Artykuł metodologiczny

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62391

⸱

31 marca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naczynia krwionośne są wszechobecne we wszystkich tkankach ciała i pełnią różnorodne funkcje. W związku z tym uzyskanie dojrzałych komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, które wyściełają światło naczyń krwionośnych, z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla wielu zastosowań inżynierii tkankowej i regeneracji. In vivo pierwotne komórki śródbłonka pochodzą z linii mezodermalnej i są określone w określonych podtypach, w tym tętniczych, żylnych, włosowatych, hemogennych i limfatycznych. Hemogenne komórki śródbłonka są szczególnie interesujące, ponieważ podczas rozwoju dają początek hematopoetycznym komórkom macierzystym i progenitorowym, które następnie generują wszystkie linie krwi przez całe życie. W związku z tym stworzenie systemu do generowania hemogennych komórek śródbłonka in vitro dałoby możliwość zbadania przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego i może doprowadzić do produkcji ex vivo ludzkich produktów krwiopochodnych i zmniejszenia zależności od ludzkich dawców. Chociaż istnieje kilka protokołów wyprowadzania komórek progenitorowych i pierwotnych śródbłonka, nie opisano wytwarzania dobrze scharakteryzowanych hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich komórek macierzystych. W tym miejscu przedstawiono metodę wyprowadzania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia: protokół różnicowania z prymitywnymi komórkami smugowymi utworzonymi w odpowiedzi na GSK3β inhibitor (CHIR99021), następnie indukcja linii mezodermy za pośrednictwem bFGF, a następnie rozwój pierwotnych komórek śródbłonka promowany przez BMP4 i VEGF-A, a na końcu specyfikacja hemogennych komórek śródbłonka indukowana przez kwas retinowy. Protokół ten daje dobrze zdefiniowaną populację hemogennych komórek śródbłonka, które można wykorzystać do dalszego zrozumienia ich regulacji molekularnej i przejścia ze śródbłonka do układu krwiotwórczego, co może być potencjalnie zastosowane w dalszych zastosowaniach terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka (EC) to heterogeniczna populacja komórek, które pełnią wiele funkcji w całym ludzkim ciele i w zmodyfikowanych tkankach. Oprócz wspierania i regulowania innych typów komórek (np. kardiomiocytów1, komórek osteoblastycznych2), funkcje te obejmują tworzenie selektywnej bariery między krwią a tkankami oraz wspomaganie tworzenia tkanek3. Różnicowanie dojrzałych EC podczas normalnego rozwoju wymaga zróżnicowanych szlaków sygnałowych. Pierwotne EC pochodzą od progenitorów mezodermy, a następnie są określane w kierunku dojrzałych fenotypów tętnic, żylnych, włosowatych i limfatycznych4. Dodatkowo, niewielka podgrupa EC w pozaembrionalnym woreczku żółtkowym i embrionalnym regionie Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) jest również określona, aby stać się hemogennymi EC EC, które powodują powstawanie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), które migrują do wątroby płodu i szpiku kostnego płodu, gdzie pozostają po urodzeniu i generują wszystkie typy komórek krwi przez całe życie4. Różnorodna gama fenotypów EC jest niezbędna dla rozwoju i utrzymania wszystkich tkanek.

Tak więc, EC i ich pochodne są kluczowymi komponentami badań mających na celu modelowanie i wyjaśnianie mechanizmów rozwoju i/lub chorób człowieka, a także zastosowań medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej5,6,7,8. Jednak głównym ograniczeniem dla tego typu badań jest brak dostępności pierwotnych ludzkich EC w wymaganej ilości. Szacuje się, że dla większości zastosowań terapeutycznych wymagane byłoby minimum 3 x 108 ECs6. Aby rozwiązać ten problem, zaproponowano wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) ze względu na ich zróżnicowany potencjał rodowy i zdolność do generowania dużej liczby potomstwa6,9.

Rzeczywiście, przydatność komórek pochodzących z hESC lub hiPSC została wykazana w wielu badaniach skoncentrowanych na modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków10,11,12. Technologia Organ-on-a-Chip (OOC) została wykorzystana do wierniejszego odtworzenia fizjologii ludzkiego ciała poprzez integrację komórek i tkanek w trójwymiarowe rusztowania. Co więcej, połączenie wielu indywidualnych OOC (tzw. body- lub human-on-a-chip, BOC/HOC) może być realizowane za pomocą mikrofluidyki, aby umożliwić przesłuch między narządami będącymi przedmiotem zainteresowania13,14,15. Tkanki podporowe, takie jak naczynia krwionośne, są krytycznymi składnikami OOC i BOC/HOC; Włączenie układu naczyniowego pozwala na transport składników odżywczych, tlenu i czynników parakrynnych w tkankach, promując w ten sposób wymagane mikrośrodowisko specyficzne dla tkanki3,12. W związku z tym metody uzyskiwania dojrzałych ludzkich EC, takie jak EC tętnicze, żylne, limfatyczne i hemogenne, mają kluczowe znaczenie dla postępu w tych podejściach inżynierii tkankowej.

