Opracowaliśmy zautomatyzowane oprogramowanie do rozpoznawania zdarzeń egzocytarnych oznaczonych przez sondy fluorescencyjne o pH czułym na pH. W tym miejscu zademonstrujemy użycie graficznego interfejsu użytkownika i programu RStudio do wykrywania zdarzeń fuzji, analizowania i wyświetlania parametrów czasoprzestrzennych fuzji oraz klasyfikowania zdarzeń w odrębnych trybach fuzji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Automatyczne wykrywanie i analiza egzocytozy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Timelapse Mikroskopia TIRF wrażliwego na pH GFP (pHluoryny) dołączonego do białek SNARE pęcherzyków jest skuteczną metodą wizualizacji pojedynczych zdarzeń egzocytarnych pęcherzyków w hodowli komórkowej. Aby przeprowadzić bezstronną, skuteczną identyfikację i analizę takich zdarzeń, opracowano i wdrożono w MATLAB podejście oparte na wizji komputerowej. Potok analizy składa się z algorytmu segmentacji komórek i identyfikacji zdarzeń egzotycznych. Podejście oparte na widzeniu komputerowym obejmuje narzędzia do badania wielu parametrów pojedynczych zdarzeń, w tym okresu półtrwania rozpadu fluorescencji i piku ΔF/F, a także analizy całej komórki częstości egzocytozy. Te i inne parametry fuzji są wykorzystywane w podejściu klasyfikacyjnym do rozróżniania różnych trybów fuzji. W tym miejscu nowo zbudowany graficzny interfejs użytkownika wykonuje potok analizy od początku do końca. Dalsza adaptacja funkcji K Ripleya w R Studio służy do rozróżniania zgrupowanych, rozproszonych lub losowych zdarzeń fuzji zarówno w przestrzeni, jak i w czasie.
Wprowadzenie
Konstrukty VAMP-pHluorin lub receptor transferyny (TfR)-pHuji są doskonałymi markerami zdarzeń egzocytarnych, ponieważ te wrażliwe na pH fluorofory są wygaszane w świetle pęcherzyka kwasowego i fluoryzują natychmiast po otwarciu porów fuzyjnych między pęcherzykiem a błoną plazmatyczną1. Po otwarciu porów fuzyjnych fluorescencja zanika wykładniczo, z pewną niejednorodnością, która ujawnia informacje o zdarzeniu fuzji. Tutaj opisana jest aplikacja graficznego interfejsu użytkownika (GUI), która automatycznie wykrywa i analizuje zdarzenia egzocytarne. Ta aplikacja pozwala użytkownikowi na automatyczne wykrywanie zdarzeń egzocytarnych ujawnionych przez markery wrażliwe na pH2 i generowanie cech z każdego zdarzenia, które można wykorzystać do celów klasyfikacji3 (Rysunek 1A). Ponadto opisano analizę grupowania zdarzeń egzocytarnych z wykorzystaniem funkcji K Ripleya.
Niedawno zgłoszono automatyczną klasyfikację zdarzeń egzocytarnych do różnych trybów egzocytarnych3. Dwa tryby egzocytozy, egzocytoza pełnej fuzji pęcherzykowej (FVF) i egzocytoza fuzji typu kiss-and-run (KNR) zostały wcześniej opisane4,5,6,7. Podczas FVF pory fuzyjne rozszerzają się, a pęcherzyk jest wbudowywany w błonę plazmatyczną. Podczas KNR por fuzji przejściowo się otwiera, a następnie ponownie uszczelnia4,5,8,9,10. Zidentyfikowano cztery tryby egzocytozy w rozwijających się neuronach, dwa związane z FVF i dwa związane z KNR. Praca ta pokazuje, że zarówno FVF, jak i KNR można dalej podzielić na zdarzenia fuzji, które przechodzą natychmiast do rozpadu fluorescencji (FVFi i KNRi) po otwarciu porów fuzyjnych lub zdarzenia egzocytarne, które wykazują opóźnienie po otwarciu porów fuzyjnych przed rozpoczęciem zaniku fluorescencji (FVFd i KNRd) (Rysunek 1B). Klasyfikator identyfikuje tryb egzocytozy dla każdego zdarzenia fuzji. W tym przypadku ta analiza została włączona do graficznego interfejsu użytkownika, który można zainstalować w MATLAB w systemach operacyjnych Windows i Mac. Wszystkie pliki analityczne można znaleźć pod adresem https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing lub
https://github.com/GuptonLab.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Oryginalny graficzny interfejs użytkownika analizy egzocytozy został napisany i skompilowany w Matlabie w wersji 9.10 (2021a). Nowe wersje MATLABa mają wymagane aktualizacje GUI, które są dostępne do pobrania z naszej strony internetowej: https://guptonlab.web.unc.edu/code/
1. Wybierz zestawy danych i katalog
- Aby wybrać zestawy danych do analizy, kliknij przycisk Znajdź zestawy danych (Rysunek 2A, czerwone pole 1), aby przejść do folderu, w którym zdeponowane są dane (np. folder RawData). Pliki danych automatycznie wypełnią pliki danych jako listę. W folderze może znajdować się więcej niż jeden zestaw danych.
