Artykuł metodologiczny

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

DOI:

10.3791/62378

⸱

5 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Sheffield Institute for Nucleic Acids, Department of Chemistry, University of Sheffield

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

smfBox to niedawno opracowany ekonomiczny, otwarty instrument do transferu energii rezonansu Förstera (smFRET), który sprawia, że pomiary swobodnie dyfuzujących biomolekuł są bardziej dostępne. Ten przegląd zawiera protokół krok po kroku dotyczący korzystania z tego przyrządu do wykonywania pomiarów precyzyjnej wydajności FRET w dupleksowych próbkach DNA, w tym szczegóły dotyczące przygotowania próbki, konfiguracji i wyrównania instrumentu, pozyskiwania danych i pełnych procedur analizy. Przedstawione podejście, które obejmuje sposób określania wszystkich współczynników korekcyjnych wymaganych do dokładnych pomiarów odległości pochodzących z FRET, opiera się na dużej liczbie niedawnych prac prowadzonych w ramach współpracy w całej społeczności FRET, których celem jest ustanowienie standardowych protokołów i podejść analitycznych. Protokół ten, który można łatwo dostosować do szeregu systemów biomolekularnych, przyczynia się do rosnących wysiłków na rzecz demokratyzacji smFRET dla szerszej społeczności naukowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer energii rezonansu Förstera (smFRET) to technika, która mierzy efektywność FRET między dwoma barwnikami - donorem i akceptorem - na poziomie pojedynczych molekuł. FRET to proces fotofizyczny powstający w wyniku nakładania się na siebie widm energetycznych dwóch barwników: donor jest wzbudzany światłem o określonej długości fali i przekazuje energię niepromieniowo do akceptora, co skutkuje emisją z akceptora. Wydajność tego transferu jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między dwoma barwnikami, więc wydajność transferu zmienia się w zależności od odległości1. W ten sposób ta wydajność FRET może być wykorzystana do określenia informacji przestrzennej o cząsteczce (cząsteczkach) < sup class="xref">2, do której przyłączone są barwniki, w zakresie 3-10 nm. Ta skala oraz fakt, że zmiany wydajności FRET są wrażliwe na ruchy molekularne angstroma3, sprawiają, że technika ta dobrze nadaje się do badania informacji strukturalnych o biomolekułach - takich jak kwasy nukleinowe i białka - bez komplikacji związanych z uśrednianiem zespołów4,5,6. Podczas gdy zmiany względnej wydajności FRET mogą być wykorzystywane do monitorowania interakcji biomolekularnych i dynamiki konformacyjnej, rzucając światło na kluczowe procesy komórkowe, takie jak (nie)fałdowanie białek, transkrypcja oraz replikacja i naprawa DNA, bezwzględne wydajności FRET zostały wykorzystane do określenia precyzyjnych odległości do określenia struktury biomolekularnej7,8,9,10, 11, pokonując potrzebę krystalizacji lub zamrażania, jak to jest wymagane w przypadku niektórych innych metod strukturalnych4,12.

smFRET eksperymenty najczęściej przyjmują dwie formy, mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Pomiędzy tymi dwoma podejściami dynamika molekularna biomolekuł może być zazwyczaj badana w skalach czasowych od piko- do milisekundy (konfokalne, swobodnie dyfuzyjne cząsteczki) do milisekundy do godzin (TIRF, cząsteczki unieruchomione powierzchniowo). Wynika to z różnych ustawień związanych z każdą techniką. W mikroskopii TIRF cząsteczki są unieruchomione na powierzchni szkiełka i wzbudzone przez falę ulotną (Rysunek 1A). Tutaj jednak nacisk kładziony jest na mikroskopię konfokalną, ponieważ jest to format smfBox. W mikroskopii konfokalnej cząsteczki nie są unieruchomione, a zamiast tego swobodnie dyfundują za pomocą ruchów Browna przez objętość konfokalną (~1 fL), utworzoną przez skupienie wiązki laserowej przez soczewkę o dużej aperturze numerycznej w miejscu na określonej głębokości w roztworze (Rysunek 1B). Powstała w ten sposób emisja jest skupiana z powrotem przez tę samą aperturę i filtrowana przez zwierciadło dichroiczne (Rysunek 1C dla pełnego schematu). Następnie jest ogniskowany przez otwór otworkowy w celu usunięcia nieostrego światła i umieszczany na fotodiodzie lawinowej (APD). Gdy APD wykryje foton, wysyła impuls TTL, którego czas może być rejestrowany z rozdzielczością do pikosekundy. Czas obserwacji tych swobodnie dyfuzyjnych cząsteczek w pobliżu objętości konfokalnej mieści się zwykle w granicach milisekund.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematy pokazujące zasady mikroskopii i konfiguracji smfBox. (A) Zasada mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF): światło wzbudzenia jest kierowane na krawędź obiektywu (Obj.) i ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu na granicy fazy-bufora, generując wykładniczo zanikające pole ulotności, które wzbudza cząsteczki przyczepione do powierzchni. (B) Mikroskopia konfokalna: Swobodnie dyfuzyjne cząsteczki są wzbudzane przez miejsce o ograniczonej dyfrakcji skupione w próbce. (C) Konfiguracja smfBox używana w tym protokole, pokazująca wszystkie kluczowe komponenty: fotodiody lawinowe (APD), rozdzielacz wiązki (BS), zwierciadła dichroiczne (DM), filtry (F), lustra (M), obiektyw (O) i otwór (P). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ostatnio techniki smFRET włączyły dwie metody wzbudzania kolorów, gdzie lasery pasujące do długości fal wzbudzenia donora i akceptora są naprzemiennie stosowane5. Można to zrobić na jeden z dwóch sposobów, pierwszy poprzez modulację laserów o fali ciągłej w skali czasu KHz, która jest znana jako przemienne wzbudzenie lasera (ALEX)13,14. Druga metoda przeplata szybkie impulsy w skali czasowej MHz; to jest nanosecond-ALEX15 lub impulsowe wzbudzenie z przeplotem (PIE)16. We wszystkich tych podejściach informacje z lasera akceptorowego prowadzą do obliczenia tzw. stechiometrii, która może rozróżnić cząsteczki o niskiej wydajności FRET od tych pozbawionych akceptora (albo poprzez niepełne znakowanie, albo fotowybielanie). Zastosowanie PIE/ns-ALEX dodatkowo daje dostęp do czasów życia świetlówek na poziomie pojedynczej cząsteczki, a anizotropie mogą być mierzone w połączeniu z optyką polaryzacyjną. Ta kombinacja pomiarów jest znana jako wieloparametrowa detekcja fluorescencji (MFD)9.