Opublikowano wiele protokołów szczegółowo opisujących etapy wyprowadzania ludzkich pierwotnych lub progenitorowych EC z hESC lub hiPSCs5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Wiele z tych protokołów opiera się na tworzeniu ciała zarodkowego (EB) lub wspólnej hodowli ESC/iPSC z mysią warstwą zasilającą komórki zrębu. Strategie te są zwykle trudne i czasochłonne, z niską wydajnością EC i/lub zanieczyszczeniem ludzkich EC komórkami mysimi. Protokoły, które opierają się wyłącznie na hodowli 2D bez użycia komórek zrębu, często wymagają długich indukcji, wykorzystują złożone kombinacje czynników wzrostu i / lub inhibitorów do indukcji, mają wydłużone okresy ekspansji po separacji komórek lub kombinację tych czynników. Pogłębienie wiedzy na temat szlaków sygnałowych i czynników biorących udział w wyprowadzaniu dojrzałych typów EC in vivo stanowi podstawę dla prostego i solidnego protokołu różnicowania in vitro.

Poprzednio, zidentyfikowano kluczowe role szlaków sygnałowych Notch i kwasu retinowego (RA) w specyfikacji mysich tętniczych i hemogennych EC podczas rozwoju. Szlak sygnałowy Notch odgrywa wiele ról w specyfikacji i utrzymaniu tętniczego fenotypu EC. Prace z wykorzystaniem mysiego modelu unaczynienia siatkówki pozwoliły zidentyfikować szlak, w którym naprężenie ścinające płyn indukuje oś sygnalizacyjną Notch-Cx37-p27, promując zatrzymanie cyklu komórkowego G1, co umożliwia tętniczą specyfikację EC27. Przypuszcza się, że stany cyklu komórkowego odgrywają rolę w decyzjach dotyczących losu komórki, zapewniając wyraźne okna możliwości, w których komórki są otwarte na pewne sygnały, które mogą indukować ekspresję genów i zmiany fenotypowe28. To zatrzymanie G1 za pośrednictwem Notch umożliwiło ekspresję genów wzbogaconych w tętnicze EC EC, w tym ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 i Notch 4 (recenzja w29,30). Wykazano również, że hemogenna specyfikacja EC jest promowana in vivo poprzez sygnalizację RA31,32. Dodatkowe badania wykazały, że po sygnalizacji RZS ekspresja c-Kit i Notch zwiększa p27, co umożliwia specyfikację hemogenną w woreczku z żółtkiem myszy i AGM33. Mysie hemogenne EC można minimalnie zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów śródbłonka (tj. CD31, KDR), jak i hematopoetycznych (tj. c-Kit, CD34)4. Wreszcie, hemogenne EC przechodzą przemianę śródbłonkową do krwiotwórczej (EHT) w celu utworzenia HSPC, które mogą dać początek wszystkim typom komórek krwi4,34,35.

Ostatnie prace sprawdzały, czy ta sama hierarchia sygnalizacji może promować ludzką hemogenną specyfikację EC. W tym celu opracowano protokół hodowli 2D bez surowicy i karmy w celu uzyskania hemogennych EC z hESC, a te hemogenne EC scharakteryzowano na poziomie pojedynczej komórki jako CD31 + KDR+ c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. W badaniu wykorzystano również reporter wskaźnika cyklu komórkowego ubikwitynacji fluorescencyjnej (FUCCI), który identyfikuje różne stany cyklu komórkowego przy użyciu H9-hESC, które wyrażają konstrukt reporterowy FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. W badaniach z tymi komórkami wykazano, że RZS sprzyja wczesnemu zatrzymaniu cyklu komórkowego G1 w ECs, a wczesny stan G1 umożliwia specyfikację hemogenną in vitro37. W niniejszym dokumencie przedstawiono szczegółowy protokół różnicowania tych ludzkich hemogennych komórek śródbłonka i testy potwierdzające ich tożsamość. Ta prosta metoda stanowi użyteczny sposób generowania tego wyspecjalizowanego podzbioru EC do przyszłych badań nad mechanizmami rozwoju ludzkich krwinek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Odczynniki i przygotowanie odczynników

UWAGA: Lista odczynników znajduje się w Tabeli materiałów.

