Artykuł metodologiczny

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62364

⸱

23 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science & Innovation Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Streszczenie

Krystalografia makromolekularna o długich falach (MX) wykorzystuje anomalne właściwości rozpraszania pierwiastków, takich jak siarka, fosfor, potas, chlor czy wapń, które często są naturalnie obecne w makrocząsteczkach. Umożliwia to bezpośrednie rozwiązanie struktury białek i kwasów nukleinowych poprzez fazowanie eksperymentalne bez konieczności dodatkowego znakowania. Aby wyeliminować znaczną absorpcję promieni rentgenowskich przez powietrze w tym reżimie długości fali, eksperymenty te przeprowadza się w środowisku próżniowym. Beamline I23 w Diamond Light Source w Wielkiej Brytanii jest pierwszym tego typu instrumentem synchrotronowym, zaprojektowanym i zoptymalizowanym do eksperymentów MX w długim zakresie długości fal do 5 A.

Aby to umożliwić, duże naczynie próżniowe otacza wszystkie elementy końcowe środowiska próbki. Konieczność utrzymywania próbek w temperaturach kriogenicznych podczas przechowywania i zbierania danych w próżni wymaga zastosowania uchwytów na próbki przewodzących ciepło. Ułatwia to skuteczne odprowadzanie ciepła, zapewniając chłodzenie próbki do około 50 K. Obecny protokół opisuje procedury stosowane do przygotowania próbek i transferu próbek do próżni na linii badawczej I23. Zapewniając jednolitość praktyk i metod już ugruntowanych w społeczności krystalografii makromolekularnej, chłodzenie próbki do temperatury ciekłego azotu można przeprowadzić w dowolnym środowisku laboratoryjnym wyposażonym w standardowe narzędzia MX.

Kriogeniczne przechowywanie i transport próbek wymagają tylko standardowego, dostępnego na rynku sprzętu. Do przenoszenia kriogenicznie chłodzonych kryształów z ciekłego azotu do próżniowej stacji końcowej wymagany jest specjalistyczny sprzęt. Opracowane zostały specjalnie opracowane narzędzia do obsługi próbek oraz dedykowany system transferu kriogenicznego (CTS). Dane dyfrakcyjne zebrane na próbkach przygotowanych przy użyciu tego protokołu wykazują doskonałe statystyki łączenia, co wskazuje, że jakość próbek pozostaje niezmieniona podczas procedury. Otwiera to unikalne możliwości dla MX w próżni w zakresie długości fal wykraczającym poza standardowe synchrotronowe linie badawcze.

Wprowadzenie

Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego o długich falach jest używana do wykorzystania anomalnych właściwości rozpraszania specyficznych atomów światła natywnie obecnych w makrocząsteczkach. Pomaga to rozwiązać problem fazy krystalograficznej i jednoznacznie potwierdzić tożsamość i lokalizację takich pierwiastków w makrocząsteczkach. Podczas gdy we wczesnych dniach krystalografii makromolekularnej struktury de novo były rozwiązywane przez wielokrotną izomorficzną zamianę1, wraz z pojawieniem się przestrajalnych linii promieniowania rentgenowskiego w synchrotronach, eksperymentalne fazy oparte na technikach dyfrakcji anomalnej o wielu długościach fali i pojedynczej długości fali (SAD) stały się dominującymi metodami2. Obie metody historycznie opierały się na izomorficznym lub anomalnym sygnale metali ciężkich, które musiały być sztucznie wprowadzone do kryształów przez kokrystalizację lub nasączanie kryształami3. Podejście oparte na próbach i błędach oraz nieprzewidywalny wynik mogą sprawić, że eksperymenty te będą frustrująco czasochłonne. Włączenie selenometioniny podczas ekspresji białek4 jest bardzo eleganckim sposobem na przezwyciężenie tych ograniczeń i wykorzystanie anomalnej dyfrakcji na krótkich falach, chociaż może to być bardzo trudne w systemach ekspresji białek eukariotycznych.

Długofalowy MX jest niezwykle atrakcyjny do określania struktury za pomocą natywnych eksperymentów SAD5,6 ze względu na wygodę korzystania z kryształów bezpośrednio z udanej próby krystalizacji bez dalszego leczenia. Dodatkowo dostęp do krawędzi absorpcyjnych pierwiastków o dużym znaczeniu biologicznym, takich jak wapń, potas, chlor, siarka i fosfor, otwiera możliwość bezpośredniej identyfikacji pozycji tych pierwiastków w makrocząsteczkach7,8,9,10. Przy średniej i niskiej rozdzielczości przypisanie pierwiastków na podstawie gęstości elektronów 2Fo-F c i środowiska chemicznego może być trudne, szczególnie w przypadku pierwiastków o podobnej liczbie elektronów lub słabo związanych jonów z częściowym zajęciem. Niejasności te można rozwiązać, zbierając dane poniżej i powyżej krawędzi absorpcji elementu będącego przedmiotem zainteresowania i interpretując wynikową różnicę anomalną w fazie modelowania Mapy Fouriera11,12. Lokalizowanie pozycji atomów siarki na tych mapach może również pomóc w budowaniu modeli map gęstości elektronów o niskiej rozdzielczości13. Krawędzie absorpcyjne tych lekkich pierwiastków są obserwowane na długościach fal od λ = 3 do 6 A (patrz Rysunek 1, góra). Ten zakres długości fal znacznie wykracza poza możliwości jakiejkolwiek synchrotronowej linii badawczej MX, a efektywna praca w tym zakresie wymaga pokonania kilku wyzwań technicznych, które zostały opisane poniżej.

