Artykuł metodologiczny

Zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego i elastografii fali poprzecznej w szczurzym modelu NAFLD/NASH

DOI:

10.3791/62403

⸱

20 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Comparative Medicine, Pfizer Inc., 2Digital Medicine & Translational Imaging, Pfizer Inc., 3Internal Medicine Research Unit, Pfizer Inc., 4Drug Safety Research & Development, Pfizer Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie ulepszonej techniki ultradźwiękowej do nieinwazyjnej obserwacji i ilościowego oznaczania zmian w tkance wątroby w modelach niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby u gryzoni

.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) jest stanem ze spektrum niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), która charakteryzuje się nagromadzeniem tłuszczu w wątrobie (stłuszczenie) i stanem zapalnym prowadzącym do zwłóknienia. Modele przedkliniczne dokładnie podsumowujące ludzkie NASH/NAFLD mają zasadnicze znaczenie w opracowywaniu leków. Podczas gdy biopsja wątroby jest obecnie złotym standardem w pomiarze progresji NAFLD/NASH i diagnozowaniu w klinice, w przestrzeni przedklinicznej do analizy histologicznej w celu oceny stadium choroby potrzebne jest pobranie całych próbek wątroby w wielu punktach czasowych podczas badania lub biopsja wątroby.

Przeprowadzanie biopsji wątroby w trakcie badania jest inwazyjną i pracochłonną procedurą, a pobieranie próbek wątroby w celu oceny poziomu choroby zwiększa liczbę zwierząt badawczych potrzebnych do badania. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na wiarygodny, przekładalny, nieinwazyjny biomarker obrazowania do wykrywania NASH/NAFLD w tych modelach przedklinicznych. Nieinwazyjne obrazy ultrasonograficzne w trybie B i elastografia fali poprzecznej (SWE) mogą być używane do pomiaru stłuszczenia, a także zwłóknienia wątroby. Aby ocenić przydatność SWE w przedklinicznych modelach NASH u gryzoni, zwierzęta umieszczono na diecie pro-NASH i poddano nieinwazyjnemu obrazowaniu ultrasonograficznemu w trybie B i elastografii fali poprzecznej w celu zmierzenia wskaźnika wątrobowo-nerkowego (HR) i elastyczności wątroby, mierząc postęp zarówno akumulacji tłuszczu w wątrobie, jak i sztywności tkanek, odpowiednio, w wielu punktach czasowych w trakcie danego badania NAFLD/NASH.

Wskaźniki HR i wartości elastyczności porównano z histologicznymi markerami stłuszczenia i zwłóknienia. Wyniki wykazały silną korelację między wskaźnikiem HR a procentowym zabarwieniem czerwienią olejową O (ORO), a także między elastycznością a barwieniem wątroby czerwienią Picro-Sirius (PSR). Silna korelacja między klasycznymi metodami ex vivo a wynikami obrazowania in vivo dostarcza dowodów na to, że elastografia fal poprzecznych/obrazowanie oparte na ultradźwiękach mogą być stosowane do oceny fenotypu i progresji choroby w przedklinicznym modelu NAFLD/NASH.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest stanem metabolicznym charakteryzującym się nadmiernym nagromadzeniem tłuszczu w wątrobie i szybko staje się wiodącą dolegliwością wątroby na całym świecie, z ostatnio zgłoszonym globalnym rozpowszechnieniem wynoszącym 25%1. Niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) jest bardziej zaawansowanym etapem spektrum NAFLD, charakteryzującym się nadmiarem tłuszczu w wątrobie z postępującym uszkodzeniem komórek, stanem zapalnym i zwłóknieniem. Dolegliwości te są często ciche, niewykrywane za pomocą badań krwi lub rutynowych badań, aż do momentu, gdy dojdzie już do znacznego uszkodzenia wątroby pacjenta. Obecnie złotym standardem w diagnozowaniu NASH u pacjentów jest badanie histologiczne próbek biopsji wątroby pobranych od pacjenta. Podobnie badacze przedkliniczni, którzy pracują nad zrozumieniem patogenezy NASH/NAFLD, a także przemysł rozwoju leków, polegają na biopsji klinowej in vivo próbek wątroby lub końcowej eutanazji kohort satelitarnych w celu histologii w celu pomiaru stłuszczenia, stanu zapalnego i zwłóknienia.

