiloksanach (PDMS) do zastosowań biomedycznych, takich jak stosowanie drogiego i specjalistycznego sprzętu lub absorpcja małych, hydrofobowych cząsteczek i białek. Ponadto opracowano nową metodę opartą na przepływie równoległym, która umożliwia osadzanie in situ zarówno przedziałów skórnych, jak i naskórkowych. Konstrukt skóry składa się z macierzy fibrynowej zawierającej ludzkie fibroblasty pierwotne i monowarstwy unieśmiertelnionych keratynocytów usianych na wierzchu, która jest następnie utrzymywana w dynamicznych warunkach hodowli. Ta nowa platforma mikroprzepływowa otwiera możliwość modelowania chorób skóry u ludzi i ekstrapolacji metody w celu wygenerowania innych złożonych tkanek.

Wprowadzenie

Ostatnio poczyniono postępy w kierunku rozwoju i produkcji modeli ludzkiej skóry in vitro do analizy toksyczności produktów kosmetycznych i farmaceutycznych1. Naukowcy z branży farmaceutycznej i pielęgnacji skóry wykorzystują zwierzęta, w tym myszy najpowszechniejsze, do testowania swoich produktów2,3,4,5. Jednak testowanie produktów na zwierzętach nie zawsze pozwala przewidzieć reakcję u ludzi, co często prowadzi do niepowodzenia leczenia lub działań niepożądanych u ludzi, a w konsekwencji do strat ekonomicznych5,6. Wielka Brytania była pierwszym krajem, który zakazał wykorzystywania zwierząt do testów kosmetycznych w 1998 roku. Później, w 2013 roku, UE zakazała testowania i zatwierdzania kosmetyków na zwierzętach (rozporządzenie UE w sprawie kosmetyków nr 1223/2009)7.

Ten zakaz jest również rozważany przez inne kraje, np. w 'The Humane Cosmetics Act' w USA8. Oprócz obaw etycznych, różnice anatomiczne między skórą zwierzęcą a ludzką sprawiają, że testy na zwierzętach są czasochłonne, kosztowne i często nieskuteczne. Ponadto oczekuje się, że wielkość globalnego rynku badań toksykologicznych in vitro osiągnie 26,98 mld USD do 2025 r.9. Z tych powodów istnieje potrzeba opracowania nowych metod i alternatyw dla badań in vitro, takich jak bioinżynieryjne modele ludzkiej skóry, które umożliwiają badanie bezpieczeństwa i toksycznego działania kosmetyków i leków bez udziału zwierząt.

Istnieją dwa różne rodzaje dostępnych na rynku modeli ludzkiej skóry in vitro. Pierwszy typ składa się z warstwowych odpowiedników naskórka zawierających wiele warstw różnicujących się keratynocytów, które są osadzone na różnych materiałach. Niektóre z nich zostały zatwierdzone przez Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) i zatwierdzone przez (Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (ECVAM) do badań działania i drażniącego na skórę, takich jak EpiDerm lub SkinEthic10,11,12. Drugi typ to pełnoskórne odpowiedniki z warstwą różnicujących się ludzkich keratynocytów umieszczonych na trójwymiarowym (3D) rusztowaniu zawierającym fibroblasty, takie jak T-Skin i EpiDerm-FT. Jednak modele te są hodowane w warunkach statycznych, co sprawia, że nie są w stanie dokładnie odwzorować warunków fizjologicznych człowieka.

Ostatnie zainteresowanie skupiło się na generowaniu modeli skóry in vitro 3D w formatach wstawiania do hodowli komórkowych (CCI) z dynamiczną perfuzją13,14,15,16,17,18,19. Systemów tych nie można jednak uznać sensu stricto za mikroprzepływowe typu skin-on-chips zgodnie z ich klasyczną definicją w tej dziedzinie. Definicja narządów na chipie według Ingbera mówi, że narząd musi być umieszczony wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, co jest warunkiem, że tylko kilka urządzeń spełnia20,21. Do tej pory skin-on-chips modelowały głównie prosty nabłonek jako warstwy jednokomórkowe i/lub warstwy komórek skóry właściwej oddzielone porowatą błoną22,23. Chociaż poczyniono pewne postępy w modelowaniu skóry w układach mikroprzepływowych16,24, obecnie nie ma literatury pokazującej system narządów na chipie, który pasowałby do definicji Ingbera, zdolny do wytwarzania wielowarstwowej skóry in situ i zawierający zarówno składniki nabłonkowe, jak i zrębowe.

