Artykuł metodologiczny

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

DOI:

10.3791/62398

⸱

14 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby spowolnić i zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe, pilnie potrzebne jest szybkie testowanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST), aby ilościowo określić wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na patogeny. Zazwyczaj zajmuje to kilka dni, aby wykonać AST konwencjonalnymi metodami opartymi na długotrwałej hodowli, i nie działają one bezpośrednio w przypadku próbek klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy szybką metodę AST możliwą dzięki obrazowaniu inkorporacji metabolicznej tlenku deuteru (D2O) za pomocą wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS). Za pomocą obrazowania SRS monitoruje się wprowadzanie metaboliczneD2Odo biomasy oraz hamowanie aktywności metabolicznej po ekspozycji na antybiotyki na poziomie pojedynczej bakterii. Stężenie inaktywacji metabolizmu jednokomórkowego (SC-MIC) bakterii po ekspozycji na antybiotyki można uzyskać po łącznie 2,5 godziny przygotowania próbki i jej wykrywania. Co więcej, ta szybka metoda AspAT ma bezpośrednie zastosowanie do próbek bakteryjnych w złożonych środowiskach biologicznych, takich jak mocz lub krew pełna. Obrazowanie metaboliczne SRS inkorporacji deuteru jest przełomowe dla szybkiego fenotypowego AspAT w jednej komórce w klinice.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi rosnące globalne zagrożenie dla skutecznego leczenia chorób zakaźnych1. Przewiduje się, że oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe spowoduje dodatkowe 10 milionów zgonów rocznie i 100 bilionów dolarów straty globalnego PKB do 2050 roku, jeśli nie zostaną podjęte działania w celu zwalczania bakterii opornych na antybiotyki1,2. Podkreśla to pilną potrzebę szybkich i innowacyjnych metod diagnostycznych do badania wrażliwości na antybiotyki (AST) bakterii zakaźnych, aby spowolnić pojawianie się bakterii opornych na antybiotyki i zmniejszyć związany z tym wskaźnik śmiertelności3. Aby zapewnić jak najlepszy wynik kliniczny, kluczowe jest wprowadzenie skutecznej terapii w ciągu 24 godzin. Jednak obecna metoda złotego standardu, taka jak metoda dyfuzji krążkowej lub rozcieńczania bulionu, zwykle wymaga co najmniej 24 godzin na procedurę wstępnej inkubacji dla próbek klinicznych i dodatkowych 16-24 godzin na uzyskanie wyników minimalnego stężenia hamującego (MIC). Ogólnie rzecz biorąc, metody te są zbyt czasochłonne, aby pomóc w podjęciu natychmiastowej decyzji o leczeniu chorób zakaźnych w klinice, co prowadzi do pojawienia się i rozprzestrzeniania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe4.

Genotypowe metody AST, takie jak techniki oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)5, zostały opracowane w celu szybkiego wykrywania. Techniki te mierzą specyficzne sekwencje genetyczne oporności w celu uzyskania szybkich wyników AspAT. Nie polegają na czasochłonnej hodowli komórkowej; Badane są jednak tylko określone znane sekwencje genetyczne z opornością. Dlatego jego zastosowanie ogranicza się do różnych gatunków bakterii lub różnych mechanizmów oporności. Nie mogą również dostarczać wyników MIC do podejmowania decyzji terapeutycznych6,7. Poza tym opracowywane są nowatorskie metody fenotypowe dla szybkiego AST, aby przezwyciężyć te ograniczenia8, w tym urządzenia mikroprzepływowe9,10,11,12,13, optical devices14,15,16, fenotypowy AST określający ilościowo liczbę kopii kwasów nukleinowych17,18 oraz metody spektroskopowe Ramana19,20,21,22,23,24. Metody te skracają czas uzyskiwania wyników AST, jednak większość z nich ma zastosowanie tylko do izolatów bakteryjnych, a nie bezpośrednio do próbek klinicznych, i nadal wymagają długotrwałej preinkubacji.

