Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62395

⸱

19 kwietnia 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Iowa State University, 2Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

Streszczenie

Dynamika konformacyjna białek odgrywa fundamentalne role w regulacji katalizy enzymatycznej, wiązania ligandów, allosterii i sygnalizacji, które są ważnymi procesami biologicznymi. Zrozumienie, w jaki sposób równowaga między strukturą a dynamiką rządzi funkcjami biologicznymi, stanowi nową granicę we współczesnej biologii strukturalnej i zapoczątkowało szereg osiągnięć technicznych i metodologicznych. Wśród nich metody NMR z roztworem dyspersji relaksacyjnej CPMG dostarczają unikalnych informacji o rozdzielczości atomowej na temat struktury, kinetyki i termodynamiki równowag konformacyjnych białek zachodzących w skali czasu μs-ms. W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły akwizycji i analizy eksperymentu z dyspersją relaksacyjną 15N. Jako przykład pokazano potok analizy dynamiki μs-ms w domenie C-końcowej bakterii Enzym I.

Wprowadzenie

Eksperymenty dyspersji relaksacyjnej (RD) Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) są rutynowo stosowane do charakteryzacji równowag konformacyjnych zachodzących w skali czasowej µs-ms przy użyciu spektroskopii NMR w roztworach1,2,3,4,5. W porównaniu z innymi metodami badania dynamiki konformacyjnej, techniki CPMG są stosunkowo łatwe do wdrożenia na nowoczesnych spektrometrach NMR, nie wymagają specjalistycznych etapów przygotowania próbek (np. krystalizacji, zamrażania lub orientowania próbek i/lub kowalencyjnego sprzęgania z markerem fluorescencyjnym lub paramagnetycznym) oraz zapewniają kompleksową charakteryzację równowag konformacyjnych, dostarczając informacji strukturalnych, kinetycznych i termodynamicznych o procesach wymiany. Aby eksperyment CPMG mógł dostarczyć informacji o równowadze konformacyjnej, muszą zostać spełnione dwa warunki: (i) obserwowane spiny NMR muszą posiadać różne przesunięcia chemiczne w stanach podlegających wymianie konformacyjnej (mikrostanach) oraz (ii) wymiana musi zachodzić w skali czasowej od ~50 µs do ~10 ms. W tych warunkach obserwowana szybkość relaksacji poprzecznej (Wzór miernika odporności, R_obs.) jest sumą wewnętrznej R2 (R2 mierzonej w przypadku braku dynamiki µs-ms, Równanie równowagi statycznej ΣFx=0, ΣFy=0; wzór matematyczny; schemat edukacyjny.) oraz wkładu wymiany w relaksację poprzeczną (Rex). Wkład Rex do R2obs można stopniowo wygaszać poprzez zmniejszanie odstępu między impulsami 180° tworzącymi blok CPMG w sekwencji impulsowej, a otrzymane krzywe RD można modelować w oparciu o teorię Blocha-McConnella, aby wyznaczyć różnicę przesunięć chemicznych między mikrostanami, ułamkową populację każdego mikrostanu oraz szybkości wymiany między mikrostanami (Rycina 1)1,2,3.

W literaturze opisano kilka różnych sekwencji impulsów i protokołów analizy dla eksperymentów CPMG dla 15N. W niniejszym materiale opisano protokół wdrożony w laboratorium. W szczególności przedstawione zostaną kluczowe etapy przygotowania próbki do NMR, konfiguracji i akwizycji eksperymentów NMR oraz przetwarzania i analizy danych NMR (Rysunek 2). Aby ułatwić przeniesienie protokołu do innych laboratoriów, program impulsowy, skrypty do przetwarzania i analizy oraz jeden przykładowy zestaw danych zostały udostępnione jako Pliki uzupełniające i są dostępne do pobrania pod adresem (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Dostarczona sekwencja impulsów zawiera czterostopniowy cykl fazowy w bloku CPMG w celu stłumienia artefaktów zależnych od przesunięcia6 i jest zaprogramowana do akwizycji kilku przeplatających się eksperymentów. Eksperymenty te mają identyczny okres relaksacji, ale różną liczbę impulsów refokusejących w celu uzyskania różnych pól CPMG7. Należy również zauważyć, że opisany program impulsowy mierzy 15N R2 komponentu TROSY sygnału NMR8. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten został z powodzeniem zastosowany do charakteryzacji wymiany konformacyjnej w białkach średnich i dużych4,5,9,10. W przypadku mniejszych układów (<20 kDa) zaleca się stosowanie sekwencji impulsów opartej na heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC)11,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki do NMR