W tej pracy prezentowana jest nowa, opłacalna, solidna, oparta na winylu platforma mikroprzepływowa do zastosowań typu skin-on-a-chip. Platforma ta została stworzona przez mikroobróbkę, która zapewnia większą prostotę procesu produkcyjnego, a także zwiększoną elastyczność i wszechstronność w układzie urządzenia, pokonując niektóre ograniczenia PDMS25. Zaprojektowano również sposób na wprowadzenie uproszczonej konstrukcji skóry poprzez równoległy przepływ sterowany za pomocą pomp strzykawkowych. Przepływ równoległy umożliwia perfuzję dwóch płynów o bardzo różnych lepkościach (w tym przypadku buforu i fibryny wstępnej żelu) przez kanał bez mieszania się ze sobą. Jako dowód słuszności koncepcji, do urządzenia wprowadzono konstrukt skórno-naskórkowy zawierający fibroblasty osadzone w macierzy fibrynowej naśladującej skórę właściwą, na którą nałożono monowarstwę keratynocytów w celu naśladowania niezróżnicowanego naskórka. Wysokość komory skórnej można modulować, modyfikując natężenie przepływu. Główną nowością tej pracy, w porównaniu z poprzednio opisanymi modelami22,26,27,28,29, jest opracowanie konstrukcji 3D wewnątrz mikrokomory za pomocą mikrofluidyki. Chociaż w tym artykule przedstawiono uproszczoną, niezróżnicowaną skórę, długoterminowym celem jest wygenerowanie i scharakteryzowanie w pełni zróżnicowanego konstruktu skóry, aby zademonstrować jego żywotność i funkcjonalność do celów testów lekowych i kosmetycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt układu i parametry mikrobiegłości

  1. Zaprojektuj warstwy układu mikroprzepływowego w darmowym programie do projektowania FreeCAD; wymiary kanałów znajdują się w Tabeli 1. W projekcie uwzględnij cztery otwory o średnicy 2.54 mm, aby umożliwić zastosowanie niestandardowego urządzenia pozycjonującego w celu poprawnej superpozycji warstw.
Długość (μm)Szerokość (μm)
Komora dolna28,400800
Komora górna31,000800

Tabela 1: Wymiary górnego i dolnego kanału urządzenia.

  1. Przyciąć przezroczyste, samoprzylepne arkusze winylu o grubości 95 µm do kwadratów o wymiarach 30 cm x 30 cm, aby pasowały do plotera.
  2. Użyć oprogramowania Brother CanvasWorkspace do utworzenia obszaru roboczego o wymiarach 30 cm x 30 cm i wypełnić go zaprojektowanymi wzorami dla różnych warstw chipa (Rysunek 1A). Zapisać projekt w pliku .svg.
  3. Wyciąć arkusze winylu 30 cm x 30 cm za pomocą plotera (Rysunek 1B-D).
    1. Przykleić arkusz winylu do maty z klejem o niskiej przyczepności i w razie potrzeby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
    2. Wgrać plik .svg do plotera i ustawić parametry cięcia: ostrze tnące: poziom 3; nacisk cięcia: poziom 0; prędkość cięcia: poziom 1. Umieścić matę z winylem w ploterze i rozpocząć proces wycinania.
  4. Wyciąć wzór górnego kanału na dwustronnej taśmie winylowej o grubości 12 µm, postępując zgodnie z poprzednimi krokami.