- Kliknij przycisk Wybierz katalog i wybierz katalog (np. Test), w którym zostaną zdeponowane analizowane pliki (Rysunek 2A, czerwona ramka 2) . Zestaw folderów i gotowych plików analizy, a także pośrednich obrazów tymczasowych zostanie utworzony w tym katalogu po naciśnięciu przycisku Analiza. Jeśli katalog nie zostanie wybrany, zostaną wygenerowane błędy.
2. Ustaw rozmiar piksela i liczbę klatek na sekundę
- Wypełnij odpowiednią liczbę klatek na sekundę i rozmiar pikseli obrazów w odpowiednim polu "Liczba klatek na sekundę" lub "rozmiar piksela" (Rysunek 2A, zielone pole). Jeśli nie zostaną podane żadne wartości (są one ustawione na domyślne "0"), program przeszuka metadane powiązane z plikiem pod kątem liczby klatek na sekundę i rozmiaru pikseli. Jeśli tych wartości nie można znaleźć, program domyślnie wybierze wartość na piksel dla pomiaru i dla klatki dla punktów czasowych.
UWAGA: W podanym przykładzie liczba klatek na sekundę wynosi 100, a rozmiar piksela to 0,08.
3. Wybierz lub stwórz maski
- Użyj przycisku Kreator masek, aby automatycznie utworzyć maski komórek dla danych na liście zestawów danych pliku (Rysunek 2A, niebieskie pole). Po użyciu przycisku Kreator masek zostanie utworzony nowy folder w wybranym katalogu o nazwie MaskFiles. "Wskaźnik biegu" zmieni kolor na żółty podczas biegu i powróci do koloru zielonego po zakończeniu.
UWAGA: Maska dla każdego pliku na liście Pliki danych zostanie utworzona z pierwszych 10 klatek pliku obrazu (lub ze wszystkich klatek, jeśli w pliku obrazu znajduje się mniej niż 10) i zdeponowana w folderze MaskFiles przy użyciu odpowiedniego schematu nazewnictwa (opisanego poniżej). - Upewnij się, że pliki maski automatycznie wypełniają listę plików maski. Użytkownik może przejść bezpośrednio do analizy.
UWAGA: Zawsze sprawdzaj wizualnie pliki maski i upewnij się, że obejmują one cały obszar zainteresowania. Pierwsza klatka pliku danych i plik maski są wyświetlane w interfejsie użytkownika po wybraniu. (Rysunek 2B). Kreator masek może generować błędy w przypadku niskiego stosunku sygnału do szumu, więc sprawdzenie, czy pliki maski są odpowiednie, ma kluczowe znaczenie dla kontroli jakości. - Jako alternatywę dla korzystania z Kreatora masek, jeśli sygnał do szumu obrazów jest niewystarczający, utwórz maski ręcznie w ImageJ.
- Najpierw otwórz plik obrazu raw w ImageJ (Rysunek 3A).
- Kliknij przycisk Zaznaczanie wielokąta i kliknij, aby narysować maskę wokół komórki. Po zakończeniu kliknij dwukrotnie ostatni punkt, aby zakończyć wielokąt.
- Po zakończeniu przejdź do punktu menu Edycja | Selekcja | Utwórz maskę (Rysunek 3B). Na podstawie rysunku wielokąta zostanie utworzona nowa odwrócona maska. Zapisz maski w wyznaczonym folderze MaskFiles w wybranym katalogu. Schemat nazewnictwa plików maski musi być zgodny z odpowiadającymi im poszczególnymi plikami danych, po których następuje "_mask_file". Na przykład, jeśli plik danych ma nazwę "VAMP2_488_WT_1.tif", odpowiadający mu plik maski musi mieć nazwę "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
- Użyj przycisku Znajdź pliki maski, aby przejść do wybranego folderu z osadzonymi plikami masek niestandardowych. Maski wypełnią pliki masek jako listę.
UWAGA: Ważne jest, aby przed uruchomieniem analizy mieć maskę dla każdego pliku danych.
4. Analiza i wyodrębnianie cech
- Po wybraniu katalogu i wypełnieniu listy plików danych i listy plików maski kliknij przycisk Analiza (Rysunek 4A). Jeśli wymagana jest klasyfikacja zdarzeń egzocytarnych, przejdź do kroku 5.
