Artykuł metodologiczny

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62378

⸱

5 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Sheffield Institute for Nucleic Acids, Department of Chemistry, University of Sheffield

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Streszczenie

smfBox to niedawno opracowany ekonomiczny, otwarty instrument do transferu energii rezonansu Förstera (smFRET), który sprawia, że pomiary swobodnie dyfuzujących biomolekuł są bardziej dostępne. Ten przegląd zawiera protokół krok po kroku dotyczący korzystania z tego przyrządu do wykonywania pomiarów precyzyjnej wydajności FRET w dupleksowych próbkach DNA, w tym szczegóły dotyczące przygotowania próbki, konfiguracji i wyrównania instrumentu, pozyskiwania danych i pełnych procedur analizy. Przedstawione podejście, które obejmuje sposób określania wszystkich współczynników korekcyjnych wymaganych do dokładnych pomiarów odległości pochodzących z FRET, opiera się na dużej liczbie niedawnych prac prowadzonych w ramach współpracy w całej społeczności FRET, których celem jest ustanowienie standardowych protokołów i podejść analitycznych. Protokół ten, który można łatwo dostosować do szeregu systemów biomolekularnych, przyczynia się do rosnących wysiłków na rzecz demokratyzacji smFRET dla szerszej społeczności naukowej.

Wprowadzenie

Jednocząsteczkowy transfer energii rezonansowej Förstera (smFRET) to technika służąca do pomiaru wydajności FRET pomiędzy dwoma barwnikami – donorem a akceptorem – na poziomie pojedynczych cząsteczek. FRET jest procesem fotofizycznym wynikającym z nakładania się widm energetycznych dwóch barwników: donor jest wzbudzany światłem o określonej długości fali i przekazuje energię bezpromieniście do akceptora, co skutkuje emisją z akceptora. Wydajność tego transferu jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między dwoma barwnikami, zatem wydajność transferu zmienia się wraz z odległością1. W związku z tym wydajność FRET może być wykorzystana do określania informacji przestrzennych o cząsteczce(ach)2, do których przyłączone są barwniki, w zakresie od 3-10 nm. Taka skala oraz fakt, że zmiany wydajności FRET są czułe na ruchy molekularne rzędu angstremów3, sprawiają, że technika ta jest odpowiednia do badania informacji strukturalnych o biomolekułach – takich jak kwasy nukleinowe i białka – bez komplikacji wynikających z uśredniania ansamblowego4,5,6. Podczas gdy zmiany względnych wydajności FRET mogą być stosowane do monitorowania oddziaływań biomolekularnych i dynamiki konformacyjnej, rzucając światło na kluczowe procesy komórkowe, takie jak zwijanie i rozwijanie białek, transkrypcja oraz replikacja i naprawa DNA, bezwzględne wydajności FRET były wykorzystywane do wyznaczania precyzyjnych odległości w celu określania struktury biomolekularnej7,8,9,10,11, co eliminuje konieczność krystalizacji lub zamrażania, których wymagają niektóre inne metody strukturalne4,12.

Eksperymenty smFRET najczęściej przyjmują dwie formy: mikroskopię konfokalną lub mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). W zależności od podejścia, dynamikę molekularną biomolekuł można zazwyczaj badać w skalach czasowych od pikosekund do milisekund (mikroskopia konfokalna, cząsteczki dyfundujące swobodnie) oraz od milisekund do godzin (TIRF, cząsteczki unieruchomione na powierzchni). Wynika to z różnych konfiguracji aparatury stosowanych w każdej z tych technik. W mikroskopii TIRF cząsteczki są unieruchomione na powierzchni szkiełka i pobudzane przez falę ewanescentną (Rysunek 1A). Tutaj jednak uwaga skupia się na mikroskopii konfokalnej, ponieważ jest to format urządzenia smfBox. W mikroskopii konfokalnej cząsteczki nie są unieruchomione, lecz dyfundują swobodnie w wyniku ruchu Browna przez objętość konfokalną (~1 fL), tworzoną przez ogniskowanie wiązki lasera za pomocą soczewki o wysokiej aperturze numerycznej w punkcie na określonej głębokości wewnątrz roztworu (Rysunek 1B). Powstała emisja jest ogniskowana z powrotem przez tę samą aperturę i filtrowana przez lustro dichroiczne (Rysunek 1C w celu zapoznania się z pełnym schematem). Następnie jest ona ogniskowana przez otwór pinhole, aby usunąć światło poza ogniskiem, i kierowana na fotodiodę lawinową (APD). Gdy APD wykryje foton, generuje impuls TTL, którego czas może być rejestrowany z rozdzielczością do pikosekund. Czas obserwacji tych swobodnie dyfundujących cząsteczek w pobliżu objętości konfokalnej mieści się zazwyczaj w rzędzie milisekund.