W tej pracy prezentujemy metodę szybkiego określania podatności bakterii w moczu i krwi pełnej poprzez monitorowanie aktywności metabolicznej komórki za pomocą obrazowania SRS. Woda (H2O) bierze udział w zdecydowanej większości istotnych procesów syntezy biomolekularnej w żywych komórkach. Jako izotopolog wody, poprzez katalizowaną enzymatycznie reakcję wymiany H/D między aktywnym redoks atomem wodoru w NADPH a atomem D w D2O, deuter może zostać włączony do biomasy wewnątrz komórki25,26. W reakcji syntezy deuterowanych kwasów tłuszczowych pośredniczy NADPH znakowany deuterem. Włączenie D2O do reakcji aminokwasów (AA) powoduje produkcję białka deuterowanego26 (Rysunek 1). W ten sposób nowo zsyntetyzowane biomolekuły zawierające wiązania C-D w pojedynczych komórkach drobnoustrojów można wykorzystać jako ogólny marker aktywności metabolicznej, który ma zostać wykryty. Aby odczytać zsyntetyzowane de novo wiązania C-D, spektroskopia Ramana, wszechstronne narzędzie analityczne dostarczające specyficznych i ilościowych informacji chemicznych o biomolekułach, jest szeroko stosowana do określania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe i znacznego skracania czasu testowania do kilku godzin27,28,29,30. Jednak ze względu na nieodłącznie niską wydajność procesu rozpraszania Ramana, spontaniczna spektroskopia Ramana ma niską czułość wykrywania. W związku z tym uzyskanie wyników obrazu w czasie rzeczywistym za pomocą spontanicznej spektroskopii Ramana jest trudne. Koherentne rozpraszanie Ramana (CRS), w tym koherentne rozpraszanie Ramanowskie anty-Stokesa (CARS) i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS), osiągnęło wysoką czułość wykrywania ze względu na koherentne pole świetlne, które generuje rzędy wielkości większe niż w przypadku spontanicznej spektroskopii Ramana, zapewniając w ten sposób szybkie, specyficzne i ilościowe obrazowanie chemiczne na poziomie pojedynczej komórki31,32,33, 34,35,36,37,38,39.

Tutaj, w oparciu o nasze najnowsze prace40, przedstawiamy protokół szybkiego określania aktywności metabolicznej i wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą femtosekundowego obrazowania C-D SRSinkorporacji D 2O bakterii w normalnym środowisku, moczu i krwi pełnej na poziomie pojedynczej komórki. Femtosekundowe obrazowanie SRS ułatwia monitorowanie stężenia inaktywacji metabolizmu pojedynczej komórki (SC-MIC) przeciwko antybiotykom na poziomie pojedynczej bakterii w ciągu 2,5 godziny. Wyniki SC-MIC są walidowane za pomocą standardowego testu MIC za pomocą mikrorozcieńczenia bulionu. Nasza metoda ma zastosowanie do określania podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe patogenów zakażeń dróg moczowych (ZUM) i zakażeń krwi (BSI) przy znacznie krótszym czasie oznaczania w porównaniu z metodą konwencjonalną, co otwiera możliwość szybkiego fenotypowego AspAT w klinice na poziomie pojedynczej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie próbek ludzkiej krwi jest zgodne z wytycznymi IRB Uniwersytetu Bostońskiego i Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). W szczególności okazy pochodzą z banku i są całkowicie pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. Okazy te nie są uważane za osoby badane przez ludzi przez biuro Institutional Review Board (IRB) na Uniwersytecie Bostońskim.

1. Przygotowanie podstawowego roztworu bakterii i antybiotyków

  1. Przygotować roztwór podstawowy antybiotyków (siarczan gentamycyny lub amoksycylina) o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczony w sterylnym rozpuszczalniku 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub dimetylosulfotlenku (DMSO) w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Rozpuścić siarczan gentamycyny w sterylnym roztworze PBS, a amoksycylinę w sterylnym rozpuszczalniku DMSO. Następnie roztwór antybiotyków należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C zgodnie z zaleceniami.
  2. Aby przygotowaćD2Ozawierające pożywkę bulionową Muellera-Hintona (MHB) dostosowaną kationowo, dodaj 220 mg zasady bulionowej MHB do 10 mlD2O, aby uzyskać 100% pożywki zawierającej D2O. Wysterylizuj roztwór, filtrując filtrami o wielkości porów 200 nm.
    UWAGA: Używaj tego protokołu zawsze do sporządzania i sterylizacji roztworów pożywki w dalszych krokach.
  3. Aby przygotować próbki bakteryjne do obrazowania SRS, należy dodać 2 ml normalnej pożywki MHB, która nie zawiera deuteru, do sterylnej probówki hodowlanej z okrągłym dnem, a następnie ogrzać ją w temperaturze 37 °C.
  4. Użyj sterylnej pętli, aby wybrać jedną kolonię bakterii (Escherichia coli BW 25113 lub Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) ze świeżej kultury na tryptycznej płytce agarowej sojowej. Następnie zawieś go w podgrzanej pożywce hodowlanej i delikatnie wiruj, aby przygotować zawiesinę bakterii.
  5. Inkubować bakterie w temperaturze 37 °C w wytrząsarce z prędkością 200 obrotów na minutę (obr./min), aż osiągną fazę logarytmiczną.