Linia badawcza I23 w Diamond Light Source, Wielka Brytania, jest unikalnym instrumentem, specjalnie zaprojektowanym do ułatwiania eksperymentów MX na długich falach, przestrajalnym w zakresie długości fal od λ = 1,13 do 5,9 A (zakres energii między E = 2,1 a 11 keV). Pracując w środowisku wysokiej próżni14, absorpcja i rozpraszanie powietrza są eliminowane, co w konsekwencji zwiększa wydajność eksperymentów dyfrakcyjnych i stosunek sygnału do szumu. Duża próżniowa stacja końcowa zawiera wszystkie elementy środowiska próbki, w tym półcylindryczny detektor Pilatus 12M, goniometr wieloosiowy, systemy podglądu i kolimacji on-line, a także specjalnie zaprojektowane urządzenia do przenoszenia i przechowywania próbek (Rysunek 2). Każdy element wyposażenia został zoptymalizowany, aby zapewnić możliwość zbierania danych o długich falach najwyższej jakości. Zakrzywiony detektor Pilatus 12M może zbierać dane do kątów dyfrakcji 2θ = ±100°, co skutkuje wystarczająco wysoką rozdzielczością danych dyfrakcyjnych nawet przy najdłuższych długościach fal (Rysunek 1, na dole). 120 modułów detektora zostało specjalnie dobranych pod kątem kompatybilności niskoenergetycznej i zapewniono kalibracje dla dodatkowego trybu ultra-wysokiego wzmocnienia.

Najniższy możliwy próg detektora to 1,8 keV, co prowadzi do zwiększonych efektów narożnika i krawędzi dla energii niższych niż 3,6 keV i pogorszenia jakości danych na najdłuższych długościach fal, szczególnie dla kryształów o niskiej mozaikowości. Efekt ten w połączeniu ze spadkiem wydajności kwantowej detektora15 należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentu. Wieloosiowy goniometr umożliwia reorientację kryształów, aby umożliwić strategie gromadzenia danych, które maksymalizują jakość i siłę anomalnego sygnału, a także kompletność zebranych anomalnych danych. Absorpcja próbki jest czynnikiem ograniczającym dla eksperymentów, szczególnie przy najdłuższych długościach fal. Korekcje absorpcji, zaimplementowane w powszechnie używanych pakietach oprogramowania do przetwarzania MX16,17, działają dobrze dla długości fal około 3 A. Dłuższe fale będą wymagały analitycznych poprawek absorpcyjnych opartych na rekonstrukcjach tomograficznych18 lub ablacji laserowej w celu usunięcia materiału niedyfrakcyjnego i pocięcia kryształów w dobrze zdefiniowane kształty19. To ostatnie pomoże również w zmniejszeniu rozmiaru większych kryształów, ponieważ eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej na dłuższych falach są bardziej wydajne dla mniejszych kryształów14. Wyzwaniem związanym z utrzymaniem próbek w temperaturach kriogenicznych podczas zbierania danych jest chłodzenie przewodzące, ponieważ korzystanie z urządzeń do strumienia zimnego gazu o otwartym przepływie nie jest kompatybilne ze środowiskiem próżniowym. W związku z tym materiały przewodzące ciepło, takie jak miedź, są potrzebne do podłączenia próbki do chłodnicy kriogenicznej z rurką impulsową. Standardowe kołki SPINE ze stali nierdzewnej stosowane w MX, a także wszelkie inne dostępne na rynku mocowania próbek, nie nadają się do MX o dużej długości fali w próżni ze względu na ich słabą przewodność cieplną.

Uchwyty na próbki (SHs) dla MX w próżni muszą być istotną częścią ścieżki termicznej odprowadzania ciepła (Rysunek 3A). W związku z tym składają się z przewodzącego ciepło miedzianego korpusu i trzpienia oraz mają dwie ważne cechy: mocną podstawę magnesu, która zapewnia odpowiednie połączenie termiczne z zimną głowicą goniometru, oraz mocowanie próbki, wykonane z poliimidu, w celu zminimalizowania absorpcji i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego20. Dołożono starań, aby zapewnić, że doświadczenie użytkownika związane z pozyskiwaniem kryształów i chłodzeniem błyskawicznym jest prawie identyczne z tym, które wiąże się ze standardowymi praktykami MX. Ponieważ dedykowane I23 SH nie są bezpośrednio kompatybilne z innymi liniami synchrotronowymi, adapter ze stali nierdzewnej jest używany w celu zapewnienia kompatybilności z różdżkami magnetycznymi do zbierania kryształów i istniejącymi interfejsami goniometru na innych liniach badawczych MX (Rysunek 3B). Adapter jest również ważny do wykorzystania urządzeń automatyzacji na innych liniach badawczych Diamond MX, które są oparte na głowicach chwytaków robotów typu ALS21 i układach bazowych w stylu unipuck22, jeśli zmienność próbki wymaga szybkiego wstępnego przesiewania w celu wyboru najlepszych kryształów dyfrakcyjnych. Protokół przygotowania i załadunku próbki można podzielić na dwa etapy:

Etap 1: Zbieranie kryształów i błyskawiczne zamrażanie wykonywane przez użytkowników w ich własnych laboratoriach