Schematy mikroskopii optycznej przedstawiające ścieżki wzbudzenia i emisji w obrazowaniu fluorescencyjnym.
Rycina 1: Schematy przedstawiające zasady mikroskopii oraz konfigurację smfBox. (A) Zasada mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF): światło wzbudzające jest kierowane na krawędź obiektywu (Obj.) i ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu na granicy szkiełka nakrywnego i buforu, generując wykładniczo zanikające pole ewanescentne w celu wzbudzenia cząsteczek przytwierdzonych do powierzchni. (B) Mikroskopia konfokalna: swobodnie dyfundujące cząsteczki są wzbudzane przez punkt skupiony w próbce, ograniczony blisko limitu dyfrakcyjnego. (C) Konfiguracja smfBox zastosowana w tym protokole, przedstawiająca wszystkie kluczowe komponenty: fotodiody lawinowe (APD), dzielnik wiązki (BS), lustra dichroiczne (DM), filtry (F), lustra (M), obiektyw (O) oraz otwór przypinowy (P). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W ostatnim czasie techniki smFRET zaczęto uzupełniać o dwukolorowe wzbudzanie, w którym naprzemiennie stosuje się lasery o długościach fal odpowiadających wzbudzeniu donora i akceptora5. Można to zrealizować na dwa sposoby: pierwszy polega na modulowaniu laserów w trybie ciągłym w skali kHz, co określa się mianem naprzemiennego wzbudzania laserowego (ALEX)13,14. Druga metoda wykorzystuje przeplatanie szybkich impulsów w skali MHz; jest to nanosekundowy ALEX (ns-ALEX)15 lub przeplatane wzbudzanie impulsowe (PIE)16. We wszystkich tych podejściach informacje pochodzące z lasera wzbudzającego akceptor pozwalają na obliczenie tzw. stechiometrii, co umożliwia odróżnienie cząsteczek o niskiej wydajności FRET od tych, którym brakuje akceptora (wynikającego z niepełnego znakowania lub fotoblaknięcia). Zastosowanie PIE/ns-ALEX daje dodatkowo dostęp do czasów życia fluorescencji na poziomie pojedynczych cząsteczek, a w połączeniu z optyką polaryzacyjną pozwala na pomiar anizotropii. Ta kombinacja pomiarów jest znana jako wieloparametryczna detekcja fluorescencji (MFD)9.

Pomimo wielu zalet smFRET, metoda ta nie jest szeroko stosowana poza specjalistycznymi laboratoriami ze względu na wysokie koszty instrumentów komercyjnych oraz brak prostych, samodzielnie budowanych alternatyw. Obserwuje się rosnącą tendencję do rozwoju niskokosztowej mikroskopii otwartoźródłowej i w ostatnim czasie pojawiły się inne platformy, w tym Planktonscope17, OpenFlexure Microscope18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21 oraz Squid22. Niniejsze badanie opisuje protokół wykorzystania smfBox, niedawno opracowanego, ekonomicznego układu konfokalnego zdolnego do pomiaru wydajności FRET między dwoma barwnikami na swobodnie dyfundujących pojedynczych cząsteczkach. Szczegółowe instrukcje budowy oraz całe niezbędne oprogramowanie operacyjne są swobodnie dostępne pod adresem: https://craggslab.github.io/smfBox/23. Układ optyczny smfBox jest złożony z łatwo dostępnych komponentów zakupionych od przystępnych cenowo i powszechnie dostępnych producentów, natomiast korpus mikroskopu (odpowiedzialny za większość kosztów w standardowym układzie konfokalnym) został zastąpiony niestandardową, światłoszczelną skrzynką z anodowanego aluminium (co pozwala na dokonywanie pomiarów w warunkach oświetlenia otoczenia). Skrzynka ta mieści kluczowe elementy optyczne, w tym dichroik wzbudzenia, obiektyw i otwór pinhole, a także mechaniczną blokadę lasera, co umożliwia jego bezpieczną eksploatację jako produktu laserowego klasy I (pełny schemat przedstawiono na Ryc. 1C). smfBox wykorzystuje ALEX do walidacji stechiometrii barwnika oraz do wyznaczenia dokładnych czynników korekcji FRET. Urządzenie jest obsługiwane za pomocą dedykowanego, otwartoźródłowego oprogramowania (smOTTER), które kontroluje wszystkie aspekty akwizycji danych i generuje dane w otwartoźródłowym formacie photon-HDF524, kompatybilnym z wieloma zewnętrznymi narzędziami analitycznymi. smfBox oraz protokoły akwizycji i analizy danych zostały niedawno przetestowane w porównaniu z >20 innymi instrumentami (zarówno konfokalnymi, jak i TIRF) w wieloośrodkowym badaniu ślepym25. Uzyskane wydajności FRET były w doskonałej zgodności z wynikami wszystkich innych instrumentów, mimo że koszt smfBox stanowi jedynie ułamek ceny zestawów dostępnych komercyjnie.