Proces wycinania z winylu, schemat, sprzęt, mata klejąca, wycinarka laserowa, przygotowanie materiału.
Rycina 1: Projekt układu i proces mikrobobróbki. (A) Układ w oprogramowaniu przedstawiający obszar roboczy wypełniony wzorami górnym i dolnym zaprojektowanymi dla układu. (B) Ploter krawędziowy podczas procesu wycinania; przedstawiono ostrze tnące, cały arkusz winylu oraz matę klejącą. (C) Odrywanie wyciętego wzoru z winylu z arkusza. (D) Próbka klejącej warstwy winylu z wyciętym wzorem górnego kanału. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Wytwarzanie warstwy PDMS

  1. Wymieszaj PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (v/v), a następnie umieść mieszaninę w próżni na 15 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Wlej 55 mL mieszaniny do kwadratowej naczynia hodowlanego o powierzchni 55 cm2, aby uzyskać warstwę o grubości 2 mm. Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą igły.
  2. Utwardź mieszaninę (krok 2.1) w piekarniku przez 1 h w temperaturze 80 °C. Wyjmij PDMS z formy i potnij go na prostokąty o wymiarach odpowiadających chipowi. Wykonaj otwory na rurki za pomocą igły do strzykawki 18 G.

3. Montaż chipa

UWAGA: Aby lepiej zrozumieć proces, zapoznaj się z Rysunkiem 2.

  1. Zmontuj całe urządzenie, używając wyrównywacza do odpowiedniego dopasowania kanałów, wlotów i wylotów. Nałóż na siebie cztery warstwy winylu (z odpowiednim dolnym mikrowzorem) w celu zbudowania dolnego kanału, pozostawiając taśmę ochronną na dolnej warstwie, aby zapobiec przywieraniu do wyrównywacza.
  2. Wytnij i umieść porowatą membranę z poliwęglanu (PC) na górze dolnego kanału, aby oddzielić go od kanału górnego. Należy uważać, aby nie zasłonić wlotów dolnego kanału.
  3. Dodaj dziesięć warstw winylu z projektem górnej komory. Na górze naklej warstwę winylu z taśmą dwustronną i wzorem górnego kanału. Zdejmij chip z wyrównywacza i przyklej go do szkiełka przedmiotowego.
  4. Na warstwie winylu z taśmą dwustronną umieść arkusz PDMS o grubości 2 mm, aby zapewnić odpowiednie zakotwiczenie rurek i zapobiec wyciekom. Pozostaw obciążenie na chipie przez noc, aby upewnić się, że jest on całkowicie wodoszczelny. Sterylizuj chip, przepłukując go 70% v/v etanolem przez 5 min, a następnie przemyj wodą destylowaną H2O.

Schemat montażu urządzenia mikroprzepływowego i ustawienie dla eksperymentów płynowych, warstwy PDMS, system membranowy.
Rycina 2: Montaż chipa mikroprzepływowego. (A) Ogólny schemat montażu urządzenia. Komory dolna i górna składają się odpowiednio z czterech i jedenastu nałożonych na siebie arkuszy winylu. (B) Widoki z góry i z boku chipa mikroprzepływowego. Kanały górny i dolny przedstawiono odpowiednio w kolorze różowym i niebieskim. (C) Obraz montażu chipa z użyciem specjalnie wykonanego pozycjonera. (D) Obraz chipa po całkowitym montażu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Podłączenia pompy

UWAGA: Schematyczne przedstawienie połączeń pomp znajduje się na Rysunku 3.

  1. Podłącz pompę 1 do wlotu 1 górnej komory (UCi1).
  2. Podłącz pompę 2 do wlotu 2 górnej komory (UCi2).
  3. Podłącz pompę 3 do wlotu dolnej komory (LCi).
  4. Podłącz wylot górnej komory (UCo) oraz wylot dolnej komory (LCo) do rurki odpływowej.
  5. Podłącz strzykawki do każdego wlotu, używając rurek z politetrafluoroetylenu (PTFE) i stalowych złączek 18 G.

