Artykuł metodologiczny

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

DOI:

10.3791/62393

⸱

14 maja 2021

 ,  ,  , 
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kowalencyjne przyłączanie ubikwityny (Ub) do wewnętrznej reszty lizyny białka substratowego, proces określany jako ubikwitylacja, stanowi jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych w organizmach eukariotycznych. W ubikwitylacji pośredniczy sekwencyjna kaskada trzech klas enzymów, w tym enzymy aktywujące ubikwitynę (enzymy E1), enzymy sprzężone z ubikwityną (enzymy E2) i ligazy ubikwityny (enzymy E3), a czasami czynniki wydłużania łańcucha ubikwityny (enzymy E4). W tym miejscu przedstawiono protokoły in vitro do testów ubikwitylacji, które umożliwiają ocenę aktywności ligazy ubikwityny E3, współpracę między parami E2-E3 oraz dobór substratu. Współpracujące pary E2-E3 można badać przesiewowo, monitorując wytwarzanie wolnych łańcuchów poliubikwityny i/lub autoubikwitylację ligazy E3. Ubikwitylacja substratu jest definiowana przez selektywne wiązanie ligazy E3 i może być wykryta przez western blot reakcji in vitro. Ponadto opisano test wyładowań E2 ~ Ub, który jest użytecznym narzędziem do bezpośredniej oceny funkcjonalnej współpracy E2-E3. W tym przypadku zależny od E3 transfer ubikwityny następuje z odpowiedniego enzymu E2 do wolnych aminokwasów lizynowych (naśladując ubikwitylację substratów) lub wewnętrznych lizyn samej ligazy E3 (autoubikwitylacja). Podsumowując, dostępne są trzy różne protokoły in vitro, które są szybkie i łatwe do wykonania, aby rozwiązać problem funkcjonalności katalitycznej ligazy E3.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubikwitylacja to proces, w którym Ub jest kowalencyjnie połączony z białkiem substratu1. Modyfikacja Ub jest katalizowana przez następujące po sobie reakcje enzymatyczne polegające na działaniu trzech różnych klas enzymów, tj. enzymów aktywujących Ub (E1s), enzymów sprzężonych Ub (E2s), ligaz Ub (E3s) i ewentualnie czynników wydłużenia łańcucha Ub (E4s)2,3,4,5. Po zależnej od adenozynotrifosforanu (ATP) i magnezu (Mg2 +) aktywacji Ub przez E1, cysteina miejsca aktywnego E1 atakuje C-końcową glicynę Ub, tworząc kompleks tioestrowy (Ub ~ E1). Energia czerpana z hydrolizy ATP powoduje, że Ub osiąga wysokoenergetyczny stan przejściowy, który jest utrzymywany przez całą następującą kaskadę enzymatyczną. Następnie enzym E2 przenosi aktywowany Ub do swojej wewnętrznej katalitycznej cysteiny, tworząc w ten sposób przejściowe wiązanie tioestrowe Ub ~ E2. Następnie Ub jest przenoszony do białka substratu.

Można to zrobić na dwa sposoby. Albo ligaza E3 może najpierw związać się z E2, albo ligaza E3 może bezpośrednio związać Ub. Ten ostatni sposób powoduje powstanie półproduktu E3~Ub. W obu przypadkach Ub jest połączony z białkiem substratowym poprzez utworzenie wiązania izopeptydowego między C-końcową grupą karboksylową Ub a grupą lizynową Ɛ-aminową substratu6. Ludzki genom koduje dwa E1, około 40 E2 i ponad 600 przypuszczalnych ligaz ubikwityny7. Opierając się na mechanizmie transferu Ub E3, ligazy Ub są podzielone na trzy kategorie, w tym homologiczne do typu C-Endus E6AP (HECT), Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type i RING między ligazami typu RING (RBR)8. W tym badaniu U-box zawierający ligazę, koniec karboksylowy białka oddziałującego z HSC70 (CHIP), jest używany jako reprezentatywny enzym E3. W przeciwieństwie do enzymów E3 typu HECT, które tworzą tioestry Ub ~ E3, domena U-box CHIP wiąże E2 ~ Ub i sprzyja późniejszemu transferowi Ub / substratu bezpośrednio z enzymu E2 < sup class = "xref" >8,9. Opierając się na znaczeniu U-box dla funkcji enzymatycznej, jako kontrolę wykorzystuje się nieaktywnego mutanta CHIP U-box, CHIP (H260Q). CHIP(H260Q) nie wiąże się ze swoim pokrewnym E2s, tracąc w ten sposób aktywność ligazy E310.