  1. Wyeksponować i oczyścić próbkę białka docelowego znakowanego 2H,15N.
    UWAGA: Chociaż próbka białka znakowanego 15N może być wykorzystana do przeprowadzenia eksperymentu CPMG RD, perdeuteracja (tam, gdzie jest to możliwe) znacznie zwiększa jakość uzyskanych danych. Protokoły produkcji białek perdeuterowanych są dostępne w literaturze13.
  2. Wymienić bufor oczyszczonej próbki białka na odgazowany bufor do NMR.
  3. Przenieść próbkę NMR do probówki NMR.
    UWAGA: Stężenie próbki NMR musi zostać starannie zoptymalizowane w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu oraz zminimalizowania występowania oddziaływań białko-białko. Generalnie typowy zakres stężeń dla eksperymentów CPMG wynosi 0,1-1,0 mM.

2. Pierwsze przygotowanie eksperymentu NMR

  1. Pobierz i rozpakuj Pliki uzupełniające.
  2. Skopiuj pliki bits.vv oraz trosy_15N_cpmg.vv (znajdujące się w folderze pulseprogram) do katalogu programów impulsowych (
  3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i skopiuj wcześniej przeprowadzony eksperyment 1H-15N HSQC do nowego eksperymentu, używając komendy edc.
  4. Za pomocą komendy pulprog załaduj program impulsowy trosy_15N_cpmg.vv do nowo utworzonego eksperymentu.
  5. Skonfiguruj eksperyment CPMG zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi na końcu pliku programu impulsowego (trosy_15N_cpmg.vv).