Na przykład, biopsja klinowa wątroby była standardową techniką oceny stłuszczeniowego zapalenia wątroby i zwłóknienia podczas korzystania z modelu GUBRA NASH2. Metoda biopsji klinowej wątroby jest inwazyjna i pracochłonna u małych zwierząt3. Zastosowanie klinowej biopsji wątroby w trakcie badania stanowi dodatkową zmienną eksperymentalną w modelu choroby, która często zwiększa liczbę potrzebnych zwierząt. Mając na uwadze te czynniki, cenne okazują się nieinwazyjne techniki obrazowania, które można wykorzystać do wiarygodnej oceny stłuszczenia i zwłóknienia w modelach zwierzęcych NASH/NAFLD we wczesnych punktach czasowych. Elastografia fali poprzecznej (SWE) to metoda oparta na ultradźwiękach stosowana do pomiaru elastyczności tkanek miękkich. Technika ta mierzy rozchodzenie się fal poprzecznych wytwarzanych przez naddźwiękowe impulsy ultradźwiękowe skierowane na cel tkankowy, a następnie oblicza wartość o nazwie E modulus4. Prędkość fali ścinającej jest proporcjonalna do stopnia sztywności tkanki.

Rysunek 1 i Rysunek 2 pokazuje ustawienia obszaru obrazowania i instrument SWE. Przyrząd SWE jest pojedynczym, kołowym urządzeniem z dwoma ekranami i panelem sterowania pokazanym na Rysunek 2A. Górny monitor (Rysunek 2B) pełni funkcję monitora komputerowego i wyświetla obrazy oraz katalogi pacjentów. Panel sterowania (Rysunek 2C) to zestaw przycisków i pokręteł, które kontrolują ogólne aspekty przechwytywania obrazu: zawieszanie ekranu, zapisywanie obrazów, przełączanie z jednego trybu na drugi. Dolny ekran (Rysunek 2D) to ekran dotykowy z dodatkowymi elementami sterującymi do zmiany ustawień i działa jako klawiatura do wprowadzania danych w razie potrzeby. Przyrząd jest wyposażony w rysik, którego można używać na ekranie dotykowym w razie potrzeby. Sondy ultradźwiękowe mocuje się do dolnego przedniego panelu urządzenia. Do obrazowania gryzoni w trybie B i SWE zastosowano superliniowy przetwornik o częstotliwości od 6 do 20 MHz. Ta zdolność do nieinwazyjnego pomiaru sztywności tkanek sprawia, że SWE jest cennym narzędziem do identyfikacji i oceny stopnia zwłóknienia wątroby5 u pacjentów z NASH, zmniejszając potrzebę stosowania bardziej inwazyjnych metod. SWE jest w rzeczywistości używany do pomiaru zwłóknienia wątroby u pacjentów i jest zatwierdzoną przez FDA metodą oceny zwłóknienia w klinice6. Wykorzystanie SWE do monitorowania progresji NASH w zwierzęcych modelach choroby zapewniłoby narzędzie translacyjne do opracowywania metod leczenia i jednocześnie poprawiłoby dobrostan zwierząt poprzez zmniejszenie liczby zwierząt i udoskonalenie procedur in vivo w celu zminimalizowania bólu i stresu.

Obrazowanie SWE u pacjentów wykorzystuje przetwornik ultradźwiękowy o niskiej częstotliwości4, co nie jest idealne dla małych zwierząt. Warto zauważyć, że techniki SWE o wysokiej częstotliwości zostały wykorzystane do oceny skuteczności hamowania karboksylazy acetylo-CoA w patogenezie NASH w modelu szczurzym7, a użyteczność tej techniki została opisana w szczurzych modelach zwłóknienia wątroby z czterochlorkiem węgla z pomyślnymi wynikami w porównaniu z tradycyjnymi metodami oceny histologicznej METAVIR8. W istniejącej literaturze brakuje jednak szczegółowych informacji na temat techniki i metodologii stosowania obrazowania SWE w przedklinicznych modelach NASH. Jak opisano powyżej, stłuszczenie wątroby jest jedną z kluczowych cech stanu NAFLD/NASH i jest ważnym etapem, w którym można rozważyć interwencję. Dlatego ocena akumulacji tłuszczu w wątrobie za pomocą metody obrazowania jest równie ważna, jak ocena zwłóknienia wątroby w przedklinicznych modelach NASH/NAFLD.

