Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Podsumowanie

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Streszczenie

Kriogeniczna tomografia elektronowa (cryoET) to potężna metoda badania struktury 3D próbek biologicznych w stanie zbliżonym do rodzimego. Najnowocześniejsze metody krioET w połączeniu z analizą uśredniania subtomogramu umożliwiają określenie strukturalne w wysokiej rozdzielczości kompleksów makromolekularnych, które są obecne w wielu kopiach w ramach rekonstrukcji tomograficznych. Eksperymenty tomograficzne zwykle wymagają uzyskania ogromnej ilości serii wychylenia za pomocą wysokiej klasy transmisyjnych mikroskopów elektronowych, co wiąże się z istotnymi kosztami eksploatacji. Chociaż przepustowość i niezawodność procedur automatycznego gromadzenia danych stale się poprawiały w ostatnich latach, proces wyboru obszarów zainteresowania, w których zostanie pozyskana seria pochylenia, nie może być łatwo zautomatyzowany i nadal opiera się na ręcznym wprowadzaniu danych przez użytkownika. W związku z tym przygotowanie sesji zbierania danych na dużą skalę jest czasochłonną procedurą, która może znacznie skrócić pozostały czas mikroskopu dostępny na akwizycję serii nachylenia. W tym miejscu protokół opisuje ostatnio opracowane implementacje oparte na pakiecie SerialEM i oprogramowaniu PyEM, które znacznie poprawiają efektywność czasową przesiewania siatki i gromadzenia danych z serii przechyłu na dużą skalę. Prezentowany protokół ilustruje, w jaki sposób można wykorzystać funkcjonalności skryptów SerialEM, aby w pełni zautomatyzować mapowanie siatki, mapowanie kwadratów siatki oraz akwizycję serii pochylenia. Ponadto protokół opisuje, w jaki sposób używać PyEM do wybierania dodatkowych celów akwizycji w trybie off-line po zainicjowaniu automatycznego zbierania danych. Aby zilustrować ten protokół, opisano jego zastosowanie w kontekście wysokiej klasy gromadzenia danych z serii przechyłów Sars-Cov-2. Prezentowany potok jest szczególnie przydatny do maksymalizacji efektywności czasowej eksperymentów tomograficznych, które wymagają starannego doboru celów akwizycji i jednocześnie zebrania dużej ilości serii przechyłu.

Wprowadzenie

Metody kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) opierają się na obrazowaniu próbek biologicznych za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) po ich szybkiej witryfikacji, procesie przygotowania próbki, który zachowuje struktury molekularne i komórkowe próbek w stanie zbliżonym do natywnego i uwodnionego1^,2. W kriogenicznej tomografii elektronowej (cryoET) model 3D zeszklonej próbki uzyskuje się poprzez uzyskanie szeregu obrazów tego samego obszaru zainteresowania z różnych orientacji, tzw. szereg pochylenia, a następnie obliczeniową rekonstrukcję objętości tomograficznej³. Ta zaawansowana technika obrazowania dojrzała do tego, aby stać się potężną metodą badania strukturalnego procesów biologicznych w kontekście ich rodzimych środowisk komórkowych^4,5,6.

Oprócz analizy ultrastrukturalnej zeszklonej próbki, rekonstrukcje kompleksów makromolekularnych, które są obecne w wielu kopiach w objętości tomografii, można uzyskać poprzez zastosowanie subtomogramu uśredniającego⁵. To podejście do rekonstrukcji opiera się na iteracyjnym dopasowywaniu i uśrednianiu podwoluminów zawierających strukturę będącą przedmiotem zainteresowania i ma na celu zwiększenie stosunku sygnału do szumu oraz rozdzielczości końcowej rekonstrukcji^7,8. Uśrednianie subtomogramu opiera się na gromadzeniu i przetwarzaniu dużej ilości danych, co często wymaga pozyskania setek serii przechyłu za pomocą wysokiej klasy TEMów o wysokich kosztach eksploatacji.