W niniejszym materiale przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący pozyskiwania i analizy dokładnych, bezwzględnych wartości wydajności FRET dla swobodnie dyfundujących dupleksów DNA przy użyciu urządzenia smfBox, obejmujący cały proces od włączenia urządzenia, przez wyrównanie i ustawianie ostrości, aż po gromadzenie i analizę danych. Próbki wykorzystane w tym opracowaniu to trzy dupleksy DNA (wykazujące wysoką, średnią i niską wydajność FRET, patrz Tabela 1), które zostały ocenione w międzynarodowym badaniu ślepym25; metoda ta jest jednak możliwa do adaptacji dla wielu systemów molekularnych, w tym białek i innych kwasów nukleinowych. Mamy nadzieję, że tak szczegółowy protokół, wraz z istniejącymi już instrukcjami budowy smfBox23, pomoże uczynić tę potężną technikę jeszcze bardziej dostępną dla szerokiego grona laboratoriów.

Protokół

1. Komponenty zasilania

  1. Włącz sześć wtyczek (kolejność nieokreślona): Piezoconcept (z-focus), APD0, APD1, zielony laser, czerwony laser i fotodetektor.

2. Oprogramowanie 1-Konfiguracja eksperymentalna

  1. Uruchom centrum sterowania laserem.
    1. Upewnij się, że wybrano tryb Ciągła fala - przemienny prąd stały (CW-ACC).
    2. Włącz oba lasery.
    3. Sprawdź/ustaw moce lasera.
      UWAGA: Moc lasera będzie musiała zostać dostosowana tak, jak została zmierzona tuż przed dichroicznym wzbudzeniem, ponieważ filtry ND i rozdzielacze wiązki na ścieżce wzbudzenia zmniejszą moc lasera w stosunku do liczby podanej na panelu sterowania laserem. Podane tutaj liczby to moc w dichroiku wzbudzenia, ale moc na sterowaniu laserem, która temu odpowiada, będzie musiała zostać obliczona.
      1. Zielony laser 220 μW (515 nm, 40 mW)
      2. μ70 W dla lasera czerwonego (638 nm, 10 mW)
  2. oprogramowanie do akwizycji smOTTER
    1. Podłącz lasery, detektory, stolik Z i kamerę. Skonfiguruj je poprawnie (może się różnić w zależności od ustawień konkretnej konfiguracji karty NI).

3. Wyrównanie ścieżki emisji (nie jest rutynowo wymagane)

  1. Ustawianie wyrównania
    1. Pobrać pipetę 10 μl wolnego barwnika Cy3B (~100 nM) na mikroskop i ustawić ostrość zgodnie z opisem w krokach 4.3-4.5 poniżej.
      UWAGA: Inny barwnik dawcy z pewnym wyciekiem do kanału akceptora również by zadziałał.
    2. Otwórz zakładkę Wyrównanie w smOTTER, zmniejsz moc lasera i zmień skalę osi y, aż odczyt będzie widoczny z detektorów.
      UWAGA: Celem jest tutaj zwiększenie sygnału, więc może być konieczna ponowna zmiana skali po wzroście sygnału.
    3. Odkręć cztery z przodu smfBox i zdejmij panel przedni.
  2. Wyrównanie otworków
    1. Przekręć pokrętło x na pozycjonerze otworkowym, obserwując sygnał na zakładce Wyrównanie, próbując zwiększyć sygnał na zielono i czerwono.
    2. Teraz obróć pokrętło y, aby wyrównać otwór w przeciwnym kierunku.
    3. Wróć do pokrętła x, aby sprawdzić, czy sygnał nie uległ dalszemu wzrostowi.
  3. Wyrównanie soczewki otworkowej
    1. Obróć pokrętło x obiektywu w jednym kierunku, spowoduje to zmniejszenie sygnału.
    2. Obróć pokrętło x otworka w tym samym kierunku, aby ponownie zwiększyć sygnał.
    3. Jeśli nowy maksymalny sygnał jest wyższy niż wcześniej, kontynuuj iteracyjne przesuwanie zarówno otworka, jak i soczewki w tym kierunku. Jeśli jest niższy niż wcześniej, iteracyjnie poruszaj się w przeciwnym kierunku.
    4. Powtórz powyższe czynności dla y.
  4. Wyrównanie obiektywu APD
    1. Zaczynając od zielonego APD, przesuwaj pokrętło x, aż zielony sygnał osiągnie maksimum.
    2. Powtórz te czynności dla pokrętła y.
    3. Wróć do pokrętła x, poruszaj się w przód iw tył, aby znaleźć punkty progowe, w których sygnał zaczyna spadać, i pozostaw go w pozycji w połowie drogi między tymi dwoma punktami.
    4. Powtórz tę czynność dla pokrętła x.
    5. Powtórz powyższe kroki dla czerwonej soczewki APD, obserwując czerwony sygnał.
  5. Umieść panel przedni z powrotem na smfBox i wkręć.
    UWAGA: Wykonaj powyższy miesięczny pomiar wyrównania oraz jako środek zapobiegawczy, jeśli podejrzewa się, że w mikroskopie wystąpił błąd wyrównania między pomiarami.