Układ do cytometrii przepływowej z trzema pompami, systemem mikroprzepływowym i rurką odpływową. Schemat i zdjęcie z eksperymentu.
Rysunek 3: Połączenia pomp oraz lokalizacja wlotów i wylotów. (A) Schemat przedstawiający połączenie trzech różnych pomp z ich odpowiednimi wlotami. Wyloty są połączone z pojemnikiem na odpady. (B) Zdjęcie chipa z oznakowanymi wlotami i wylotami. Skróty: LCi = wlot do dolnej komory; LCo = wylot z dolnej komory; UCi1 = wlot 1 do górnej komory; UCi2 = wlot 2 do górnej komory; UCo = wylot z górnej komory. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

5. Hodowla komórkowa

UWAGA: Linia komórkowa HaCaT pochodzenia komercyjnego. Ludzkie pierwotne fibroblasty pochodzą od zdrowych dawców i zostały pobrane z kolekcji próbek biologicznych pochodzenia ludzkiego zarejestrowanej w „Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III”.

  1. Pracuj w komorze do hodowli komórkowych, uprzednio wysterylizowanej światłem ultrafioletowym i przetartej etanolem.
  2. Rozmroź komórki H2B-GFP-HaCaT (ludzkie unieśmiertelnione keratynocyty skóry, hKCs) oraz GFP-ludzkie pierwotne fibroblasty (hFBs) w temperaturze 37 °C, dodaj 2 mL pożywki hodowlanej i wiruj przez 7 min w temperaturze 20 °C przy 250 × g.
    UWAGA: Komórki H2B-GFP-HaCaT to ludzkie unieśmiertelnione keratynocyty zmodyfikowane w celu ekspresji hybrydowej histony H2B-zielone białko fluorescencyjne (GFP), co nadaje ich jądrom zieloną fluorescencję. GFP-hFBs to ludzkie pierwotne fibroblasty przetransformowane wektorem pLZRS-IRES-EGFP w celu ekspresji cytoplazmatycznej zielonej fluorescencji. Komórki te zostały zmodyfikowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami30,31
  3. Hoduj zarówno hKCs, jak i hFBs w 1x DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% roztworu antybiotyków/antymykotyków. Przed użyciem podgrzej pożywkę hodowlaną do temperatury 37 °C.
  4. Odczep komórki, przemywając je 1x solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), dodając 2 mL trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubując przez 10 min w temperaturze 37 °C.
  5. Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 mL pożywki hodowlanej. Resuspenduj komórki i przenieś je do probówki o pojemności 15 mL. Pobierz 10 µL w celu zliczenia komórek w komorze Neubauera i ustalenia odpowiedniego stężenia.
  6. Wiruj probówkę 15 mL przez 7 min w temperaturze 20 °C przy 250 × g. Usuń nadsącz i resuspenduj osad do pożądanego stężenia: hFBs do 50 000 komórek/mL oraz hKCs do 5·× 106 komórek/mL.

6. Przygotowanie roztworu fibrinogenu przed żelowaniem

  1. Aktywować trombinę, dodając 1mL CaCl2 (1% w/v w NaCl) do fiolki.
  2. Dodać następujące składniki, aby otrzymać 1 mL hydrożelu fibrynowego o końcowym stężeniu fibryny 3,5 mg/mL: 59 µL aktywowanej trombiny (10 jednostek NIH/mL), 59 µL kwasu traneksamowego (Tabela Materiałów, 100 mg/mL), 764 µL pożywki hodowlanej zawierającej 50 000 hFBs/mL, 118 µL fibrynogenu (20 mg/mL w NaCl (0,9% w/v)).
    UWAGA: Fibrynogen należy dodać na samym końcu.

7. Protokół przepływu równoległego

  1. Przez cały proces pompuj 1x PBS pompą 3 przez LCi z prędkością 50 µL/min.
  2. Pompuj płyn poświęcalny (1x PBS) pompą 2 przez UCi2 z prędkością 100 µL/min.
  3. Napełnij strzykawkę preżelem, szybko umieść ją w pompie 1 i uruchom z prędkością 200 µL/min (Rysunek 4A).
  4. Zatrzymaj pompy 1 i 2, gdy preżel opuści UCo.
  5. Pozostaw chip z podłączonymi przewodami w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 min, aby umożliwić żelowanie.
  6. Przez całą noc pompuj pożywkę hodowlaną pompą 3 przez UCi2 z prędkością 50 µL/h.
  7. Zablokuj UCi1 za pomocą korka.