Ubikwitylacja białek odgrywa kluczową rolę w regulacji wielu zdarzeń komórkowych w komórkach eukariotycznych. Różnorodność wyników komórkowych, które są promowane przez odwracalne przyłączanie cząsteczek Ub do białek substratowych, można przypisać charakterystyce molekularnej Ub. Ponieważ sam Ub zawiera siedem reszt lizyny (K) do dalszej ubikwitylacji, istnieje bogata różnorodność typów łańcuchów Ub o różnych rozmiarach i/lub topologiach11. Na przykład, substraty mogą być modyfikowane przez pojedynczą cząsteczkę Ub w jednej (mono-ubikwitylacja) lub wielu lizynach (multi mono-ubikwitylacja), a nawet przez łańcuchy Ub (poli-ubikwitylacja)11. Łańcuchy Ub są tworzone homo- lub heterotypowo przez te same lub różne reszty lizyny Ub, co może nawet prowadzić do rozgałęzionych łańcuchów Ub9. Tak więc ubikwitylacja białek prowadzi do różnych układów cząsteczek Ub, które dostarczają określonych informacji, np. dotyczących degradacji, aktywacji lub lokalizacji sprzężonych białek12,13. Te różne sygnały Ub umożliwiają szybkie przeprogramowanie komórkowych szlaków sygnałowych, co jest ważnym wymogiem dla zdolności komórki do reagowania na zmieniające się potrzeby środowiskowe.

Centralnym aspektem ubikwitylacji jest kontrola jakości białka. Nieprawidłowo sfałdowane lub nieodwracalnie uszkodzone białka muszą zostać zdegradowane i zastąpione nowo zsyntetyzowanymi białkami, aby utrzymać homeostazę białek lub proteostazę14. Ligaza E3 kontroli jakości, CHIP, współpracuje z molekularnymi białkami opiekuńczymi w zależnej od Ub degradacji uszkodzonych białek9,15,16,17. Oprócz tego CHIP reguluje stabilność kierowanego miozyną białka opiekuńczego, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), który jest ściśle skoordynowany z funkcją mięśni, a odchylenia od optymalnych poziomów prowadzą do ludzkiej miopatii18,19,20,21. Degradacja UNC-45B przez proteasom 26S odbywa się za pośrednictwem przyłączenia łańcucha poli-Ub połączonego z K489. W przypadku braku białek substratowych, CHIP przeprowadza auto-ubikwitylację10,22,23, co jest charakterystyczne dla ligaz ubikwityny RING/U-box E324,25 i uważane za regulujące aktywność ligazy26. Zastosowanie metod testowych ubikwitylacji in vitro opisanych w tym artykule pomogło w systematycznej identyfikacji enzymów E2, które współpracują z CHIP w celu promowania tworzenia wolnych łańcuchów poli-Ub i/lub autoubikwitylacji CHIP (sekcja 2 protokołu). Ponadto zaobserwowano zależną od CHIP ubikwitylację UNC-45B, który jest znanym substratem ligazy E3 < klasy sup = "xref" >18,< klasa sup = "xref">19 (sekcja 3 protokołu). Ostatecznie monitorowano zależny od CZIP transfer aktywowanego Ub z tioestru Ub ~ E2 (sekcja 4 protokołu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i odczynników

UWAGA: i odczynniki, które zostały ręcznie przygotowane w laboratorium, są wymienione poniżej. Wszystkie inne i odczynniki użyte w protokołach zostały zakupione z różnych źródeł i użyte zgodnie z instrukcjami producentów.