2. D2O leczenie inkorekcyjne w obecności antybiotyków (Rysunek 2a)

  1. Sprawdź stężenie bakterii, mierząc gęstość optyczną (OD) za pomocą fotometru o długości fali 600 nm.
  2. Rozcieńczyć roztwór bakteryjny przy użyciu zwykłego podłoża MHB, które nie zawiera deuteru, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek 8 x 105 jtk/ml. Delikatnie wiruj, aby wymieszać komórki bakteryjne.
  3. Przygotować 300 μl porcji roztworu bakteryjnego w siedmiu mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml i 600 μl podwielokrotności roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 4,8 μl roztworu podstawowego antybiotyku (gentamycyny lub amoksycyliny) (1 mg/ml) do mikroprobówki zawierającej 600 μl roztworu bakteryjnego, aby końcowe stężenie antybiotyku wynosiło 8 μg/ml.
  5. Pobrać 300 μl roztworu z 8 μg/ml roztworu bakterii zawierających antybiotyk i dodać do kolejnych 300 μl roztworu bakteryjnego, aby uzyskać dwukrotnie rozcieńczony roztwór bakterii zawierający antybiotyk (4 μg/ml).
  6. Powtórzyć dwukrotne seryjne rozcieńczanie badanych antybiotyków, gentamycyny lub amoksycyliny, aż do osiągnięcia mikroprobówki o najniższym stężeniu (0,25 μg/ml) i wyrzucić 300 μl z probówki. Zarówno dla gentamycyny, jak i amoksycyliny stężenia szeregowe wahają się od 0,25 μg/ml do 8 μg/ml.
    1. Pozostaw jedną probówkę bez antybiotyków do ślepej próby. Będzie to kontrola pozytywna w celu sprawdzenia aktywności metabolicznej bakterii bez leczenia antybiotykami, ale z leczeniemD2O.
    2. Pozostawić jedną probówkę bez antybiotyków i bezD2Odla kontroli ujemnej.
  7. Inkubować podwielokrotność bakteryjną z określonym antybiotykiem (gentamycyną lub amoksycyliną) zawierającym pożywkę MHB przez 1 godzinę.
  8. Podczas inkubacji należy przygotować seryjne rozcieńczenie antybiotyków ze 100% pożywką zawierającąD2O o tym samym gradiencie stężeń co antybiotyki przygotowane w kroku 2.6. Zarówno dla gentamycyny, jak i amoksycyliny stężenia szeregowe wahają się od 0,25 μg/ml do 8 μg/ml.
  9. Po 1 godzinie antybiotykoterapii dodać odpowiednio 700 μl seryjnie rozcieńczonego antybiotyku i 100% pożywki MHB zawierającej D2O do 300 μl bakterii wstępnie potraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu antybiotyku (przygotowanym w kroku 2.6).
    1. Na przykład dodaj 700 μl 100% pożywki MHB zawierającej D2O (zawierającej 8 μg/ml antybiotyku) do 300 μl bakterii wstępnie poddanych działaniu antybiotyku o stężeniu 8 μg/mL. W ten sam sposób przenieść do odpowiednich probówek o następnym stężeniu i homogenizować, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
    2. Dodać 700 μl bezantybiotykowej pożywki 100% D2O zawierającej MHB do 300 μl bakterii wolnych od antybiotyków (przygotowanych w kroku 2.6.1) jako ślepą próbę.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubacyjnej z prędkością 200 obr./min przez dodatkowe 30 min.
      UWAGA: Na tym etapie końcowe stężenieD2Ow pożywce do badania wynosi 70%.
  10. Najpierw odwirować 1 ml antybiotyku i próbki bakteryjnej poddanej działaniuD2O w temperaturze 6200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dwukrotnie przemyć oczyszczoną wodą. Na koniec utrwalić próbki w 10% roztworze formaliny i przechowywać je w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie bakterii w środowisku moczu (Rysunek 2b)