3. Rutynowa konfiguracja eksperymentu NMR

  1. Wprowadź próbkę do magnesu i wykonaj wszystkie podstawowe kroki akwizycji dowolnego eksperymentu NMR: zablokuj pole i wykonaj shimming próbki; dopasuj i dostrój kanały 1H oraz 15N.
  2. Ustaw p1 i p7 na czas trwania odpowiednio twardych impulsów 90° dla 1H i 15N.
    UWAGA: Dla uzyskania optymalnych wyników ważne jest bardzo dokładne skalibrowanie impulsu 90° dla 15N. Kalibrację zazwyczaj przeprowadza się przy użyciu próbki 100 mM mocznika znakowanego 15N w DMSO, zgodnie z opisem w instrukcji spektrometru. Ponadto możliwe jest ponowne sprawdzenie kalibracji bezpośrednio na roboczej próbce NMR poprzez akwizycję pierwszego inkrementu widma 1H-15N HSQC, w którym impuls 90° dla 15N w pierwszym bloku INEPT zastąpiono impulsem 180°. Jeśli kalibracja jest poprawna, sygnał powinien zostać wygaszony.
  3. W oknie akwizycji ustaw centrum i szerokość widma dla wymiarów 1H i 15N.
    UWAGA: W celu optymalnej supresji sygnału wody wycentruj widmo 1H na częstotliwości sygnału wody.
  4. Ustaw opóźnienie relaksacyjne (d30) na wartość równą 0,7 T2, gdzie T2 jest oczekiwanym czasem relaksacji poprzecznej 15N Twojego białka.
    UWAGA: Wartość d30 można optymalizować empirycznie w celu uzyskania najlepszych wyników.
  5. Użyj polecenia vclist , aby stworzyć listę liczb całkowitych odpowiadających parametrowi n na Rysunku 1A i Rysunku 1B. Upewnij się, że każdy wpis na liście odpowiada innemu polu CPMG (νcpmg) zgodnie z wzorem νcpmg = 4 x n / d30. Upewnij się, że pierwszą liczbą na liście jest 0 (odpowiada to eksperymentowi referencyjnemu, w którym pomijany jest blok CPMG, a d30 = 0 s) i nie używaj liczb większych niż 1 000 x d30 / 4. Liczby przekraczające ten próg skutkują νcpmg > 1 kHz i mogą uszkodzić sondę.
  6. Ustaw l8 na liczbę wpisów w vclist, l3 na liczbę punktów rzeczywistych dla wymiaru pośredniego (zazwyczaj dla l3 ustawia się zakres 64–200), a 1 td na wartość równą l8 x l3 x 2.
    UWAGA: Wykonaj kroki 3.7–3.11, aby zoptymalizować supresję wody.
  7. Ustaw wzmocnienie odbiornika (rg) na 1; otwórz plik programu impulsowego (edcpul), przejdź do linii 91, usuń średnik poprzedzający goto 999 i zapisz plik.
  8. Za pomocą polecenia gs dostrój parametry spdb0 (lub spdw0), aby zminimalizować intensywność sygnału FID.
  9. Przywróć średnik w linii 91 pliku programu impulsowego i zapisz plik.
  10. Powtórz kroki 3.7–3.9, aby zoptymalizować spdb11 (linia 168 pliku programu impulsowego), spdb2 (linia 179 pliku programu impulsowego) oraz pldb2 (linia 184 pliku programu impulsowego).
  11. Uruchom polecenie rga , aby zoptymalizować wzmocnienie odbiornika.
  12. Ustaw liczbę skanów (ns) na wielokrotność 8.
  13. Uruchom polecenie zg, aby rozpocząć eksperyment.

4. Przetwarzanie i analiza danych NMR

  1. Skopiuj folder o nazwie Process (Supplemental Files) do katalogu zawierającego plik ser.
  2. Użyj plików sep_fid.com i ft2D.com do przetworzenia danych NMR.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące edycji skryptów przetwarzania znajdują się w plikach sep_fid.com i ft2D.com.
  3. Otwórz w programie Sparky pliki ucsf znajdujące się w katalogu CPMG_Sparky_files.
    UWAGA: Pliki ucsf są tworzone przez skrypty przetwarzające. Dla każdego wpisu w vclist istnieje jeden plik ucsf. Pierwszy plik ucsf (test_1.ucsf) zawiera eksperyment referencyjny. Kolejne pliki ucsf (test_2.ucsf, test_3.ucsf, …, test_n.ucsf) są uporządkowane od najniższej do najwyższej wartości νcpmg.
  4. Wyznacz piki krosowe NMR na referencyjnym widmie NMR (test_1.ucsf).
  5. Zaznacz wszystkie wyznaczone piki krosowe, używając polecenia Sparky pa.
  6. Uruchom polecenie Sparky rh. Polecenie to otwiera okno dialogowe. Wybierz opcję heights at the same position in each spectrum. Kliknij Setup i zaznacz wszystkie widma NMR. Kliknij Update i zapisz plik wynikowy w katalogu roboczym. Plik wynikowy zawiera macierz intensywności sygnałów dla wszystkich otwartych widm NMR.
    UWAGA: W literaturze opisano dokładniejsze protokoły wykorzystujące dopasowywanie kształtu linii (lineshape fitting) w celu odzyskania intensywności z przeplatanych eksperymentów pseudo-3D14. Bezpłatne oprogramowanie do dopasowywania kształtu linii jest dostępne pod adresami https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) oraz w ramach NMRPipe (moduł nLinLS) i SPARKY (moduł it).
  7. Dla każdego pola CPMG przelicz intensywności sygnałów na szybkości R2 korzystając z wzoru Równanie równowagi statycznej; R₂=1/d₃₀ ln(I₀/Iₓ₃₀); metoda analizy wzoru., gdzie I0 i Id30 to odpowiednio intensywność widm NMR referencyjnego (vc = 0) i relaksacyjnego (vc > 0).
    UWAGA: W Supplemental Files znajduje się szablon pliku arkusza kalkulacyjnego (R2_calc.xls) służący do przeliczania intensywności sygnałów na szybkości R2 oraz do wizualizacji profili RD.
  8. Odczytaj poziom szumu w widmie referencyjnym za pomocą polecenia Sparky st i przeprowadź propagację błędu dla szybkości R2.
    UWAGA: W Supplemental Files znajduje się szablon pliku arkusza kalkulacyjnego (R2_calc.xls) służący do propagacji błędu dla zmierzonych szybkości R2.

