Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Summary

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Abstract

Mikroskopia krioelektronowa (cryoEM) to potężna technika określania struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą analizy pojedynczych cząstek (SPA). Cały proces polega na i) zeszkleniu próbki w cienkiej warstwie umieszczonej na siatce krioelektromagnetycznej; (ii) badanie przesiewowe próbki w celu oceny rozmieszczenia cząstek i jakości lodu; (iii) jeżeli siatka jest odpowiednia, gromadzenie zbioru danych dotyczących pojedynczych cząstek do analizy; oraz iv) przetwarzanie obrazu w celu uzyskania mapy gęstości EM. W tym protokole znajduje się przegląd każdego z tych kroków, ze szczególnym uwzględnieniem zmiennych, które użytkownik może modyfikować podczas przepływu pracy, oraz rozwiązywania typowych problemów. W związku z tym, że zdalna obsługa mikroskopu staje się standardem w wielu obiektach, opisane zostaną różne warianty protokołów obrazowania, które pomagają użytkownikom w wydajnej pracy i obrazowaniu, gdy fizyczny dostęp do mikroskopu jest ograniczony.

Introduction

CryoEM
Aby badać życie na poziomie molekularnym, musimy zrozumieć jego strukturę. Dostępnych jest wiele technik badania struktury białek, takich jak NMR, krystalografia rentgenowska, spektrometria mas i mikroskopia elektronowa (EM). Do tej pory większość struktur zdeponowanych w Banku Danych Białek (PDB) została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Jednak od ~2012 r. mikroskopia krioelektronowa (cryoEM) stała się główną techniką określania struktury białek, a jej zastosowanie gwałtownie wzrosło. Całkowita liczba map EM zdeponowanych w Electron Microscopy Databank (EMDB) (stan na grudzień 2020 r.) wyniosła 13 421 w porównaniu z 1 566 w 2012 r. (Rysunek 1, www.ebi.co.uk). W 2012 r. liczba współrzędnych atomowych modelowanych na mapach gęstości krioEM, zdeponowanych w PDB wynosiła zaledwie 67, ale do grudnia 2020 r. zdeponowano do tej pory 2309 struktur, co stanowi 35-krotny wzrost. Ten podstawowy wzrost jakości i ilości tworzonych map gęstości krioEM, czasami określany jako "rewolucja rozdzielczości"¹, był spowodowany zbiegiem postępów w wielu obszarach: rozwoju nowych kamer do obrazowania, znanych jako bezpośrednie detektory elektronów; nowe oprogramowanie; i bardziej stabilne mikroskopy^2,3,4.

Rysunek 1: Skumulowane zgłoszenia do EMDB od 2012 r. do grudnia 2020 r. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza pojedynczych cząstek (SPA) to potężne narzędzie do generowania wglądu biologicznego w szerokiej gamie typów próbek poprzez wyjaśnienie struktur o wysokiej rozdzielczości izolowanych kompleksów^{5, 6} w tym wirusy^7,8, białka błonowe^{9, 10}, zespoły spiralne¹¹ oraz inne dynamiczne i niejednorodne kompleksy makromolekularne^{12, 13}, których rozmiary różnią się o rzędy wielkości (od 39 kDa^{14, 15} do dziesiątek megadaltonów). W tym miejscu opisano protokół standardowego rurociągu dla cryoEM SPA od próbki do struktury.

Przed rozpoczęciem tego rurociągu, oczyszczona próbka powinna zostać poddana analizie biochemicznej, aby ocenić jej szanse na dalszy sukces. Przygotowanie odpowiedniej próbki jest prawdopodobnie największą barierą dla SPA, szczególnie w przypadku przejściowych i niejednorodnych (zarówno składowych, jak i konformacyjnych) kompleksów. Preparat kompleksu makromolekularnego powinien zawierać jak najmniej zanieczyszczeń, w stężeniu wystarczającym do uzyskania wielu cząstek na każdym mikrozdjęciu krioelektromagnetycznym oraz w składzie buforowym dobrze nadającym się do analizy krioelektromagnetycznej. Niektóre składniki buforowe, w tym sacharoza, glicerol i wysokie (~> 350 mM stężenia soli, w zależności od wielkości próbki, właściwości i innych składników buforowych) mogą zakłócać proces witryfikacji lub zmniejszać stosunek sygnału do szumu na obrazach, utrudniając określenie struktury¹⁶.

Zazwyczaj, jako minimum, chromatografia wykluczająca rozmiar (SEC) i analiza żelowa SDS-PAGE powinny być używane do oceny czystości próbki^{17, 18,} ale dichroizm kołowy, testy funkcjonalne, SEC w połączeniu z wielokątowym rozpraszaniem światła i testy stabilności termicznej są użytecznymi narzędziami do analizy jakościowej preparatów kompleksów makromolekularnych przed analizą krioEM. Jednak wyniki tych analiz biochemicznych mogą dostarczyć niewiele informacji na temat niejednorodności strukturalnej próbki i jej zachowania na siatce krioelektromagnetycznej. Z tego powodu EM o ujemnym zabarwieniu jest rutynowo używane jako szybkie, tanie i potężne narzędzie do oceny niejednorodności składu i konformacji, a tym samym dobry sposób na ustalenie, która frakcja elucyjna z oczyszczania jest najbardziej obiecująca, lub badanie przesiewowe różnych kompozycji^{19, 20}. Po zidentyfikowaniu obiecującej próbki możemy przejść do rurociągu krioEM SPA. Ujemne zabarwienie nie zawsze pokrywa się z późniejszymi wynikami obserwowanymi w cryoEM; czasami próbka wygląda słabo przez ujemne zabarwienie, ale poprawia się, gdy jest widoczna w szklistym lodzie w cryoEM. W przeciwieństwie do tego, czasami próbki wyglądają doskonale na etapach barwienia ujemnego, ale wymagają dalszej optymalizacji po przejściu do cryoEM. Jednak w większości przypadków negatywna plama stanowi przydatny etap kontroli jakości.

Witryfikacja
Trudne warunki panujące w systemie próżniowym mikroskopu elektronowego powodują zarówno odwodnienie, jak i uszkodzenia radioaktywne nieutrwalonych próbek biologicznych²¹. Dlatego, aby zobrazować próbkę w stanie podobnym do natywnego, próbka biologiczna musi zostać zachowana przed obrazowaniem. W przypadku oczyszczonych preparatów kompleksów wielkocząsteczkowych witryfikacja jest metodą z wyboru, która umożliwia jej wizualizację za pomocą krioEM przy jednoczesnym zachowaniu szczegółów atomowych kompleksu. Odkrycie witryfikacji jako metody przygotowania próbek było fundamentalnym postępem w mikroskopii elektronowej próbek biologicznych, za który Dubochet został uhonorowany Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 2017 roku. Witryfikacja próbki polega na utworzeniu cienkiej warstwy roztworu zawierającej badaną próbkę, zwykle o grubości kilkudziesięciu nm, zawieszonej na podporze siatki krioEM. Cienka warstwa jest następnie niezwykle szybko zamrażana w kriogenie, takim jak ciekły etan, w temperaturze ~-175 °C. Szybkość zamarzania wynosi ~10⁶ °C/s, na tyle szybko, że tworzy się amorficzny lub szklisty lód, zawieszając próbkę w cienkiej, stałej warstwie²².