  1. Aby przygotować E. coli BW 25113 w fazie logarytmicznej, wykonaj czynności opisane w punktach 1.4 i 1.5.
  2. Sprawdź stężenie bakterii, mierząc OD za pomocą fotometru o długości fali 600 nm.
  3. Aby naśladować kliniczne próbki ZUM14,18,41, wstrzyknij roztwór E. coli do 10 ml zanonimizowanego moczu, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek 106 CFU/ml.
  4. Przefiltruj mocz z E. coli za pomocą filtra 5 μm, a następnie podziel roztwór bakteryjny na 300 μl podwielokrotności na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 ml i 600 μl podwielokrotności roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
  5. Przeprowadzić zabieg inkorporacjiD2Ow obecności antybiotyków i pobrać próbkę zgodnie z opisem w poprzednich krokach od 2.4 do 2.10.

4. Przygotowanie bakterii w środowisku krwi (Rysunek 2c)

  1. Aby przygotować Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 w fazie logarytmicznej, wykonaj czynności opisane w punktach 1.4 i 1.5.
  2. Aby naśladować kliniczne próbki zakażeń krwi42,43, wstrzyknij P. aeruginosa w 1 ml zdeidentyfikowanej krwi ludzkiej, aby osiągnąć stężenie 107 CFU/ml.
  3. Dodaj 9 ml sterylnej, oczyszczonej wody, aby zlizować krew.
  4. Przefiltruj krew wzbogaconą P. aeruginosa za pomocą filtra 5 μm. Następnie zebrać bakterie do objętości 1 ml przez odwirowanie przy 6200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 9 ml wstępnie podgrzanego normalnego MHB do roztworu bakterii i delikatnie odwirować. Końcowe stężenie bakterii wynosi 106 jtk/ml
  5. Podzielić roztwór krwi wzbogaconej P. aeruginosa na 300 μl porcji na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 ml i 600 μl podwielokrotności roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
  6. Przeprowadzić zabieg inkorporacjiD2Ow obecności antybiotyków i pobrać próbkę zgodnie z opisem w poprzednich krokach od 2.4 do 2.10.

5. Obrazowanie SRS inkorporacji metabolicznej D2O w pojedynczej bakterii

  1. Przemyć 1 ml utrwalonego roztworu bakteryjnego oczyszczoną wodą, a następnie odwirować przy 6200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Roztwór bakteryjny wzbogacić do około 20 μl.
  2. Umieść roztwór bakteryjny na szkle nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną. Umieścić i uszczelnić próbkę do obrazowania SRS.
  3. Obrazowanie bakterii o częstotliwości drgań C-D na wysokości 2168 cm-1 za pomocą mikroskopu SRS.
    1. Wprowadź i dostosuj długość fali pompy do 852 nm za pomocą oprogramowania sterującego na komputerze.
    2. Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy. Ustaw moc lasera pompującego na próbce na ~8 mW, a moc lasera Stokesa na próbce na ~40 mW, regulując płytkę półfalową przed wyjściem lasera.
      UWAGA: W mikroskopie SRS przestrajalny laser femtosekundowy o częstotliwości powtarzania 80 MHz zapewnia pompie (680 do 1300 nm) i lasery wzbudzające Stokesa (1045 nm).
  4. Regulując zwierciadeł odbiciowych, wyrównaj przestrzennie pompę i wiązki Stokesa i skieruj obie wiązki do pionowego mikroskopu wyposażonego w system luster galvo 2D do skanowania laserowego.
    1. Użyj obiektywu zanurzającego się w wodzie z 60-krotnym zanurzeniem, aby skupić pompę i lasery Stokesa na próbce.
    2. Użyj skraplacza oleju, aby zebrać sygnały z próbki w kierunku do przodu.
    3. Użyj filtra pasmowo-przepustowego, aby odfiltrować laser Stokesa przed skierowaniem go do fotodiody.
    4. Wyodrębnij wymuszony sygnał Ramana za pomocą wzmacniacza typu lock-in i wykryj sygnały za pomocą fotodiody.
  5. Ustaw każdy obraz SRS tak, aby zawierał 200 x 200 pikseli i czas przebywania pikseli wynoszący 30 μs w panelu sterowania oprogramowania. Całkowity czas akwizycji dla jednego obrazu wynosi ~1,2 s. Ustaw rozmiar kroku na 150 nm, aby rozmiar obrazu wynosił około 30 x 30 μm2. Należy narysować co najmniej trzy pola widzenia dla każdej próbki.