Pomimo wielu zalet smFRET, nie jest on powszechnie stosowany poza specjalistycznymi laboratoriami ze względu na wysokie koszty komercyjnych instrumentów i brak prostych, samodzielnie zbudowanych alternatyw. Obserwuje się rosnący trend w kierunku rozwoju taniej mikroskopii opensource, a ostatnio pojawiły się inne platformy, w tym Planktonscope17, OpenFlexure Microscope18, Flexiscope19, miCube20, liteTIRF21 i Squid22. W niniejszym badaniu opisano protokół korzystania z smfBox, niedawno opracowanego ekonomicznego zestawu konfokalnego, który jest w stanie zmierzyć wydajność FRET między dwoma barwnikami na swobodnie dyfuzujących pojedynczych cząsteczkach. Szczegółowe instrukcje budowy i wszystkie niezbędne oprogramowanie operacyjne są dostępne bezpłatnie pod adresem: https://craggslab.github.io/smfBox/23. Układ optyczny smfBox składa się z łatwo dostępnych komponentów zakupionych od niedrogich i powszechnie dostępnych producentów, podczas gdy korpus mikroskopu (odpowiedzialny za większość kosztów w standardowym zestawie konfokalnym) został zastąpiony niestandardową, światłoszczelną obudową z anodyzowanego aluminium (umożliwiającą wykonywanie pomiarów w warunkach oświetlenia otoczenia). W tej skrzynce znajdują się kluczowe elementy optyczne, w tym dichroik wzbudzenia, obiektyw i otwór oraz mechaniczna blokada laserowa, co umożliwia bezpieczną pracę jako produkt laserowy klasy I (pełny schemat znajduje się na rysunku 1C). smfBox wykorzystuje ALEX do walidacji stechiometrii barwnika i określenia dokładnych współczynników korekcyjnych FRET. Jest obsługiwany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania typu open source (smOTTER), które kontroluje wszystkie aspekty akwizycji danych i wyprowadza dane w formacie open-source photon-HDF5 24, kompatybilnym z wieloma narzędziami analitycznymi innych firm. smfBox oraz protokoły akwizycji i analizy danych zostały niedawno przetestowane z >20 innymi instrumentami (zarówno konfokalnymi, jak i TIRF) w ślepym badaniu z udziałem wielu laboratoriów25. Uzyskana wydajność FRET była w doskonałej zgodzie ze wszystkimi innymi instrumentami, mimo że smfBox kosztował tylko ułamek ceny dostępnych na rynku konfiguracji.

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół do pozyskiwania i analizowania dokładnych, bezwzględnych skuteczności FRET na swobodnie dyfuzujących dupleksach DNA za pomocą smfBox, aż do włączenia, poprzez wyrównanie i skupienie, aż do zbierania i analizy danych. Użyte tutaj próbki to trzy dupleksowe DNA (wykazujące wysoką, średnią i niską skuteczność FRET, patrz Tabela 1), które zostały ocenione w ogólnoświatowym ślepym badaniu25; Metodę można jednak dostosować do wielu układów molekularnych, w tym białek i innych kwasów nukleinowych. Mamy nadzieję, że tak szczegółowy protokół, wraz z już istniejącymi instrukcjami budowania dla klasy smfBox23, pomoże uczynić tę potężną technikę jeszcze bardziej dostępną dla szerokiego grona laboratoriów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Komponenty zasilania

  1. Włącz sześć wtyczek (kolejność nieokreślona): Piezoconcept (z-focus), APD0, APD1, zielony laser, czerwony laser i fotodetektor.