4. Akwizycja danych pomiarowych

  1. W przypadku pierwszej próbki należy oczyścić stolik chusteczką do czyszczenia soczewek nasączoną metanolem; delikatnie przetrzeć obiektyw od jednego końca do drugiego.
  2. Nałóż 3-4 krople olejku immersyjnego do mikroskopii na środek obiektywu; uzupełniaj w razie potrzeby między próbkami.
  3. Przygotowanie próbki
    1. Pobrać pipetą 10 μl próbki (ultraczysta woda typu I pierwszego użycia) na środek czystej szklanki nakrywkowej.
    2. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na soczewce obiektywu, opuszczając je pod kątem do oleju, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza między szkłem nakrywkowym a obiektywem.
      UWAGA: W razie potrzeby przesuń szkło nakrywkowe, aby wypchnąć pęcherzyki powietrza z oleju z dala od punktu ogniskowego.
  4. Aby przeprowadzić eksperymenty ze wzbudzeniem laserem przemiennym (ALEX), skonfiguruj laser w panelu cykli pracy lasera w następujący sposób.
    1. Dawca (zielony laser) 0 wył., 45 wł., 55 wył.
    2. Akceptor (czerwony laser) 50 wył., 45 wł., 5 wył.
    3. Okres ALEX (μs): 100
  5. Kliknij zakładkę Ostrość Z na wstążce; w panelu akwizycji przełącz lasery na Live (Na żywo) i uruchom kamerę; dostosuj ekspozycję tak, aby pojawił się jasny punkt otoczony czernią.
    UWAGA: Kamera rejestruje światło odbite przez granicę faz szkło/woda między szkiełkiem nakrywkowym a próbką, a widzialny okrąg światła ma najmniejszą średnicę, gdy ognisko znajduje się na tym interfejsie. W związku z tym konieczne jest rozpoczęcie poniżej tego interfejsu, zwiększenie wysokości z do granicy fazy, a następnie nieco dalej, aby skupić się powyżej szkiełka nakrywkowego i w mierzonej próbce.
    1. Zaczynając od niskiej pozycji Z, zwiększaj wysokość, aż jasna plamka osiągnie swój minimalny rozmiar, a następnie zwiększ wysokość jeszcze bardziej o maksymalnie 20 μm, aby skupić laser nad olejem i szkłem nakrywkowym oraz w próbce.
    2. Zatrzymaj aparat po ustawieniu ostrości.
  6. Aby potwierdzić, że konfiguracja została przeprowadzona prawidłowo, należy monitorować ślad ultraczystej wody typu I, aby nie zauważyć żadnych sygnałów fluorescencyjnych; powtórzyć potwierdzenie czystości dla, w których przygotowywane są próbki.
  7. Ostrożnie zdejmij szkło nakrywkowe za pomocą pęsety z gumową końcówką, aby uniknąć uszkodzenia obiektywu, a następnie umieść na obiektywie próbkę będącą przedmiotem zainteresowania. W razie potrzeby uzupełnij olejek immersyjny, aby utrzymać jednolitą powierzchnię kontaktu między szkłem nakrywkowym a obiektywem (szczególną uwagę zwrócono na obszar kontaktu próbki ze szkłem nakrywkowym i obszar ogniskowy obiektywu)
  8. Koncentracja bingo
    1. Aby zapewnić uzyskanie danych dotyczących pojedynczych cząsteczek, próbki muszą mieć stężenie, przy którym obserwuje się 1-5 impulsów na sekundę w panelu śledzenia na żywo smOTTER (minimalizuje to ryzyko obecności więcej niż jednej cząsteczki w objętości detekcji jednocześnie). Pomiary należy wykonać, gdy zostanie określone odpowiednie stężenie.
    2. Aby zapobiec parowaniu podczas długich eksperymentów, przygotuj szczelną komorę na próbki. Dociśnij izolatory silikonowe (otwór o średnicy 8-9 mm) do środka szkła nakrywkowego (pokolorowanego końcówką do pipety). Następnie ostrożnie odpipetuj próbkę do środka, unikając kontaktu z silikonem. Następnie umieść drugą szklankę nakrywkową na górze i dociśnij, aby utworzyć uszczelkę.
    3. Sprawdź histogram stechiometrii na żywo w funkcji wydajności FRET (ES), aby zobaczyć, czy próbka zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami, tj. oczekiwana wydajność FRET i rozsądna stechiometria (~0,5).
  9. Gdy próbka będzie gotowa, wprowadź szczegóły eksperymentu w panelu zapisywania ustawień. Wybierz odpowiedni katalog i nazwę pliku, klikając ikonę wielokropka (pliki zapisane w formacie hdf5/h5) w panelu zapisu ustawień.
    1. Wprowadź informacje o nazwie próbki, szczegółach próbki, etykietach dawcy i akceptora, długości fal wzbudzenia bufora, dawcy i akceptora, długości fal wykrywania i mocy lasera oraz przynależności użytkownika i użytkownika.
  10. Wróć do karty śledzenia na żywo na wstążce i w panelu akwizycji wprowadź długość eksperymentu (w minutach), wybierz odpowiedni interwał zapisywania, aby ograniczyć potencjalną utratę danych w przypadku błędu. W razie potrzeby wybierz opcję Save Laser Powers (Zapisz moce lasera).
  11. Naciśnij Start, aby pobrać dane.
    UWAGA: Aby umożliwić dokładne oznaczenie FRET, należy zmierzyć co najmniej dwie próbki zawierające te same barwniki donorowe i akceptorowe, ale o wystarczająco różnych wydajnościach FRET.