6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych ( Rysunek 3)

  1. Aby uzyskać średnie natężenie sygnału C-D, otwórz i przetwórz obrazy SRS za pomocą oprogramowania ImageJ.
  2. Najpierw przekonwertuj obrazy SRS na obrazy typu 8-bitowego z odwróconym kolorem, klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy, a następnie Edytuj | Odwróć przyciski w oprogramowaniu ImageJ.
  3. Następnie przefiltruj obrazy za pomocą rozmycia gaussowskiego, klikając przycisk Proces | Filtry | Rozmycie gaussowskie i ustaw Sigma (promień) na 1.
  4. Użyj regulacji progu obrazu, aby wybrać obszar bakterii. Kliknij Obraz | Dostosuj | Próg, aby upewnić się, że wybrane rozmiary bakterii są zgodne z tymi na oryginalnych obrazach SRS. Wyeliminuj małe cząstki, dostosowując próg wielkości w celu określenia cząstek. Kliknij przycisk Zastosuj.
  5. Stosowanie analizy | Przyciski Analiza cząstek, aby oznaczyć i określić obszar bakterii.
  6. Klikając przycisk Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby uzyskać oryginalny nieprzetworzony obraz SRS, oznacz ten sam obszar bakterii, określ średnią intensywność każdego punktu danych, klikając przycisk Zmierz w menedżerze ROI.
  7. Zakreśl obszar tła na oryginalnym obrazie SRS i zmierz średnią intensywność tła. Średnią intensywność C-D każdej bakterii uzyskuje się przez odjęcie intensywności sygnału tła.

7. Kwantyfikacja wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą SC-MIC

UWAGA: Wartość graniczna na poziomie 0,60 do wyznaczenia SC-MIC jest ustalana na podstawie analizy statystycznej intensywności SRS C-D w warunkach aktywnego metabolizmu i zahamowanego metabolizmu dla bakterii przy różnych stężeniach ekspozycji na lek40. Intensywności C-D dla grup wrażliwych na antybiotyki i opornych na antybiotyki dopasowano do rozkładu normalnego.

  1. Wykreślić krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) i ocenić próg odcięcia na poziomie 0,60. Na podstawie tej wartości granicznej można zdefiniować SC-MIC jako wskaźnik skuteczności antybiotyków w celu określenia grupy metabolicznie nieaktywnej i metabolicznie aktywnej.
  2. Aby ilościowo przeanalizować dane obrazowania SRS, należy wykreślić histogramy intensywności sygnału C-D dla każdej grupy bakterii traktowanej seryjnie rozcieńczanym stężeniem antybiotyku. Kolorowe punkty danych oznaczają różne indywidualne bakterie.
  3. Normalizować intensywność C-D w grupie leczonej antybiotykiem do średniej intensywności w grupie kontrolnej bez leczenia antybiotykami. Określ wyniki SC-MIC dla różnych kombinacji bakterii i antybiotyków, określając ilościowo intensywność sygnału SRS w regionie C-D w porównaniu z różnymi stężeniami antybiotyków przy użyciu wartości odcięcia wynoszącej 0,60.
  4. Zwaliduj i porównaj odczyt SC-MIC z odczytem MIC określonym za pomocą konwencjonalnego testu mikrorozcieńczenia bulionu.
  5. Według Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) kategoria wrażliwości na podstawie wyników obrazowania metabolicznego SRS dla każdego badanego szczepu bakteryjnego jest interpretowana jako "podatny", "oporny" lub "pośredni".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ czasu inkubacji na inkorporację deuteru jest mierzony za pomocą spontanicznej mikrospektroskopii Ramana w obszarze C-D (2070 do 2250 cm-1) i C-H (2,800 do 3,100 cm-1) (Rysunek 4a). Poklatkowe jednokomórkowe widma Ramana P. aeruginosa hodowane w pożywce zawierającej 70% D2O wykazują rosnącą intensywność CD / CH w czasie inkubacji od 0 do 180 minut. (Rysunek 4b) Rosnąca obfitość C-D w pojedynczych komórkach drobnoustrojów ujawnia, że