Technika ultrasonograficzna znana jako wskaźnik HR, stosunek jasności tkanek wątroby do jasności kory nerkowej, została użyta jako zastępczy marker stłuszczenia w klinice9,10. Podejście to nie było jednak szeroko stosowane w przedklinicznych modelach zwierzęcych NAFLD/NASH. W artykule opisano metodę pomiaru elastyczności oraz wskaźnika HR jako zastępczego markera odpowiednio zwłóknienia wątroby i stłuszczenia w szczurzym modelu NAFLD/NASH z niedoborem choliny i dietą wysokotłuszczową (CDAHFD). Model ten wywołuje szybkie stłuszczenie, zapalenie wątroby i zwłóknienie, które można zmierzyć w ciągu 6 tygodni u myszy11. Wykazano, że dodanie cholesterolu (1%) do tej diety sprzyja fibrogenezie u szczurów12, co czyni ten model odpowiednim kandydatem do badań walidacyjnych obejmujących obrazowanie fali poprzecznej. Ogólnie rzecz biorąc, ta technologia obrazowania może być również stosowana w szerokim zakresie modeli/diet NASH, w których stłuszczenie i/lub zwłóknienie jest punktem końcowym będącym przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) firmy Pfizer i przeprowadzone w międzynarodowym akredytowanym obiekcie AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care).

1. Indukcja choroby

  1. Użyj samców szczurów rasy Wister Han (150-175 g; ~ 6-7 tygodni; łącznie 40 szczurów), które są wolne od znanych patogenów przybyszowych szczurów. Szczury trzyma się parami w indywidualnie wentylowanych klatkach z papierową ściółką (patrz Tabela Materiałów) i utrzymują je w temperaturze 22 ± 1 °C, wilgotności względnej 40-70% w cyklu 12:12 godzin światła i ciemności.
  2. Umieść szczury o wadze 150-175 g (~6-7 tygodni) na diecie wysokotłuszczowej z niedoborem choliny z 1% cholesterolem (n = 20) lub standardowej karmę dla gryzoni laboratoryjnych (n = 20) w zależności od projektu badania.
    UWAGA: W tym badaniu włączono łącznie 40 szczurów z 20 zwierzętami w grupie. Pod koniec6 tygodnia połowa kohorty z każdej grupy została poddana sekcji zwłok w celu analizy histologicznej próbek wątroby w połowie badania. Tak więc wielkość próby wynosiła 10 zwierząt w grupie dla 9. i 12. tygodniowego punktu czasowego.

2. Konfiguracja instrumentu

  1. Ustaw obszar obrazowania w następujący sposób: dołącz rozgrzaną powierzchnię, aby utrzymać zwierzę w cieple podczas obrazowania (c w Rysunek 1) oraz zabezpieczony stożek nosowy do znieczulenia wziewnego do podawania znieczulenia wziewnego w celu utrzymania płaszczyzny znieczulenia przez cały zabieg (b w Rysunek 1).
  2. Użyj uchwytu sondy ultradźwiękowej, aby ułatwić przenoszenie sondy ultradźwiękowej w żądane miejsce i zapobiec spoczywaniu sondy na zwierzęciu.
    1. Użyj podgrzanego żelu ultradźwiękowego na skórze, na której pozyskiwany jest obraz ultrasonograficzny.
    2. Przez cały czas trwania procedury należy utrzymywać następujące ustawienia, które można regulować na ekranie dotykowym: Moc akustyczna 0,0 dB; Tuner tkanek 1540 m/s; Zakres dynamiki 60 dB; Zakres elastyczności (dla trybu SWE) < 30 kPa.
  3. Przymocuj sondę ultradźwiękową do systemu szynowego w specjalistycznym uchwycie (a w Rysunek 1).
  4. Włącz instrument i pozwól mu się uruchomić. Po włączeniu monitora zwróć uwagę na obraz trybu B ze szczegółami podłączonego przetwornika.