Początkową zmienną do rozważenia jest wybrana obsługa siatki cryoEM²³. Siatka EM zazwyczaj składa się z amorficznej folii węglowej z perforacją (regularną lub nieregularną) nad strukturą nośną. Konstrukcja nośna to zazwyczaj okrągła metalowa siatka o średnicy 3,05 mm, zwykle wykonana z miedzi, ale można użyć innych metali, takich jak złoto lub molibden (który ma preferowane właściwości rozszerzalności cieplnej²⁴). Czasami w poprzek siatki nakładane jest dodatkowe cienkie, ciągłe podparcie, takie jak grafen, tlenek grafenu lub cienka (~1-2 nm) amorficzna warstwa węgla. Podczas gdy standardowe siatki krioEM (najczęściej miedź o oczkach 400-200 z perforowanymi (1,2 μm okrągłe otwory oddzielone 1,3 μm (r1,2/1,3) lub 2 μm oddzielone 2 μm węgla (r2/2)) podparcia węglowego - chociaż dostępnych jest wiele różnych wzorów) były stosowane w zdecydowanej większości zgłoszonych do tej pory konstrukcji, Zgłoszono nowe technologie siatki o ulepszonej przewodności i zmniejszonym ruchu próbek²⁵. Wybrane siatki są poddawane czyszczeniu jarzeniowo-rozżarzonemu/plazmowemu, aby nadać im hydrofilowy charakter²⁶.

Po wyładowaniu jarzeniowym, następnym etapem jest tworzenie cienkiej warstwy. Ta cienka folia jest najczęściej tworzona przy użyciu bibuły filtracyjnej w celu usunięcia nadmiaru cieczy z siatki. Chociaż można to zrobić ręcznie, na rynku dostępnych jest wiele urządzeń do zamrażania wgłębnego, w tym Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) i CP3 (Gatan). Za pomocą tych urządzeń ~3-5 μL próbki w roztworze nakłada się na siatkę EM, a następnie usuwa nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej. Siatka, z zawieszoną na niej cienką folią, jest następnie zanurzana w ciekłym etanie chłodzonym ciekłym azotem (LN₂) do temperatury ~-175 °C. Po zamrożeniu siatka jest utrzymywana w temperaturze poniżej punktu dewitryfikacji (-137 °C) przed obrazowaniem i w jego trakcie.

Badanie próbek i zbieranie danych
Po zeszkleniu siatki krioelektromagnetycznej kolejnym etapem jest przesiewanie siatki w celu oceny jej jakości i określenia, czy siatka jest odpowiednia do gromadzenia danych o wysokiej rozdzielczości. Idealna siatka krioEM zawiera szklisty lód (w przeciwieństwie do lodu krystalicznego), którego grubość lodu jest wystarczająca, aby pomieścić najdłuższy wymiar próbki, dzięki czemu otaczający lód przyczynia się do jak najmniejszego szumu na wynikowym obrazie. Cząstki w lodzie powinny mieć rozmiar i (jeśli są znane) kształt zgodne z biochemią, a najlepiej być monodyspersyjne z losowym rozkładem orientacji cząstek. Wreszcie, siatka powinna mieć wystarczającą liczbę obszarów o wystarczającej jakości, aby spełnić żądaną długość zbierania danych. W zależności od próbki może to wymagać wielu iteracji witryfikacji i przesiewania, aż do uzyskania optymalnych siatek. Zarówno na szczęście, jak i na nieszczęście, istnieje ogromny zakres zmiennych, które można empirycznie przetestować w celu zmiany rozkładu cząstek na siatkach krioEM (przejrzane w^16,27). W tym manuskrypcie przedstawiono reprezentatywne wyniki dla projektu białka błonowego¹⁰.

Po zidentyfikowaniu odpowiedniej siatki, zbieranie danych może być kontynuowane. Kilka modeli kriotransmisyjnych mikroskopów elektronowych do próbek biologicznych jest zoptymalizowanych pod kątem automatycznego zbierania danych o wysokiej rozdzielczości. Zazwyczaj dane zbierane są na instalacjach 300 kV lub 200 kV. Automatyczne gromadzenie danych można osiągnąć za pomocą oprogramowania, w tym EPU (Thermo Fisher Scientific)²⁸, Leginon²⁹, JADAS³⁰ i SerialEM^{31, 32}. Zautomatyzowane gromadzenie danych za pomocą nowoczesnych detektorów zwykle skutkuje terabajtami (TB) surowych danych w okresie 24 godzin (średni rozmiar zestawów danych wynosi ~ 4 TB).

Ze względu na ograniczenia związane z COVID-19 obowiązujące na większości świata (czas pisania grudnia 2020), wiele ośrodków mikroskopowych przeniosło się do oferowania zdalnego dostępu. Po załadowaniu siatek do automatycznego podajnika mikroskopu, akwizycja danych może być prowadzona zdalnie.

Przetwarzanie obrazów i budowanie modeli
Podczas gdy sesja zbierania danych może trwać zwykle 0,5-4 dni, późniejsze przetwarzanie obrazu może trwać wiele tygodni i miesięcy, w zależności od dostępności zasobów obliczeniowych. Standardem jest, że początkowe etapy przetwarzania obrazu, a mianowicie korekcja ruchu i szacowanie funkcji transferu kontrastu (CTF), odbywają się "w locie" ^{33, 34}. Do dalszego przetwarzania dostępnych jest mnóstwo pakietów oprogramowania. Cząstki są "wybierane" i ekstrahowane z mikrofotografii^{35, 36}. Po wyekstrahowaniu cząstek standardowym protokołem byłoby przetworzenie cząstek przez kilka rund klasyfikacji (zarówno w dwóch wymiarach (2D), jak i trzech wymiarach (3D) i/lub skupionych na określonych obszarach zainteresowania) w celu osiągnięcia jednorodnego podzbioru cząstek. Ten jednorodny podzbiór cząstek jest następnie uśredniany razem w celu uzyskania rekonstrukcji 3D. W tym momencie dane są często dalej korygowane w celu uzyskania najwyższej możliwej jakości mapy, na przykład poprzez udoskonalenie CTF, korekcję zniekształceń³⁷ i Bayesian polishing³⁸ . Wynikiem tego przetwarzania obrazu jest mapa krioelektromagnetyczna 3D próbki biologicznej będącej przedmiotem zainteresowania. Zakres rozdzielczości osiągnięty w "standardowym" zautomatyzowanym eksperymencie z pojedynczą cząstką z siatki o wystarczającej jakości, z danymi zebranymi w systemie mikroskopowym 300 kV, wynosi zwykle od 10 A do 2 A, w zależności od wielkości i elastyczności kompleksu białkowego. Z idealnym egzemplarzem, rozdzielczości ~1,2 A zostały teraz osiągnięte przy użyciu przepływów pracy SPA⁵. Chociaż protokół ten szczegółowo opisuje kroki w kierunku uzyskania mapy gęstości EM, gdy jest już w jej posiadaniu, można ją dalej interpretować poprzez dopasowanie i udoskonalenie modelu białka (jeśli rozdzielczość wynosi < 3,5 A) lub zbudowanie de novo³⁹. Dane związane z eksperymentami określania struktury mogą być deponowane w publicznych repozytoriach online, w tym na mapach gęstości EM (Bank Danych Mikroskopii Elektronowej)⁴⁰, wynikowe współrzędne atomowe (Bank Danych Białkowych)⁴¹ i surowe zestawy danych (Electron Microscopy Public Image Archive)⁴².

W tym protokole, jako przykładowy kompleks makromolekularny kompleks białkowy RagAB (~340 kDa) z Porphyromonas gingivalis jest używany jako przykładowy kompleks makromolekularny¹⁰ (EMPIAR-10543). Dla tych, którzy dopiero zaczynają przygodę z cryoEM, dostępne jest wsparcie dla próbek za pośrednictwem tego procesu od próbki do struktury, z zastrzeżeniem wzajemnej oceny, za pośrednictwem finansowanych programów dostępu, takich jak iNEXT Discovery i Instruct.