Po ocenie przydatności projektu do zbierania danych I23, uchwyty na próbki z pętlami pasującymi do rozmiarów kryształów (wstępnie zmontowane z adapterami) są wysyłane do laboratoriów użytkowników w celu pobrania kryształów. Aby zapobiec uszkodzeniom, SH i adaptery nie powinny być rozdzielane i powinny być używane jako jedna jednostka do łowienia kryształów z pętlami o odpowiedniej wielkości przy użyciu standardowych różdżek magnetycznych do zbierania kryształów. Jak to zwykle bywa w MX, zadanie to jest wykonywane ręcznie pod mikroskopem, a kryształy są natychmiast chłodzone w piance dewara z ciekłym azotem23. Ze względu na niedopasowanie sił magnetycznych, SH nie są obecnie kompatybilne z unipuckami. Magazynowanie i wysyłka odbywa się za pomocą kombajnów (patrz Tabela Materiałów), które są dostępne dla użytkowników na życzenie, wraz z kompatybilnymi wkładkami do transportu suchego (Rysunek 3C). Krążki te mają tę samą płytę bazową co powszechnie stosowane krążki i umożliwiają szybkie wstępne badanie próbek na innych liniach badawczych Diamond MX. Wypożyczenie tego sprzętu użytkownikom jest obecnie najlepszym rozwiązaniem, dopóki niestandardowe uchwyty na próbki nie będą dostępne na rynku. Transport na linię badawczą wymaga standardowych załadowców suchych używanych w społeczności MX.

Etap 2: Transfer próbek chłodzonych kriogenicznie do próżniowej stacji końcowej

Gdy próbki dotrą na linię badawczą, są przygotowywane do transferu do próżniowej stacji końcowej. Polega to na usunięciu SH z kombajnów i oddzieleniu ich od adapterów. Wprowadzanie próbek biologicznych do próżni jest rutynowo wykonywane w dziedzinie mikroskopii krioelektronowej. Niektóre z dobrze ugruntowanych koncepcji zostały zaadaptowane do transferu próbek I23. Krótko mówiąc, SH są przenoszone pod ciekłym azotem na bloki transferowe (Rysunek 3D). Bloki te mają doskonałą przewodność cieplną i znaczną masę termiczną, co zapobiega osiąganiu przez kryształy temperatury zeszklenia w próżni. Do czterech bloków, o pojemności czterech próbek każdy, jest ładowanych pod ciekłym azotem do krążka blokowego (Rysunek 3H), który jest używany albo do przenoszenia próbek do kriogenicznego systemu transferu (CTS), albo do przechowywania w ciekłym azocie dewarów między eksperymentami.  

System Kriogenicznego Transferu opracowany w Diamond Light Source składa się z dwóch podzespołów, Stacji Próbkowania i Wahadłowca (Rysunek 4A). Stacja próbkowania składa się z kąpieli w ciekłym azocie do tymczasowego przechowywania kryształów białka i posiada specyficzne cechy zapewniające bezpieczeństwo i umożliwiające przyjazne dla użytkownika doświadczenie (Rysunek 5). CTS jest sterowany za pomocą programowalnego sterownika logicznego za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu ekranu dotykowego. Stacja pobierania próbek ma wbudowane diody elektroluminescencyjne dla lepszej wizualizacji oraz zestaw grzałek sterowanych w zamkniętej pętli, aby zautomatyzować suszenie kąpieli ciekłego azotu po przeniesieniu próbek. Posiada również różnorodne czujniki zapewniające bezpieczeństwo i sprawne funkcjonowanie systemu. Stacja pobierania próbek jest wyposażona w specjalny sprzęt, który zapewnia niezawodny interfejs elektryczny do interakcji z wahadłowcem w przypadku operacji, takich jak pompowanie do niskiej próżni w celu przeniesienia próbki, a także monitorowanie poziomu ciekłego azotu i temperatury wewnątrz wahadłowca.

Wahadłowiec (Rysunek 6) to przenośne urządzenie służące do pobierania bloku transferowego z kąpieli ciekłego azotu w stacji pobierania próbek i przenoszenia go w środowisku kriogenicznym i próżniowym do stacji końcowej. Zawiera dewara z ciekłym azotem, który utrzymuje próbki w niskiej temperaturze podczas przenoszenia, monitorowanie poziomu cieczy w dewarze oraz różnorodne czujniki zapewniające działanie i bezpieczeństwo użytkownika. Ramię transferowe jest wyposażone w napęd magnetyczny i zawiera obrobione rowki, które prowadzą użytkowników przez bezpieczny załadunek i rozładunek bloków transferowych do stacji końcowej. Transfer z wahadłowca do zbiornika próżniowego odbywa się przez śluzę powietrzną. Śluza powietrzna jest interfejsem dla wahadłowca na stacji końcowej, służącym do ewakuacji przestrzeni między wahadłowcem a stacją końcową, przed otwarciem zaworów podciśnieniowych wahadłowca i stacji końcowej. Sekwencje pompowania i odpowietrzania są w pełni zautomatyzowane i mogą być obsługiwane za pomocą dużego ekranu dotykowego z przyjaznym dla użytkownika interfejsem (Rysunek 4C). Obecny protokół służy do przesyłania kryształu taumatyny do próżniowej stacji końcowej w celu zebrania danych.

Protokół

1. Zbieranie kryształów

UWAGA: Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej: gogli i rękawic, jeśli to możliwe.

  1. Po tym, jak SH dotrą do laboratorium użytkownika w kombipukach (Rysunek 3C), oddziel pokrywkę od podstawy kombikucji tak, aby SH pozostały przymocowane do podstawy, a fiolki zostały zatrzymane w pokrywie.
  2. Zanurzyć pokrywkę z fiolkami w ciekłym azocie. Podłącz adapter SH + (Rysunek 3B, po prawej) do magnetycznej różdżki i zbieraj kryształy jak zwykle.
  3. Schładzaj każdą próbkę bezpośrednio w kombikucie, zwracając uwagę na położenie próbki. Aby zamknąć krążek, użyj różdżki krążka, aby przymocować podstawę do pokrywy.
  4. Przenieś kombipuk z ciekłego azotu do suchego transportera lub dewara do przechowywania ciekłego azotu. Wyślij przesyłkę w stanie suchym do firmy Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).