3. Przygotowanie przedmiotu

  1. Upewnij się, że zwierzęta są na czczo co najmniej 4 godziny przed zabiegiem obrazowania, aby treść jelitowa nie zakłócała akwizycji obrazu.
    1. Po co najmniej 4 godzinach postu umieścić szczura w komorze indukcyjnej znieczulenia izofluranem, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu znieczulenia, potwierdzonego brakiem reakcji na szczypanie palca. Wystaw zwierzęta na działanie 3-5% izofluranu przez 3-5 minut w celu wywołania znieczulenia.
    2. W celu znieczulenia podtrzymującego należy utrzymywać zwierzęta poniżej 2-3% izofluranu podczas pozyskiwania obrazu. Zastosuj maść okulistyczną, aby chronić oko przed wysuszeniem podczas znieczulenia.
  2. Po uzyskaniu znieczulenia wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je na ciepłym kocu cyrkulacyjnym z gorącą wodą. Umieść znieczulający stożek nosowy na pysku i ogol zwierzę po prawej stronie, od klatki piersiowej do miednicy. Użyj chemicznego kremu do depilacji, aby usunąć wszystkie pozostałe włosy w tym obszarze.
  3. Po usunięciu sierści umieść zwierzę w lewej pozycji bocznej z górnymi łapami przyklejonymi taśmą nad głową na ciepłej platformie obrazowania (Rysunek 3A).
  4. Naciśnij przycisk Pacjent na tablicy sterowniczej przyrządu i zidentyfikuj osobę badaną zgodnie z projektem badania.
    1. Otwórz funkcję klawiatury w instrumencie, dotykając ikony na ekranie dotykowym. Wpisz nazwy zgodnie z potrzebami.
    2. Dotknij opcji Wyjdź, aby wyjść z ekranu z nazwą pacjenta. Zwróć uwagę, że tryb B otwiera się ponownie na monitorze.

4. Akwizycja obrazu do pomiaru wskaźnika wątrobowo-nerkowego (HR)

  1. Nałóż niewielką ilość podgrzanego żelu ultradźwiękowego na depilowany obszar skóry zwierzęcia.
  2. Przesuń sondę ultradźwiękową tak, aby dotknęła pokrytego żelem obszaru obiektu (Rysunek 3B). Gdy na monitorze pojawi się obraz narządów wewnętrznych pacjenta w trybie B na żywo, przesuń sondę ultrasonograficzną na obszar nieco powyżej biodra, tuż równolegle do kręgów lędźwiowych (płaszczyzna strzałkowa).
  3. Korzystając z wyświetlacza trybu B na monitorze, zlokalizuj prawą nerkę, identyfikując dużą tętnicę nerkową i separację kory/rdzenia (Rysunek 4A). Ponadto obserwuj część wątroby w jednej płaszczyźnie obrazu.
    1. Upewnij się, że artefakty obrazu, takie jak cienie i pęcherzyki powietrza, są niewielkie lub nie ma ich wcale.
  4. Zmierz współczynnik trybu B, aby uzyskać wskaźnik HR.
    1. Upewnij się, że zarówno kora nerkowa, jak i miąższ wątroby znajdują się w tej samej płaszczyźnie ostrości. W razie potrzeby dostosuj ostrość i kontrolę wzmocnienia, aby uzyskać wyraźny obraz.
      1. Wyreguluj ostrość, obracając pokrętło ostrości na panelu sterowania. Dostosuj wzmocnienie, naciskając raz przycisk Auto TGC.
    2. Naciśnij Freeze na panelu sterowania. Upewnij się, że zwierzę znajduje się między oddechami podczas zamrażania ekranu, aby uniknąć rozmytych obrazów.
    3. Po zamrożeniu ekranu dotknij opcji Narzędzia pomiarowe na ekranie dotykowym. Wybierz Współczynnik w trybie B, wbudowane narzędzie, które mierzy względną jasność tkanki z wybranego obszaru zainteresowania. Utwórz okrąg o średnicy 2 mm, aby wybrać obszar zainteresowania (ROI). Dostosuj rozmiar okręgu, przesuwając palcem wzdłuż zewnętrznej krawędzi trackballa na panelu sterowania.
    4. Umieść okrąg o średnicy 2 mm na obrazie wątroby ROI, który powinien znajdować się po prawej stronie nerki. Zidentyfikuj tkankę wątroby na podstawie jej jednorodnej echogeniczności i gładkiego konturu.
    5. Gdy okrąg znajdzie się na swoim miejscu, naciśnij przycisk Wybierz na panelu sterowania i obserwuj nowy okrąg, który się pojawi.
    6. Dostosuj rozmiar nowego koła do 2 mm i umieść go na obrazie kory nerkowej. Upewnij się, że głębokość okręgów na wątrobie i korze nerek jest taka sama. Po umieszczeniu na miejscu naciśnij przycisk Select na panelu sterowania. Obserwuj, że wbudowane narzędzie systemowe wyświetla wskaźnik tętna jako współczynnik w trybie B.
    7. Naciśnij Zapisz obraz, aby zapisać obraz, i obserwuj zapisane obrazy, które pojawiają się jako miniatury po prawej stronie monitora.
    8. Naciśnij przycisk Zamrożenie na panelu sterowania, aby odblokować obraz i powrócić do obrazu w trybie Live B.
  5. Powtórz pomiar współczynnika w trybie B 3 razy na różnych głębokościach i płaszczyznach tkanki. Oblicz średnią z tych trzech współczynników trybu B dla każdego zwierzęcia i punktu czasowego.