5. Dopasowanie krzywych RD

  1. Skopiuj folder o nazwie RD_fitting (Pliki uzupełniające) do katalogu roboczego.
  2. Dla każdego przypisanego sygnału NMR oszacuj RProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. poprzez obliczenie Równanie R2 w stanach niskim i wysokim, ilustrujące dynamiczną zmianę częstotliwości na schemacie naukowym.. R<sub>2</sub><sup>lowF</sup>, wzór chemiczny, równanie, zapis naukowy, zastosowanie edukacyjne. i Równowaga statyczna; symbol matematyczny R₂^highF; reprezentacja wzoru fizycznego. czy R2 prędkości zmierzone przy najniższej i najwyższej wartości νCPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) w liście vclist.
  3. Wizualnie sprawdź krzywe RD za pomocą programu RPrzykładowy tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści źródłowej w języku angielskim, abym mógł przygotować profesjonalne tłumaczenie na język polski zgodnie z wytycznymi. większe niż dwukrotność szacowanego błędu i odrzucić wszystkie krzywe RD, które są zbyt zaszumione, aby można było je dokładnie zamodelować.
    UWAGA: Szum na Rex mogą być propagowane z błędów w R<sub>2</sub><sup>lowF</sup>, wzór chemiczny, równanie, zapis naukowy, zastosowanie edukacyjne. i Równowaga statyczna; symbol matematyczny R₂^highF; reprezentacja wzoru fizycznego..
  4. Przygotuj plik wejściowy do skryptu dopasowującego, wykorzystując wszystkie krzywe RD z RPrzykład przewyższający dwukrotność szacowanego błędu.
    UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania plików wejściowych znajdują się w skryptach dopasowujących. Przykładowe pliki wejściowe zostały udostępnione jako Pliki uzupełniająceZazwyczaj dane RD mierzy się w dwóch różnych polach statycznych i dopasowuje je jednocześnie. W tym protokole wymagane są dwa różne pliki wejściowe (Pliki uzupełniające).
  5. Dopasuj dane RD, korzystając ze skryptów dostarczonych w Pliki uzupełniające.
    UWAGA: Dostarczono dwa różne skrypty, służące odpowiednio do dopasowania krzywych RD w oparciu o poszczególne reszty lub do dopasowania globalnego. Oba skrypty dopasowują krzywe RD z wykorzystaniem modelu wymiany dwuCentered (two-site exchange model) oraz równania Carvera-Richardsa. Bardziej szczegółowe instrukcje znajdują się wewnątrz skryptów do dopasowania. Dostępne są również dodatkowe pakiety oprogramowania, takie jak Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) i CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/), służące do dopasowania danych z wykorzystaniem równań Blocka-McConcella.
  6. Przetestuj wiarygodność dopasowanych parametrów szacujących zredukowane χ2 w funkcji pb oraz kPrzykład.
    UWAGA: Zredukowany χ2 zostało dostarczone w pliku wyjściowym. pb oraz kPrzykładowy tekst do tłumaczenia. można ograniczyć do określonych wartości, stosując dolne i górne granice w procedurach dopasowania. W naszych skryptach dolne i górne granice dla pb wynoszą odpowiednio lb(2) i ub(2). Dolna i górna granica dla kPrzykładowy tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści źródłowej w języku angielskim, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych i edukacyjnych JoVE. odpowiednio lb(3) i ub(3).
  7. Oszacuj błąd dopasowanych parametrów. Można to zrobić, ustawiając w skrypcie wartość MC_fac na 1 i powtarzając dopasowanie wielokrotnie (zazwyczaj >20 powtórzeń). Błąd każdego parametru oszacowano jako odchylenie standardowe rozkładu.