8. Wysiewanie monowarstwy hKCs

  1. Pod mikroskopem należy sprawdzić, czy hFB są rozprzestrzenione 24 h po utworzeniu przedziału skórnego.
  2. Wprowadź hKCs za pomocą pompy 2 przez UCi2 w stężeniu 5 × 106 komórek/ml przy 40 µL/min przez 1 min (Rycina 4B).
  3. Pozostawić chip przez noc w 37 °C w inkubatorze z nasyconą wilgotnością w celu adhezji komórek.
  4. Pompowanie świeżej pożywki za pomocą pompy 3 wyłącznie przez LCi przy 50 µL/min (Rycina 4C).

Schemat modelu skóry: warstwowanie hFb przed żelowaniem (A), integracja medium hodowlanego hkCs (B), ekspozycja na powietrze (C), przekrój poprzeczny (D).
Rysunek 4: Protokół mikroprzepływowy dla generowania konstruktu skórno-epidermalnego. (A) Przekrój poprzeczny przedstawiający proces przepływu równoległego w celu wytworzenia przedziału skórnego. (B) Wysiew monowarstwy keratynocytów 24 h po wytworzeniu przedziału skórnego. (C) Utrzymywanie hodowli komórkowej wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego. (D) Rekonstrukcja przekroju poprzecznego skóry wewnątrz chipa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

9. Test żywotności komórek

UWAGA: Zestaw Live/Dead barwi komórki na zielono lub czerwono w zależności od tego, czy są żywe, czy martwe. Aby uzyskać prawidłowe rozróżnienie żywotności, w tym kroku należy użyć niefluorescencyjnych hKCs i hFBs. Wszystkie etapy procedury są realizowane za pomocą UCi2 z pompą 2.

  1. Przemyć górny kanał 1x PBS przez 5 min z przepływem 50 µL/min, aby usunąć pożywkę hodowlaną.
  2. Przepompować powietrze, aby usunąć 1x PBS z przepływem 50 µL/min.
  3. Przygotować roztwór z zestawu Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Przepompować roztwór Live/Dead z przepływem 50 µL/min przez 2 min.
  5. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w ciemności.
  6. Przemyć górny kanał, pompując 1x PBS z przepływem 50 µL/min przez 2 min, aby usunąć pozostałości odczynnika.
  7. Obserwować próbkę pod mikroskopem konfokalnym. W przypadku komórek żywych i martwych zastosować odpowiednio długość fali wzbudzenia 495/590 nm oraz długość fali emisji 519/617 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaprojektowany chip składa się z dwóch komór płynowych oddzielonych membraną poliwęglanową (PC) o rozmiarze porów 5 µm, która umożliwia wzrost komórek poprzez przepuszczanie cząsteczek promujących wzrost z dolnej komory. Górna komora zawiera konstrukt tkankowy, w tym przypadku monowarstwę hKCs na hydrożelu fibrynowym zawierającym hFBs.