  1. Otrzymanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    UWAGA: Wytwarzanie hemogennych EC może być bardziej wydajne w linii komórkowej H1.
  2. Przygotuj zapasy białka matrycy: Podwielokrotnić białko matrycy do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml (na lodzie), tak aby każda probówka zawierała 1 mg białka matrycowego. 1 mg białka matrycy wystarcza do pokrycia wszystkich studzienek dwóch płytek 6-dołkowych (łącznie 12 dołków). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    UWAGA: Wykonać wszystkie czynności związane z białkiem matrycowym na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z białkiem matrycy na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Po rozmrożeniu należy zakręcić fiolkę, aby upewnić się, że zawartość jest wymieszana. Schładzać wstępnie 1,5 ml probówek mikrowirówkowych przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20 °C i przenieść do lodu bezpośrednio przed porcjowaniem.
  3. Przygotować płytki pokryte białkiem matrycowym: Rozmrozić podwielokrotności białka matrycy na lodzie w temperaturze 4 °C. Dodać 12,5 ml lodowatego DMEM:F12 do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki na lodzie. Korzystając z wstępnie schłodzonych końcówek pipet, przenieś jedną porcję (1 mg) białka matrycy do stożkowej probówki i dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Porcję 1 ml rozcieńczonego białka matrycy do każdego dołka wstępnie schłodzonych płytek 6-dołkowych (na lodzie) za pomocą wstępnie schłodzonej pipety serologicznej. Zakręć i kołysz talerze, aby cała studnia była równomiernie pokryta. Inkubować płytki przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić zestalenie się białka matrycy. Owinąć płytki folią i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Płytki pokryte białkiem matrycowym należy stosować w ciągu 2 tygodni od przygotowania.
    UWAGA: Użyj 6-dołkowych płytek pokrytych białkiem macierzy do rutynowego pasażowania komórek i różnicowania do pierwotnych i hemogennych komórek śródbłonka. Wykonaj wszystkie kroki na lodzie. Przed użyciem należy wstępnie schłodzić płytki 6-dołkowe, końcówki pipet, pipety serologiczne i probówki stożkowe przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20 °C. Przenieść te przedmioty do lodu, gdy będą gotowe do użycia.
  4. Przygotować pożywkę różnicującą zasady, dodając 5 ml PFHM do 100 ml pluripotencjalnej pożywki różnicującej komórki macierzyste. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować 0,1% BSA-PBS, rozpuszczając 0,1 g BSA w 100 ml PBS. Filtr sterylizuje BSA-PBS, przechodząc przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotuj 5 mM HCl, rozcieńczając podstawowy HCl (12 M) 1:2,400 wodą. Dostosuj pH do 3,0 za pomocą NaOH. Filtr wysterylizować roztwór, przepuszczając przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotuj zapasy bFGF, BMP4, VEGF-A, kwasu retinowego (RA) i DLL4.
    1. bFGF: Rozpuść liofilizowany proszek do 100 μg/ml w 0,1% BSA-PBS. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wywar z bFGF zużyć w ciągu 3 miesięcy od przygotowania. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
    2. BMP4: Rozpuść liofilizowany proszek do 1 mg/ml w 5 mM HCl, pH 3,0. Następnie rozcieńczyć do 50 μg/ml w 0,1% BSA-PBS. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zapasy BMP4 zużyć w ciągu 3 miesięcy od przygotowania. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
    3. VEGF-A: Rozpuścić liofilizowany proszek do 1 mg/ml w dH2O. Dalej rozcieńczyć do 100 μg/ml w 0,1% BSA-PBS. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wywar VEGF-A zużyć w ciągu 3 miesięcy od przygotowania. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
    4. RA: Rozpuść liofilizowany proszek do 100 mM w DMSO. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zapasy RZS zużyć w ciągu 1 miesiąca od przygotowania. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
      UWAGA: Chronić kolby RA przed światłem.
    5. DLL4: Rozpuść liofilizowany proszek do 1 mg/ml w PBS. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zapasy DLL4 należy zużyć w ciągu 12 miesięcy od przygotowania. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
  8. Bezpośrednio przed użyciem przygotować pożywkę do różnicowania komórek śródbłonka, rozcieńczając VEGF-A i BMP4 w pożywce różnicującej zasady (etap 1.4) tak, aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 25 ng/ml i 50 ng/ml.
  9. Przygotuj roboczą RA bezpośrednio przed użyciem, rozcieńczając 100 mM materiału 1:1,000 w DMSO do 100 μM.
    UWAGA: Chroń pracujący RA przed światłem.
  10. Przygotować pożywkę do różnicowania hemogennych komórek śródbłonka bezpośrednio przed użyciem, rozcieńczając VEGF-A, BMP4 i robocze RA w pożywce różnicującej zasady (krok 1.4), tak aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 25 ng / ml, 50 ng / ml i 0,5 μM.
  11. Przygotować bufor do barwienia przeciwciał, sporządzając HBSS zawierający 10% FBS i uzupełnić rozcieńczonym w stosunku 1:500 odczynnikiem przeciwdrobnoustrojowym. Sterylnie przefiltrować bufor i natychmiast zużyć.
  12. Przygotować bufor do sortowania komórek, sporządzając HBSS zawierający 1% FBS i uzupełnić rozcieńczonym odczynnikiem przeciwdrobnoustrojowym w stosunku 1:500. Sterylnie przefiltrować bufor i natychmiast zużyć.
  13. Przygotuj 1 mg/ml wywaru fibronektyny, dodając 5 ml sterylnej wody do 5 mg liofilizowanej fibronektyny. Porcję należy podać i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zapasy fibronektyny należy zużyć przed upływem terminu ważności podanego na etykiecie produktu liofilizowanego. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
  14. Przygotuj naczynia o średnicy 35 mm pokryte fibronektyną. Rozcieńczyć zapasy fibronektyny (1 mg/ml) do 4 μg/ml w sterylnej wodzie. Dodać 1 ml tego roztworu powlekającego fibronektynę do każdego naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut do 1 godziny. Naczynia należy używać bezpośrednio po powlekaniu.
  15. Przygotować 3 lub 4 ml podwielokrotności pożywki na bazie metylocelulozy zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Należy użyć podwielokrotności pożywki na bazie metylocelulozy przed upływem terminu ważności wskazanego na etykiecie produktu podstawowego. Rozmrozić podwielokrotności bezpośrednio przed użyciem.
  16. Przygotować roztwór powlekający DLL4, rozcieńczając rekombinowany ludzki materiał podstawowy DLL4 do końcowego stężenia 10 μg/ml w PBS.
  17. Przygotuj i przechowuj pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka zgodnie z instrukcjami producenta.
  18. Przygotować bufor do analizy cytometrii przepływowej, sporządzając PBS zawierający 0,1% BSA. Sterylnie przefiltrować bufor i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Hodowla komórkowa i pasażowanie hESC