5. Analiza/oprogramowanie 2

  1. Uruchom notes Jupyter z pakietem języka Python FRETBursts (instrukcje konfiguracji można znaleźć tutaj: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html)
  2. Jeśli korekta na bezwzględną sprawność FRET nie jest potrzebna (tj. do pomiaru wystarczające są tylko względne zmiany FRET), uruchom Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb. Służy do eksportowania rysunków lub danych jako plików csv w celu dalszej analizy lub wykreślenia w innym oprogramowaniu.
    UWAGA: Każdy zeszyt zawiera szczegółowe instrukcje, które prowadzą użytkownika przez procedury analizy. Aby uzyskać bardziej szczegółowe omówienie procedur analizy, w tym algorytmów wyszukiwania serii, korekcji tła i wszystkich parametrów korekcji, zobacz23,25.
  3. Jeśli potrzebna jest korekta dla bezwzględnych sprawności FRET, należy rozpocząć od obliczenia parametrów przesłuchu alfa (wyciek emisji donorowej do kanału akceptora) i delta (proporcja bezpośredniego wzbudzenia akceptora pod wzbudzeniem donora).
    1. Najpierw uruchom program Alpha-Delta.ipynb notesu Jupyter Correction Factor Finder i określ parametry alfa i delta.
      UWAGA: Jeśli są one niespójne między próbkami, mikroskop mógł mieć problem z wyrównaniem między pomiarami lub widma barwników różnią się między próbkami.
    2. Jeśli parametry alfa i delta są spójne, uruchom program Jupyter notebook Correct Factor Finder Gamma-Beta.ipynb, aby określić parametry gamma i beta (które odpowiadają za różnice w skuteczności wzbudzenia i wykrywania między barwnikami).
      UWAGA: Jeśli wykres gamma i beta nie pasuje dobrze, mikroskop mógł mieć problem z wyrównaniem między pomiarami, wydajnością kwantową lub współczynnikami ekstynkcji barwników różniącymi się między próbkami.
    3. Po określeniu czterech parametrów przesłuchu, czynniki te mogą być używane w notatniku FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter do określenia bezwzględnej sprawności FRET.

6. Rozwiązywanie problemów

  1. Jeśli wszystkie sygnały są niskie lub liczba na serię jest niższa niż oczekiwano (jest to zależne od barwnika, ale dla ATTO-550 i ATTO-647N w smfBox typowe wartości wynoszą od 50 do 100 zliczeń na ms podczas serii pojedynczej cząsteczki), wyrównaj smfBox.
  2. Pomost między podwójnie i pojedynczo oznaczonymi populacjami na histogramie ES.
    UWAGA: Może to być spowodowane pracą w zbyt wysokim stężeniu (można temu zaradzić, rozcieńczając próbkę) lub fotowybielaniem, które może być spowodowane użyciem zbyt dużej mocy lasera (można temu zaradzić, zmniejszając moc lasera).
  3. Jeśli szybkość rozerwania spadnie w trakcie eksperymentu (cząsteczki znakowane fluorescencyjnie prawdopodobnie przylegają do szklanego szkiełka nakrywkowego), użyj zwiększonego stężenia BSA do rektyfikacji.
  4. Jeśli szybkość rozerwania wzrasta w trakcie eksperymentu (próbka prawdopodobnie paruje), przygotuj hermetyczną komorę na próbki, jak opisano powyżej.
  5. Jeśli sygnał spadnie do zera podczas wyrównywania (oprogramowanie prawdopodobnie jest przytłoczone sygnałem z detektorów), zmniejsz moc lasera lub użyj bardziej rozcieńczonej próbki wyrównania.
  6. Jeśli ognisko Z pokazuje koncentryczne pierścienie (może się to zdarzyć, jeśli na obiektywie umieszczono wiele szkiełek nakrywkowych), sprawdź, czy na obiektywie nie ma wielu szkiełek nakrywkowych.
  7. Jeśli próbka zawiera jasne, długie impulsy pośrednich stechiometrii (spowodowanych przez zagregowane cząsteczki), należy użyć detergentów lub zmodyfikować protokoły oczyszczania próbki.
    UWAGA: Uzyskanie czystego bufora może być problemem, ponieważ niektóre składniki bufora często zawierają bardzo małe ilości umiarkowanie fluorescencyjnych zanieczyszczeń, które wystarczają, aby przedstawić się jako pojedyncze wybuchy kolorów na śladzie czasu. Jeśli w buforze jest tego za dużo, może to zbiegać się z wybuchami próbki i zmienić mierzoną wydajność FRET lub stechiometrię. W szczególności BSA może być często problematyczne pod tym względem, dlatego pomocne jest wystawienie standardowego roztworu BSA na działanie silnego źródła światła w celu fotowybielania zanieczyszczeń.