2. Przeniesienie próbki do próżni

  1. Załadunek SH z kombipuku do bloku przeładowczego
    1. Umieść podstawę krążka blokowego (Rysunek 3H) już wypełniony pustymi blokami transferowymi (Rysunek 3D) na jego podstawie nośnej wewnątrz ciekłego azotu w pojemniku piankowym (Rysunek 3J-b).
      UWAGA: Orientacja bloków transferowych jest ważna dla dokładności przenoszenia próbki wewnątrz naczynia próżniowego. W związku z tym klocki powinny być umieszczone na podstawie krążka blokowego, upewniając się, że pinezka oznaczona strzałką w Rysunek 3D znajduje się po lewej stronie bloku.
    2. Umieść krążek z fiolką w pojemniku piankowym wypełnionym ciekłym azotem, upewniając się, że podstawa krążka jest przymocowana do uchwytu magnetycznego wewnątrz pojemnika z pianką (Rysunek 3J-a).
    3. Wstępnie schłodzić wszystkie niezbędne narzędzia w ciekłym azocie. Użyj narzędzia do separatora krążków pokazanego na Rysunek 3G na wysokim ustawieniu H, aby oddzielić pokrywę od podstawy, tak aby podstawa pozostała przymocowana do uchwytu magnetycznego, a SH były odsłonięte wewnątrz ciekłego azotu.
    4. Aby wyjąć każdy SH z adaptera, użyj różdżki separatora (Rysunek 3F), aby podnieść SH z podstawy kombajnu i umieść w odpowiedniej pozycji bloku transferowego w pozycji poziomej karuzeli w Rysunek 3J-b.
      1. Umieść różdżkę separatora nad adapterem SH + tak nisko, jak to możliwe, upewniając się, że różdżka jest pionowa, aby uniknąć dotykania próbki.
      2. Przesuń kciukiem małą dźwignię na różdżce separatora w dół, aż usłyszysz kliknięcie, aby zabezpieczyć SH w środku i wyciągnij SH z adaptera.
      3. Opuść separator nad żądaną pozycję bloku, upewniając się, że jeden z trzech bolców pasuje do środkowego otworu bloku.
      4. Zwolnij SH, przesuwając dźwignię z powrotem do góry. Powtórz te kroki dla każdego SH.
    5. Aby załadować próbki do następnego bloku próbki, użyj narzędzia klucza karuzeli (Rysunek 3E), aby obrócić pusty blok do pozycji poziomej.
    6. Przymocuj narzędzie do separatora krążków pokazane na Rysunek 3G, używając niskiego ustawienia L do pokrywy krążka blokowego, przykręcając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
    7. Po przeniesieniu wszystkich SH, aby zamknąć krążek blokowy, umieść pokrywkę w ciekłym azocie i poczekaj, aż temperatura się wyrówna, a następnie załóż pokrywkę na podstawę, jak w Rysunek 3I. Po dołączeniu narzędzia do separatora delikatnie podnieś, aby zwolnić z karuzeli.
    8. Na tym etapie krążek blokowy może zostać przeniesiony do CTS (Rysunek 4B) lub do dewara magazynującego ciekły azot.
  2. Załadunek bloków transferowych do zbiornika próżniowego
    1. Upewnij się, że wahadłowiec jest bezpiecznie przymocowany do stacji. Otwórz zawory azotu i powietrza i upewnij się, że gazy płyną. Włącz CTS.
    2. Jeśli na wyświetlaczu nie pojawią się żadne komunikaty ostrzegawcze, należy przystąpić do schładzania zarówno wanny, jak i czółenka ciekłym azotem. Umieść dostarczony lejek w porcie napełniania na wahadłowcu i powoli wlewaj ciekły azot do lejka, monitorując poziom na ekranie. Zatrzymaj się, gdy wskaźnik zmieni kolor z czerwonego na niebieski.
      UWAGA: Wahadłowiec jest gotowy do użycia, gdy temperatura zimnego siedzenia wyświetlana na ekranie dotykowym jest niższa niż 100 K. Wanna stacji próbkowania może być napełniana jednocześnie za pomocą odpowiedniego lejka do poziomu oznaczonego na ściance wanny lub w 100% na wyświetlaczu poziomu ciekłego azotu. Czujniki poziomu ciekłego azotu i temperatury powinny być stale monitorowane przez cały czas pracy; Wymagane będzie kilka doładowań.
    3. Gdy temperatura zimnego siedzenia wahadłowca spadnie poniżej 100 K, a poziom ciekłego azotu na wózku i wannie ustabilizuje się, przenieś krążek blokowy z ciekłego azotu do kąpieli CTS za pomocą dołączonego separatora krążków. Zdejmij pokrywę krążka blokowego i zamknij pokrywę wanny CTS.
    4. Aby wprowadzić blok do wózka, należy otworzyć zawór CTS, jeśli nie jest jeszcze otwarty, naciskając przycisk Otwórz zawór wahadłowy na wyświetlaczu. Odblokuj uchwyt wahadłowy, obracając go o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przesuń go w kierunku wanny tak, aby prowadnica na uchwycie wymusiła prawidłową ścieżkę ruchu w kierunku wanny. Gdy osłona bloku jest widoczna wewnątrz wanny, pozwól jej ostygnąć. Po ustaniu bulgotania ciekłego azotu wokół pokrywy przejdź do bloku transferowego.
    5. Aby zablokować blok transferowy na wózku, obróć uchwyt o 180° zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
    6. Cofnij uchwyt do pierwotnej tylnej pozycji, a następnie "zablokuj" go na miejscu, obracając o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
    7. Naciśnij przycisk Zamknij zawór wahadłowy i pompę na ekranie wyświetlacza, aby rozpocząć ewakuację wahadłowca.
    8. Gdy na ekranie dotykowym pojawi się komunikat Wahadłowiec gotowy do odłączenia, naciśnij dźwignię pod wózkiem i ostrożnie podnieś go za pomocą uchwytu u góry.
    9. Przenieś wahadłowiec do śluzy powietrznej na stacji końcowej odkurzacza w pozycji pionowej.
    10. Przymocuj wahadłowiec do śluzy powietrznej na stacji końcowej odkurzacza.
      UWAGA: Po bezpiecznym zamocowaniu ekran dotykowy na stacji końcowej potwierdzi stan wózka i blokady.
    11. Wybierz pustą pozycję bloku w zbiorniku, naciskając odpowiedni przycisk na ekranie dotykowym i przesuwając sample hotel do właściwej pozycji załadunku.
    12. Gdy przykładowy hotel znajdzie się na swoim miejscu, przycisk Otwórz stanie się aktywny. Naciśnij ten przycisk, aby zainicjować sekwencję blokady podciśnienia.
      UWAGA: Pompa uruchomi się, a postęp zostanie wyświetlony na monitorze. Może to potrwać do dwóch minut.
    13. Po zakończeniu sekwencji status zmieni się na Śluza powietrzna otwarta, transfer w toku. Przekręć uchwyt o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby odblokować pręt, i delikatnie wepchnij pręt do naczynia, aby prowadzona prowadnica ponownie wymusiła prawidłową ścieżkę podróży w kierunku sample pozycja hotelu. Korzystając z sygnału wideo wyświetlanego na ekranie w celu uzyskania wskazówek, powoli włóż klocek do hotelu, upewniając się, że lampka pozycyjna bloku na wyświetlaczu dotykowym jest włączona. Po aktywacji obróć uchwyt o 180° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zwolnić blok i wyciągnij pręt z naczynia. Po całkowitym schowaniu obróć uchwyt o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zablokować pręt.
    14. Gdy pręt zostanie zablokowany, przycisk Zamknij stanie się aktywny. Naciśnij to, aby zamknąć zawór podciśnieniowy stacji końcowej i odpowietrzyć przestrzeń między wahadłowcem a naczyniem do ciśnienia atmosferycznego, czekając do 20 s na zakończenie.
    15. Poczekaj, aż wyświetlacz pokaże stan w porządku, aby usunąć czółenko po zakończeniu sekwencji. W tym momencie usuń czółenko i wróć do CTS, aby powtórzyć proces dla następnego bloku.
    16. Aby przygotować następny blok do przeniesienia, obróć krążek blokowy w wannie. Wciśnij wbudowany klucz obrotowy na górze akrylowej pokrywy w dół do zamka pośrodku krążka blokowego. Przytrzymując go, przekręć kluczyk, aby ustawić żądany blok w pozycji podbieracza.
    17. Po przeniesieniu wszystkich bloków upewnij się, że zawór wahadłowy jest otwarty, gdy jest zamontowany na CTS. Naciśnij przycisk pieczenia na ekranie dotykowym i wybierz zarówno kąpiel, jak i wahadło, a następnie naciśnij bake.
      UWAGA: Powoduje to rozgrzanie zarówno czółenka, jak i wanny w celu zagotowania ciekłego azotu, a następnie odparowania nagromadzonego lodu/kondensatu przed następnym użyciem. Po rozpoczęciu pieczenia można wyłączyć dopływ gazu i powietrza.