Wysokość kanałów jest określona przez liczbę arkuszy klejących dodanych do każdego z nich. Dolna komora składa się z 4 warstw (380 µm), a górna z 10 warstw taśm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Motywacją do opracowania tej metody była chęć modelowania chorób skóry oraz badania efektów nowych i innowacyjnych terapii na platformie wysokoprzepustowej. Do tej pory laboratorium to wytwarza te dermo-naskórkowe odpowiedniki poprzez odlewanie - ręcznie lub za pomocą technologii biodruku 3D - żelu fibrynowego z fibroblastami do płytki wprowadzającej do hodowli komórkowej i umieszczanie na niej keratynocytów. Gdy keratynocyty osiągną zbieg, kultura 3D jest wystawiana na działanie granicy faz powietrze-ciecz, która induku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy dr Javierowi Rodríguezowi, dr Maríi Luisie López, Carlosowi Matellánowi i Juanowi Francisco Rodríguezowi za bardzo pomocne sugestie, dyskusje i/lub wstępne dane. Serdecznie dziękujemy również Sergio Férnandezowi, Pedro Herrerosowi i Larze Stolzenburg za wkład w ten projekt. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Marty Garcíi za hFB i hKC z oznaczeniem GFP. Na koniec doceniamy doskonałą pomoc techniczną ze strony Guillermo Vizcaíno i Angélicy Corral. Prace te były wspierane przez "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Prace te były również wspierane przez "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AmchafibrynaRottafarmKwas traneksamowy
Antybiotyk/PrzeciwgrzybiczyThermo Scientific HyClone
Chlorek wapniaSigma Aldrich
Płytki hodowlaneFisher
DMEMInvitrogen Life Technologies
Taśma dwustronna vynilATP Systemy klejoweGM 107CC, 12 i mikro; m gruby
Ploter krawędziowyBrotherScanncut CM900
FBSThermo Scientific HyClone
FibrinogenSigma AldrichEkstrahowany z ludzkiego osocza
SzkiełkoThermo Scientific
GFP-Ludzkie fibroblasty skórne-Podstawowe. Prezent od dr Marty Garcí
linia komórkowa H2B-GFP-HaCaTATCCUnieśmiertelnione keratynocyty. Prezent od dr Marty Garcí
zestaw Live/deadInvitrogen
PBSSigma Aldrich
Membrana poliwęglanowaMerk TM5 µ m wielkość porów
PolidimetylosiloksanDow CorningSylgard 184
Chlorek soduSigma Aldrich
StrzykawkiTerumo5 ml
TrombinSigma Aldrich10 NIH/fiolka
Przezroczysty klej winylowyMactacJT 8500 CG-RT, 95 µ m grube
Trypsin/EDTASigma Aldrich
IDEXTeflon, 1/16" Średnica zewnętrzna, 0,020" Id
: rurki

Bibliografia

  1. McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
  2. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).
  3. Abd, E., et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).
  4. Flaten, G. E., et al. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).
  5. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).
  6. Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
  7. Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. Pronko et al. Reply. Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387(2001).
  8. H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858 (2016).
  9. Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html (2018).
  10. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
  11. OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. OECD Guideline for Testing of Chemicals. , (2019).
  12. Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).
  13. vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).
  14. Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
  15. Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).
  16. Wu, R., et al. Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function. Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).
  17. Materne, E. -M., et al. The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526(2015).
  18. Schimek, K., et al. Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications. Bioengineering. 5 (2), 43(2018).
  19. Alberti, M., et al. Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing. Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).
  20. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  21. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Wufuer, M., et al. Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment. Scientific Reports. 6, 37471(2016).
  23. Ramadana, Q., Ting, F. C. W. In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin. Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).
  24. Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898(2020).
  25. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  26. Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  27. Huh, D. A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice. Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).
  28. Beckwitt, C. H., et al. Liver ' organ on a chip '. Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).
  29. Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. Human-gut-microbiome on a chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).
  30. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  31. Escámez, M. J., et al. Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement. Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).
  32. Llames, S. G., et al. Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin. Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).
  33. Llames, S., et al. Clinical results of an autologous engineered skin. Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).
  34. Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 9 (1), 015006(2016).
  35. Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip. Biomaterials. 116, 48-56 (2017).
  36. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).
  37. Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nature Communications. 7, 11535(2016).
  38. Marx, U., et al. Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man. Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).
  39. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  40. Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation. Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).
  41. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).
  42. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  43. O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture. Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).
  44. Ren, K., Chen, Y., Wu, H. New materials for microfluidics in biology. Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Winylowa mikroprzepływowośćmetoda przepływu równoległegoprzedział skórnyprzedział naskórkowymacierz fibrynowaludzkie pierwotne fibroblastymonowarstwa keratynocytów
Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.