Wyniki

Protokół wymaga krytycznej oceny warunków eksperymentalnych podczas konfiguracji (patrz krok protokołu 4.8). Na tym etapie uzyskuje się pierwsze wyniki, które determinują sukces lub niepowodzenie eksperymentu. Wynikiem pozytywnym jest uzyskanie od jednego do pięciu serii impulsów na sekundę (patrz Rycina 2B,C). Wynikiem negatywnym byłoby wystąpienie zbyt wielu serii (Rycina 2A) lub zbyt niewielu serii impulsów (Rycina 2D) w tym przedziale czasowym. Na tym etapie możliwe jest jeszcze skorygowanie tych błędów: próbkę o zbyt wysokim stężeniu należy po prostu rozcieńczyć; jeśli jednak stężenie jest zbyt niskie, konieczne może być przygotowanie nowej próbki (decydujące jest to, czy przy tak niskim stężeniu możliwe jest zebranie danych w rozsądnym czasie).

Czasowo-skorelowane zliczanie pojedynczych fotonów, wykres zaniku, eksperyment fluorescencyjny, analiza emisji.
Rysunek 2: Zrzuty ekranu z pomiaru w czasie rzeczywistym podczas konfiguracji eksperymentalnej, przedstawiające różne stężenia próbek dwukrotnie znakowanego dwuniciowego DNA. (A) zbyt wysokie, (B) górna dopuszczalna granica, (C) stężenie docelowe, (D) zbyt niskie. Liczba fotonów (biny 1 ms) jest pokazana w trzech kanałach detekcji: emisja donora po wzbudzeniu donora (DD), emisja akceptora po wzbudzeniu donora (DA) oraz emisja akceptora po wzbudzeniu akceptora (AA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Statyczny układ jednoskładnikowy zazwyczaj wymaga od 30 do 60 min pomiaru w celu uzyskania niezbędnej liczby ~1 000 impulsów (bursts) potrzebnych do wiarygodnej analizy danych. Czas trwania pomiaru oraz liczba wymaganych impulsów zwiększają się w przypadku układów wieloskładnikowych lub dynamicznych. Po zebraniu i analizie danych zgodnie z protokołem, wykresy są eksportowane z notatników Jupyter. Wykres naprzemienny (Rycina 3A) powinien odpowiadać okresowi ALEX w konfiguracji eksperymentalnej. Ślad czasowy (Rycina 3B) służy do jakościowej oceny, czy stężenie próbki jest odpowiednie. Wykres tła (Rycina 3C) przedstawia rozkład okresów opóźnienia między fotonami z liniowym dopasowaniem do dłuższych czasów w celu oszacowania poziomu tła26. Ślad tła (Rycina 3D) pozwala zidentyfikować, czy w trakcie trwania eksperymentu zaszły zmiany w próbce; wynika to przede wszystkim z odparowywania podczas dłuższych czasów akwizycji. Histogramy ES są generowane dla wszystkich fotonów (Rycina 3E) oraz dla gatunków podwójnie znakowanych (Rycina 3F). Na koniec generowany jest 1D histogram E (Rycina 3G) z dopasowaniem gaussowskim do danych z impulsów.