  1. Pozwól, aby płytki pokryte białkiem macierzy, pożywka do wzrostu komórek macierzystych i DMEM: F12 ogrzały się do temperatury pokojowej.
  2. Hodować linie komórkowe hESC w pożywce do wzrostu komórek macierzystych (2 ml/dołek) na 6-dołkowych płytkach pokrytych białkiem matrycowym w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Codziennie sprawdzaj komórki i w razie potrzeby usuwaj zróżnicowane komórki, delikatnie zeskrobując je z płytki za pomocą końcówki do pipety p200.
    UWAGA: Zróżnicowane komórki pojawią się na obrzeżach kolonii. Zapoznaj się z instrukcją obsługi pożywki do wzrostu komórek macierzystych, aby zapoznać się z przykładami zróżnicowanych komórek w hodowli.
  4. Przejdź przez komórki, gdy osiągną 70%-80% konfluencji. Aby przejść komórki, wykonaj następujące czynności.
    UWAGA: Komórki należy podzielić przed osiągnięciem 70%-80% konfluencji, jeśli występuje zwiększone różnicowanie.
    1. Usuń pożywkę nad komórkami i delikatnie przemyj 1 ml DMEM:F12 na dołek.
    2. Dodaj 1 ml DMEM:F12 na dołek.
    3. Dodać 160 μl/ml dypazy do studzienki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 45 minut.
    4. Po inkubacji Dispase dodać dodatkowy 1 ml DMEM:F12 na studzienkę i delikatnie pipetować, aby podnieść komórki.
      UWAGA: Unikaj dysocjacji komórek w zawiesinę jednokomórkową. Przejdź komórki w postaci małych grudek.
    5. Przenieś komórki do stożkowej probówki zawierającej 12 ml DMEM:F12 i pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie (~5-10 min).
    6. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 0,5 ml pożywki do wzrostu komórek macierzystych na studzienkę podniesionych komórek, aby uzyskać małe grudki komórek.
      UWAGA: Unikaj dysocjacji komórek w zawiesinę jednokomórkową. Przejdź komórki w postaci małych grudek.
    7. Odessać roztwór powlekający białko macierzy z dołków przygotowanej płytki pokrytej białkiem macierzy i dodać 1,5 ml pożywki do wzrostu komórek macierzystych na studzienkę.
    8. Dodać żądaną objętość ponownie zawieszonych komórek (krok 2.4.6) do każdego dołka przygotowanej płytki pokrytej białkiem matrycowym.
    9. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 24 godziny na świeżą pożywkę do wzrostu komórek macierzystych.