    UWAGA: Ustawienie parametru MC_fac na 1 generuje syntetyczny zestaw danych, w którym do danych eksperymentalnych dodany zostaje błąd o rozkładzie Gaussa (obliczony na podstawie błędu eksperymentalnego).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół pozwala na pozyskanie profili RD dla każdego piku w widmie 1H-15N TROSY (Rysunek 3A). Na podstawie uzyskanych profili RD można oszacować wkład wymiany w relaksację poprzeczną 15N każdej grupy amidowej szkieletu (Rysunek 3A,3B). Poprzez naniesienie wartości Rex na strukturę 3D badanego białka możliwe jest zidentyfikowanie regionów strukturalnych podlegających wymianie konformacyjn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano protokół zastosowany w laboratorium w celu pozyskiwania i analizy danych 15N RD dotyczących białek. W szczególności omówiono kluczowe etapy przygotowania próbki NMR, pomiaru danych NMR i analizy profili RD. Poniżej omówiono kilka ważnych aspektów dotyczących pozyskiwania i analizy eksperymentów RD. Jednak w celu bardziej szczegółowego opisu eksperymentu i analizy danych zaleca się dokładne przestudiowanie oryginalnej literatury 3,8,11,15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy zapoznali się z manuskryptem i go zatwierdzili. Oświadczamy, że nie występujemy w przypadku konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z NIGMS R35GM133488 oraz z Roy J. Carver Charitable Trust dla V.V.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sonda kriogenicznaBruker5 mm TCI 800 H-C/N-D KriosondaPoprawa czułości
Tlenek deuteruSigma Aldrich756822-1>99,8% czysty, stosowany do przygotowywania próbek NMR i kultur deuterowanych
Wirówka z napędem ręcznymScientific dostarczaCENTFG1Służy do usuwania wszelkich pęcherzyków powietrza lub resztek cieczy, które utknęły na ściankach rurki NMR.
Spektrometr NMR wysokiego polaBruker Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800Akwizycja danych NMR
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlModelowanie danych NMR
Pasteur Pipeta NMR CorningIncorporation7095D-NMRPipeta pastuer ze szkła Pyrex do przenoszenia próbki cieczy w probówce NMR
Rurka NMRWillmad Precyzja535-PP-75mm cienkościenna 7-calowa cylindryczna szklana rurka
NMRPipeBadania Instytutu Nauk Biologicznych i Biotechnologiihttps://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.htmlPrzetwarzanie danych NMR
SPARKYUniwersytet Kalifornijski, San Franciscohttps://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/Analiza danych NMR
Tospin 3.2 (lub nowszy)BrukerOprogramowanie do akwizycji
United https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html

Bibliografia

  1. Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
  2. Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
  3. Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
  4. Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
  5. Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960(2015).
  6. Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
  7. Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
  8. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
  9. Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
  10. Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
  11. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  12. Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
  13. Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
  14. Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
  15. Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
  16. Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
  17. Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
  18. Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
  19. Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
  20. Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
  21. Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
  22. Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
  23. Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

NMR w roztworzeNMR azotu 15wymiana konformacyjnaparametry kinetyczneparametry termodynamicznebiologia strukturalnakataliza enzymatyczna
15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.