2. Oprogramowanie 1-Konfiguracja eksperymentalna

  1. Uruchom centrum sterowania laserem.
    1. Upewnij się, że wybrano tryb Ciągła fala - przemienny prąd stały (CW-ACC).
    2. Włącz oba lasery.
    3. Sprawdź/ustaw moce lasera.
      UWAGA: Moc lasera będzie musiała zostać dostosowana tak, jak została zmierzona tuż przed dichroicznym wzbudzeniem, ponieważ filtry ND i rozdzielacze wiązki na ścieżce wzbudzenia zmniejszą moc lasera w stosunku do liczby podanej na panelu sterowania laserem. Podane tutaj liczby to moc w dichroiku wzbudzenia, ale moc na sterowaniu laserem, która temu odpowiada, będzie musiała zostać obliczona.
      1. Zielony laser 220 μW (515 nm, 40 mW)
      2. μ70 W dla lasera czerwonego (638 nm, 10 mW)
  2. oprogramowanie do akwizycji smOTTER
    1. Podłącz lasery, detektory, stolik Z i kamerę. Skonfiguruj je poprawnie (może się różnić w zależności od ustawień konkretnej konfiguracji karty NI).

3. Wyrównanie ścieżki emisji (nie jest rutynowo wymagane)

  1. Ustawianie wyrównania
    1. Pobrać pipetę 10 μl wolnego barwnika Cy3B (~100 nM) na mikroskop i ustawić ostrość zgodnie z opisem w krokach 4.3-4.5 poniżej.
      UWAGA: Inny barwnik dawcy z pewnym wyciekiem do kanału akceptora również by zadziałał.
    2. Otwórz zakładkę Wyrównanie w smOTTER, zmniejsz moc lasera i zmień skalę osi y, aż odczyt będzie widoczny z detektorów.
      UWAGA: Celem jest tutaj zwiększenie sygnału, więc może być konieczna ponowna zmiana skali po wzroście sygnału.
    3. Odkręć cztery z przodu smfBox i zdejmij panel przedni.
  2. Wyrównanie otworków
    1. Przekręć pokrętło x na pozycjonerze otworkowym, obserwując sygnał na zakładce Wyrównanie, próbując zwiększyć sygnał na zielono i czerwono.
    2. Teraz obróć pokrętło y, aby wyrównać otwór w przeciwnym kierunku.
    3. Wróć do pokrętła x, aby sprawdzić, czy sygnał nie uległ dalszemu wzrostowi.
  3. Wyrównanie soczewki otworkowej
    1. Obróć pokrętło x obiektywu w jednym kierunku, spowoduje to zmniejszenie sygnału.
    2. Obróć pokrętło x otworka w tym samym kierunku, aby ponownie zwiększyć sygnał.
    3. Jeśli nowy maksymalny sygnał jest wyższy niż wcześniej, kontynuuj iteracyjne przesuwanie zarówno otworka, jak i soczewki w tym kierunku. Jeśli jest niższy niż wcześniej, iteracyjnie poruszaj się w przeciwnym kierunku.
    4. Powtórz powyższe czynności dla y.
  4. Wyrównanie obiektywu APD
    1. Zaczynając od zielonego APD, przesuwaj pokrętło x, aż zielony sygnał osiągnie maksimum.
    2. Powtórz te czynności dla pokrętła y.
    3. Wróć do pokrętła x, poruszaj się w przód iw tył, aby znaleźć punkty progowe, w których sygnał zaczyna spadać, i pozostaw go w pozycji w połowie drogi między tymi dwoma punktami.
    4. Powtórz tę czynność dla pokrętła x.
    5. Powtórz powyższe kroki dla czerwonej soczewki APD, obserwując czerwony sygnał.
  5. Umieść panel przedni z powrotem na smfBox i wkręć.
    UWAGA: Wykonaj powyższy miesięczny pomiar wyrównania oraz jako środek zapobiegawczy, jeśli podejrzewa się, że w mikroskopie wystąpił błąd wyrównania między pomiarami.