UWAGA: Kliknięcie przycisku Analiza spowoduje wykonanie serii zautomatyzowanych zadań w celu przeanalizowania danych. Utworzy indywidualne foldery w wybranym katalogu, aby zdeponować przeanalizowane dane. Podczas biegu "wskaźnik biegu" zmieni kolor z zielonego na żółty (Rysunek 4A, czerwona ramka). Po zakończeniu analizy zmieni się z powrotem na zielony. - Znajdź folder DataFiles (Rysunek 4B) z pełnym zestawem plików analizy (a także plików wyodrębniania cech, które zostaną użyte w późniejszej klasyfikacji) nazwanych zgodnie z każdym plikiem danych (Rysunek 4C).
UWAGA: Opis tych plików analitycznych znajduje się poniżej w sekcji Reprezentatywne wyniki.
5. Klasyfikacja zdarzeń egzocytarnych
- Aby przeprowadzić jednoczesną klasyfikację zdarzeń egzocytarnych z automatycznym wykrywaniem, zaznacz pole wyboru Klasyfikacja przed kliknięciem przycisku Analiza. Dla każdego zdarzenia egzocytarnego przypisz wynik prawdopodobieństwa od 0 do 1 dla każdej klasy. Zdarzenie egzocytarne jest uważane za sklasyfikowane jako jedna z czterech klas, jeśli wynik prawdopodobieństwa dla tej klasy wynosi > 0,5,
UWAGA: Po zakończeniu analizy w wybranym katalogu pojawi się nowy folder z plikami danych. Folder będzie zawierał pliki analityczne odpowiadające każdemu plikowi obrazu.
6. Czasoprzestrzenna analiza egzocytozy przy użyciu wartości K Ripleya
- Utwórz osobny plik maski "neuryt" i "soma". Najpierw podziel somę na segmenty od neurytu. Nie ma bezstronnej metody segmentacji somy od neurytów, więc użytkownik powinien być ślepy na eksperyment warunkowania i kierować się najlepszym osądem; Sugerowana jest elipsoida bez widocznych rozszerzeń neurytów.
- Otwórz ImageJ/Fiji.
- Przeciągnij i upuść plik maski lub użyj punktu menu Plik | Otwórz, a następnie wybierz plik maski.
- Użyj narzędzia do wybierania kolorów i kliknij dowolny z czarnych pikseli w tle maski, aby ustawić kolor na.
- Użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów lub odręcznie, aby narysować kontur wokół somy, oddzielając ją od neurytów. Wymaga to ręcznego podejmowania decyzji.
- Kliknij Edytuj | Selekcja | Zrób maskę. Otworzy się nowy obraz z zakreśloną somą oddzieloną od reszty obrazu. Spowoduje to utworzenie pliku maski soma.
- Nie przesuwając narysowanego regionu, kliknij nagłówek oryginalnego pliku maski.
- Kliknij Edytuj | Napełnij, aby wypełnić zakreśloną somę, tak aby tylko neuryty pozostały w masce.
- Po uzyskaniu oddzielnych plików neurytu i maski zapisz oba pliki maski.
- Otwórz "neurite_2D_network" w Matlabie.
- W programie MATLAB przejdź do katalogu ze wszystkimi danymi analizy.
- Zmień ścieżkę "nazwa maski" na nazwę maski neurytowej, tj. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Zmień "csv_file_name" na miejsce, w którym znajduje się fluorescent_traces.csv plik, tj. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Kliknij przycisk Uruchom, aby zszkieletyzować plik maski neurytowej. Spowoduje to utworzenie szkieletowej wersji pliku maski neurytowej i zdeponowanie jej jako pliku CSV w folderze maskfiles.
- Następnie wygeneruj plik CSV dla somy. Otwórz "CSV_mask_creator.m" w Matlabie.
- Wprowadź ścieżkę do "nazwy maski" do nazwy maski soma, tj. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Zmień "macierz zapisu" na nazwę pliku csv, który ma zostać utworzony, tj. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Kliknij przycisk Uruchom. Spowoduje to utworzenie nowego pliku VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
- Powtórz 6.14 dla każdego pliku maski.
7. Ustawienia RStudio
- Otwórz Rstudio i otwórz ripleys_k_analysis. Plik R.
- Zainstaluj pakiet "spatstat" w programie RStudio, przechodząc do pozycji Narzędzia | Zainstaluj pakiety i wpisz "spatstat", a następnie kliknij Install.
UWAGA: Należy to wykonać tylko raz na instalację Rstudio. - Uruchom bibliotekę spatstat na początku każdej sesji.
- Zwróć uwagę na dwie główne zmienne w tym przypadku: "neuron_mask" i "neuron_datapoints". Neuron Mask wskazuje na zestaw plików masek do uruchomienia, tj. pliki masek soma."