Wyniki

Kryształ taumatyny wprowadzono do stacji próżniowej zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Dane dyfrakcyjne zebrano przy długości fali 2,7552 Å (E = 4500 eV) w postaci 3600 obrazów z przyrostem obrotu 0,1° i czasem ekspozycji 0,1 s na obraz. Rozmiar wiązki ustawiono na 150 µm x 150 µm i zredukowano transmisję do 10%, przy odpowiadającym temu pomiarze strumienia wynoszącym 7,1 x 109 fotonów/s. Wybór λ = 2,7552 Å wynika z kompromisu między wzrostem sygnału anomalnego a efektami absorpcji próbki, a także spadkiem rozdzielczości przy dłuższych długościach fal. Mimo że wartość ta nie jest bliska teoretycznej krawędzi absorpcyjnej siarki (λ= 5,0095 Å), przy tej długości fali urojona część czynnika rozpraszania siarki f" wynosi 1,57 e-, co jest wartością o 1,6-2,1 raza większą w porównaniu do długości fal między 1,7 a 2 Å. Powstałe w ten sposób silniejsze sygnały anomalne umożliwiają skuteczne wyznaczenie faz metodą S-SAD w przypadku bardziej wymagających projektów.

Na linii wiązki I23 przeprowadzono już szereg trudnych eksperymentów związanych z wyznaczaniem faz.24,25,26,27z danymi zebranymi przy tej długości fali. Choć fazowanie metodą S-SAD jest możliwe przy użyciu znacznie krótszych długości fal, często wymaga ono wzmocnienia sygnału anomalnego poprzez scalanie danych z wielu izomorficznych kryształów w celu osiągnięcia wartości multiplicity przekraczających 10028Ze względu na wzmocniony sygnał anomalny przy dłuższych długościach fal, większość projektów wyznaczania faz rozwiązanych na linii I23 wymagała danych zaledwie z jednego kryształu. Reprezentatywny obraz dyfrakcyjny przedstawiono na Rysunek 7, po lewej. Przetwarzanie danych przy użyciu programu Xia2-3dii29 uzyskano doskonałe statystyki scalania, zgodnie z opisem w Tabela 1. Rysunek 7po prawej stronie przedstawiono fragment reprezentatywnego obrazu dyfrakcyjnego z zestawu danych dla taumatyny, co ilustruje niskie tło otaczające refleksy Bragga; przyczynia się to do wysokich wartości I/σ(I) zazwyczaj obserwowanych w układzie próżniowym, zapewniając, że do detektora docierają jedynie promienie X rozproszone przez próbkę.