4. Akwizycja danych pomiarowych

  1. W przypadku pierwszej próbki należy oczyścić stolik chusteczką do czyszczenia soczewek nasączoną metanolem; delikatnie przetrzeć obiektyw od jednego końca do drugiego.
  2. Nałóż 3-4 krople olejku immersyjnego do mikroskopii na środek obiektywu; uzupełniaj w razie potrzeby między próbkami.
  3. Przygotowanie próbki
    1. Pobrać pipetą 10 μl próbki (ultraczysta woda typu I pierwszego użycia) na środek czystej szklanki nakrywkowej.
    2. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na soczewce obiektywu, opuszczając je pod kątem do oleju, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza między szkłem nakrywkowym a obiektywem.
      UWAGA: W razie potrzeby przesuń szkło nakrywkowe, aby wypchnąć pęcherzyki powietrza z oleju z dala od punktu ogniskowego.
  4. Aby przeprowadzić eksperymenty ze wzbudzeniem laserem przemiennym (ALEX), skonfiguruj laser w panelu cykli pracy lasera w następujący sposób.
    1. Dawca (zielony laser) 0 wył., 45 wł., 55 wył.
    2. Akceptor (czerwony laser) 50 wył., 45 wł., 5 wył.
    3. Okres ALEX (μs): 100
  5. Kliknij zakładkę Ostrość Z na wstążce; w panelu akwizycji przełącz lasery na Live (Na żywo) i uruchom kamerę; dostosuj ekspozycję tak, aby pojawił się jasny punkt otoczony czernią.
    UWAGA: Kamera rejestruje światło odbite przez granicę faz szkło/woda między szkiełkiem nakrywkowym a próbką, a widzialny okrąg światła ma najmniejszą średnicę, gdy ognisko znajduje się na tym interfejsie. W związku z tym konieczne jest rozpoczęcie poniżej tego interfejsu, zwiększenie wysokości z do granicy fazy, a następnie nieco dalej, aby skupić się powyżej szkiełka nakrywkowego i w mierzonej próbce.
    1. Zaczynając od niskiej pozycji Z, zwiększaj wysokość, aż jasna plamka osiągnie swój minimalny rozmiar, a następnie zwiększ wysokość jeszcze bardziej o maksymalnie 20 μm, aby skupić laser nad olejem i szkłem nakrywkowym oraz w próbce.
    2. Zatrzymaj aparat po ustawieniu ostrości.
  6. Aby potwierdzić, że konfiguracja została przeprowadzona prawidłowo, należy monitorować ślad ultraczystej wody typu I, aby nie zauważyć żadnych sygnałów fluorescencyjnych; powtórzyć potwierdzenie czystości dla, w których przygotowywane są próbki.
  7. Ostrożnie zdejmij szkło nakrywkowe za pomocą pęsety z gumową końcówką, aby uniknąć uszkodzenia obiektywu, a następnie umieść na obiektywie próbkę będącą przedmiotem zainteresowania. W razie potrzeby uzupełnij olejek immersyjny, aby utrzymać jednolitą powierzchnię kontaktu między szkłem nakrywkowym a obiektywem (szczególną uwagę zwrócono na obszar kontaktu próbki ze szkłem nakrywkowym i obszar ogniskowy obiektywu)
  8. Koncentracja bingo
    1. Aby zapewnić uzyskanie danych dotyczących pojedynczych cząsteczek, próbki muszą mieć stężenie, przy którym obserwuje się 1-5 impulsów na sekundę w panelu śledzenia na żywo smOTTER (minimalizuje to ryzyko obecności więcej niż jednej cząsteczki w objętości detekcji jednocześnie). Pomiary należy wykonać, gdy zostanie określone odpowiednie stężenie.
    2. Aby zapobiec parowaniu podczas długich eksperymentów, przygotuj szczelną komorę na próbki. Dociśnij izolatory silikonowe (otwór o średnicy 8-9 mm) do środka szkła nakrywkowego (pokolorowanego końcówką do pipety). Następnie ostrożnie odpipetuj próbkę do środka, unikając kontaktu z silikonem. Następnie umieść drugą szklankę nakrywkową na górze i dociśnij, aby utworzyć uszczelkę.
    3. Sprawdź histogram stechiometrii na żywo w funkcji wydajności FRET (ES), aby zobaczyć, czy próbka zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami, tj. oczekiwana wydajność FRET i rozsądna stechiometria (~0,5).
  9. Gdy próbka będzie gotowa, wprowadź szczegóły eksperymentu w panelu zapisywania ustawień. Wybierz odpowiedni katalog i nazwę pliku, klikając ikonę wielokropka (pliki zapisane w formacie hdf5/h5) w panelu zapisu ustawień.
    1. Wprowadź informacje o nazwie próbki, szczegółach próbki, etykietach dawcy i akceptora, długości fal wzbudzenia bufora, dawcy i akceptora, długości fal wykrywania i mocy lasera oraz przynależności użytkownika i użytkownika.
  10. Wróć do karty śledzenia na żywo na wstążce i w panelu akwizycji wprowadź długość eksperymentu (w minutach), wybierz odpowiedni interwał zapisywania, aby ograniczyć potencjalną utratę danych w przypadku błędu. W razie potrzeby wybierz opcję Save Laser Powers (Zapisz moce lasera).
  11. Naciśnij Start, aby pobrać dane.
    UWAGA: Aby umożliwić dokładne oznaczenie FRET, należy zmierzyć co najmniej dwie próbki zawierające te same barwniki donorowe i akceptorowe, ale o wystarczająco różnych wydajnościach FRET.