  1. Przygotować 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (10x PBS). W tym celu zmieszać 1,37 M chlorku sodu (NaCl), 27 mM chlorku potasu (KCl), 80 mM dwuwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4,2 H2O) i 20 mM diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) w 1 l podwójnie destylowanego H2O (ddH2O). Autoklawować 10x PBS i przygotować 1x PBS roztwór w ddH2O.
    1. Autoklawowanie przeprowadza się przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 98,9 kPa.
      UWAGA: Autoklawowanie przeprowadza się w tych warunkach dla wszystkich i roztworów. Jeśli nie wskazano inaczej, roztwory przechowuje się w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Przygotuj 1 l roztworu PBS-Tween (PBS-T), dodając 0,1% Tween do 1 l 1x PBS.
  3. Przygotować 10 ml 0,5 M roztworu podstawowego L-lizyny, rozpuszczając L-lizynę w ddH2O. Aliquot L-lizyny w porcjach 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: L-lizynę można wielokrotnie zamrażać i rozmrażać.
  4. Przygotować 0,25 M roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), rozpuszczając EDTA w 200 ml ddH2O.
    1. Dostosuj pH do 8,0 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH).
    2. Dostosuj objętość do 250 ml za pomocą ddH2O.
    3. Autoklaw roztworu.
  5. Przygotować 10 ml roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 20 mg/ml przez rozpuszczenie BSA w ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 200 μl podwielokrotności.
    UWAGA: BSA można wielokrotnie zamrażać i rozmrażać.
  6. Przygotować 1 l buforu do pracy kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), rozpuszczając 50 mM MES, 50 mM zasady Tris, 3,47 mM dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1,03 mM EDTA w 0,9 l ddH2O. Po odpowiednim wymieszaniu dostosuj objętość do 1 L.
    1. pH buforu 1x wynosi 7,6. Nie reguluj pH kwasem lub zasadą.
  7. Przygotuj 200 ml roztworu blokującego (5% mleka), rozpuszczając 10 g mleka w proszku w 1x PBS-T. Roztwór blokujący przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  8. Przygotować 1 l buforu transferowego (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcją producenta.
  9. Przygotować 2x bufor do próbek SDS, rozpuszczając 125 mM zasady Tris, 4% SDS, 4% glicerolu, 0,03% błękitu bromofenolowego i 50 μl/ml β-merkaptoetanolu w 50 ml ddH2O. Aliquot w porcjach 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