Protocol

1. Zeszklenie siatki

UWAGA: Dla wszystkich kroków w krokach 1 i 2 upewnij się, że wszystkie narzędzia są czyste, suche i mają temperaturę pokojową przed schłodzeniem ich do temperatury LN₂, używając świeżo zdekantowanego LN₂ w celu zmniejszenia zanieczyszczenia lodem. Jeśli to możliwe, pracuj w środowisku o kontrolowanej wilgotności < wilgotności względnej 20%. Przed rozpoczęciem pracy upewnij się, że masz odpowiednie środki ochrony osobistej i dokumentację BHP.

1. Upewnij się, że próbka, która Cię interesuje, jest gotowa do przygotowania próbki.
2. Wybierz odpowiednie kratki krioEM i upewnij się, że zostały one unieszkodliwione jako hydrofilowe za pomocą wyładowania jarzeniowego lub obróbki plazmowej. Dostępna jest szeroka gama systemów i wariantów protokołu, ale wszystkie obejmują umieszczenie kratek w systemie wyładowania jarzeniowego/czyszczenia plazmowego i uruchomienie programu, który przepompuje komorę do pożądanego poziomu próżni, przed wprowadzeniem do systemu określonej mieszaniny gazów/oparów chemicznych lub powietrza. Przez system przepływa prąd elektryczny, który jonizuje cząsteczki gazu i powoduje, że powierzchnia siatek staje się bardziej hydrofilowa.
3. Uruchom urządzenie do zamrażania wgłębnego w celu zeszklenia siatki, włączając system za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu i poczekaj, aż załaduje się ekran dotykowy.
4. Za pomocą dołączonego rysika lub palców w konsoli ustaw żądaną temperaturę pracy komory (dostępny zakres to 4-60 °C, zalecany dla większości makrocząsteczek 4-6 °C).
5. Napełnij nawilżacz 50 ml wody laboratoryjnej typu II za pomocą strzykawki, przez gumową rurkę na spodzie nawilżacza. Należy upewnić się, że usunięto powietrze uwięzione w strzykawce przed napełnieniem. Uważaj, aby nie przepełnić nawilżacza, w przeciwnym razie woda będzie wyciekać do komory. Po napełnieniu nawilżacza cofnij tłok strzykawki o 5-10 ml, aby utworzyć uszczelnienie próżniowe.
6. W konsoli ustaw żądaną wilgotność względną dla komory (dostępny zakres to 0-100%, zwykle używana jest wilgotność 95-100%). Pozostaw wilgotność ustawioną na "wyłączoną" aż do momentu bezpośrednio przed utworzeniem rusztu, aby komora nie była zbyt mokra.
7. Zaopatrz się w pęsetę do zamrażania wgłębnego i bibułę filtracyjną przyciętą do odpowiedniego rozmiaru, aby pasowała do podkładek, zakupioną lub za pomocą stempla do wycięcia otworu o odpowiednim rozmiarze.
8. Przygotuj kriogen do zamrażania wgłębnego.
   1. Umieść metalowy uchwyt na kriogeniczną siatkę, kubek kriogeniczny i metalowe nogi pająka w pojemniku na płyn chłodzący.
   2. Schłodzić pojemnik, napełniając komorę zewnętrzną LN₂. Utrzymuj komorę zewnętrzną uzupełnioną, aby zakryć górną część uchwytu pudełka z kriosiatką. Dodaj ~ 1 cm dodatkowego LN₂ do kubka kriogenicznego, aby wspomóc równowagę systemu do temperatury LN₂.
      UWAGA: Pierścień zapobiegający zanieczyszczeniom może być używany do ograniczania kondensacji wilgotnego powietrza wokół kubka kriogenicznego i prowadzącego do zanieczyszczenia chłodziwem kriogenicznym/etanem. Na ogół nie jest to wymagane w środowisku o kontrolowanej wilgotności. W przypadku korzystania z pierścienia zapobiegającego zanieczyszczeniom należy uważać, aby nie przepełnić pojemnika LN₂, ponieważ może on się rozlać, gdy pierścień zostanie wciśnięty do pojemnika w dalszej części procesu.
   3. Odczekaj 3-5 minut, aby zaobserwować gotowanie nóg pająka, a następnie odczekaj kolejne 3 minuty, aby upewnić się, że kubek kriogeniczny jest wystarczająco zimny, aby skondensować pożywkę witryfikacyjną.
9. Skroplić kriogen (ciekły etan) do kubka kriogenicznego.
   1. Weź rurkę butli z etanem z cienkimi rurkami i dyszą, aby dozować gaz. Idealna jest tutaj końcówka do pipety P200 z otworem otwieranym poprzez odcięcie samej końcówki za pomocą żyletki. Potrzebny jest szerszy otwór, aby zapobiec krzepnięciu etanu na końcówce i blokowaniu przepływu gazu.
   2. Upewnij się, że kubek kriogeniczny nie zawiera pozostałego LN₂, weź dyszę etanu i umieść ją w kubku kriogenicznym. Za pomocą regulatora butli z gazem uruchom niski przepływ i dozuj gaz kriogeniczny do kubka kriogenicznego, aby skroplić gaz. Końcówkę, z której przepływa gaz, należy przycisnąć bezpośrednio do ścianki pojemnika kriogenicznego, ale delikatnie przesuwaj ją do przodu iz powrotem, stukając o powierzchnię. Reguluj przepływ gazu, aby umożliwić niski, stały przepływ do rozpoczęcia kondensacji/skraplania w kontrolowany sposób w kubku kriogenicznym.
   3. Napełnij kubek tuż poniżej srebrnej krawędzi pająka i zatrzymaj przepływ gazu, a następnie ostrożnie odłącz przewód gazowy, aby uniknąć zanieczyszczenia otaczającego LN₂ etanem.
   4. Uzupełnij pojemnik płynu chłodzącego LN₂, bardzo uważając, aby nie rozlać go do ciekłego etanu.
   5. Pozostaw nogi pająka na miejscu na ~ 3-5 minut, aby upewnić się, że ciekły etan jest zrównoważony do wystarczająco niskiej temperatury. Kriogen zacznie wyglądać na mętny/lekko nieprzezroczysty. Oznacza to, że jest bliski punktu zamarzania. Na tym etapie użyj pęsety, aby usunąć pająka. Tak długo, jak LN₂ jest przechowywany w pojemniku otaczającym kubek kriogeniczny, etan pozostanie skroplony i będzie nadawał się do witryfikacji przez 1-2 godziny. Należy jednak dążyć do jak najszybszego zakończenia procedury, zwłaszcza w pomieszczeniach o niekontrolowanej wilgotności, aby zmniejszyć zanieczyszczenie lodem.
      UWAGA: Jeśli pająk wydaje się być "przyklejony", użyj metalowego przedmiotu, takiego jak nakrętka, i przytrzymaj za nogi pająka, aby je lekko rozgrzać, a następnie zdejmij nogi.
10. Przygotować urządzenie do zamrażania wgłębnego i akcesoria do witryfikacji próbki.