5. Analiza/oprogramowanie 2

  1. Uruchom notes Jupyter z pakietem języka Python FRETBursts (instrukcje konfiguracji można znaleźć tutaj: https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html)
  2. Jeśli korekta na bezwzględną sprawność FRET nie jest potrzebna (tj. do pomiaru wystarczające są tylko względne zmiany FRET), uruchom Jupyter notebook FRET Analysis 1.4 Uncorrected.ipynb. Służy do eksportowania rysunków lub danych jako plików csv w celu dalszej analizy lub wykreślenia w innym oprogramowaniu.
    UWAGA: Każdy zeszyt zawiera szczegółowe instrukcje, które prowadzą użytkownika przez procedury analizy. Aby uzyskać bardziej szczegółowe omówienie procedur analizy, w tym algorytmów wyszukiwania serii, korekcji tła i wszystkich parametrów korekcji, zobacz23,25.
  3. Jeśli potrzebna jest korekta dla bezwzględnych sprawności FRET, należy rozpocząć od obliczenia parametrów przesłuchu alfa (wyciek emisji donorowej do kanału akceptora) i delta (proporcja bezpośredniego wzbudzenia akceptora pod wzbudzeniem donora).
    1. Najpierw uruchom program Alpha-Delta.ipynb notesu Jupyter Correction Factor Finder i określ parametry alfa i delta.
      UWAGA: Jeśli są one niespójne między próbkami, mikroskop mógł mieć problem z wyrównaniem między pomiarami lub widma barwników różnią się między próbkami.
    2. Jeśli parametry alfa i delta są spójne, uruchom program Jupyter notebook Correct Factor Finder Gamma-Beta.ipynb, aby określić parametry gamma i beta (które odpowiadają za różnice w skuteczności wzbudzenia i wykrywania między barwnikami).
      UWAGA: Jeśli wykres gamma i beta nie pasuje dobrze, mikroskop mógł mieć problem z wyrównaniem między pomiarami, wydajnością kwantową lub współczynnikami ekstynkcji barwników różniącymi się między próbkami.
    3. Po określeniu czterech parametrów przesłuchu, czynniki te mogą być używane w notatniku FRET Analysis 1.4 Corrected.ipynb Jupyter do określenia bezwzględnej sprawności FRET.

6. Rozwiązywanie problemów

  1. Jeśli wszystkie sygnały są niskie lub liczba na serię jest niższa niż oczekiwano (jest to zależne od barwnika, ale dla ATTO-550 i ATTO-647N w smfBox typowe wartości wynoszą od 50 do 100 zliczeń na ms podczas serii pojedynczej cząsteczki), wyrównaj smfBox.
  2. Pomost między podwójnie i pojedynczo oznaczonymi populacjami na histogramie ES.
    UWAGA: Może to być spowodowane pracą w zbyt wysokim stężeniu (można temu zaradzić, rozcieńczając próbkę) lub fotowybielaniem, które może być spowodowane użyciem zbyt dużej mocy lasera (można temu zaradzić, zmniejszając moc lasera).
  3. Jeśli szybkość rozerwania spadnie w trakcie eksperymentu (cząsteczki znakowane fluorescencyjnie prawdopodobnie przylegają do szklanego szkiełka nakrywkowego), użyj zwiększonego stężenia BSA do rektyfikacji.
  4. Jeśli szybkość rozerwania wzrasta w trakcie eksperymentu (próbka prawdopodobnie paruje), przygotuj hermetyczną komorę na próbki, jak opisano powyżej.
  5. Jeśli sygnał spadnie do zera podczas wyrównywania (oprogramowanie prawdopodobnie jest przytłoczone sygnałem z detektorów), zmniejsz moc lasera lub użyj bardziej rozcieńczonej próbki wyrównania.
  6. Jeśli ognisko Z pokazuje koncentryczne pierścienie (może się to zdarzyć, jeśli na obiektywie umieszczono wiele szkiełek nakrywkowych), sprawdź, czy na obiektywie nie ma wielu szkiełek nakrywkowych.
  7. Jeśli próbka zawiera jasne, długie impulsy pośrednich stechiometrii (spowodowanych przez zagregowane cząsteczki), należy użyć detergentów lub zmodyfikować protokoły oczyszczania próbki.
    UWAGA: Uzyskanie czystego bufora może być problemem, ponieważ niektóre składniki bufora często zawierają bardzo małe ilości umiarkowanie fluorescencyjnych zanieczyszczeń, które wystarczają, aby przedstawić się jako pojedyncze wybuchy kolorów na śladzie czasu. Jeśli w buforze jest tego za dużo, może to zbiegać się z wybuchami próbki i zmienić mierzoną wydajność FRET lub stechiometrię. W szczególności BSA może być często problematyczne pod tym względem, dlatego pomocne jest wystawienie standardowego roztworu BSA na działanie silnego źródła światła w celu fotowybielania zanieczyszczeń.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół wymaga krytycznej oceny warunków eksperymentalnych podczas instalacji (patrz krok 4.8 protokołu). Na tym etapie osiągane są pierwsze uzyskane wyniki, które decydują o sukcesie lub porażce eksperymentu. Pozytywnym wynikiem byłoby posiadanie od pięciu do jednej serii na sekundę (patrz Rysunek 2B,C). Negatywnym wynikiem byłoby posiadanie zbyt wielu (Rysunek 2A) lub zbyt mało serii (Rysunek 2D) w tym przedziale czasowym. Na tym etapie możliwe jest skorygowanie tych błędów: próbka o zbyt wysokim stężeniu musi być po prostu rozcieńczona; Jeżeli jednak stężenie jest zbyt niskie, może być konieczne przygotowanie nowej próbki (wyznacznikiem jest to, czy przy tak niskim stężeniu możliwe jest zebranie danych w rozsądnych ramach czasowych).