2. Test autoubikwitylacji in vitro

  1. Przygotowanie i wykonanie testu
    1. Obliczyć objętość każdego odczynnika wymaganą dla każdej reakcji w oparciu o podane molowe białka i stężenia białek w roztworach białkowych. Na reakcję autoubikwitylacji użyj 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 i 50 μM Ub. Dostosować objętość reakcji do 20 μl za pomocą ddH2O.
      UWAGA: Roztwór ATP i bufor ubikwitylacyjny zakupiono jako 10x roztwory podstawowe i użyto w 1x.
    2. Przygotuj schemat pipetowania dla wszystkich reakcji. Przetestuj dziewięć różnych enzymów E2 pod kątem ich zdolności do działania (I) z CHIP, (II) z katalitycznie nieaktywnym mutantem CHIP(H260Q) i (III) bez CHIP w poszczególnych reakcjach ubikwitylacji.
    3. Aby uniknąć błędów w pipetowaniu, należy przygotować na lodzie mieszankę wzorcową, która zawiera objętość wymaganą dla wszystkich reakcji plus jedną dodatkową reakcję. Obliczyć ilość mieszanki wzorcowej wymaganą na reakcję.
      UWAGA: Składniki mieszanki głównej to odczynniki, które są jednakowo wymagane dla każdej reakcji, tj. E1, E3, Ub, ATP i bufor ubikwitylacyjny.
    4. Dodać ddH2O i mieszaninę wzorcową do probówek reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Trzymaj probówki na lodzie.
    5. Przed rozpoczęciem reakcji ubikwitylacji poprzez dodanie enzymów E2 należy skonfigurować termocykler PCR z następującym programem: 2 godziny, 37 °C, a następnie 4 °C, w nieskończoność.
    6. Dodać 1 μM enzymów E2 do odpowiednich probówek i inkubować próbki w termocyklerze PCR przez wskazany okres czasu.
    7. Po 2 godzinach dodać bufor próbki SDS do każdej reakcji i wymieszać, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
      UWAGA: Wymagana objętość buforu próbki zależy od stężenia wyjściowego buforu próbki. Tutaj do każdej reakcji dodano 20 μl buforu do próbki 2x SDS.
    8. Próbki należy natychmiast zagotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut i kontynuować elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Zdenaturowane białka przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Elektroforeza żelowa i western blot
    1. Po rozmrożeniu należy odwirowywać próbki przez około 10 s i naładować żel SDS-PAGE. Użyj drabinki białkowej jako odniesienia rozmiaru.
      UWAGA: Tutaj użyto 4-12% żeli gradientowych Bis-Tris i 3 μL drabinki białkowej. Podzielić objętość próbki i równomiernie naładować dwa żele, używając 20 μl każdej próbki.
    2. Uruchom żel pod napięciem 160-200 V przez około 30-45 minut, tak aby przód próbki sięgał dna żelu.
    3. Przenieś każdy żel do plastikowego pojemnika wypełnionego półsuchym buforem do bibuły i inkubuj go przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń żel do układania.
    4. Przygotuj dwa kawałki bibuły wielkości żelu i membranę nitrocelulozową o wielkości żelu na żel SDS i wstępnie zanurz w półsuchym buforze do bibuły. Złóż kanapkę western blot (WB) w komorze WB od dołu do góry w następującej kolejności: bibuła, membrana nitrocelulozowa, żel SDS-PAGE, bibuła.
    5. Usuń pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione między warstwami kanapek. W tym celu za pomocą wałka ostrożnie przetoczyć kanapkę kilka razy.
    6. Zamknij komorę i poczekaj, aż nadmiar buforu blot spłynie.
    7. Umieścić komorę w odpowiednim urządzeniu do bibułowania i użyć następującego programu do blottingu półsuchego: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Przenieść osuszoną membranę do plastikowego pojemnika wypełnionego roztworem blokującym i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając przeciwciało do 10 ml PBS-T zawierającego odczynnik blokujący (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Stężenie robocze przeciwciała jest specyficzne dla przeciwciała. W tym przypadku zastosowano monoklonalne mysie przeciwciało anty-ubikwityny w rozcieńczeniu 1:5 000. W przypadku drugiego żelu zastosowano monoklonalne królicze przeciwciało anty-CHIP w stosunku 1:5 000 w odczynniku PBS-T / blokującym.
    10. Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na bujaku.
    11. Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS-T.
    12. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, dodając odpowiednie przeciwciało do 10 ml PBS-T.
      UWAGA: W tym przypadku stosuje się kozie przeciwciała anty-mysie i mysie anty-królików w rozcieńczeniu 1:10 000.
    13. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na kołysce.
    14. Umyj membranę trzy razy przez 5 minut za pomocą PBS-T.
  3. analiza danych
    1. Dodać odczynniki do wykrywania western blot dla przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) do przemytej membrany zgodnie z instrukcjami producenta i przechwycić sygnał HRP za pomocą klisz rentgenowskich lub kamery urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (Rysunek 1).