3. Różnicowanie komórek hESC do pierwotnych komórek śródbłonka

  1. Dzień -1: Hodowla i pasaż komórek, jak opisano powyżej w sekcji 2. Zasiej komórki (krok 2.4.6) w małe kępy (~50 μm) o gęstości około 2 grudek na centymetr kwadratowy38.
    UWAGA: Oceń gęstość nasion i w razie potrzeby udoskonal empirycznie.
  2. Dzień 0: 24 godziny po wysianiu komórek, odessać pożywkę z każdej studzienki i delikatnie przemyć komórki 1 ml DMEM:F12 na dołek. Dodać 1 ml pożywki różnicującej zawierającej 5 μM GSK3i (CHIR99021, dodane świeże) do każdej studzienki i inkubować przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2).
    UWAGA: Na wszystkich etapach mycia powoli dodawaj wskazany środek myjący do płytki, pipetując do ścianki płytki. Delikatnie zakręć płytką tak, aby cała powierzchnia studni była pokryta mediami myjącymi. Lekko przechyl płytę tak, aby płyn myjący zebrał się w pozycji godziny szóstej i ostrożnie zassaj płyn myjący.
  3. Dzień 1: Odessać pożywkę z każdej studzienki i delikatnie przemyć komórki 1 ml DMEM:F12 na dołek. Dodać 1 ml pożywki do różnicowania zasad zawierającej 50 ng/ml bFGF (dodanego świeżego, 1:2 000 z zamrożonego bulionu) do każdej studzienki i inkubować przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Dzień 2: Odessać pożywkę z każdej studzienki i delikatnie umyć komórki 1 ml DMEM:F12 na dołek. Dodać 1 ml pożywki do różnicowania komórek śródbłonka do każdej studzienki i inkubować przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  5. Dzień 3: Zastąp pożywkę nad komórkami 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka na dołek i inkubuj 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  6. Dzień 4: Zastąp pożywkę nad komórkami 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do różnicowania komórek śródbłonka na dołek i inkubuj 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  7. Dzień 5: FACS oczyszczają komórki w celu oceny fenotypu EC (sekcje 4-5) lub utrzymują w hodowli i różnicują się w kierunku hemogennych komórek śródbłonka (sekcja 6).

4. Oczyszczanie pierwotnych komórek śródbłonka metodą FACS

  1. Zassać pożywkę powyżej komórek i delikatnie przemyć raz 1 ml DMEM:F12 na dołek.
  2. Dodać 1 ml roztworu do odrywania komórek do studzienki i inkubować komórki przez 12 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 lub do momentu dysocjacji komórek.
  3. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki zawierającej 12 ml DMEM:F12 i osadu przez odwirowanie przez 5 minut, 1,000 x g.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml DMEM:F12 w celu przemycia.
  5. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut, 1 000 x g.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w lodowatym buforze do barwienia przeciwciał i policzyć komórki. Dostosuj stężenie za pomocą lodowatego buforu do barwienia przeciwciał do 1 x 105 komórek/ml.
  7. Podzielić komórki równomiernie do probówek mikrowirówek na lodzie, z których każda zawiera co najmniej 600 μl komórek o stężeniu 1 x 105 komórek/ml, w celu barwienia przeciwciał.
    UWAGA: Do barwienia pierwotnych EC wymagane są cztery probówki komórek: kontrola niebarwiona, kontrola pojedynczego przeciwciała CD31, kontrola pojedynczego przeciwciała CD45 oraz próbka zawierająca zarówno przeciwciała CD31, jak i CD45. Informacje na temat przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów.
  8. Dodać przeciwciała do probówek zawierających komórki, w zależności od potrzeb, i inkubować na lodzie, chronić przed światłem przez 30 minut.
    1. Niebarwiona kontrola: Nie dodawać żadnych przeciwciał.
    2. Kontrola pojedynczego przeciwciała CD31: Dodaj tylko przeciwciało CD31.
    3. Kontrola pojedynczego przeciwciała CD45: Dodaj tylko przeciwciało CD45.
    4. Próbka: Dodaj przeciwciała CD31 i CD45.
      UWAGA: Końcowe stężenie przeciwciał w próbce, jak również koniugaty fluorescencyjne, powinno być zoptymalizowane w oparciu o zastosowane specyficzne przeciwciała i sorter komórek.
  9. Granulować komórki przez odwirowanie w mikrowirówce stołowej o temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 1 000 x g.
  10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 600 μl lodowatego buforu sortującego.
  11. Przecedzić próbki przez siatkowe nasadki filtrujące w probówkach FACS o pojemności 5 ml i przechowywać komórki na lodzie, chronione przed światłem, w celu natychmiastowego FACS.
  12. Uzyskaj pierwotne komórki śródbłonka (CD31 + CD45-), wykonując następujące czynności.
    1. Zidentyfikuj populację komórek i bramkę CD45-ujemną (CD45-).
    2. W obrębie (CD45-) zidentyfikuj populację komórek CD31-dodatnich (CD31 +) i posortuj komórki do 6 ml lodowatego buforu do sortowania komórek. Ogniwa te należy stosować w dalszych zastosowaniach (patrz sekcja 5).