Obecnie konfiguracja takich automatycznych sesji cryoET jest czasochłonnym procesem, który zazwyczaj opiera się na ręcznym wprowadzaniu danych przez użytkownika^9,10,11. Zazwyczaj cele są identyfikowane poprzez oględziny zmapowanej siatki, a następnie ustawiane do automatycznego gromadzenia danych. Na skuteczność użytkownika w identyfikowaniu punktów akwizycji często wpływa charakter próbki, co staje się szczególnie trudne podczas analizy oczyszczonych makrocząsteczek o nieoptymalnym stężeniu lub w przypadku rzadkich zdarzeń w zatłoczonych środowiskach komórkowych, co implikuje stosowanie podejść korelacyjnych¹². Co więcej, obecne przepływy pracy wymagają pozyskiwania obrazów podczas ustawiania przy różnych powiększeniach, które zostaną później wykorzystane do precyzyjnej lokalizacji i wyśrodkowania celu podczas automatycznej akwizycji^11,13,14. Te bardzo precyzyjne etapy ponownego wyrównywania mają kluczowe znaczenie dla zastosowań o wysokiej rozdzielczości, które wymagają wykonywania obrazowania w dużym powiększeniu i wymagają dokładnych kroków centrowania w celu zachowania obszaru zainteresowania w wynikowym małym polu widzenia. W sumie na tę czasochłonną procedurę, podczas której TEM nie jest zaangażowany w akwizycję serii pochylenia, poświęca się w sumie kilka godzin z każdej sesji zbierania danych. W związku z tym, w zależności od wymaganej liczby serii nachylenia, identyfikacja i ustawienie punktów akwizycji może mieć znaczący wpływ na czas dostępny pod mikroskopem na zbieranie danych podczas sesji krioET.

Opisany tutaj jest zoptymalizowany protokół oparty na pakiecie oprogramowania SerialEM¹⁵ i najnowszej wersji oprogramowania PyEM¹⁶ do mapowania siatek, mapowania kwadratów siatki, wybierania celów i ustawiania automatycznego gromadzenia danych dla zbierania serii tilt na dużą skalę. Kluczową koncepcją tego podejścia jest dostarczenie SerialEM obrazów generowanych obliczeniowo przez PyEM dla każdego elementu akwizycji, nazywanego wirtualnymi mapami, w celu dokładnej lokalizacji i wyśrodkowania celu. Aby uzyskać rzeczywisty czas akwizycji, wybór celów, jak również tworzenie wirtualnych map odbywa się w trybie off-line przy użyciu drugiej fikcyjnej instancji SerialEM, co oddziela proces wyboru celów akwizycji od operacji TEM. Chociaż nie zajmuje się tym, jak zwiększyć jakość danych^13,17 lub szybkością akwizycji serii tilt^18,19, protokół ten koncentruje się przede wszystkim na strategiach optymalizacji efektywności czasowej konfiguracji dużych zautomatyzowanych sesji cryoET. W związku z tym implementacja przedstawionego protokołu jest przeznaczona dla tych naukowców, którzy tworzą procesy zbierania danych cryoET, którzy chcą zmaksymalizować wydajność zautomatyzowanej akwizycji danych poprzez wydłużenie czasu mikroskopu dostępnego dla akwizycji serii pochylenia.

Protokół

Protokół opisany tutaj jest częścią bardziej obszernego dokumentu opracowanego przez platformę EMBL CryoEM Service, który zawiera dokładne instrukcje krok po kroku i zrzuty ekranu ilustrujące całą procedurę typowej sesji krioET, w tym ładowanie próbek, mapowanie siatki, strojenie mikroskopu, ustawianie punktów akwizycji i automatyczne zbieranie danych. Pełny protokół można pobrać pod następującym linkiem: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Wymagania wstępne

1. Zainstaluj SerialEM w wersji 3.8 i skonfiguruj do sterowania mikroskopem i detektorem (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
2. Zainstaluj fikcyjne wystąpienie SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
3. Zainstaluj PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Mapowanie siatki