Maksymalna osiągalna rozdzielczość 1.8 Å wynika z geometrii detektora oraz wybranej długości fali promieniowania rentgenowskiego. Zbiór danych dostarczył bardzo silnego sygnału anomalnego, co odzwierciedla wartość parametru średniego nachylenia prawdopodobieństwa normalnego dla sygnału anomalnego wynosząca 2,677, co ułatwiło rozwiązanie struktury za pomocą automatycznego potoku fazowania CRANK2. Wysoka jakość wynikłej mapy gęstości elektronowej umożliwiła pomyślne automatyczne budowanie modelu przez moduł Buccaneer30 w ramach CRANK231, z poprawnym rozmieszczeniem 100% sekwencji aminokwasowej taumatyny. Fazowana mapa różnicowa Fouriera dla sygnału anomalnego, obliczona za pomocą ANODE11, ujawnia 16 bardzo dobrze uporządkowanych atomów siarki oraz jeden atom siarki z Cys159 w dwóch alternatywnych konformacjach, co potwierdzają 18 znaczących wysokości pików w pozycjach rozpraszaczy anomalnych w Tabeli 2. 16 reszt cysteiny w taumatynie tworzy 8 mostków disiarczkowych, które są wszystkie wyraźnie widoczne na mapie 2Fo-Fc (Rycina 8).

Wykres absorpcji i rozdzielczości promieni rentgenowskich z poziomami energii; analiza widmowa dla pierwiastków Ca, K, Cl, S, P.
Rysunek 1: Dane dyfrakcyjne o wysokiej rozdzielczości z eksperymentów MX z długimi falami. (A) Wykres wartości f" w funkcji energii, wskazujący krawędzie absorpcyjne lekkich pierwiastków dostępne na linii wiązki I23. (B) Maksymalna rozdzielczość osiągalna na narożnikach detektora P12M w funkcji energii. Skrót: MX = krystalografia makromolekularna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat ustawienia tomografii rentgenowskiej z goniometrem, detektorem i pozycją próbki; szczegóły procesu obrazowania.
Rycina 2: Przekrój poziomy przez komorę próżniową ze wszystkimi komponentami stacji końcowej. Skrót: OAV = system obserwacji w osi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Komponenty sprzętu do spektrometrii mas, pozłacane sondy; układ eksperymentalny, pomiar precyzyjny.
Rysunek 3: Narzędzia do obsługi próbek. (A) Uchwyt na próbkę I23. (B) Standardowy pin MX spine (lewo) obok uchwytu na próbkę I23 z adapterem (prawo). (C) Pokrywa i podstawa Combipuck z uchwytami na próbki I23 (niebieskie). Pokrywa i podstawa Block puck z dwoma blokami transferowymi (złote). W tle widoczna jest rurka do suchego transportu (dry shipper cane), kompatybilna zarówno z Combipuckami, jak i Block puckami. (D) Blok transferowy z czterema uchwytami na próbki I23. (E) Narzędzie kluczowe służące do obracania podstawy Block puck. (F) Pręt separatora. (G) Narzędzie separatora Puck z dwiema strzałkami wskazującymi ustawienia wysokie i niskie. (H) Podstawa Block puck z czterema pustymi blokami Cu. (I) Pokrywa do Block puck. (J) Pojemnik piankowy ze wszystkimi niezbędnymi narzędziami do przenoszenia uchwytów na próbki z podstaw Combipuck do bloków miedzianych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja systemu kriogenicznego z panelem sterowania; sprzęt do analizy eksperymentalnej i widok wnętrza komory.
Rycina 4: System transferu kriogenicznego. (A) Stacja próbek CTS z podłączonym wahadłem oraz lejkami używanymi do napełniania. (B) Bloczek z dwoma blokami transferowymi umieszczony wewnątrz CTS. (C) Ekran dotykowy oprogramowania sterującego CTS. Skrót: CTS = Cryogenic Transfer System. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat kriostacji z ekranem dotykowym, rotacją uchwytów oraz czujnikiem LN2, służącej do przygotowania próbek.
Rycina 5: Stacja próbek kriogenicznego systemu transferowego. Skróty: LEDs = diody emitujące światło; LN2 = ciekły azot. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat systemu przenoszenia ciekłego azotu; opisane komponenty; naczynie Dewara, uchwyt; zastosowanie kriogeniczne.
Rysunek 6: Wahadło systemu przenoszenia kriogenicznego. Skróty: LEDs = diody emitujące światło; LN2 = ciekły azot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa ciepła wydajności transfekcji, wynik eksperymentu edycji genów, analiza danych z kodowaniem kolorystycznym.
Rycina 7Obrazy dyfrakcyjne. Po lewej, obraz dyfrakcyjny z zestawu danych zebranych dla kryształu taumatyny. Prawda, refleks dyfrakcyjny otoczony pikselami tła o niskiej liczbie zliczeń. Aby wyświetlić większą wersję tej figury, kliknij tutaj.