11. Dodaj skrzynki do przechowywania siatki do metalowego uchwytu skrzynki kriokratowej i przez cały czas trwania procedury upewnij się, że LN₂ jest uzupełniony do poziomu tuż powyżej poziomu skrzynek kratowych (zwykle co ~ 5 minut).
12. Na ekranie urządzenia do zamrażania wgłębnego, w polu Parametry procesu wprowadź wybrane parametry, w tym: czas osuszania (czas, w którym podkładki urządzenia do zamrażania wgłębnego się zejdą), siłę (odległość podkładek do bibuły od siatki, która zmienia gradient tworzenia się lodu) i sumę (ile razy podkładki do bibuły się spotkają). Wybierz te parametry w oparciu o indywidualne urządzenie do zamrażania wgłębnego i zachowanie makrocząsteczki. Typowe wartości to siła blot z zakresu od 0 do 5, czas blot od 1 do 6 s i suma blot równa 1. Typowy czas oczekiwania (czas między zainicjowaniem blot a jego rozpoczęciem) i czas drenażu (czas po osuszeniu przed zanurzeniem) wynosi 0-2 s.
    UWAGA: W zależności od preferencji użytkownika można wybrać dodatkowe opcje w sekcji Opcje, Różne, w tym Użyj pedału nożnego, aby przejść do następnego kroku przy każdym naciśnięciu, Pomiń transfer siatki (pomija ostatni krok, w którym ramię pęsety jest lekko uniesione), wyłącz wilgotność podczas procesu (podczas nakładania próbki zatrzymuje aktywne nawilżanie komory, co może utrudnić widoczność siatki) i Autoraise Ethanelift (łączy w sobie krok pęsety podnoszonej do komory i podnoszenia pojemnika z płynem chłodzącym - pomija krok Podnieś pojemnik na etan). Tutaj wszystkie te opcje są włączone.
13. Umieść pojemnik z płynem chłodzącym bezpiecznie na ruchomym ramieniu platformy pod komorą
14. Włóż świeżą bibułę na każde ramię bibuły, upewniając się, że plastikowe klipsy do pierścieni są zabezpieczone. Każda bibuła filtracyjna pozwoli na 16 blot (ramiona obracają bibułę). Naciśnij przycisk Resetuj papier do bibuły w sekcji Sterowanie.
15. Uruchom 1 pełny cykl procesu witryfikacji urządzenia do zamrażania wgłębnego, aby upewnić się, że każda ruchoma część zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami.
    1. Naciśnij (lub użyj pedału nożnego), aby umieścić nową siatkę, następnie Rozpocznij proces, następnie Przetwarzaj, a następnie Kontynuuj. Na tym etapie obserwuj, czy ramiona bibułki stykają się ze sobą zgodnie z oczekiwaniami.
16. Włącz nawilżacz. Wytwarzana będzie para wodna (o ile ustawiona wilgotność będzie wyższa niż aktualnie w komorze).
17. Interesujący nas okaz można teraz poddać witryfikacji. Użyj pedału nożnego lub umieść nową siatkę, a pręt zanurzający wyjdzie z komory, umożliwiając przymocowanie pęsety do uchwytu.
    1. Za pomocą pęsety do zamrażania wgłębnego podnieś żądaną siatkę cryoEM wyładowaną jarzeniowo/plazmową, zwracając uwagę, aby zanotować, która strona jest właściwą stroną do aplikacji próbki według producenta siatki. Podnieś siatkę za obręcz, uważając, aby uniknąć nadmiernego/niepotrzebnego kontaktu z pęsetą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie podpory. Zabezpiecz siatkę w pęsetie, przesuwając klips w dół do prążkowanej części pęsety. Siatka musi być bezpiecznie trzymana, ale klips nie powinien znajdować się zbyt głęboko w dół, ponieważ będzie stykał się z bibułkami, co doprowadzi do niepowtarzalnego osuszenia, a później pęseta będzie musiała być trzymana poniżej tego punktu podczas zwalniania klipsa.
    2. Umieść pęsetę do zamrażania wgłębnego przytrzymującą siatkę krioEM na ramieniu pneumatycznym prawą stroną skierowaną w stronę dominującej ręki. Konstrukcja pęsety i komory urządzenia do zamrażania wgłębnego jest taka, że próbka może być nakładana przez prawą lub lewą stronę komory, w zależności od ręczności użytkownika.
       UWAGA: Nakładanie próbki na różne strony o tych samych parametrach blottingu rzadko daje porównywalne wyniki, więc leworęczni badacze mogą być zmuszeni do dostrojenia parametrów blottingu niezależnie od swoich praworęcznych kolegów.
    3. Naciśnij Start Process, a siatka trzymana w pęsetie zostanie wniesiona do komory, a pojemnik na płyn chłodzący zostanie podniesiony.
    4. Naciśnij przycisk Proces, a pęseta przesunie siatkę do pozycji, w której można użyć pipety do nałożenia próbki na siatkę. Otwórz boczny port skierowany w stronę właściwej strony siatki i nałóż próbkę przez pipetowanie, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka siatki, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia wspornika siatki/wygięcia siatki, ale dozuj płyn na tyle blisko, aby kropla dozowała się na siatkę. Zazwyczaj stosuje się 3-5 μl.
18. Naciśnij przycisk Kontynuuj, a predefiniowane parametry użytkownika osuszą siatkę, a następnie zanurzą pęsetę z siatką zamontowaną w miseczce na płyn chłodzący w celu zeszklenia próbki. Pęseta będzie opadać w połączeniu z ramieniem przytrzymującym pojemnik z płynem chłodzącym i płyn chłodzący, utrzymując siatkę zanurzoną w kriogenie.
19. Przenieś siatkę z kubka kriogenicznego do skrzynki do przechowywania siatki zanurzonej w LN₂.
    1. Odłącz pęsetę od ramienia pęsety, bardzo uważając, aby nie zetknąć się z zeszkloną siatką z bokami kubka kriogenicznego. Wyreguluj uchwyt tak, aby pęseta była wygodnie trzymana. Tak szybko i ostrożnie, jak to możliwe, przenieś siatkę z kriogenu na LN_2. Jedną ręką przytrzymaj pęsetę palcami, a drugą ręką przesuń klips do góry, przytrzymując pęsetę zaciśniętą. Wyreguluj uchwyt i manipuluj siatką w skrzynce do przechowywania siatki.
    2. Powtarzaj kroki 1.10-1.19, aż wszystkie siatki zostaną utworzone (typowa sesja będzie obejmować wykonanie 4-12 siatek). Przechowuj wszystkie skrzynki do przechowywania siatki zawierające kratki w LN₂ dewar do następnych etapów.