1. Załaduj kasetę z siatkami do automatycznego podajnika mikroskopu.
2. Skonfiguruj warunki obrazowania odpowiednie do mapowania całej siatki. Zrób to przy możliwie najmniejszym powiększeniu, biorąc pod uwagę pole widzenia na zastosowanym detektorze (EFTEM SA 2250x). Zapisz warunki obrazowania jako stan obrazowania SerialEM, aby ułatwić późniejsze użycie.
3. Skonfiguruj pełny montaż
   1. Otwórz menu SerialEM Navigator.
   2. Wybierz opcję Montaż i siatki.
   3. Wybierz opcję Skonfiguruj pełny montaż.
4. Uruchom skrypt Grid_Mapping. Pozwól skryptowi czekać, aż autoloader ostygnie; Wykonaj inwentaryzację, a następnie zmapuj każdą siatkę, którą znalazła procedura inwentaryzacji. Wprowadź wiadomość e-mail za pomocą menu serii Tilt, aby umożliwić skryptowi wygodne wysłanie wiadomości e-mail po zakończeniu.
5. Zapisz nawigatora.
6. Sprawdź wszystkie mapy siatki w SerialEM Navigator i wybierz siatkę, która ma być mapowana dalej przy większym powiększeniu.
   UWAGA: Wiele TEMów wyposażonych w system automatycznego ładowania pokaże obrót siatki po ponownym załadowaniu. Najlepiej jest ponownie zmapować dowolną siatkę po jej ponownym załadowaniu. Alternatywne systemy zwykle doświadczają tylko pewnych przesunięć, które można skorygować w SerialEM za pomocą procedury Shift To Marker.

3. Ustaw niską dawkę SerialEM

1. Ustaw powiększenie trybów SerialEM low dose View i Preview (jest to wymagane w kroku 6).
2. Uzyskaj obraz widoku i zapisz go jako mapę w Nawigatorze.
3. Pobierz obraz podglądu i zapisz go jako mapę w Nawigatorze.
   1. Ustaw oba tryby na to samo kategoryzowanie (sugerowane jest kategoryzowanie 4). Pozwala to na zapisanie dwóch map w jednym stosie obrazów.
   2. W oknie SerialEM Navigator zmień etykietę mapy widoku na Widok, a etykietę mapy podglądu na Podgląd.
   3. Zapisz i zamknij plik nawigatora.
      UWAGA: Dla początkowych obrazów Podgląd i Podgląd nie jest wymagany żaden cel, PyEM użyje jedynie ich ustawień obrazowania.

4. Mapowanie kwadratów siatki

1. Skonfiguruj warunki obrazowania, aby zmapować kwadraty siatki. Bardzo ważne jest, aby móc zobaczyć interesującą nas próbkę i rozkład koralików odniesienia. Aby zapewnić optymalny kontrast dla map kwadratowych z siatką, wykonaj następujące czynności.
   1. Wstaw przysłonę obiektywu.
   2. W razie potrzeby włóż szczelinę filtra energii.
   3. Użyj rozmycia -100 μm.
2. Ekran dla dobrych kwadratów siatki nadających się do dalszego mapowania. Po oględzinach kwadratowych z mapy siatkowej wykonaj zdjęcia próbne kwadratu z warunkami obrazowania, które mają być użyte na mapach kwadratów siatki.
3. Po zidentyfikowaniu prawidłowego kwadratu należy oznaczyć jego środek na obrazie mapy siatki za pomocą funkcji Dodaj punkty w nawigatorze SerialEM.
4. Po dodaniu wszystkich punktów w Nawigatorze SerialEM naciśnij Shift + A w pierwszym punkcie, a następnie naciśnij Shift + A w ostatnim punkcie.
   UWAGA: Wszystkie dodane punkty są teraz oznaczone literą A, co oznacza, że wszystkie są punktami zdobycia.
5. Naciśnij Shift + N (utwórz nowy plik w elemencie) w pierwszym punkcie, a następnie ponownie w ostatnim punkcie. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz opcję Montaged Images (Obrazy montażowe).
6. Gdy pojawi się okno dialogowe montażu, ustaw rozmiar montażu, który obejmuje jeden kwadrat siatki. Zależy to od powiększenia i rozmiaru siatki użytych siatek i zazwyczaj wymaga montaży od 2 x 2 do 4 x 4. Nadaj mu nazwę z numerem (np. squaremap_01.mrc), aby umożliwić SerialEM wygodne automatyczne numerowanie wszystkich plików na kwadracie siatki.
7. Rozpocznij mapowanie siatki, otwierając menu SerialEM Navigator i kliknij Zdobądź w elementach.
8. Z wyskakującego menu wybierz następujące opcje.
   1. Wybierz opcję Przybliżona eucentryczność.
   2. Wybierz opcję Pobierz obraz mapy.
   3. Wybierz opcję Zamknij zawory kolumny na końcu.
   4. Wybierz pozycję Wyślij wiadomość e-mail na końcu.