Analiza struktury białka; krystalografia; schemat; mapa gęstości elektronowej; konformacja cząsteczkowa.
Rycina 8: Rozwiązanie struktury taumatyny za pomocą automatycznego rurociągu CRANK2 (ustawienia domyślne, bez późniejszego udoskonalenia). (A) Przegląd taumatyny z mapą 2Fo-Fc przy 1,6σ (niebieska) oraz zfazowaną mapą różnicową Fouriera dla sygnałów anomalnych przy 5σ obliczoną w programie ANODE (zielona). (B) Przegląd taumatyny przedstawiający wyłącznie zfazowaną mapę różnicową Fouriera dla sygnałów anomalnych przy 5σ. (C) Powiększony widok mostka dwusiarczkowego obecnego w taumatynie z mapą 2Fo-Fc przy 1,6σ (niebieska) oraz zfazowaną mapą różnicową Fouriera dla sygnałów anomalnych przy 5σ. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

NazwaTaumatyna
Długość fali gromadzenia danych (Å) (energia (eV))2.7552 (4500)
Liczba obrazów x rozmiar klina (°)3600 x 0,1
Grupa przestrzennaP 41212
Parametry komórki elementarnej
(a = b, c) (Å)57.8, 150.2
(α = β = γ) (°)90
Rozdzielczość (Å)150.22–1.80 (1.84–1.80)
Kompletność96.3 (81.1)
ISa36.48
Rpomiary0.042 (0.118)
Rpim0.01 (0.049)
CC1/21 (0.989)
I/σ(I)57.9 (14.7)
Krotność15.0 (5.4)
Środkowy odcinek stoku2.677

Tabela 1: Statystyki gromadzenia i przetwarzania danych dla taumatyny przy długości fali 2,755 Å na linii wiązki I23, DLS. Dla rozdzielczości, kompletności, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) oraz wielokrotności, powłoki wysokiej rozdzielczości podano w nawiasach. Skrót: DLS = Diamond Light Source.

Najbliższy atomWysokość piku (sigma)
CYS925.83
CYS5625.03
MET11224.54
CYS14924.37
CYS12624.21
CYS14524.2
CYS13423.6
CYS17723.48
CYS20423.43
CYS6623.17
CYS16422.54
CYS19322.15
CYS15821.51
CYS7721.21
CYS12120.8
CYS7119.17
CYS159_112.27
CYS159_28.34

Tabela 2: Wysokości pików na mapie różnic Fouriera dla rozproszenia anomalnego, obliczone przez program ANODE przy użyciu zfazowanego i automatycznie zbudowanego modelu z programu CRANK2.

Dyskusja

Obecny protokół został opracowany w celu spełnienia wymagań dotyczących przygotowania próbek do eksperymentów MX na długich falach w próżni na linii badawczej I23. Jest on wykorzystywany na linii badawczej od roku i przyczynił się do pomyślnego zakończenia wielu projektów. Jak wskazują przedstawione tu wyniki, protokół umożliwia bezpieczny i niezawodny transfer próbek do próżniowej stacji końcowej przy zachowaniu ich jakości dyfrakcyjnej. Jest to ważny aspekt dla funkcjonowania linii badawczej i będzie mu towarzyszyć osobiste szkolenie użytkowników prowadzone przez personel linii. Warto podkreślić niektóre z etapów jako kluczowe dla pomyślnego i bezpiecznego zakończenia procedury: przenoszenie próbek z baz kombipuckowych do bloków próbek wymaga dokładności i uwagi, aby uniknąć uszkodzenia próbek (zob. krok 2.1.4); monitorowanie poziomu ciekłego azotu na wszystkich etapach jest ważne, aby zapobiec wystawieniu próbek na działanie powietrza lub bliskiemu kontaktowi z częściami, które nie są odpowiednio chłodzone (2.1.3 i 2.2.2); odczekanie, aż sekwencja zamykania (2.2.14) zostanie całkowicie zakończona, przed wyjęciem czółenka ze stacji końcowej (2.2.15), aby uniknąć degradacji podciśnienia w stacji końcowej.

Koncepcja protokołu została zainicjowana wraz z pracami inżynieryjnymi mającymi na celu opracowanie specjalnie skonstruowanego sprzętu do przenoszenia kryształów białek do środowiska próżniowego. Końcowymi produktami tego projektu były CTS i związane z nim narzędzia do obsługi próbek opisane powyżej. CTS jest znaczącym ulepszeniem w stosunku do swojego poprzednika, Leica EMVCT100 14, i usuwa wiele ograniczeń, takich jak brak osłony próbki i środowiska próżniowego podczas transferu, gromadzenie się lodu wewnątrz kąpieli ciekłego azotu oraz brak intuicyjnego interfejsu użytkownika i funkcji bezpieczeństwa. Dodatkowe funkcje CTS, które poprawiają komfort użytkowania, to monitorowanie temperatury i poziomu ciekłego azotu wewnątrz wózka i stacji pobierania próbek, wanna o większej pojemności, mieszcząca jednocześnie cztery bloki, a nie jeden, oraz samosterujący mechanizm do obsługi wózka. CTS jest w pełni zintegrowany z systemem sterowania linią badawczą z przyjaznym dla użytkownika interfejsem ekranu dotykowego oraz zwiększonym podciśnieniem i bezpieczeństwem mechanicznym podczas łączenia ze stacją końcową.