2. Siatki tnące do załadunku do mikroskopu automatycznego ładowania

1. Przytnij siatki do zespołu automatycznej siatki zgodnie z wcześniej opisanym protokołem ²⁸.

3. Bezpieczne zdalne logowanie do mikroskopów

UWAGA: W związku z kontrolami COVID-19 w chwili pisania tego tekstu, ale także z obawami o środowisko związanymi z podróżami międzynarodowymi, coraz więcej ośrodków mikroskopowych oferuje usługi, w których użytkownik działa zdalnie. Metoda wdrożenia tego rozwiązania będzie się różnić w zależności od lokalnej konfiguracji IT każdego obiektu oraz potrzeb jego wewnętrznej i zewnętrznej społeczności użytkowników. Tutaj opisano proces zdalnego dostępu do krioEM-ów w eBIC i sterowania mikroskopem za pomocą oprogramowania EPU.

1. Zdalne logowanie do krioEM. Zdalne logowanie odbywa się za pośrednictwem oprogramowania NoMachine w celu uzyskania dostępu do komputera obsługi mikroskopu i jest skonfigurowane tak, aby zezwalać na dostęp tylko użytkownikom, którzy są zarejestrowani podczas wizyty za pośrednictwem danych logowania użytkownika FedID. Dostęp pozostaje aktywny tylko przez czas trwania sesji.
2. Otwórz NoMachine i rozpocznij nowe połączenie NX, aby nx-cloud.diamond.ac.uk z uwierzytelnianiem za pomocą hasła.
3. Otwórz połączenie i zaloguj się przy użyciu nazwy użytkownika fedid@fed.cclrc.ac.uk i hasła FedID. Kliknij dwukrotnie ikonę odpowiadającą odpowiedniemu mikroskopowi z dostępnych opcji, aby otworzyć połączenie z odpowiednim komputerem pomocniczym.
4. Wprowadź nazwę użytkownika clrc\FedID i hasło na ekranie logowania systemu Windows.
5. Otwórz oprogramowanie TeamViewer za pomocą ikony na pulpicie i połącz się z PartnerID: TEM za pomocą podanego hasła. Spowoduje to nawiązanie połączenia między komputerem pomocniczym a komputerem TEM. Przycisk Next Monitor (Następny monitor) na wstążce programu TeamViewer może służyć do przełączania między interfejsem użytkownika mikroskopu a oknem EPU.
6. Funkcje mikroskopu mogą być następnie sterowane przez użytkowników bezpośrednio przez interfejs EPU.

4. Ładowanie próbek do mikroskopu automatycznego podajnika i badanie przesiewowe pod kątem jakości lodu i próbki

UWAGA: W tej sekcji do badania próbek używany jest mikroskop z automatycznym ładowaniem i oprogramowaniem EPU, ale można to osiągnąć za pomocą innego oprogramowania oraz systemu bocznego wprowadzania i krioEMÓW innych producentów.

1. Załaduj przycięte siatki do automatycznego ładowania mikroskopu zgodnie z wcześniejszym opisem²⁸.
2. Na karcie automatycznego wczytywania w interfejsie użytkownika mikroskopu wyjdź z okna dialogowego Opcje za pomocą strzałki i naciśnij przycisk Inwentaryzacja . Spowoduje to sekwencyjne sprawdzenie każdej pozycji w kasecie, aby określić, czy wkład jest obecny. Zajęte miejsca będą oznaczone kolorem niebieskim. Jeśli wszystkie zajęte miejsca zostały zmapowane, naciśnij ponownie przycisk Ekwipunk, aby zatrzymać się po bieżącej pozycji, w przeciwnym razie pozostaw włączone, dopóki wszystkie zajęte miejsca nie zostaną zmapowane. Oznacz wszystkie zajęte miejsca szczegółami próbki w odpowiednich polach.
3. Podświetl siatkę, która ma zostać przeniesiona do kolumny mikroskopu, i kliknij przycisk Załaduj. Etykieta miejsca zmieni kolor z niebieskiego na żółty po pomyślnym załadowaniu siatki na scenę. Przejdź do przesiewania siatek.
   1. Otwórz oprogramowanie EPU. Na stronie Preparation (Przygotowanie) wybierz opcję Acquisition optics and settings (Optyka i ustawienia) , a następnie wybierz ustawienie wstępne Atlas (Atlas) z menu rozwijanego. Wybierz odpowiednie ustawienia ustawień wiązki (np. 64x nominalny mag, rozmiar plamki 5, Mikrosonda, z oświetlonym obszarem w równoległym zakresie dla detektora Falcon - więcej informacji na temat wyboru ustawień wiązki można znaleźć w ²⁸). Naciśnij przycisk Set, aby przesłać parametry do mikroskopu.
   2. Naciśnij Otwórz zawory kolumny i włóż FluScreen. Sprawdź, czy wiązka jest widoczna i wystarczająco rozproszona i wyśrodkowana, aby zakryć detektor. W razie potrzeby przejdź do cieńszego obszaru siatki za pomocą joysticka lub menu stage, aby sterować ruchami stage w X i Y.
   3. Podnieś FluScreen i zrób zdjęcie za pomocą przycisku Podgląd w EPU. Na podstawie uzyskanego obrazu dawkę można zwiększyć, przesuwając się do mniejszej liczby rozmiarów plamki i odwrotnie.
   4. W EPU przejdź do strony Atlas i naciśnij Nowa sesja. Wybierz opcję Format obrazu MRC i wprowadź odpowiednią nazwę folderu oraz lokalizację, w której chcesz zapisać sesję przesiewową, a następnie kliknij przycisk Apply (Zastosuj).
   5. Wybierz Screening (Selekcja) z menu po lewej stronie. Zaznacz pola wyboru obok każdej siatki, aby uzyskać montaż atlasu. Rozpocznij sesję przesiewową w EPU. Dla każdej zaznaczonej siatki zostanie zdobyty atlas, z liczbą dostępnych kwadratów siatki wymienionych po ukończeniu. Każdy atlas można wyświetlić, podświetlając go na stronie projekcji, wraz ze znacznikami przedstawiającymi kwadraty siatki o podobnej przewidywanej grubości lodu, pogrupowane według kolorów.
4. Po zakończeniu należy dokonać przeglądu zebranych atlasów i wskazać siatki odpowiednie do oceny jakości próbki przy większych powiększeniach (tj. takie, które mają odpowiednią liczbę kwadratów siatki, które nie są ani suche, ani zasłonięte grubym lodem). Podświetl wybraną siatkę w menu rastrowania EPU i kliknij przycisk Załaduj próbkę.
   1. Użyj ustawień wstępnych ustawień belki (patrz ²⁸, aby uzyskać wyjaśnienie ustawień belki wymaganych dla każdego etapu) i funkcji podglądu, aby bardziej szczegółowo zbadać żądane kwadraty siatki.
   2. Z menu rastrowania Atlas wybierz aktualnie załadowaną siatkę i przenieś scenę do kwadratu siatki zawierającego wypełnione otwory, klikając prawym przyciskiem myszy żądane miejsce na obrazie siatki i wybierając przejście do kwadratu siatki.
   3. Wróć do EPU, strony Przygotowanie i wybierz ustawienie wstępne GridSquare.
   4. Otwórz stronę EPU, Auto Functions i uruchom Auto-eucentric przez pochylenie stolika z ustawieniem wstępnym GridSquare, aby przesunąć próbkę na wysokość eucentryczną.
      UWAGA: Dostępna jest również funkcja autoeucentryczna z pochyleniem wiązki, która jest szybsza, ale zazwyczaj mniej dokładna niż autoeucentryczna z pochyleniem sceny.
   5. W obszarze EPU, Przygotowanie, utwórz nowy obraz podglądu GridSquare. Zwróć uwagę na różne wartości szarości na różnych otworach, wskazujące na różną grubość lodu. Przesuń scenę nad otwór za pomocą prawego przycisku myszy> przenieść scenę tutaj. Wybierz ustawienie predefiniowane Wysokość otworu/eucentryczności i Podgląd.
      UWAGA: W zależności od masy cząsteczkowej i kształtu interesującej cząstki, może być możliwe zidentyfikowanie jej przy powiększeniu Hole/Eucentric Height.
   6. Wybierz ustawienie wstępne Akwizycji danych i ustaw powiększenie, które umożliwia łatwą identyfikację cząstek (odpowiadające próbkowaniu obiektu o zwykle <2 A/piksel). Ustaw przesunięcie rozmycia na ~-3 do -5 μm przy dawce elektronów ekspozycji ~40-80 e^-/ Ų.
5. Wykonaj iterację przez kroki opisane w punkcie 4.4, aby ocenić zakres grubości lodu pod kątem rozkładu cząstek, orientacji i zanieczyszczenia w siatce. Rozkład cząstek może się różnić w pobliżu krawędzi w stosunku do środka otworu, dlatego ważne jest, aby badać różne miejsca z otworem.
6. Prześwietl wszystkie siatki, które są obiecujące z atlasów, jako posiadające wystarczającą liczbę kwadratów siatki. Albo należy je przechowywać w mikroskopie i przystępować do akwizycji danych za pomocą EPU, albo wyładować próbki z mikroskopu i przechowywać w LN₂ do czasu zaplanowania zbierania danych.