5. Wybór celów

1. Otwórz fikcyjną instancję SerialEM. Można to skonfigurować na komputerze SerialEM, który steruje mikroskopem, lub na innym komputerze (pomocniczym), jeśli oba komputery mają wspólne połączenie sieciowe.
2. Po zmapowaniu pierwszego kwadratu siatki użyj opcji Scal w menu SerialEM Navigator, aby zobaczyć montaż w fikcyjnej instancji SerialEM.
3. Kliknij dwukrotnie okno Nawigatora, aby otworzyć kwadratową mapę siatki.
4. Przeszukaj mapę i użyj fikcyjnej opcji SerialEM Navigator Dodaj punkty, aby dodać punkty akwizycji obrazu w interesującym Cię celu.
5. Po zakończeniu i po zmapowaniu nowych kwadratów zapisz plik Nawigatora i ponownie scal Nawigatora; kontynuuj, aż wszystkie kwadraty siatki zostaną zmapowane.

6. Generuj mapy wirtualne

1. Ponownie scal plik nawigatora z fikcyjną instancją SerialEM.
2. Uruchom skrypt PyEM Virtual maps z fikcyjnego menu SerialEM, Narzędzia i wybierz Virtual Anchor Maps. Może to zająć trochę czasu w zależności od rozmiaru i ilości kwadratowych map siatki oraz kategoryzacji map widoku i podglądu.
   UWAGA: PyEM uruchamia okno poleceń, które automatycznie zamyka się po zakończeniu, a następnie można otworzyć nowy plik nawigatora. Na zmontowaną mapę, która zawiera wybrane punkty, PyEM zapisuje pojedynczą scaloną mapę i wszystkie jej mapy widoku i podglądu. Na koniec zapisuje nowy plik Navigatora o nazwie <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. Strojenie mikroskopu

1. Sprawdź strojenie mikroskopu. Aby zapewnić prawidłowe działanie mikroskopu, należy użyć tej samej konfiguracji powiększenia i rozmiaru wiązki do pozyskiwania danych, w następującej kolejności.
   1. Uruchom wyrównanie SeriaLEM bez komy za pomocą CTF (Zemlin tableau).
   2. Wstaw i wyśrodkuj otwór obiektywu.
   3. Uruchom SerialEM Correct Astigmatism przez CTF (autostygmatyzacja).
   4. Uruchom GIF Quick Tune (tj. tylko ostrość szczelinowa).
      UWAGA: Ponieważ kroki 7.1.1, 7.1.3 i 7.1.4 mogą wymagać większej dawki dawki, należy zmienić tylko rozmiar plamki; Nie należy zmieniać rozmiaru wiązki, ponieważ powoduje to przechylenie wiązki, co powoduje nieprawidłowe strojenie. Kroki 7.1.1, 7.1.2 i 7.1.3 są częściowo zautomatyzowane w tym publicznie dostępnym skrypcie (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Konfiguracja Nawigatora