figure-results-1
Rysunek 2: Zrzuty ekranu z żywego śladu podczas konfiguracji eksperymentalnej pokazujące różne stężenia podwójnie znakowanych próbek DNA duplex. (A) zbyt wysoka, (B) górna dopuszczalna granica, (C) docelowe stężenie, (D) zbyt niska. Zliczanie fotonów (przedziały 1 ms) jest pokazane w trzech kanałach detekcji; emisja donorowa po wzbudzeniu donora (DD), emisja akceptora po wzbudzeniu donora (DA) i emisja akceptora po wzbudzeniu akceptora (AA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Statyczny system jednogatunkowy zazwyczaj wymagałby od 30 do 60 minut pomiaru, aby uzyskać niezbędne ~1,000 serii potrzebnych do rzetelnej analizy danych. Wymagany czas i liczba impulsów będzie się zwiększać w przypadku wielu gatunków lub systemów dynamicznych. Po zebraniu i analizie danych przy użyciu protokołu rysunki są eksportowane z notesów Jupyter. Wykres alternacji (Rysunek 3A) powinien pasować do okresu ALEX konfiguracji eksperymentalnej. Ślad czasowy (Rysunek 3B) służy do jakościowej oceny, czy stężenie próbki jest rozsądne. Wykres tła (Rysunek 3C) pokazuje rozkład okresów opóźnień między fotonami z liniowym dopasowaniem do dłuższych czasów w celu oszacowania współczynnika tła26. Ślad tła (Rysunek 3D) może zidentyfikować, czy w próbce zaszły zmiany w czasie trwania eksperymentu; Przede wszystkim wynikałoby to z parowania podczas dłuższych czasów akwizycji. Histogramy ES są generowane dla wszystkich fotonów (Rysunek 3E) i podwójnie oznaczonych gatunków (Rysunek 3F). Na koniec generowany jest histogram 1D E (Rysunek 3G) z dopasowaniem gaussowskim danych burstu.

figure-results-2
Rysunek 3: Przykładowy rysunek przedstawiający dane analizowane przez Jupyter Notebooks. (A) Wykres naprzemienny, (B) Ślad w czasie, (C) Wyznaczanie tła, (D) Współczynniki tła, (E) Histogram ES wszystkich fotonów, (F) Histogram ES dwukanałowy, oraz (G) Histogram 1D E. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

nazwakolejność
1a5'- KNEBEL KTG AAA GTG GTG AGT TTG TTT KNEBEL TGT TTG TCT GG - 3'
3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5'
1b5'- KNEBEL KTG AAA GTG GTG AGT TTG TTT KNEBEL TGT TTG TCT GG - 3'
3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5'
1c5'- KNEBEL KTG AAA GTG GTG AGT TTG TTT KNEBEL TGT TTG TCT GG - 3'
3'- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC - 5'

Tabela 1: Sekwencje DNA użyte w protokole. Nukleotydy są podświetlone na niebiesko i czerwono, reprezentując modyfikowane aminowo reszty tyminy C2 znakowane odpowiednio Atto-550 i Atto-647N.