5. Zbieranie danych krioEM pojedynczych cząstek (z naciskiem na zdalną obsługę)

UWAGA: Szczegółowy protokół pozyskiwania danych za pomocą EPU jest opisany w podręczniku producenta i gdzie indziej²⁸. W tym miejscu podkreślono modyfikacje tego protokołu do obsługi zdalnej (a mianowicie ograniczenie wykorzystania paneli ręcznych do wykonywania zadań i korzystanie z alternatyw opartych na oprogramowaniu).

1. O ile nie został on już zebrany podczas sesji, zbierz Atlas do siatki.
2. Zdefiniuj każde z ustawień wstępnych belki zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami projektu.
3. Wykonaj kalibrację przesunięcia obrazu²⁸.
4. Skonfiguruj sesję EPU.
   1. W EPU wybierz stronę EPU, a następnie Ustawienia sesji, wybierz Nowa sesja, a następnie Nowa w preferencjach.
   2. Wybierz pozycję Nowa sesja, pojawi się wyskakujące okienko z opcją użycia poprzednich ustawień. Tak spowoduje automatyczne załadowanie ustawień z poprzedniego EPU (tj. nośnika próbki, zakresu rozmycia, ustawień autofokusa, typu siatki) do bieżącej sesji EPU. Wybranie opcji Nowy w preferencjach umożliwia użytkownikowi wybranie pliku z zapisanymi preferencjami (tj. zakres ostrości, ustawienia autofokusa, typ siatki), a informacje te zostaną wstępnie załadowane do EPU.
   3. Wpisz nazwę sesji czymś informacyjnym. Lokalna placówka może zasugerować konwencję nazewnictwa.
   4. W polu Type (Typ) wybierz opcję Manual (Ręcznie).
   5. W trybie Akwizycja wybierz dokładne centrowanie otworów lub szybszą akwizycję.
   6. W polu Format obrazu wybierz żądany format.
   7. Wybierz odpowiedni folder przechowywania, a EPU utworzy katalog z nazwą sesji.
   8. Wybierz odpowiedni nośnik próbki, w zależności od rodzaju siatki i stosowanych odstępów między otworami (np. Quantifoil 1.2/1.3) i naciśnij Zastosuj. Protokół ten opisuje proces generowania szablonu dla regularnej tablicy otworów
5. Wybierz początkowy kwadrat siatki i ustaw szablon przejęcia.
   1. Idź Kwadrat zaznaczenia, jeśli wszystkie kwadraty są zielone, kliknij odznacz wszystko w lewym górnym rogu.
   2. Otwórz kafelki (kliknij prawym przyciskiem myszy> otworzyć kafelek). Wybierz kwadrat (kliknij prawym przyciskiem myszy, > dodać, kliknij prawym przyciskiem myszy > przenieś scenę do kwadratu siatki).
   3. Przejdź do opcji Wybór otworów i naciśnij przycisk Auto eucentryczny. Poczekaj, aż to zostanie zakończone i zostanie zrobiony obraz kwadratu siatki. Jeśli funkcja automatyczna nie powiedzie się, może to być spowodowane tym, że wysokość jest znacznie obniżona; jeśli tak, można go regulować ręcznie za pomocą FluScreen w powiększeniu Grid Square.
   4. Zmierz rozmiar otworu. Przesuń i dostosuj żółte kółka tak, aby znajdowały się nad otworami o odpowiednim rozmiarze i odstępach.
   5. Naciśnij przycisk Znajdź otwory. Sprawdź, czy otwory zostały znalezione prawidłowo. Jeśli nie, zmień rozmiar otworu i ponownie znajdź otwory. Powtarzaj to, aż prawidłowo znajdzie otwór. Jeśli konsekwentnie się nie powiedzie, rozważ przejście do niższego rozmiaru plamki (jaśniejszej) przy powiększeniu siatki do kwadratu.
   6. Użyj histogramu jakości lodu filtra po prawej stronie, aby dostosować wybór otworów. Może to być przydatne do wykluczenia obszarów z grubym lodem i cienkim lodem. Zostanie to zapamiętane dla przyszłych kwadratów siatki wybranych podczas tej sesji.
   7. Zoptymalizuj wybór otworów za pomocą narzędzi w menu Wybierz u góry. Na przykład kliknij Usuń otwory w pobliżu paska siatki.
   8. Przejdź do Definicji szablonu i naciśnij Pobierz.
   9. Kliknij Znajdź i wyśrodkuj otwór. Pojawi się teraz obraz z żółtym kółkiem wokół.
      UWAGA: Jeśli ma trudności ze znalezieniem otworu, włóż otwór obiektywu. Jeśli nadal nie może znaleźć otworu, spróbuj wydłużyć czas naświetlania dla ustawienia wysokości otworu/eucentrycznego lub zwiększyć rozmycie dla tego ustawienia wstępnego lub wbić obraz do kosza. Duża zmiana rozmycia może zmienić wyrównanie przesunięcia obrazu.
   10. Zmień czas opóźnienia po przesunięciu etapu i opóźnienia po przesunięciu obrazu na 1-5 s.
   11. Sprawdź, czy maksymalna wartość przesunięcia obrazu (jeśli opcja jest dostępna) jest zgodna z potrzebami. Jeśli używane jest zbieranie przesunięć obrazu bez aberracji, wartość ta jest zdefiniowana w pliku konfiguracyjnym EPU, w przeciwnym razie 5 μm jest wartością standardową.
   12. Kliknij opcję Dodaj obszar pozyskiwania, a następnie kliknij w dowolnym miejscu obrazu. Przesuń obszar akwizycji w żądane miejsce (tj. na krawędzi otworu), tak aby obszary akwizycji nie były podwójnie naświetlone wiązką (kwadrat w zielonym okręgu reprezentuje obszar detektora, zielone kółko to średnica wiązki).
   13. W prawym górnym rogu dodaj zakres rozmycia. Następnie dodaj inne obszary pozyskiwania. Typowa lista rozmycia dla projektu białka błonowego to rozogniskowanie od -0,8 do -3 μm.
   14. Kliknij Dodaj obszar autofokusa i kliknij w dowolnym miejscu obrazu. Przesuń obszar autofokusa na węgiel otaczający otwór. Standardową praktyką jest autofokus po wyśrodkowaniu podczas korzystania z AFIS lub co 5-15 μm, w zależności od zmiany wysokości z w poprzek kwadratu.
   15. Kliknij Dodaj obszar pomiaru dryftu, pomiar dryftu wykonywany raz na kwadrat siatki, z ustawionym progiem 0,05 nm/s jest ustawieniem standardowym. Obszar pomiaru dryftu może (i jest to dobry pomysł) pokrywać się bezpośrednio z obszarem autofokusa. Upewnij się, że ani dryf, ani obszar autofokusa nie pokrywają się z obszarem akwizycji.
       UWAGA: Szablon można sprawdzić za pomocą funkcji wykonywania szablonu. Jest to dobry pomysł, aby sprawdzić, czy obszary akwizycji wymagają przesunięcia (np. za dużo/za mało węgla na obrazach), ale nie jest to konieczne.
   16. Wróć do wyboru kwadratów i na siatce wybierz kwadraty do przejęcia. Użyj liczby obszarów akwizycji i oczekiwanej szybkości pozyskiwania danych (z obiektu w oparciu o detektory i konfigurację eksperymentalną), aby przewidzieć, ile obszarów akwizycji jest wymaganych.
   17. Po wybraniu wszystkich żądanych kwadratów naciśnij przycisk Przygotuj wszystkie kwadraty.
   18. Po zebraniu każdego kwadratu nawiguj między kwadratami siatki i dostosuj otwory za pomocą pędzla wyboru.
6. Przejdź do lokalizacji sceny nad próbką i użyj funkcji automatycznych, aby ustawić wysokość eucentryczną. Wykonuj wyrównanie mikroskopu zgodnie z wcześniejszym opisem²⁸, ale zamiast wykonywać wyrównanie bez komy i ręcznie korygować astygmatyzm obiektywny, skorzystaj z narzędzi do wyrównania w oprogramowaniu. Krótko mówiąc, ustaw warunki wiązki akwizycyjnej, upewnij się, że apertura obiektywu (OA) została usunięta, a stolik jest umieszczony nad stabilnym obszarem wiązki próbki na wysokości eucentrycznej. Wykonaj wyrównanie bez komy w ramach funkcji automatycznych przed ponownym włożeniem i wyśrodkowaniem OA oraz korekcją astygmatyzmu soczewki obiektywu za pomocą EPU. Upewnij się, że oba ułożenia zbiegają się na odpowiednich wartościach (<150 nm komy i bliski zeru astygmatyzm.
   1. Przed rozpoczęciem automatycznego przebiegu akwizycji upewnij się, że pompa turbo automatycznej ładowarki jest wyłączona, a otwór obiektywu jest włożony.
7. W obszarze Automatyczne pobieranie naciśnij przycisk Rozpocznij uruchamianie, aby rozpocząć automatyczne pobieranie danych.