3. Test ubikwitylacji substratu in vitro

  1. Przygotowanie i wykonanie testu
    1. Obliczyć objętość każdego odczynnika wymaganą na reakcję, w oparciu o podane molowość białek i stężenia białek w roztworach białkowych. Na reakcję ubikwitylacji substratu należy użyć 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substratu i 50 μM Ub. Użyć 10x roztworu ATP i 10x buforu ubikwitylacji przy 1x. Dostosować objętość reakcji ubikwitylacji substratu do 20 μl za pomocąddH2O.
    2. Przygotuj schemat pipetowania dla wszystkich reakcji. Uwzględnij odpowiednie reakcje kontrolne sprawdzające, czy ubikwitylacja substratu jest specyficzna dla E3. Użyć białka UNC-45B jako reprezentatywnego substratu CHIP i katalitycznie nieaktywnego mutanta CHIP (H260Q) jako kontroli. Przygotować następujące reakcje: E1, E2, Ub mix (w tym Ub, ATP, bufor ubikwitylacyjny); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP (H260Q), UNC-45B; oraz E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Aby uniknąć błędów w pipetowaniu, należy przygotować na lodzie mieszankę wzorcową, która zawiera objętość wymaganą dla wszystkich reakcji plus jedną dodatkową reakcję. Obliczyć objętość mieszanki wzorcowej, która jest wymagana na reakcję.
      UWAGA: Składniki mieszanki głównej dla tego testu obejmują E1, E2, Ub, ATP i bufor ubikwitylacyjny.
    4. Dodaj składniki reakcji w następującej kolejności: ddH2O, substrat, ligaza E3.
    5. Przed rozpoczęciem reakcji ubikwitylacji przez dodanie mieszanki wzorcowej, należy ustawić termocykler PCR z następującym programem: 2 godziny, 37 °C, a następnie 4 °C, w nieskończoność.
    6. Dodać mieszankę wzorcową do każdej probówki i inkubować próbki w termocyklerze PCR przez wskazany okres czasu.
    7. Po 2 godzinach dodać 2x bufor próbki SDS do każdej reakcji i mieszać, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
    8. Po zakończeniu cyklu natychmiast zagotować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie kontynuować stosowanie PAGE. Alternatywnie, zdenaturowane białka należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Elektroforeza żelowa i western blot
    1. Wykonać elektroforezę żelową i western blot zgodnie z opisem w punkcie 2.2. Użyj specyficznych przeciwciał do wykrywania odpowiednio substratu i ligazy E3.
      UWAGA: W tym przypadku UNC-45B jest połączony ze znacznikiem białka polipeptydowego pochodzącym z produktu genu c-myc, co pozwala na zastosowanie monoklonalnego mysiego przeciwciała anty-MYC. Anty-MYC jest używany w skali 1:10 000.
  3. analiza danych
    1. Przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w sekcji 2.3 (Rysunek 2).