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybki AspAT można uzyskać, oceniając odpowiedź aktywności metabolicznej bakterii na antybiotykoterapię za pomocą obrazowania metabolicznego SRS pojedynczej komórki w ciągu 2,5 godziny od próbki do wyników SC-MIC. Odpowiedź na aktywność metaboliczną bakterii i podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe można wykryć, monitorując inkorporację metabolicznąD2Odo syntezy biomolekuł za pomocą obrazowania SRS wiązań C-D. Ponieważ woda jest powszechnie stosowana w żywych komórkach, obrazowanie metaboliczne SRS stanowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH R01AI141439 do J.-X.C i M.S, a R35GM136223 do J.-X.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Modulacja akustyczno-optycznaGooch& HousegoR15180-1.06-LTDModulowana wiązka laserowa
AmoksycylinaSigma AldrichA8523-5G
Filtr pasmowoprzepustowyChromaHQ825/150mBlokuj wiązkę laserową stokes przed fotodiodą
Chlorek wapniaSigma AldrichC1016-100GRegulacja
kationów Regulowany bulion Mueller-HintonFisher ScientificB12322Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe mikroorganizmów metodami rozcieńczania bulionu
WirówkaThermo Scientific75002542
Okulary nakrywkoweVWR16004-318
Probówka hodowlana z zatrzaskiemMarka Fisher149569B
DaptomycynaAcrosA0386346
Tlenek151882Rozpuszczalnik organiczny do rozpuszczania antybiotyków
Tlenek deuteru-d6Sigma Aldrich156914Rozpuszczalnik organiczny jako wzorzec do kalibracji systemu obrazowania SRS
Escherichia coli BW 25113Centrum Genetyczne Coli7636
Polipropylenowe probówki wirówkowe Eppendorf 1,5 mlMarka Fisher05-408-129
Siarczan gentamycynySigma AldrichG4918
Hydrofilowe filtry z polifluorku winylidenuMillipore-SigmaSLSV025NBwielkość porów 5 i mikro; m
Oprogramowanie ImageJNIHWersja: 2.0.0-rc-69/1.52tPrzetwarzanie i analiza obrazu
Inkubacyjny wytrząsarka orbitalna ustawiona na 37 & stopni; CVWR97009-890
Pętla inokulacyjnaSigmaBR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosekundowy laser impulsowywidmowo-fizycznyinsight X3Przestrajalne źródło lasera i stałe źródło lasera o długości fali 1045 nm do obrazowania SRS
Wzmacniacz blokującyZurich InstrumentHF2LIDemodulacja sygnałów SRS
Skraplacz olejuOlympusU-AACNA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)American Type Culture CollectionATCC 47085
FotodiodaHamamatsuS3994-01Detektor
Rurka stożkowa polipropylenowa 15 mlFalcon14-959-53A Filtry
polipropylenoweThermo Scientific726-2520wielkość porów 0,2 i mikro; m
Sterylne szalki PetriegoCorning07-202-031
Strzykawka 10 mlmarki Fisher14955459
spektrofotometr UV/VisBeckman CoulterModel: DU 530Pomiar gęstości optycznej przy długości fali 600 nm
Mieszalnik wirowyVWR97043-562
Obiektyw wodnyOlympusUPLANAPO/IR60 razy;, NA 1.2
deuteru Model :

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187(2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681(2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, Ö, Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217(2015).
  21. Liu, C. -Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335(2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648(2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452(2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148(2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870(2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278(2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie pojedynczych bakteriiszybkie ASTaktywno metaboliczna bakteriimikroskopia SRSanaliza pr bek klinicznychPseudomonas AeruginosaEscherichia Coli

Powiązane artykuły