1. W programie SerialEM otwórz nowy plik nawigatora o nazwie _automaps.nav.
   UWAGA: V_yyyy to Wyświetl mapy, a P_yyyy są mapy w wersji zapoznawczej. Mapy podglądu są ustawione jako punkty nabycia.
2. W oknie SerialEM Navigator usuń zaznaczenie wszystkich punktów A, zaznacz pierwszy V_yyyy mapy, wybierz opcję Zwiń, kliknij dwukrotnie A i usuń zaznaczenie opcji Zwiń.
3. Wybierz pierwszą pozycję V_yyyy, naciśnij Shift + T, a następnie wybierz ostatnią pozycję V_yyyy i ponownie naciśnij Shift + T.
4. Wybierz opcję Obrazy z pojedynczą ramką we właściwościach pliku, aby otworzyć okno dialogowe.
5. W następnym oknie dialogowym File Properties (Właściwości pliku) wybierz żądane parametry zgodnie z potrzebami obrazowania i ustawieniami urządzenia.
6. Po wyświetleniu monitu podaj nazwę wraz z numerem (np. TS_001.mrc) i kliknij Zapisz.
   UWAGA: SerialEM automatycznie ponumeruje nazwy plików dla wszystkich serii pochylenia.
7. Ustaw regulator serii przechyłu na pierwszą pozycję TS. Po zakończeniu kliknij OK, aby ustawić te parametry dla wszystkich serii pochylenia po tym elemencie przejęcia. Wszystkie mapy podglądu są teraz wybierane jako TS (Tilt Series) z numerowaną nazwą pliku TS_xxx.mrc.
   UWAGA: Parametry można później zmienić ręcznie za pomocą funkcji Navigator TSparams; Zmiany zostaną zastosowane do wszystkich pozycji znajdujących się niżej na liście. Użytkownik ma możliwość uruchomienia niestandardowego skryptu zamiast serii pochylenia.

9. Ustaw pozycje ostrości/ścieżki

1. W razie potrzeby ustaw odległość ostrości/śledzenia dla każdego celu (upewnij się, że niska dawka SerialEM jest włączona).
2. Kliknij dwukrotnie Mapę widoków, aby ją załadować.
3. Wybierz opcję Podgląd mapy z listy Nawigator
.
4. Wybierz opcję Edytuj fokus w oknie Nawigatora.
5. W panelu Low Dose Control (Sterowanie niską dawką) usuń zaznaczenie opcji Obróć oś międzyobszarową, aby umieścić opcje Trial (Próba) i Focus (Ostrość) wzdłuż osi pochylenia stołu montażowego.
6. Kliknij żądany region na załadowanej mapie widoków, aby ustawić ostrość/pozycję próbną dla tej serii pochylenia.
7. Upewnij się, że element Nawigatora ma teraz ustawiony TSP; powtórz procedurę dla wszystkich elementów.
   UWAGA: Pozycje ostrości/ścieżki są automatycznie kopiowane w dół w Nawigatorze. W związku z tym, jeśli pozycja ostrości/ścieżki dla poprzedniego elementu znajduje się po właściwej stronie i w odpowiedniej odległości, nie ma potrzeby jej zmiany dla bieżącego elementu.

10. Ustawianie dodatkowych skryptów

1. Dwa skrypty obsługują zakres Focus: pretomo i duringtomo. Skrypt pretomo jest uruchamiany przed każdą serią tiltów, a skrypt duringtomo podczas każdej serii tiltu.
2. Edytuj zakres ostrości w pretomo skryptu.
3. W menu SerialEM Tilt Series zaznacz opcję Uruchom skrypt w TS i wybierz numer skryptu duringtomo.

11. Uruchom

1. Sprawdź poziom azotu w zbiorniku.
2. Sprawdź, czy wybrano opcję Wyłącz turbo automatyczną ładowarkę.
3. Sprawdź wolne miejsce w pamięci masowej.
4. W menu Plik SerialEM usuń zaznaczenie opcji ciągłego zapisywania dla pliku dziennika i zamknij wszystkie aktualnie otwarte pliki dziennika. Każda seria pochyleń otrzyma swój własny plik dziennika.
5. W menu Nawigator kliknij opcję Zdobądź w elementach.
6. Uruchom skrypt PreTomo.
7. Wybierz zadanie podstawowe Zdobądź serię pochylenia.
8. Wybierz opcję Uruchom skrypt po PostTomo.
9. Wybierz opcję Zamknij zawory kolumny na końcu.
10. Wybierz pozycję Wyślij wiadomość e-mail na końcu.
11. Kliknij GO.
    UWAGA: SerialEM wyśle wiadomość e-mail na serię przechyłu, pomyślnie lub błędnie; Błąd może jednak również oznaczać, że nie osiągnięto pełnego zakresu pochylenia.