5. Akwizycja obrazu dla elastografii fali poprzecznej

  1. Przesuń sondę poprzecznie w prawym obszarze podżebrowym, aby zlokalizować wątrobę w trybie B. Zlokalizuj obszar wątroby, który jest w większości miąższem i jest wolny od dużych naczyń krwionośnych, takich jak żyła wrotna i tętnica wątrobowa. Po znalezieniu wolnego obszaru wątroby wygeneruj mapę elastyczności na ścinanie tkanki, naciskając przycisk SWE na panelu sterowania.
  2. Dostosuj rozmiar i położenie pudełka SWE poniżej torebki wątrobowej w obszarze wolnym od cieni. Zidentyfikuj kapsułkę jako jasną linię echogeniczną w pobliżu górnej części wątroby.
  3. Zwróć uwagę, że skrzynka SWE przechodzi w kolorową mapę w ciągu 5-10 sekund. Gdy pudełko jest pełne i stabilne, naciśnij przycisk Zamroź na panelu sterowania, gdy zwierzę znajdzie się między oddechami.
    UWAGA: Minimalna ilość pokrycia pudełka powinna wynosić 60-80%, aby dokładnie ocenić elastyczność wątroby.
  4. Na ekranie dotykowym dotknij QBox, wbudowanego narzędzia systemowego, które oblicza elastyczność na podstawie zwrotu z inwestycji na mapie sprężystości fali tnącej. Zwróć uwagę na okrąg i pole danych, które pojawiają się na monitorze. Dostosuj pozycję QBox, dotykając ikony pozycji na ekranie dotykowym, aby uzyskać żądaną konfigurację.
  5. Dostosuj rozmiar okręgu do 3 mm, przesuwając palcem wzdłuż zewnętrznej krawędzi trackballa na panelu sterowania. Za pomocą trackballa umieść okrąg w obszarze wolnym od cienia o jednolitej kolorystyce (Rysunek 5A,B). Należy uważać, aby uniknąć znanych obszarów sztywności, takich jak naczynia krwionośne lub torebka wątroby, a także krwawienia z tych struktur.
  6. Po znalezieniu odpowiedniego obszaru naciśnij przycisk Zapisz obraz na panelu sterowania, aby zapisać obraz. Powtórz tę procedurę 3 razy w różnych obszarach wątroby. Przesuwaj sondę w górę iw dół lub na boki brzucha, aby zebrać obrazy zmapowane przez SWE z różnych obszarów wątroby.
  7. Po zebraniu wszystkich obrazów naciśnij przycisk Zakończ egzamin na panelu sterowania i zanotuj ekran informacji o pacjencie, który pojawi się na monitorze.
  8. Usuń taśmę z łap zwierzęcia, zetrzyj nadmiar żelu i usuń zwierzę ze sceny obrazowania. Pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu w ciepłej, suchej klatce, aż do całkowitego wyzdrowienia. Monitoruj każde zwierzę, aby zapewnić pełne wyzdrowienie po znieczuleniu, na co wskazuje jego zdolność do utrzymania pozycji leżącej mostka
  9. Powtórz kroki w sekcjach 4-5 dla każdego zwierzęcia w kohorcie, które ma być zobrazowane.