6. Przetwarzanie obrazu w celu uzyskania mapy gęstości EM

UWAGA: Większość urządzeń krioEM oferuje wstępne przetwarzanie filmów mikrograficznych 'w locie'. W tym celu dostępnych jest wiele różnych pakietów oprogramowania i podejść, w tym RELION pipelines^28,33, cryoSPARC⁴³, Scipion³⁴ i WarpEM⁴⁴. Opisany jest tutaj potok oparty na RELION i zakłada się, że użytkownik przeniósł filmy z mikrofotografii do odpowiedniej lokalizacji przechowywania z dostępem do zasobów obliczeniowych. Przedstawiono przegląd procesu i reprezentatywne wyniki dla projektu dotyczącego białek błonowych, szczegółowy opis i samouczek krok po kroku można znaleźć na stronie internetowej RELION: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.

1. Wykonuj "w locie" analizę korekcji ruchu mikrograficznego i estymacji CTF. Uruchom RELION w katalogu projektu. Zaplanuj zadania importu, korekcji ruchu i szacowania CTF tak, aby zapętlały się w taki sposób, aby były współbieżne z gromadzeniem i przesyłaniem danych. Skrypt do analizy mikrograficznej²⁸ dostarcza w czasie rzeczywistym wizualnej informacji zwrotnej na temat astygmatyzmu i szacowanych wartości rozmycia (zobacz reprezentatywne wyniki).
2. Wybieraj cząstki ze wstępnie przetworzonych mikrofotografii. Do wyboru jest wiele pakietów oprogramowania do automatycznego zbierania cząstek. Opcje kompletacji bez odniesień i oparte na szablonach są dostępne w zakładce Automatyczne wybieranie w RELION³⁷. Inne programy mogą być używane do różnych kroków, na przykład za pomocą crYOLO do zbierania cząstek³⁵.
3. Wyodrębnij cząstki z mikrofotografii z korektą CTF.
   UWAGA: Aby skrócić czas obliczeniowy wymagany do wczesnych, "oczyszczających" etapów przetwarzania, należy zmniejszyć skalę/zaśmiecić cząstki podczas ekstrakcji. Szczegółowe informacje na temat uruchamiania zadania wyodrębniania można znaleźć w samouczku RELION 3.1. W tym projekcie cząstki zostały początkowo zabyliżowane przez współczynnik 2.
4. Wykonaj uśrednianie klas 2D. Klasyfikacja w 100–200 klasach działa dobrze w przypadku większości zestawów danych zawierających ≥100 000 cząstek. Nie zaleca się używania wielu więcej niż 200 klas lub mniej niż 50 klas, nawet jeśli zestawy danych są małe, chyba że próbka ma wysoką symetrię (tj. wirus dwudziestościenny), w którym to przypadku mniej niż 50 klas może nadal dawać dobry wynik. Ustaw średnicę maski na tyle dużą, aby zmieścić najdłuższy wymiar cząstki, ale na tyle ciasną, aby wykluczyć wszelkie sąsiednie cząstki (może to wymagać kilku prób i błędów).
5. Wybierz dobre klasy (tj. te z detalami strukturalnymi) za pomocą zadania wyboru podzbioru. Przykłady dobrych i złych średnich klas 2D można znaleźć w sekcji reprezentatywnych wyników.
6. Wygeneruj początkowy model de novo na podstawie danych za pomocą zadania początkowego modelu 3D w RELION.
   UWAGA: Mniej czyste stosy cząstek mogą skorzystać z wieloreferencyjnego udoskonalenia ab initio SGD (stochastic gradient descent), ponieważ daje to dodatkową możliwość odsiewania śmieci/nieoptymalnych cząstek. Wybierz średnicę maski, która może pomieścić interesującą cząstkę, i pozostaw domyślne wartości dla pól w zakładce "SGD", ponieważ rutynowo działają one dobrze. Upewnij się, że początkowy model wygląda rozsądnie w Chimerze (lub innym odpowiednim programie do wizualizacji) (patrz reprezentatywne wyniki).
7. Wykonaj klasyfikację 3D, aby rozwiązać problem niejednorodności danych, używając danych wyjściowych z kroku 6.6 jako modelu referencyjnego. Oceń wynikowe mapy w Chimerze. Przetwarzaj niezależnie stosy cząstek odpowiadające unikalnym stanom konformacyjnym. Użyj zadania wyboru podzbioru, aby wybrać klasę/klasy zainteresowania i wygenerować pliki particles.star dla powiązanych stosów cząstek.
8. Uruchom automatyczne udoskonalanie 3D. Średnie klasy 3D uzyskane w poprzednim kroku można wykorzystać jako punkty odniesienia do uściślenia odpowiadających im stosów cząstek. Jeśli rozdzielczość zagęszczenia zbliża się do limitu Nyquista danych, ponownie wyodrębnij cząstki bez zmniejszania skalowania. Po ponownym wyodrębnieniu powtórz zadanie automatycznego uszlachetniania 3D z nieskinningowanym stosem cząstek. W takim przypadku modele referencyjne 3D muszą zostać przeskalowane w taki sposób, aby rozmiary pikseli i ramek były zgodne z rozmiarami ponownie wyodrębnionych obrazów cząstek. Użyj narzędzia wiersza poleceń relion_image_handler, aby wykonać tę operację.
9. W razie potrzeby wykorzystaj symetrię w udoskonaleniu. Jeśli zrekonstruowana mapa ma symetrię, wyrównaj mapę do odpowiedniej osi symetrii za pomocą narzędzia wiersza poleceń relion_align_symmetry. Wynikowej mapy wyrównanej można użyć jako odniesienia w nowym zadaniu automatycznego udoskonalania 3D z odpowiednim operatorem symetrii określonym na karcie odniesienia.
10. Wyostrzanie map dzięki automatycznemu poprawianiu 3D. Odbywa się to za pomocą zadania post-processingu w RELION, ale najpierw należy utworzyć odpowiednią maskę z dopracowanej mapy. Etapy tworzenia maski i przetwarzania końcowego są szczegółowo opisane w samouczku RELION (zobacz również reprezentatywne wyniki).
    UWAGA: Rozdzielczość wielu rekonstrukcji można dodatkowo poprawić, korzystając z funkcji polerowania bayesowskiego i udoskonalania CTF w RELION. Użyj zadania uściślania CTF, aby oszacować i skorygować aberracje wyższego rzędu (nachylenie wiązki, aberracje koniczyny i aberracje 4^{. rzędu)} oraz, jako oddzielne zadania, powiększenie anizotropowe i rozogniskowanie na cząstkę. Następnie użyj zadania polerowania bayesowskiego (wytrenowanego lub z wartościami domyślnymi), aby zająć się ruchem wywołanym wiązką na podstawie cząstki. Jak omówiono w samouczku RELION 3.1, te zadania prawdopodobnie skorzystają z podejścia iteracyjnego (udoskonalanie CTF → polerowanie bayesowskie → automatyczne udoskonalanie 3D → →pętla przetwarzania końcowego), ponieważ oba korzystają z modeli o wyższej rozdzielczości.
11. W razie potrzeby należy skorygować ręczność map gęstości EM. Zbadaj mapy, aby określić, czy ręczność jest poprawna, próbując dopasować do istniejącego modelu atomowego lub oceniając ręczność regionów alfa helis. Tam, gdzie jest to wymagane, odwróć mapę wzdłuż osi z w UCSF Chimera⁴⁵ za pomocą polecenia 'vop zflip'.