Wyniki

Niniejszą procedurę zastosowano w celu uzyskania serii obrazów pochylonych Sars-Cov-2 opisanych w pracy Turonova i wsp. 2020²⁰; cały zestaw danych został wytworzony przy użyciu trzech różnych siatek podczas trzech sesji mikroskopowych w EMBL Heidelberg. Niniejsze badanie skupi się na opisie pierwszej sesji trwającej 3 dni (~72 h), przeprowadzonej z wykorzystaniem pierwszej siatki.

Po zmapowaniu całej siatki przy niskim powiększeniu (~10 min, patrz krok 2), na mapie siatki wybrano 71 odpowiednich kwadratów, a następnie wykonano mapy przy średnim powiększeniu (mapy kwadratowe) wykonano przy zastosowaniu ustawień (powiększenie, czas ekspozycji, defocus), które umożliwiają bezpośrednią wizualizację i identyfikację badanego obiektu, w tym przypadku koronawirusów (patrz krok 4) (Rysunek 1A). Czas akwizycji wynosił ok. 3 min na pole, łącznie 3 h 45 min.

Gdy tylko utworzono pierwszą mapę kwadratową, na osobnym komputerze otwarto pomocniczą instancję SerialEM (bez kontroli nad kamerą lub mikroskopem), aby zwizualizować mapę kwadratową i zaznaczyć punkty na celach odpowiednich do pozyskiwania serii przechyłów (patrz krok 5) (Rysunek 1B). Nowo pozyskane mapy kwadratowe pobierano poprzez scalenie bieżącego nawigatora pomocniczej instancji SerialEM z nawigatorem z instancji SerialEM odpowiedzialnej za akwizycję. Po około 2 h akwizycji i wyboru kwadratów siatki zidentyfikowano 50 początkowych celów.

Po zakończeniu pozyskiwania map kwadratowych skonfigurowano tryb low-dose w programie SerialEM, a następnie wykonano i zapisano jako mapy obrazy referencyjne View oraz Preview (patrz krok 3). Te ostatnie mapy można było bezzwłocznie wykorzystać w pomocniczej instancji SerialEM do wygenerowania z odpowiadających im obrazów map kwadratowych map Virtual View (Rysunek 1C) oraz Virtual Preview (Rysunek 1D) dla 50 wybranych celów przy użyciu pakietu oprogramowania PyEM, co zajęło około 30 min (patrz krok 6). Ten czas przetwarzania w pomocniczej sesji SerialEM wykorzystano do przeprowadzenia końcowych przygotowań mikroskopu do akwizycji: strojenia filtra energetycznego, pozyskiwania nowego referencyjnego obrazu wzmocnienia kamery oraz wyrównania soczewki obiektywu w celu eliminacji astygmatyzmu i komy.

Po zakończeniu strojenia mikroskopu i wygenerowaniu wirtualnych map z 50 początkowych celów, skonfigurowano właściwy nawigator SerialEM do akwizycji (patrz krok 8), ustawiono pozycje ostrości i śledzenia (krok 9), a następnie rozpoczęto akwizycję serii pochyleń (patrz kroki 10 i 11). Mapy Virtual View (Rycina 1C) posłużyły do wstępnego centrowania celu (Rycina 1E), po czym przeprowadzono końcowe centrowanie przy powiększeniu stosowanym podczas właściwej akwizycji serii pochyleń (Rycina 1F), korzystając z mapy Virtual Preview (Rycina 1D).