5. Test potwierdzający fenotyp pierwotnej komórki śródbłonka

  1. Pokryć trzy dołki 6-dołkowej płytki roztworem powlekającym DLL4 o pojemności 1 ml/studzienkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Jako kontrolę, pobierz pozostałe trzy dołki płytki 1 ml / studzienkę PBS.
  2. Odessać roztwór powlekający DLL4 i PBS, a następnie umieścić 25 000 posortowanych pierwotnych komórek śródbłonka (patrz krok 4.12) w 2 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka na studzienkę.
  3. Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Zassać pożywkę powyżej komórek i przemyć raz 2 ml/studzienkę PBS. Analizuj komórki za pomocą qPCR lub cytometrii przepływowej (dla komórek wyrażających konstrukt FUCCI).
    1. Aby przeanalizować komórki metodą qPCR, wykonaj następujące czynności.
      1. Odessać ciecz nad komórkami i wyizolować RNA w komórkach za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta.
      2. Wykonaj reakcje odwrotnej transkrypcji z główną mieszanką odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.
      3. Przeprowadzić reakcje qPCR z mieszanką wzorcową SYBR Green zgodnie z protokołem producenta.
        UWAGA: Zastosowane startery (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) są wymienione w tabeli 1.
    2. Aby przeanalizować komórki wyrażające konstrukt FUCCI za pomocą cytometrii przepływowej, wykonaj następujące kroki.
      1. Odessać płyn powyżej komórek i dodać 500 μl/studzienkę 0,25% trypsyny-EDTA.
      2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 do momentu ich podniesienia, ~5 min.
      3. Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki i zagnieździć je w mikrowirówce o temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 1 000 x g.
      4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl lodowatego buforu do analizy cytometrii przepływowej.
      5. Przecedzić próbki przez siatkową nasadkę filtra w probówce FACS o pojemności 5 ml i przechowywać komórki na lodzie, chronione przed światłem, w celu natychmiastowej analizy metodą cytometrii przepływowej.
      6. Przeanalizuj procent komórek posianych na DLL4 w porównaniu z kontrolą PBS we wczesnym G1 (brak koloru), późnym G1 (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) i S/G2/M (mCherry-/mVenus+).

6. Różnicowanie hESC do hemogennych komórek śródbłonka

UWAGA: Różnicuj komórki do 4 dnia pierwotnego EC, jak opisano powyżej w sekcjach 3.1-3.6.

  1. Dzień 5: Odessać pożywkę powyżej komórek i delikatnie umyć komórki 1 ml DMEM:F12 na dołek. Dodać 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do różnicowania hemogennych komórek śródbłonka na dołek i inkubować przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Dzień 6: Zastąp pożywkę nad komórkami 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do różnicowania hemogennych komórek śródbłonka na studzienkę i inkubuj 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  3. Dzień 7: Zastąp pożywkę nad komórkami 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do różnicowania hemogennych komórek śródbłonka na studzienkę i inkubuj 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
  4. Dzień 8: FACS izoluje hemogenne komórki śródbłonka (patrz punkt 7).