Analiza FRET pojedynczej cząsteczki; schematy i wykresy; oddziaływanie donora i akceptora; dane fluorescencyjne.
Rysunek 3: Przykład wyników analizy danych wygenerowanych za pomocą Notatników Jupyter. (A) Wykres naprzemienny, (B) ślad czasowy, (C) wyznaczanie tła, (D) szybkości tła, (E) histogram ES dla wszystkich fotonów, (F) dwukanałowy histogram ES oraz (G) jednowymiarowy histogram E. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

NazwaSekwencja
1a5’- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3’
3’- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5’
1b5’- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3’
3’- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5’
1c5’- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3’
3’- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5’

Tabela 1: Sekwencje DNA użyte w protokole. Nukleotydy zaznaczone na niebiesko i czerwono reprezentują odpowiednio reszty tymidyny modyfikowane w pozycji C2, znakowane Atto-550 i Atto-647N.

Correction Factor Finder Alpha-Delta: Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Narzędzie do wyznaczania współczynnika korekcji Gamma-Beta: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Analiza FRET 1.4 wersja poprawiona: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Analiza FRET 1.4 Uncorrected: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są ustawienie mikroskopu i dostosowanie stężenia próbki do prawidłowego rozcieńczenia. Jeśli wyrównanie jest wyłączone, sygnał może być niewystarczający do zidentyfikowania impulsów i wykreślenia histogramów, a jeśli wystąpi niewspółosiowość między próbkami, dokładna korekcja FRET może się nie powieść z powodu zmian w nieszczelności i skuteczności wykrywania / wzbudzenia. Nie bez znaczenia jest również zastosowanie odpowiedniego stężenia, zbyt wysokie stężenie spowoduje zbieżne wybuchy, zawierające wiele cząsteczek o potencjalnie różnej wydajności FRET lub znakujące stechiometrie. Zbyt niskie stężenie spowoduje zbyt małą liczbę impulsów do solidnej analizy danych.

Opisany tutaj protokół służy do pomiaru odległości w statycznych pojedynczych gatunkach FRET. Jeśli próbka ma więcej niż jeden pik na histogramie wydajności FRET lub piki wydają się szerokie (co może się zdarzyć w przypadku gatunków dynamicznych), może być potrzebnych więcej impulsów, aby dopasować histogramy do tego samego stopnia precyzji. W przypadku dwóch dobrze oddzielonych szczytów potrzeba około dwa razy więcej danych, ale jeśli populacje nieznacznie się pokrywają, potrzeba jeszcze więcej danych.

Jeśli obie populacje przejdą wzajemną konwersję w skali czasowej eksperymentu, można potencjalnie określić dynamikę i kinetykę systemu. Testy takie jak BVA27 i 2CDE28 mogą potwierdzić, że pośrednie impulsy mają charakter dynamiczny, podczas gdy analizy obejmujące dPDA29,30 lub H2MM31 mogą określić szybkość interkonwersji. Notebooki Jupyter dla BVA i 2CDE są dostępne na stronie internetowej FRETBursts26, a oprogramowanie PAM32 oparte na MATLab może uruchamiać analizy BVA, 2CDE i PDA.

Konfokalny jednocząsteczkowy FRET może z łatwością obserwować stany znacznie krócej żyjące (~1 ms) niż TIRF; Jednak krótkie czasy obserwacji, ograniczone dyfuzją, nie dają historii molekularnej, a więc nie mogą określić dłuższych czasów przebywania lub złożonych sieci przejściowych w sposób, w jaki mogą to robić eksperymenty unieruchomione na powierzchni.

Ponieważ protokół mierzy swobodnie dyfuzujące cząsteczki w bardzo niskim stężeniu, najlepiej sprawdza się przy pomiarze odległości wewnątrzcząsteczkowych na tej samej cząsteczce. Odległości międzycząsteczkowe między przejściowo związanymi cząsteczkami można zmierzyć, pod warunkiem, że Kd dwóch cząsteczek jest wystarczająco niskie, aby kompleks występował w znacznej ilości przy niskim stężeniu roboczym wymaganym przez doświadczenie (~100 pM). Jeśli Kd jest znacznie wyższe niż to, to widoczne będą tylko pojedynczo znakowane cząsteczki. Problem ten można rozwiązać, stosując mikrofluidykę do mieszania dwóch znakowanych składników razem w wysokim stężeniu, a następnie szybkiego rozcieńczania i przepływania przez obiektyw, zanim kompleks zdysocjuje33,34.