6. Pobieranie i analiza danych obrazowych

  1. Po zebraniu obrazów dla wszystkich zwierząt wyłącz znieczulenie.
  2. Aby pobrać dane obrazu z urządzenia, naciśnij przycisk Review na panelu sterowania i obserwuj wszystkie skany wykonane na tym urządzeniu, które pojawiają się na monitorze. Wyszukaj żądane skany za pomocą okna wyszukiwania w górnym rogu ekranu.
  3. Wybierz wszystkie skany potrzebne do analizy danych, zaznaczając pole obok imienia i nazwiska pacjenta za pomocą trackballa i przycisku Wybierz. Po podświetleniu wszystkich potrzebnych skanów wybierz opcję Eksportuj pliki JPEG na ekranie dotykowym. Eksportuj dane na dysk sieciowy lub przenośny dysk uniwersalnej magistrali szeregowej (USB). Znajdź porty USB z tyłu instrumentu.
  4. Po wyeksportowaniu plików otwórz poszczególne pliki jpg z każdego skanowania na komputerze stacji roboczej. Obserwuj wszystkie dane po prawej stronie obrazu: Współczynnik trybu B - zbierz liczbę współczynnika B; Q Box - zbiera średnią wartość sprężystości (kPa).
  5. Wprowadź wszystkie dane do arkusza kalkulacyjnego lub innego oprogramowania do zarządzania bazą danych i wykonuj żądane analizy statystyczne
    6. .

7. Analiza histologiczna próbek wątroby

  1. Pod koniec 6 tygodnia należy przeprowadzić sekcję zwłok połowy kohorty z każdej grupy w celu przeprowadzenia analizy histologicznej próbek wątroby w połowie badania. Podobnie, poddaj eutanazji resztę kohorty zwierząt i zbierz próbki wątroby do analizy histologicznej w 12. tygodniu.
  2. W przypadku barwienia ORO należy umocować skrawki wątroby w 10% neutralnie buforowanej formalinie i zakonserwować je sacharozą, używając schłodzonego 30% roztworu sacharozy co najmniej przez noc. Osadź sekcje w związku o optymalnej temperaturze cięcia i przekrój je kriogenicznie na naładowanych szkiełkach, aby przygotować się do barwienia ORO.
  3. Umieść kriosklekcje w 100% glikolu propylenowym na 2 minuty, a następnie przez noc inkubuj w 0,5% roztworze OR. Po wyjęciu z roztworu ORO rozdzielić skrawki w 85% glikolu propylenowym przez 1 minutę, spłukać w wodzie dejonizowanej i przeciwbarwić modyfikacją Hematoxylin-Lillie Mayera przez 1 minutę.
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą wodnego podłoża montażowego i wysusz je w temperaturze pokojowej.
  4. W przypadku PSR należy odparafinować utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie szkiełka wątroby, umieścić je na noc w płynie Bouin, a następnie zabarwić za pomocą automatycznego barwnika szkiełkowego zgodnie z protokołem producenta z kilkoma zoptymalizowanymi krokami (1% kwas fosfomolibdenowy przez 5 minut; 0,1% Syriusza Czerwona w nasyconym kwasie pikrynowym przez 90 min; 2 x 30 s prać w 0,5% kwasie octowym). Automatycznie odwadniaj prowadnice, a następnie zamontuj je za pomocą stałego nośnika montażowego.
  5. Za pomocą cyfrowego skanera mikroskopowego można rejestrować obrazy preparatów barwionych metodą ORO i PSR w 20-krotnym powiększeniu, zapisywać je w formacie .svs i przechowywać w bazie danych obrazów menedżera slajdów.
  6. Analizuj obrazy za pomocą niestandardowych algorytmów utworzonych w cyfrowym oprogramowaniu patologicznym. Jednolicie stosuj cyfrowe aplikacje patologiczne z parametrami progowymi do identyfikacji i ilościowego określania obszaru skrawków wątroby, a także obszarów barwionych ORO i PSR. Eksportuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia procentu powierzchni.

8. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadź analizę statystyczną danych obrazowych za pomocą dwukierunkowej ANOVA, korzystając z testu wielokrotnych porównań firmy Sidak, aby ocenić różnicę między grupami w różnych punktach czasowych. Załóżmy, że różnice między grupami są istotne dla wartości prawdopodobieństwa p ≤ 0,001. Ponadto należy wykonać korelację odczytów obrazowych z analizami histologicznymi.
  2. Użyj statystyk nieparametrycznych, aby przeanalizować wyniki analizy histologicznej z tego badania. Wartości grupy należy podać jako medianę ± półprzedział międzykwartylowy (sIQR). Załóżmy, że różnice między grupami są istotne dla wartości prawdopodobieństwa p ≤ 0,001. Użyj testu Manna-Whitneya, aby porównać ilość barwienia histochemicznego PSR i ORO między różnymi grupami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z cech charakterystycznych zwierząt karmionych CDAHFD jest stłuszczenie. Nagromadzenie tłuszczu w wątrobie zmienia właściwości echogeniczne tkanki, które można określić ilościowo, mierząc jasność wątroby i normalizując ją do jasności kory nerkowej na podstawie obrazu w trybie B wykonanego w tej samej płaszczyźnie. Wartość ilościowa jest wyrażona jako wskaźnik HR, który jest pośrednią miarą stłuszczenia. W Rysunek 4A, reprezentatywny obraz wątroby od zwierzęcia kontrolnego pokazuje w pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie oparte na ultradźwiękach, w tym SWE, może być nieocenionym narzędziem do podłużnej oceny stłuszczenia i sztywności wątroby w przedklinicznych modelach NAFLD/NASH. W artykule opisano szczegółowe metodologie pozyskiwania wysokiej jakości obrazów wątroby w trybie B oraz SWE w celu pomiaru wskaźnika HR i elastyczności przy użyciu szczurzego modelu NASH wywołanego dietą CDAHFD. Ponadto uzyskane wyniki wykazują doskonałą korelację wskaźnika HR i elastyczności ze złotym standardem oceny histologicznej tkanki wątroby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Pfizer, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Zespołowi Operacyjnemu Medycyny Porównawczej firmy Pfizer za ciężką pracę nad opieką i zapewnieniem zdrowia badanych zwierząt, a także za pomoc w niektórych technikach. Podziękowania należą się również Danielle Crowell, Gary'emu Seitisowi i Jennifer Ashley Olson za ich pomoc w przetwarzaniu tkanek do analiz histologicznych. Ponadto autorzy pragną podziękować Julicie Ramirez za recenzowanie i przekazywanie cennych informacji zwrotnych podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
elastografii fali poprzecznejAixplorerSupersonic Imagine
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 PrzetwornikSupersonic Imaginedo elastografii fali poprzecznej
Klatki dla szczurówAlpha-dri Skaner
Aperio AT2Leica BiosystemsDigital Pathology Brightfield
Compac 6 System anestezjologicznyVetEquipi system dozowania. Można jednak zastosować dowolny system podawania znieczulenia.
Zarządzanie bazą danych imagerówLeica BiosystemsPatologia cyfrowa
Mayer's HematoxilinDako/AgilentH& E Barwienie/Histologia Kościół
Nair& DwightHair remover
Oil Red O roztwórPoly ScientificBarwienie lipidów / Histologia
Picrosirius Red Stain (PSR)Rowley BiochemicalF-357-2Collagen Stain/Histology
Puralube Maść okulistycznaDechra ProduktSmarowanie zapobiegające suchości oczu podczas znieczulenia
Tissue-Tek Prisma PlusSakura Finetek USAZautomatyzowany barwnik do szkiełek
Oprogramowanie VISIOPHARMCyfrowe oprogramowanie
Research DietsA06071309iDieta
Wistar Han ratsCharles River Laboratories
Przyrząd do Przetwornik Skaner Waporyzator anestezjologiczny weterynaryjny patologiczne Visiopharm indukująca NASH Purina 5053 Kontrola karmy zwierzęcej Stacja obrazowania Vevo Fujifilm VisualSonics Stacja obrazowania Vevo służy do trzymania przetwornika ultradźwiękowego podczas obrazowania.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
  2. Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
  3. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).
  4. Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
  5. Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
  6. Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
  7. Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
  8. Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
  9. Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
  10. Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
  11. Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
  12. Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
  13. Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1(2018).
  14. Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
  15. Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
  16. Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie ultrasonograficznemodel szczura z NAFLDmodel szczura z NASHobrazowanie w knienia w trobyindeks w trobowo nerkowyultrasonografia w trybie Bpomiar st uszczenia w trobybarwienie Oil Red Obarwienie Picrosirius Red

Powiązane artykuły