Rozpoczęwszy od mapowania siatki o godzinie 9:30 rano, akwizycja serii nachyleń dla 50 początkowych celów rozpoczęła się około godziny 15:00. Przy ustawieniach zastosowanych do akwizycji tomograficznej (szczegóły w odniesieniu), pozyskanie jednej serii nachyleń zajmowało ~20 min, co zapewniło wystarczającą liczbę celów do pracy przez całą noc. Podczas trwania akwizycji można było analizować pozostałe mapy kwadratowe i dodawać kolejne cele, nadal w trybie off-line za pomocą pomocniczej instancji SerialEM. Spośród pozostałych map kwadratowych wybrano 121 dodatkowych celów i dodano je do nawigatora SerialEM odpowiedzialnego za akwizycję po utworzeniu map wirtualnych dla tych nowych celów, co wystarczyło do zakończenia 72 h sesji.

Procedura ta (podsumowana na Rysunku 2) pozwoliła w ciągu jednego dnia roboczego na przygotowanie 171 celów do zautomatyzowanej akwizycji tomograficznej dla 72-godzinnej (3-dniowej) sesji mikroskopowej.

Rysunek 1: Przykład mapy kwadratowej z reprezentatywnymi mapami wirtualnymi i odpowiadającymi im akwizycjami po centrowaniu. (A) Reprezentatywna mapa kwadratowa siatki cryoEM Sars-Cov-2 użytej w pracy Turonova et al.²⁰. Cztery obszary zainteresowania są zaznaczone czerwonym krzyżykiem. Powiększenie mikroskopu wynosi 2 250x. (B) Wycinek mapy kwadratowej wyróżniający obszary, które zostały wykorzystane do wygenerowania map Virtual View (pomarańczowe) i Virtual Preview (żółte) dla wybranego celu (czerwony krzyżyk) (C) Mapa Virtual View. (D) Mapa Virtual Preview. (E) Rzeczywista akwizycja widoku (Actual View) po centrowaniu z wykorzystaniem mapy Virtual View jako referencji. Powiększenie mikroskopu wynosi 11 500x. (F) Akwizycja przy nachyleniu 0° z serii nachyleń po centrowaniu z wykorzystaniem mapy Virtual Preview jako referencji. Powiększenie mikroskopu wynosi 64 000x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Przepływ pracy sesji CryoET z wykorzystaniem SerialEM oraz narzędzi PyEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Z techniki niszowej, cryoET stał się obecnie szeroko rozpowszechnioną metodą wykonywania badań strukturalnych na poziomie komórkowym i molekularnym z niespotykaną dotąd osiągalną rozdzielczością^21,22. Stale rosnące zapotrzebowanie na obrazowanie krioelektromagnetyczne stanowi obciążenie dla ograniczonych zasobów dostępnych w celu uzyskania dostępu do tej technologii. Pomimo otwarcia wielu krajowych ośrodków krioEM i wysiłków instytutów naukowych w celu zwiększenia ich zdolności TEM do zaspokajania potrzeb społeczności na całym świecie, dostęp do instrumentów krioEM jest nadal ograniczony, a zatem czas dostępny na gromadzenie danych musi być efektywnie wykorzystany przez użytkowników, aby zmaksymalizować wydajność każdej sesji mikroskopowej. Konieczność pozyskania setek serii pochyleń w połączeniu z ograniczonym czasem dostępnym na gromadzenie danych wymagała nowatorskich procedur akwizycji obrazów w celu osiągnięcia lepszej przepustowości bez uszczerbku dla jakości danych. Ostatnie osiągnięcia w zakresie sprzętu i procesów obrazowania znacznie zwiększyły szybkość akwizycji serii pochylenia^18,19, co spowodowało radykalną zmianę stosunku czasu poświęconego na ustawienie punktu akwizycji do czasu potrzebnego na faktyczną akwizycję serii pochylenia. Ogólnie rzecz biorąc, procedura ustawiania punktów akwizycji staje się jednym z głównych wąskich gardeł dla osiągalnej przepustowości sesji krioET.