Beamline I23 jest pierwszym tego rodzaju instrumentem synchrotronowym MX pracującym na długich falach, w związku z czym wprowadzenie kryształów białka do środowiska wysokiej próżni i przechowywanie ich w temperaturach kriogenicznych wymagało znacznych wysiłków. Trwają prace nad ulepszeniami narzędzi i protokołu przygotowywania próbek, a także wysiłki na rzecz usprawnienia procesów. W ramach wsparcia dla użytkowników, pracownicy linii badawczej są zawsze dostępni, aby pomóc w rozwiązywaniu problemów. Przykładem jednego z takich scenariuszy mogą być problemy, które zagrażają integralności systemu próżniowego, prowadząc do trudności w podłączaniu lub zdejmowaniu wahadłowca do/z CTS lub śluzy końcowej stacji. Różne poziomy testów są wykonywane co tydzień i codziennie, a szkolenie użytkowników obejmuje dodatkowe kontrole w celu uniknięcia potencjalnych awarii, takie jak kontrola wzrokowa O-ringów na interfejsach, do których przymocowany jest wózek. Podczas gdy środowisko próżniowe otwiera możliwość przeprowadzania eksperymentów dyfrakcyjnych w zakresie długości fal niedostępnym na innych liniach badawczych, dodatkowy etap transferu zmniejsza ogólną przepustowość próbki.

Ręczny transfer z tylko czterema próbkami na blok transferowy i do pięciu bloków wewnątrz naczynia próżniowego ogranicza całkowitą pojemność do 20 próbek. W związku z tym, w przypadku projektów z dużą zmiennością między próbkami, próbki powinny być wstępnie przesiewane na liniach badawczych Diamond o wysokiej przepustowości, a następnie tylko najbardziej obiecujące próbki powinny być przenoszone do późniejszego zoptymalizowanego eksperymentu na długich falach. Podczas gdy uchwyty na próbki i bloki transferowe pozostały niezmienione od czasu ich pierwszego wprowadzenia kilka lat temu, prezentowane tutaj narzędzia do obsługi są całkowicie nowymi rozwiązaniami. Dedykowane uchwyty na próbki I23 są niezmienne ze względu na ich rolę w koncepcji chłodzenia linii badawczej. W związku z tym projekt narzędzi do obsługi próbek miał na celu stworzenie powiązania między tym nowym typem uchwytu a standardowymi dostępnymi na rynku narzędziami, które społeczność użytkowników MX przyjmowała od dawna, takimi jak kombajny, różdżki do zbierania kryształów i system transportu suchych nadawców. Ich projekt wymagał intensywnych konsultacji ze społecznością użytkowników i wymagał kilku iteracji do ukończenia. Prezentowany tutaj sprzęt, narzędzia i protokół reprezentują prosty i solidny system do transferu próbek użytkownika do eksperymentów na linii badawczej I23 w Diamond Light Source. Ten instrument do krystalografii makromolekularnej na długich falach w próżni otwiera nowe możliwości dla biologii strukturalnej.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Adamowi Taylorowi, Adamowi Prescottowi, Kenowi Jonesowi, Arvinderowi Palaha i Kevinowi Wilkinsonowi za ich wsparcie w rozwoju Systemu Transferu Próbek Kriogenicznych (CTS). Ta praca została sfinansowana przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Detektor 12MDectris, SzwajcariaDetektor promieniowania rentgenowskiego zliczający pojedyncze fotony
CombiPuckMiTeGenSKU: M-CBP-P1Kriopuki używane do kriogenicznego przechowywania i transportu uchwytów i próbek I23
Różdżka magnetyczna do zbierania kryształówWymiary molekularneMD7-411Służy do zbierania kryształów
Dry Shipper (CX100)Wymiary molekularneMD7-21Służy do kriogenicznego przechowywania i transportu uchwytów na próbki I23 i próbek
Sucha wkładka transportowa (CombiPuck Transport Cane)MiTeGenSKU: M-CBP-PTC1Służydo kriogenicznego przechowywania i transportu uchwytów na próbki I23 i próbek
Poliimidkaptonowyuchwyt na próbkę wykonany z poliimidu Kapton
Akrylowa pokrywkaz wbudowanym kluczem obrotowym
Proszek taumatyny  Sigma-AldrichT7638Stosowany do wytwarzania kryształów taumatyny metodą dyfuzji parowej
Perpsex

Bibliografia

  1. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287(1954).
  2. Hendrickson, W. A. Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation. Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).
  3. Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  4. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  5. Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).
  6. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).
  7. Rozov, A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nature Communications. 10 (1), 2519(2019).
  8. Rocchio, S., et al. Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).
  9. Langan, P. S., et al. Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels. Nature Communications. 9 (1), 4540(2018).
  10. Lolicato, M., et al. K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions. Science Advances. 6 (44), (2020).
  11. Thorn, A., Sheldrick, G. M. ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation. Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).
  12. Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).
  13. Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters. Nature Communications. 9 (1), 550(2018).
  14. Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).
  15. Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).
  16. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  17. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  18. Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples. Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).
  19. Kitano, H., et al. Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).
  20. Mykhaylyk, V., Wagner, A. Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum. Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010(2013).
  21. Snell, G., et al. Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source. Structure. 12 (4), 537-545 (2004).
  22. The universal container project. , Available from: https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/ (2020).
  23. Teng, T. Y., et al. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film. Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).
  24. Esposito, D., et al. Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3. Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).
  25. O'Donnell, J. P., et al. The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion. eLife. 9, 57887(2020).
  26. Mishra, A. K., et al. Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38. Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).
  27. Rudolf, A. F., et al. The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism. Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).
  28. El Omari, K., et al. Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).
  29. Winter, G. XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  30. Cowtan, K. The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).
  31. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4 (1), 2777(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krystalografia makromolekularnawyznaczanie faz eksperymentalnekrystalografia w próżnikriogeniczny transfer próbekprotokół przygotowania próbekrozpraszanie anomalneprzechowywanie kriogeniczneinstrument synchrotronowy
Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.