4. Test wyładowczy lizyny

  1. Przygotowanie i wykonanie testu
    1. Ładowanie enzymu E2 Ub przez E1
      1. Obliczyć objętość każdego odczynnika wymaganą dla każdej reakcji w oparciu o podane molowe białka i stężenia białek w roztworach białkowych. Na reakcję ładowania użyj 2 μM E1, 4 μM E2 i 4 μM ubikwityny bez lizyny (Ub K0). Użyj 10x bufora ATP i 10x bufora ubikwitylacyjnego przy 1x. Dostosuj objętość reakcji ładowania do 20 μl za pomocą ddH20,
        UWAGA: Wolny od lizyny mutant Ub K0 jest używany do wymuszania wyłącznej produkcji mono-ubikwitylowanego E2. Można również użyć Ub typu dzikiego; jednak może to prowadzić do różnych modyfikacji E2 ~ Ub (np. poli-ubikwitylacja E2), które są trudniejsze do analizy. Przy pierwszym użyciu lub przy użyciu nowego enzymu E2 określ poziom naładowania Ub na E2, który może być osiągnięty przez E1. Aby określić wydajność ładowania, wizualizuj nienaładowany i naładowany E2 za pomocą barwienia Coomassie. W tym przypadku około połowa Ub K0 została niezawodnie przekształcona do UBE2D2~Ub przy użyciu równomolowych stosunków UBE2D2 i Ub K0 (rysunek uzupełniający S2A).
      2. Przygotuj schemat pipetowania dla reakcji ładowania. Dostosuj objętość reakcji ładowania do kolejnych wybranych reakcji rozładowania, np. użyj CHIP i CHIP(H260Q) w poszczególnych reakcjach rozładowania. W ten sposób przygotuj podwójną objętość jednej reakcji ładowania.
        UWAGA: Przy pierwszym użyciu przetestuj różne stężenia wybranej ligazy E3, aby monitorować optymalne warunki rozładowania i przeanalizować je za pomocą western blot. W idealnych warunkach wydzielanie Ub z E2 będzie się z czasem zwiększać, aż zniknie odpowiednie pasmo białka E2 ~ Ub.
      3. Inkubować reakcję ładowania przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Zakończenie reakcji ładowania
      1. Zatrzymać reakcję ładowania przez dodanie apyrazy o końcowym stężeniu 1,8 U/ml. Przeprowadzić inkubację z apyrazą przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać EDTA w końcowym stężeniu 30 mM. Dostosuj objętość reakcji ładowania do 30 μL za pomocą ddH2O.
        UWAGA: Apyraza służy do przekształcania cząsteczek ATP w cząsteczki ADP (difosforan adenozyny). Ponieważ aktywność enzymu E1 jest zależna od ATP, E1 nie może już ładować E2. EDTA jest dodatkowo stosowany w celu zapewnienia, że E1 jest hamowany przez wygaszanie jonów Mg2+, które są niezbędnymi kofaktorami dla E1. Objętość apyrazy wymagana do zatrzymania reakcji może się różnić w zależności od warunków testu. Chociaż sama apiraza już wygasza dostępne cząsteczki ATP, połączenie apirazy i EDTA było bardziej skuteczne w zatrzymywaniu reakcji ładowania pary E1-UBE2D2. Ponieważ zatrzymanie reakcji jest krytycznym czynnikiem dla odtwarzalności testu, skuteczne zatrzymanie powinno być testowane dla nowych par E1-E2. W tym celu należy ustawić reakcję ładowania, zatrzymać ją i pobrać próbki w określonych punktach czasowych, np. po 2, 5, 10 i 15 minutach. Niezmienne poziomy E2 ~ Ub wskazują, że reakcja została zatrzymana i że tioester był stabilny w tym okresie czasu (rysunek uzupełniający S2B).
    3. Rozładowanie E2 ~ Ub przez E3
      1. Przygotować cztery probówki odpowiadające różnym punktom czasowym (t0, t1, t2, t3); dodać nieredukujący bufor próbki (6,7 μl 4x buforu dodecylosiarczanu litu (LDS)) do każdej probówki.
        UWAGA: Nie używać środka redukującego w buforze próbki.
      2. Usunąć 6 μl z zatrzymanej reakcji ładowania dla t0 i dostosować objętość do 20 μl za pomocą ddH2O.
      3. Inkubować próbkęt 0 przez 10 minut w temperaturze 70 °C.
        UWAGA: Nie należy gotować próbki poprzez wydłużanie czasu inkubacji, ponieważ tioestry są labilne w wyższych temperaturach.
      4. Obliczyć objętość każdego odczynnika wymaganą na reakcję rozładowania. Użyj pozostałych 24 μl naładowanego E2 i dodaj 10 mM L-lizyny, 1 mg/ml BSA i 500 nM ligazy E3. Użyj buforu ubikwitylacyjnego przy 1x i dostosuj objętość do 80 μL za pomocą ddH2O.
      5. Przygotuj schemat pipetowania dla wszystkich reakcji wyładowczych i użyj CHIP(H260Q) jako sterownika oprócz CHIP(WT).
      6. Ustaw reakcje wyładowania na lodzie, dodając wymagane składniki w następującej kolejności: ddH2O, bufor ubikwitylacyjny, BSA, lizyna, ligaza E3 i naładowany E2, aby rozpocząć reakcję.