7. FACS-izolacja hemogennych komórek śródbłonka

  1. Podnieść i umyć ogniwa zgodnie z opisem powyżej w sekcjach 4.1-4.6.
  2. Podzielić komórki równomiernie do probówek mikrowirówek na lodzie, z których każda zawiera co najmniej 600 μl komórek o stężeniu 1 x 105 komórek/ml, w celu barwienia przeciwciał.
    UWAGA: Do barwienia przeciwciał hemogennych EC wymaganych jest osiem probówek komórek: kontrola niebarwiona, kontrola pojedynczego przeciwciała CD31, kontrola pojedynczego przeciwciała CD45, kontrola pojedynczego przeciwciała KDR, kontrola pojedynczego przeciwciała c-Kit, kontrola pojedynczego przeciwciała CD34, kontrola pojedynczego przeciwciała VE-kadheryny i próbka zawierająca wszystkie sześć przeciwciał.
    UWAGA: Informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli Materiałów.
  3. Dodać przeciwciała do probówek zawierających komórki, w zależności od potrzeb, i inkubować na lodzie, chronić przed światłem przez 30 minut.
    1. Niebarwiona kontrola: Nie dodawać przeciwciał.
    2. Kontrola pojedynczego przeciwciała CD31: Dodaj tylko przeciwciało CD31.
    3. Kontrola pojedynczego przeciwciała CD45: Dodaj tylko przeciwciało CD45.
    4. Kontrola pojedynczego przeciwciała KDR: Dodaj tylko przeciwciało KDR.
    5. Kontrola pojedynczego przeciwciała c-Kit: Dodaj tylko przeciwciało c-Kit.
    6. Kontrola pojedynczego przeciwciała CD34: Dodaj tylko przeciwciało CD34.
    7. Kontrola pojedynczego przeciwciała VE-kadheryny: Dodać tylko przeciwciało VE-kadheryny.
    8. Próbka: Dodaj przeciwciała przeciwko CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 i VE-kadherynie.
      UWAGA: Końcowe stężenie przeciwciał w próbce, jak również koniugaty fluorescencyjne, powinno być zoptymalizowane w oparciu o zastosowane specyficzne przeciwciała i sorter komórek.
  4. Granulować komórki przez odwirowanie w mikrowirówce o temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 1 000 x g.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w 600 μl lodowatego buforu sortującego.
  6. Przecedzić próbki przez siatkową nasadkę filtra w probówkach FACS o pojemności 5 ml i przechowywać komórki na lodzie, chronione przed światłem, w celu natychmiastowego FACS.
  7. Aby uzyskać hemogenne komórki śródbłonka (CD31+, KDR+, c-Kit+, CD34+, VE-Kadheryna-CD45-), wykonaj następujące kroki.
    1. Zidentyfikuj populację komórek CD45 i bramkę (CD45-).
    2. Wewnątrz (CD45-) zidentyfikuj populację komórek CD31 + i bramę (CD31 +).
    3. W obrębie (CD31 +) zidentyfikuj populację komórek VE-kadheryny i bramę (CDH5-).
    4. Wewnątrz (CDH5-) zidentyfikuj populację komórek c-Kit + i bramkę (KIT +).
    5. W (KIT+) zidentyfikuj populację komórek CD34 + i bramę (CD34 +).
    6. Wewnątrz (CD34+) zidentyfikuj i posortuj komórki KDR+ w 6 ml lodowatego bufora do sortowania komórek. Tych komórek należy używać w dalszych aplikacjach (patrz sekcja 8).

