In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Leonie Müller; Carl Elias Kutzner; Vishnu Balaji; Thorsten Hoppe

doi:10.3791/62393

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62393

⸱

14 maja 2021

Leonie Müller¹ , Carl Elias Kutzner¹^,² , Vishnu Balaji¹ , Thorsten Hoppe¹^,²

¹Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, ²Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

Streszczenie

Kowalencyjne przyłączanie ubikwityny (Ub) do wewnętrznej reszty lizyny białka substratowego, proces określany jako ubikwitylacja, stanowi jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych w organizmach eukariotycznych. W ubikwitylacji pośredniczy sekwencyjna kaskada trzech klas enzymów, w tym enzymy aktywujące ubikwitynę (enzymy E1), enzymy sprzężone z ubikwityną (enzymy E2) i ligazy ubikwityny (enzymy E3), a czasami czynniki wydłużania łańcucha ubikwityny (enzymy E4). W tym miejscu przedstawiono protokoły in vitro do testów ubikwitylacji, które umożliwiają ocenę aktywności ligazy ubikwityny E3, współpracę między parami E2-E3 oraz dobór substratu. Współpracujące pary E2-E3 można badać przesiewowo, monitorując wytwarzanie wolnych łańcuchów poliubikwityny i/lub autoubikwitylację ligazy E3. Ubikwitylacja substratu jest definiowana przez selektywne wiązanie ligazy E3 i może być wykryta przez western blot reakcji in vitro. Ponadto opisano test wyładowań E2 ~ Ub, który jest użytecznym narzędziem do bezpośredniej oceny funkcjonalnej współpracy E2-E3. W tym przypadku zależny od E3 transfer ubikwityny następuje z odpowiedniego enzymu E2 do wolnych aminokwasów lizynowych (naśladując ubikwitylację substratów) lub wewnętrznych lizyn samej ligazy E3 (autoubikwitylacja). Podsumowując, dostępne są trzy różne protokoły in vitro, które są szybkie i łatwe do wykonania, aby rozwiązać problem funkcjonalności katalitycznej ligazy E3.

Wprowadzenie

Ubikwitylacja to proces, w którym Ub jest kowalencyjnie połączony z białkiem substratu¹. Modyfikacja Ub jest katalizowana przez następujące po sobie reakcje enzymatyczne polegające na działaniu trzech różnych klas enzymów, tj. enzymów aktywujących Ub (E1s), enzymów sprzężonych Ub (E2s), ligaz Ub (E3s) i ewentualnie czynników wydłużenia łańcucha Ub (E4s)²^,³^,⁴^,⁵. Po zależnej od adenozynotrifosforanu (ATP) i magnezu (Mg^{2 +}) aktywacji Ub przez E1, cysteina miejsca aktywnego E1 atakuje C-końcową glicynę....