UWAGA: Uruchom wszystkie pliki maski soma razem, oddzielnie od plików masek Neurite i odwrotnie. - Odczytaj .csv plików masek dla każdego z neuronów, które mają być analizowane.
- Uruchamiaj wiele plików jednocześnie, kopiując dodatkowe neuron_mask_n+1. Pozwoli to na agregację analiz Ripleya za pomocą skryptu opisanego w punkcie 8.
- Teraz sprawdź drugą zmienną, "neuron_datapoints".
- Wczytaj do pliku "X_fluorescent_traces.csv" wygenerowanego przez program analityczny (według cech wszystkich extracted_R pliku) z pozycjami x,y,t zdarzeń egzocytarnych, a także specyficznym dla neurytów plikiem pozycji x,y dla sieci 2D. To idzie w pozycji "neuron_datapoints".
- W programie RStudio wybierz pozycję Kod | Region uruchamiania | Uruchom wszystko. Spowoduje to wygenerowanie kilku wykresów, w tym zgrupowanych wartości K Ripleya, a także wykresów gęstości.
- Zapisz działki, przechodząc do punktu menu Eksport | Zapisz obraz jako | Wybierz odpowiedni format obrazu i katalog, wprowadź odpowiednią nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk Zapisz.
UWAGA: Funkcja kreślenia map cieplnych jest wywoływana w skrypcie za pomocą "plot(density(soma_data,0.4))". Liczba "0,4" oznacza tutaj, jak wygładzona powinna być funkcja gęstości. Można go zmienić, aby w znaczący sposób dopasować dane użytkownika, ale jeśli mają być wykonywane porównania między różnymi mapami cieplnymi, liczba między nimi musi być taka sama. - Eksportuj lub zapisz obraz z Rstudio. Jeśli mapa cieplna wymaga dalszej edycji, wybierz odpowiedni typ pliku (SVG lub EPS).
8. Analiza Ripleya
UWAGA: Ripleys_k_analysis. Plik R automatycznie wygenerował również wykresy wartości k Ripleya. Uruchomienie całego skryptu spowoduje automatyczne uruchomienie funkcji wymienionych poniżej, ale jest on uwzględniony w szczegółach, jeśli ktoś chce uruchomić każdą część skryptu osobno lub wprowadzić zmiany w analizie.
- Najpierw uruchom funkcję koperty dla każdej komórki. Funkcja ta symulowała pełną losowość przestrzenną (CSR) w celu przetestowania wartości K Ripleya wzorca punktu zdarzenia egzocytarnego w stosunku do .
Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - Następnie połącz te koperty i utwórz jedno oszacowanie CSR dla grupy:
Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Następnie uruchom funkcję K Ripleya dla wszystkich punktów danych.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, stosunek = PRAWDA)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, stosunek = PRAWDA) - Po zakończeniu połącz ze sobą wartości K Ripleya i uruchom ich przedziały ufności za pomocą następującego polecenia:
Pula danych = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Uruchom plik za pomocą następującego polecenia:
Final_Ripleys_K = varblock(zabawa = Kest, Data_pool) - Wykreśl dane.
- Jeśli wymagana jest twarda różnica statystyczna, do pakietu spatstat dołączany jest Studentised Permutation Test w celu sprawdzenia różnicy między grupami wzorców punktowych:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupa, nperm = np).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Oto interfejs graficzny użytkownika (GUI) (Rysunek 2A) wykorzystano do analizy zdarzeń egzocytozy w trzech neuronach wykazujących ekspresję VAMP2-pHluorin w 3. dniu in vitro (DIV), z zastosowaniem mikroskopii TIRF (całkownego wewnętrznego odbicia fluorescencyjnego). Neurony korowe E15.5 zostały wyizolowane, następnie poddane transfekcji VAMP2-pHluorin i wysiane zgodnie z protokołami opisanymi w pracach Winkle et al., 2016 oraz Viesselmann et al., 2011.11,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Korzystając z oprogramowania do wykrywania i analizy egzocytów, należy wziąć pod uwagę, że program akceptuje tylko pliki .tif z kompresją bezstratną jako dane wejściowe. .tif pliki obrazów mogą być 8-bitowymi, 16-bitowymi lub 32-bitowymi obrazami w skali szarości (jednokanałowymi). Inne formaty obrazów muszą zostać przekonwertowane na jeden z tych typów przed wprowadzeniem. Przykładami użytymi w tym artykule są 16-bitowe obrazy w skali szarości.
Nieodłącznym elementem automatycznego procesu de...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują niczego do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dustinowi Revellowi i Reginaldowi Edwardsowi za przetestowanie kodu i graficznego interfejsu użytkownika. Badania te były finansowane przez National Institutes of Health: w tym R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) i F31NS103586 (FLU).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R Core Team | https://www.r-project.org/ | ||
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Bibliografia
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