Przedstawiony tutaj zoptymalizowany protokół umożliwił nam ustawienie, w trybie off-line, 171 pozycji do automatycznej akwizycji tomograficznej w ciągu pierwszego dnia sesji krioET, podczas gdy mikroskop był aktywnie zaangażowany w inne operacje (np. mapowanie kwadratowe, strojenie i automatyczną akwizycję serii pochylenia), bez wpływu na czas dostępny do zbierania danych pod mikroskopem. Oprócz maksymalizacji przepustowości sesji cryoET, potok ten drastycznie zmniejsza ilość czasu zainwestowanego przez użytkownika w fazę przygotowawczą sesji automatycznego zbierania danych. W opisanym protokole użytkownik jest proszony o przeglądanie zmapowanych kwadratów siatki w celu zidentyfikowania odpowiednich obszarów zainteresowania i dodania ich do Serial EM Navigator jako punktów akwizycji. Wszystkie cele zostaną następnie automatycznie przetworzone wsadowo w SerialEM przez narzędzie PyEM w celu wytworzenia map wirtualnych¹⁶. Przedstawione podejście obliczeniowe jest zatem znacznie szybsze niż pozyskiwanie rzeczywistych map zakotwiczenia, eliminując okresy oczekiwania związane z ruchem sceny, akwizycją obrazu, zmianą warunków obrazowania między widokiem a podglądem oraz poprzez ewentualne powtórzenie tych kroków przy wyśrodkowaniu w dużym powiększeniu. Dodatkowo, ponieważ każdy uzyskany obraz prowadzi do akumulacji dawki elektronów na obiekcie zainteresowania²³, wykorzystanie wirtualnych map do precyzyjnego przegrupowania celów zmniejsza uszkodzenia radiacyjne wprowadzone w fazie przygotowawczej sesji krioET przed właściwą akwizycją serii pochylenia. Opisany tutaj protokół wykorzystuje zarówno średnie, jak i duże powiększenia wirtualne mapy (odpowiednio Podgląd i Widok) do ponownego wyrównania celu przed akwizycją serii pochylenia. Procedurę tę można łatwo zmodyfikować tak, aby używała tylko pośredniego powiększenia Wyświetl obraz, gdy dokładność wyrównania ma mniejsze znaczenie, na przykład w przypadku dużych konstrukcji, w których ostateczna dokładność celu jest mniej istotna¹⁰ lub w przypadku próbek do analizy pojedynczych cząstek, które są słabo rozłożone na kriosiatce, co wymaga ręcznego wyboru przez użytkownika każdego punktu akwizycji^{24, Lokal mieszkalny 25}. Wreszcie, podejście oparte na wykorzystaniu w trybie off-line fikcyjnej instancji SerialEM ułatwia również ustawianie punktów akwizycji za pośrednictwem zdalnego połączenia, minimalizując potrzebę fizycznej obecności użytkownika przy mikroskopie, umożliwiając w ten sposób większą elastyczność w zakresie organizacji operacyjnej obiektu.

Ostatnie postępy w technologii i metodach krioET drastycznie poprawiły szybkość i niezawodność automatycznych sesji zbierania danych. Konieczne są jednak dalsze prace w celu rozwiązania pozostałych etapów ograniczania szybkości w ramach tej metody. Przede wszystkim początkowy etap mapowania siatki i kwadratu staje się obecnie jednym z głównych wąskich gardeł w konfiguracji sesji, generując w ten sposób potrzebę ulepszeń sprzętowych mających na celu zwiększenie prędkości ruchów stolika mikroskopu i akwizycji obrazu przez bezpośrednie detektory elektronów. Ponadto opracowanie podejść do uczenia maszynowego w celu pełnej automatyzacji procesu identyfikacji celów będzie miało kluczowe znaczenie dla wyeliminowania potrzeby oględzin użytkowników w celu wyboru obszarów zainteresowania, co jest czasochłonną procedurą, która opiera się na wiedzy specjalistycznej użytkowników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Transmisyjny mikroskop elektronowy			Nasz protokół opiera się wyłącznie na obliczeniowych przepływach pracy. Użytkownik będzie potrzebował tylko dostępu do dowolnego rodzaju TEM