8. Test jednostki tworzącej kolonię

  1. Rozmrozić porcje pożywki na bazie metylocelulozy zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Jedna podwielokrotność o pojemności 3 ml wystarcza na dwie próbki, a jedna podwielokrotność o pojemności 4 ml wystarcza na trzy próbki.
  2. Policz posortowane hemogenne komórki śródbłonka otrzymane w kroku 7.7.
  3. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, obliczyć objętość posortowanych komórek, które należy dodać do każdej podwielokrotności pożywki na bazie metylocelulozy, tak aby każda próbka zawierała co najmniej 1 000 hemogennych komórek śródbłonka.
    UWAGA: W razie potrzeby liczbę komórek można dostosować.
  4. Dodać obliczoną objętość komórek do podwielokrotności pożywki na bazie metylocelulozy i dokładnie odwirować. Pozostaw kultury pożywki na bazie metylocelulozy w temperaturze pokojowej na 10 minut lub do momentu, gdy pęcherzyki znikną.
  5. Odessać roztwór powlekający fibronektynę z przygotowanych szalek o średnicy 35 mm. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, dozować 1 ml pożywki na bazie metylocelulozy na 35 mm szalka. Delikatnie obróć naczynie, aby równomiernie rozprowadzić kulturę.
  6. Umieść te szalki o średnicy 35 mm, a także dwie dodatkowe szalki o średnicy 35 mm wypełnione sterylną wodą, w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 15 cm.
  7. Inkubować kultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i obserwować kultury w dniach 8 i 14.
    1. W dniu 8 policz kolonie CFU-E i BFU-E.
    2. W dniu 14 policz kolonie CFU-GM i CFU-GEMM.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją pożywki na bazie metylocelulozy w celu morfologicznej identyfikacji typów kolonii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat przedstawiający specyfikację pierwotnych EC i hemogennych EC z hESC, oraz reprezentatywny obraz komórek 24 godziny po posiewie są pokazane w Rysunek 1. Zgodnie ze specyfikacją, pierwotne EC i hemogenne EC są oczyszczane FACS odpowiednio w 5 i 8 dniu. Pierwotne EC są definiowane jako CD31 + CD45 - a hemogenne EC są definiowane jako CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Kadheryna - CD45-. Reprezentatywna s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono etapy wytwarzania hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia przy użyciu mysiego systemu hodowli 2D bez karmnika i surowicy (ryc. 1). Protokół ten rozszerza metodę opisaną przez Srirama i in. (2015) w celu uzyskania pierwotnych EC38. Pierwotny charakter i potencjał specyfikacji CD31 + CD45-EC wykazano poprzez hodowlę tych komórek na płytkach pokrytych DLL4 i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIH HL128064 i U2EB017103. Dalszego wsparcia udzielił grant CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki 15 cmCorning430599hodowla tkankowa poddana obróbce
Szalki 35 mmCorning430165kultura tkankowa poddane działaniu
6-dołkowych płytekCorning3516hodowla tkankowa poddana działaniu
odczynnika przeciwdrobnoustrojowego
Nazwa marki: Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR& Systemy D233-FB-025stosować w stężeniu 50 ng/ml
BMP4BioLegend595202stosować w stężeniu 25 ng/ml
albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Roztwór do depatyzacji komórek
Nazwa handlowa: Accutase		Stemcell Technologies7920
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
DispaseStemcell Technologies7913
DLL4R& Systemy D1506-D4/CFrekombinowany człowiek; stosować przy 10 μ g / ml
DMEM: F12Gibco11320-033
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)Gibco14190144
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka
Nazwa handlowa: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		Rurki LonzaCC-3162
FACSCorning352235polistyren z okrągłym dnem z nasadką
filtraPłodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectinThermoFisher Scientific 33016015stosowania w wieku 4 μ g/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM kolba; stosować przy 5 μ
M Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Gibco14175-095
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Białko macierzy 
Nazwa handlowa: Matrigel		Corning356230Zmniejszony współczynnik wzrostu. Zapoznać się ze świadectwem analizy dla partii w celu określenia stężenia białka (Matrigel). Stężenie to jest wymagane do obliczenia objętości Matrigelu zawierającego 1 mg białka.
Pożywka na bazie metylocelulozy
Nazwa handlowa: MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
Pluripotencjalne podłoże różnicujące komórki macierzyste
Nazwa handlowa: STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
Pluripotencjalne komórki macierzyste: H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)człowiek; H9-FUCCI uzyskano z laboratorium dr Ludovica Valliera w Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)Gibco12040077
Kwas retinowySigma AldrichR2625-50 mgprzy użyciu 0,5 μ M
Mistrz odwrotnej transkrypcji mix
Nazwa handlowa: iScript Reverse Transcription Supermix		Zestaw do1708840

Nazwa handlowa: RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
Pożywka do wzrostu komórek macierzystych
Nazwa handlowa: mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Green master mix
Nazwa handlowa: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
Trypsin-EDTAGibco252999560,25%
VEGF165 (VEGF-A)PeproTech100-20stosować przy 50 ng/ml
α-CD31-FITCBioLegend3031042 μ g/ml*
α-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 μ g/ml*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 &m; g/ml*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μ g/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μ g/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μ g/ml*
* Koniugaty fluorescencyjne przeciwciał powinny być zoptymalizowane w oparciu o zastosowany sorter komórek. Poniżej przedstawiono końcowe stężenia wykorzystane w tym badaniu.
ekstrakcji RNA BioRad

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391(2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271(2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493(2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200(2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143(2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149(2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361(2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465(2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261(2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823(2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67(2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

r nicowanie r db onkoweprzej cie r db onka w kom rki krwiotw rczejednostki kolonogennesortowanie metod cytometrii przep ywowejkom rki CD34 dodatnieindukcja linii mezodermalnejindukcja kwasem retinowymhodowla bez kom rek karmionek

Powiązane artykuły