Wyszukiwarka współczynników korekcyjnych Alpha-Delta: Wyszukiwarka współczynników korekcyjnych Gamma-Beta: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Analiza FRET 1.4 Poprawiona: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Analiza FRET 1.4 Niepoprawiona:

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są ustawienie mikroskopu i dostosowanie stężenia próbki do prawidłowego rozcieńczenia. Jeśli wyrównanie jest wyłączone, sygnał może być niewystarczający do zidentyfikowania impulsów i wykreślenia histogramów, a jeśli wystąpi niewspółosiowość między próbkami, dokładna korekcja FRET może się nie powieść z powodu zmian w nieszczelności i skuteczności wykrywania / wzbudzenia. Nie bez znaczenia jest również zastosowanie odpowiedniego stężenia, zbyt wysokie stężenie spowoduje zbieżne wybuchy, zawierające wiele cząsteczek o potencjalnie różnej wydajności FRET lub znakujące stechiometrie. Zbyt niskie stężenie spowoduje zbyt małą liczbę impulsów do solidnej analizy danych.

Opisany tutaj protokół służy do pomiaru odległości w statycznych pojedynczych gatunkach FRET. Jeśli próbka ma więcej niż jeden pik na histogramie wydajności FRET lub piki wydają się szerokie (co może się zdarzyć w przypadku gatunków dynamicznych), może być potrzebnych więcej impulsów, aby dopasować histogramy do tego samego stopnia precyzji. W przypadku dwóch dobrze oddzielonych szczytów potrzeba około dwa razy więcej danych, ale jeśli populacje nieznacznie się pokrywają, potrzeba jeszcze więcej danych.

Jeśli obie populacje przejdą wzajemną konwersję w skali czasowej eksperymentu, można potencjalnie określić dynamikę i kinetykę systemu. Testy takie jak BVA27 i 2CDE28 mogą potwierdzić, że pośrednie impulsy mają charakter dynamiczny, podczas gdy analizy obejmujące dPDA29,30 lub H2MM31 mogą określić szybkość interkonwersji. Notebooki Jupyter dla BVA i 2CDE są dostępne na stronie internetowej FRETBursts26, a oprogramowanie PAM32 oparte na MATLab może uruchamiać analizy BVA, 2CDE i PDA.

Konfokalny jednocząsteczkowy FRET może z łatwością obserwować stany znacznie krócej żyjące (~1 ms) niż TIRF; Jednak krótkie czasy obserwacji, ograniczone dyfuzją, nie dają historii molekularnej, a więc nie mogą określić dłuższych czasów przebywania lub złożonych sieci przejściowych w sposób, w jaki mogą to robić eksperymenty unieruchomione na powierzchni.

Ponieważ protokół mierzy swobodnie dyfuzujące cząsteczki w bardzo niskim stężeniu, najlepiej sprawdza się przy pomiarze odległości wewnątrzcząsteczkowych na tej samej cząsteczce. Odległości międzycząsteczkowe między przejściowo związanymi cząsteczkami można zmierzyć, pod warunkiem, że Kd dwóch cząsteczek jest wystarczająco niskie, aby kompleks występował w znacznej ilości przy niskim stężeniu roboczym wymaganym przez doświadczenie (~100 pM). Jeśli Kd jest znacznie wyższe niż to, to widoczne będą tylko pojedynczo znakowane cząsteczki. Problem ten można rozwiązać, stosując mikrofluidykę do mieszania dwóch znakowanych składników razem w wysokim stężeniu, a następnie szybkiego rozcieńczania i przepływania przez obiektyw, zanim kompleks zdysocjuje33,34.

Pomiar wydajności FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki ma znaczną przewagę nad technikami zespołowymi, ponieważ informuje o heterogenicznych subpopulacjach, które w eksperymencie zespołowym zostałyby uśrednione. Co więcej, jednocząsteczkowy FRET z ALEX daje dostęp do dokładnych wydajności FRET, które można przekształcić na dokładne odległości. Umożliwia to określenie bardziej szczegółowych informacji strukturalnych, a nie tylko sondowanie względnych zmian odległości. smfBox niesie ze sobą wszystkie te zalety i możliwości, ale może być zbudowany przy znacznie niższym budżecie niż porównywalne dostępne na rynku mikroskopy zdolne do konfokalnego smFRET23.