Pomiar wydajności FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki ma znaczną przewagę nad technikami zespołowymi, ponieważ informuje o heterogenicznych subpopulacjach, które w eksperymencie zespołowym zostałyby uśrednione. Co więcej, jednocząsteczkowy FRET z ALEX daje dostęp do dokładnych wydajności FRET, które można przekształcić na dokładne odległości. Umożliwia to określenie bardziej szczegółowych informacji strukturalnych, a nie tylko sondowanie względnych zmian odległości. smfBox niesie ze sobą wszystkie te zalety i możliwości, ale może być zbudowany przy znacznie niższym budżecie niż porównywalne dostępne na rynku mikroskopy zdolne do konfokalnego smFRET23.

smfBox stanowi znacznie niższą barierę wejścia dla technik smFRET, umożliwiając naukowcom pomiar zmian konformacyjnych oraz dokładne odległości w obrębie i między białkami a kwasami nukleinowymi 7,8,9,10,11,35.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują następującym źródłom finansowania: BBSRC (BB/T008032/1); EPSRC (Stypendium do B.A.) i MRC (Stypendium do A. R.-T.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oligonukleotyd modyfikowany aminamiEurogentecN/AMoże być zamawiany u różnych dostawców lub syntetyzowany; Modyfikacja aminokwasów umożliwia znakowanie barwnikami modyfikowanymi estrami NHS
Fotodioda lawinowa (APD)ExcelitasSPCM-AQRH-14Do konfiguracji smfBox wymagane są dwa APD
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)MerckA2153W zależności od systemu; składnik buforowy do obrazowania (0,1 mg/ml w bufor)
Kompaktowy sumator laserowyOMICRONLightHUB-2Lasery 515 nm (80 mW) i 638 nm (100 mW)
Szkło nakrywkoweVWR630-2742Grubość: 0,17 ± 0,01 mm, DxS: 22x22 mm
Cy3BCytivaPA631011 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg)
FRETBursts Python PakietN/A/APakiet Pythona o otwartym kodzie źródłowym do analizy impulsów swobodnie dyfuzyjnych danych FRET pojedynczych cząsteczek: Bufor
obrazowaniahttps://fretbursts.readthedocs.io Nie dotyczyW zależności od systemu; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7,5 i 0,1 mg/ml
BSA Olejek immersyjnyOlympusIMMOIL-F30CC
Notebooki JupyterProjekt JupyterN/AAplikacja internetowa typu open source do tworzenia i udostępniania dokumentów zawierających kod na żywo, równania, wizualizacje i tekst; notatniki do analizy danych dla smfBox można znaleźć w SI
Lens TissueThorLabsMC-5MC-50E to ten sam przedmiot luzem
Chlorek magnezuMerckM2670W zależności od systemu; komponent bufora obrazowania (20 mM w buforze)
MilliQ/Ultraczysta wodaNie dotyczy
NanopoistionerPiezoconceptFOC300Nanopozycjoner do dokładnego pozycjonowania Obiektyw mikroskopowy
modyfikowany estrem NHS ATTO-550ATTO-TECAD 550-311 mg, AD 550-35 (5 mg)
Estry modyfikowane NHS ATTO-647NATTO-TECAD 647N-311 mg, AD 647N-35 (5 mg)
Soczewka obiektywowaOlympusN1480700seria obiektywów Olympus od oryginalnego smfBox wycofany; zastąpiony przez N5702300
OMICRON Control Center (OCC)- laserowe centrum sterowaniaOMICRONNie dotyczyv3.5.34 - Oprogramowanie sterownika lasera OMICRON
Press-To-Seal izolator silikonowyGrace Bio-Labs664201  Średnica 8-9 mm x głębokość 1,7 mm
smOTTERN/A N/AOprogramowanie typu open source do akwizycji dla Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER
Chlorek soduMerckS7653Zależny od systemu; komponent bufora obrazowania (5 mM w buforze)
Tris baseMerck93362W zależności od systemu; komponent buforowy obrazowania (5 mM, pH 7,5 w buforze)
Woda ultraczysta typu IMerckZIQ7000T0Milli-Q® IQ 7000 System wody ultraczystej
N

Bibliografia

  1. Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).
  2. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).
  3. Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131(2013).
  4. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).
  5. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  6. Lerner, E., et al. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).
  7. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).
  8. Craggs, T. D., et al. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).
  9. Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676(2019).
  10. Nagy, J., et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161(2015).
  11. LeBlanc, S. J., et al. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).
  12. Segal, M., et al. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).
  13. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  14. Kapanidis, A. N., et al. Alternating-laser excitation of single molecules. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 523-533 (2005).
  15. Müller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  16. Laurence, T. A., Kong, X., Jager, M., Weiss, S. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).
  17. Pollina, T., et al. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978(2020).
  18. Collins, J. T., et al. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).
  19. Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949(2020).
  20. Martens, K. J. A., et al. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552(2019).
  21. Auer, A., et al. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).
  22. Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613(2020).
  23. Ambrose, B., et al. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641(2020).
  24. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716(2016).
  27. Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).
  28. Tomov, T. E., et al. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).
  29. Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
  30. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  31. Pirchi, M., et al. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).
  32. Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).
  33. Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  34. Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  35. Bennet, I. A., et al. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wydajność FRETinstrument smfBoxdwuniciowe DNAprzygotowanie próbkiwyrównanie instrumentuakwizycja danychfotodioda lawinowanaprzemienne wzbudzanie laseremstruktura biomolekularna
Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.