      7. Inkubować reakcję wyładowania w temperaturze pokojowej.
      8. Próbki należy pobrać po 5, 30 i 60 minutach, przenosząc 20 μl reakcji rozładowania do odpowiednich probówek z próbkami.
        UWAGA: Odpowiednie punkty czasowe, które pozwalają na prawidłowe monitorowanie wyładowania, mogą się różnić między parami E2-E3.
      9. Natychmiast wymieszać próbkę i inkubować ją w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
      10. Bezpośrednio przejdź do PAGE.
        UWAGA: Tioestry E2 ~ Ub mogą być labilne nawet po denaturacji w buforze próbki. W związku z tym elektroforezę żelową należy wykonać bezpośrednio po wykonaniu testu.
  2. Elektroforeza żelowa i western blot
    1. Wykonać elektroforezę żelową i western blot zgodnie z opisem w punkcie 2.2. Użyj przeciwciała swoistego dla Ub i, jeśli to możliwe, użyj również przeciwciała specyficznego dla E3, które zostało wyhodowane u innego gatunku, co pozwala na jednoczesne wykrycie sygnału ligazy Ub i E3.
  3. analiza danych
    1. Przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w sekcji 2.3 (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować enzymy E2, które współpracują z CHIP ligazy ubikwityny, przetestowano zestaw kandydatów na E2 w indywidualnych reakcjach ubikwitylacji in vitro. Współpracujące pary E2-E3 monitorowano poprzez tworzenie zależnych od E3 produktów ubikwitylacji, tj. autoubikwitylację ligazy E3 i tworzenie wolnych polimerów Ub. Produkty ubikwitylacji analizowano metodą western blot. Interpretacja danych opiera się na porównaniu wielkości otrzymanych prążków białkowych z markerami masy cząsteczkowej. Ubikw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano podstawowe metody ubikwitylacji in vitro do analizy funkcji ligazy E3. Wykonując testy ubikwitylacji in vitro , należy wziąć pod uwagę, że niektóre enzymy E2 mogą przeprowadzać autoubikwitylację dzięki atakowi ich aktywnej cysteiny na ich własne reszty lizyny, które znajdują się w bliskiej odległości od miejsca aktywnego30. Aby obejść ten problem, zaleca się stosowanie mutanta E2, w którym odpowiednia reszta lizyny jest wymieniana na argininę, w wyniku czego po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom naszego laboratorium za krytyczną dyskusję i pomocne rady dotyczące manuskryptu. Przepraszamy, że nie zacytowaliśmy cennych wkładów ze względu na ograniczenie rozmiaru. Prace te są wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 oraz Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD do TH. Praca ta została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach niemieckiej strategii doskonałości - EXC 2030 - 390661388 i - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amershan Protran 0,1 &mikro; m NCGE Healthcare10600000membrana nitrocelulozowa
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoklonalne królicze przeciwciało anty-CHIP, klon C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoklonalne mysie przeciwciało anty-MYC, klon 9E10
Anty-ubikwitynaUpstate05-944Monoklonalne mysie przeciwciało anty-Ub, klon P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS bufor próbek (4x)novexB0007
L-LizynaSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE PrzeciwutleniaczinvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer bufor (20x)novexNP0006-1
Linijka do stron plusThermo Fisher26619Drabinka białkowa
RotiBlockRothA151.1Odczynnik blokujący
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 TermocyklerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUSystem transferowy
Baza TrisRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
Zestaw enzymów UbcHBostonBiochemK-980BEnzymy E2
UbikwitynaBostonBiochemU-100H
Enzym aktywujący ubikwitynę E1EnzoBML-UW941U-0050
Bufor ubikwitylacyjny (10x)EnzoBML-KW9885-001
Bibuła bibułowa WhatmanBio Rad1703969Bardzo gruba bibuła filtracyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6(2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740(2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385(2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ubikwitynacja in vitrotransfer ubikwitynyspecyficzno enzymu E2ubikwitynacja substratutest autoubikwitynacjitest uwalniania lizynywestern blottinga cuchy polibikwitynoweaktywno ligazy ubikwityny

Powiązane artykuły