smfBox stanowi znacznie niższą barierę wejścia dla technik smFRET, umożliwiając naukowcom pomiar zmian konformacyjnych oraz dokładne odległości w obrębie i między białkami a kwasami nukleinowymi 7,8,9,10,11,35.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują następującym źródłom finansowania: BBSRC (BB/T008032/1); EPSRC (Stypendium do B.A.) i MRC (Stypendium do A. R.-T.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oligonukleotyd modyfikowany aminamiEurogentecN/AMoże być zamawiany u różnych dostawców lub syntetyzowany; Modyfikacja aminokwasów umożliwia znakowanie barwnikami modyfikowanymi estrami NHS
Fotodioda lawinowa (APD)ExcelitasSPCM-AQRH-14Do konfiguracji smfBox wymagane są dwa APD
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)MerckA2153W zależności od systemu; składnik buforowy do obrazowania (0,1 mg/ml w bufor)
Kompaktowy sumator laserowyOMICRONLightHUB-2Lasery 515 nm (80 mW) i 638 nm (100 mW)
Szkło nakrywkoweVWR630-2742Grubość: 0,17 ± 0,01 mm, DxS: 22x22 mm
Cy3BCytivaPA631011 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg)
FRETBursts Python PakietN/A/APakiet Pythona o otwartym kodzie źródłowym do analizy impulsów swobodnie dyfuzyjnych danych FRET pojedynczych cząsteczek: Bufor
obrazowaniahttps://fretbursts.readthedocs.io Nie dotyczyW zależności od systemu; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7,5 i 0,1 mg/ml
BSA Olejek immersyjnyOlympusIMMOIL-F30CC
Notebooki JupyterProjekt JupyterN/AAplikacja internetowa typu open source do tworzenia i udostępniania dokumentów zawierających kod na żywo, równania, wizualizacje i tekst; notatniki do analizy danych dla smfBox można znaleźć w SI
Lens TissueThorLabsMC-5MC-50E to ten sam przedmiot luzem
Chlorek magnezuMerckM2670W zależności od systemu; komponent bufora obrazowania (20 mM w buforze)
MilliQ/Ultraczysta wodaNie dotyczy
NanopoistionerPiezoconceptFOC300Nanopozycjoner do dokładnego pozycjonowania Obiektyw mikroskopowy
modyfikowany estrem NHS ATTO-550ATTO-TECAD 550-311 mg, AD 550-35 (5 mg)
Estry modyfikowane NHS ATTO-647NATTO-TECAD 647N-311 mg, AD 647N-35 (5 mg)
Soczewka obiektywowaOlympusN1480700seria obiektywów Olympus od oryginalnego smfBox wycofany; zastąpiony przez N5702300
OMICRON Control Center (OCC)- laserowe centrum sterowaniaOMICRONNie dotyczyv3.5.34 - Oprogramowanie sterownika lasera OMICRON
Press-To-Seal izolator silikonowyGrace Bio-Labs664201  Średnica 8-9 mm x głębokość 1,7 mm
smOTTERN/A N/AOprogramowanie typu open source do akwizycji dla Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER
Chlorek soduMerckS7653Zależny od systemu; komponent bufora obrazowania (5 mM w buforze)
Tris baseMerck93362W zależności od systemu; komponent buforowy obrazowania (5 mM, pH 7,5 w buforze)
Woda ultraczysta typu IMerckZIQ7000T0Milli-Q® IQ 7000 System wody ultraczystej
N

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).">Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).
  2. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).">Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).
  3. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131(2013).">Hohlbein, J., et al. Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion. Nature Communications. 4 (1), 2131(2013).
  4. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).">Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), (2018).
  5. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).">Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  6. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).">Lerner, E., et al. The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices. arXiv. , (2020).
  7. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).">Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).
  8. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).">Craggs, T. D., et al. Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).
  9. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676(2019).">Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nature Communications. 10 (1), 1676(2019).
  10. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161(2015).">Nagy, J., et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS. Nature Communications. 6 (1), 6161(2015).
  11. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).">LeBlanc, S. J., et al. Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS. Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).
  12. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).">Segal, M., et al. High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins. Methods. 169, 21-45 (2019).
  13. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).">Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  14. Alternating-laser excitation of single molecules. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 523-533 (2005).">Kapanidis, A. N., et al. Alternating-laser excitation of single molecules. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 523-533 (2005).
  15. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).">Müller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  16. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).">Laurence, T. A., Kong, X., Jager, M., Weiss, S. Probing structural heterogeneities and fluctuations of nucleic acids and denatured proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17348-17353 (2005).
  17. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978(2020).">Pollina, T., et al. PlanktonScope: Affordable modular imaging platform for citizen oceanography. bioRxiv. , 056978(2020).
  18. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).">Collins, J. T., et al. Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope. Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).
  19. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949(2020).">Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation. Royal Society Open Science. 7 (3), 191949(2020).
  20. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552(2019).">Martens, K. J. A., et al. Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework. Nature Communications. 10 (1), 3552(2019).
  21. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).">Auer, A., et al. Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope. ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).
  22. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613(2020).">Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , 424613(2020).
  23. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641(2020).">Ambrose, B., et al. The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET. Nature Communications. 11 (1), 5641(2020).
  24. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).">Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  25. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).">Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716(2016).">Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET. PLOS One. 11 (8), 0160716(2016).
  27. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).">Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis. Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).
  28. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).">Tomov, T. E., et al. Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis. Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).
  29. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).">Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis. ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).
  30. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).">Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  31. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).">Pirchi, M., et al. Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).
  32. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).">Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).
  33. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).">Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
  34. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).">Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
  35. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).">Bennet, I. A., et al. Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1. Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FRET EfficiencysmfBox InstrumentDuplex DNASample PreparationInstrument AlignmentData AcquisitionAvalanche PhotodiodeAlternating Laser ExcitationBiomolecular Structure

Powiązane artykuły