Results

Podczas selekcji, siatki mogą zostać odrzucone na etapie atlasu, gdzie cechy rozwiązane przy małym powiększeniu oznaczają siatkę jako nieodpowiednią do pozyskiwania danych. Na przykład, jeśli siatka została poddana znacznym uszkodzeniom mechanicznym, a większość kwadratów siatki jest uszkodzona (Rysunek 2A) lub jeśli siatka wydaje się być "sucha", bez szklistego lodu (Rysunek 2B). Takie siatki są zazwyczaj rozpoznawalne po tym, jak krawędzie kwadratów siatki są ostre i wyraźne. Na większości siatek wykonanych za pomocą urządzenia do zamrażania wgłębnego obserwuje się gradient lodu (Rysunek 2C,D). Rozkład cząstek, w zależności od interesującej nas próbki, może się znacznie różnić w zależności od grubości lodu, dlatego zaleca się badanie przesiewowe szeregu kwadratów siatki w celu oceny rozkładu cząstek. Narzędzia zostały zaimplementowane w oprogramowaniu EPU na etapie przesiewania atlasu, aby pomóc użytkownikowi zidentyfikować kwadraty siatki o podobnej lub różnej grubości lodu, co może być szczególnie przydatne dla użytkowników, którzy są nowicjuszami w badaniu siatek krioEM (Rysunek 2E, F).

Rysunek 2: Przykładowe montaże "atlasu" w małym powiększeniu z sesji przesiewowych. A) Siatka, która doznała znacznych uszkodzeń, a większość kwadratów siatki jest uszkodzona - nie nadaje się do zbiórki. B) Sucha kratka bez szklistego lodu - nienadająca się do zbierania. C) Siatka przedstawiająca gradient lodu z ~ 50% użyteczności siatki. D) Gradient lodu z ~ 33% użytecznej siatki. Zarówno C, jak i D nadają się do zbierania danych, jeśli użyteczne kwadraty siatki mają grubość lodu odpowiednią do zbierania i jest wystarczająco dużo obszarów akwizycji, aby spełnić minimalny czas trwania zbierania (np. 24 godziny) E) Przykładowy atlas z zakresem grubości lodu. F) Ten sam atlas przedstawiony w E, ale z kwadratami siatki skategoryzowanymi i pokolorowanymi przez oprogramowanie EPU według grubości lodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podczas badania rozkładu cząstek, upewnij się, że parametry obrazowania, takie jak powiększenie i całkowita dawka elektronów, są podobne do tych, które powinny być używane podczas pozyskiwania danych, aby zapewnić dokładny obraz oczekiwanych wyników. Podczas badań przesiewowych idealny rozkład cząstek to monodyspersja z widocznym zakresem orientacji cząstek (w zależności od próbki i istniejącej wiedzy na temat morfologii cząstki, może to być trudne do ustalenia) (Rysunek 3A). Lód powinien być tak cienki, jak to możliwe, a jednocześnie mieścić największy wymiar cząstek, jeśli lód jest zbyt cienki, może się stopić, gdy zostanie oświetlony wiązką elektronów. Powoduje to nadmierny ruch na mikrofotografii i należy unikać obszarów, które wykazują tę cechę (Rysunek 3B). Z kolektywnego doświadczenia wynika, że efekt ten obserwuje się najczęściej, gdy w buforze znajduje się detergent. Może to spowodować, że w środku otworu pojawi się bardzo cienki lód, a więc cząstki mogą być fizycznie wykluczone i wypchnięte w kierunku krawędzi. Efekt ten jest obserwowany w Rysunek 3C, ale w tym przypadku nie jest to ekstremalny przykład i te obrazy nadal z pożytkiem wniosłyby wkład do zestawu danych. Wreszcie, lód musi być szklisty; wykluczyć z akwizycji danych wszelkie obszary siatki (lub siatki), w których większość lub wszystkie wykonane obrazy pokazują krystaliczny lód (Rysunek 3D). Często na krawędzi kwadratów siatki obserwuje się lód nieszklistowy. Czytelnicy są odsyłani do szczegółowych przeglądów zmiennych, które mogą być zmieniane podczas witryfikacji siatki¹⁶ oraz opisów zachowania się cząstek w środowisku cienkowarstwowym^{46, 47} w celu uzyskania dalszych informacji.

Rysunek 3: Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające różne rozkłady cząstek. A) "Idealny" rozkład cząstek monodyspersyjnych przyjmujących różne orientacje. B) Zbyt cienki lód w środku otworu, który odkształca się pod wpływem wiązki elektronów, powodując nadmierny ruch na mikrofotografii. Efekt ten jest najczęściej obserwowany, gdy detergent jest obecny w buforze C) Tam, gdzie lód jest cieńszy w środku otworu, fizycznie wyklucza to cząstki ze środka, powodując stłoczenie cząstek w kierunku krawędzi otworu. W tym przypadku nie jest to na tyle ekstremalne, aby uniemożliwić przydatność tych obrazów, ale sugeruje, że warto prześwietlić nieco grubsze obszary. D) Lód nie jest szklisty, nie należy zbierać danych na obszarach, które wyglądają jak ta przykładowa mikrofotografia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przetwarzanie obrazów w locie może pomóc w wykrywaniu błędów i problemów z pozyskiwaniem danych, dlatego zawsze jest zalecane, jeśli to możliwe. Na przykład nadmierny ruch w obrębie mikrofotografii może wskazywać, że pompa turbo automatycznego podajnika jest aktywna lub dane są zbierane na pękniętym kwadracie siatki, w którym lód porusza się znacznie w wiązce elektronów, co wskazuje, że kwadrat siatki powinien zostać pominięty. Estymacja CTF w locie może ujawnić okoliczności, w których stosowany jest dodatni punkt ostrości (zamiast rozmycia) (gdzie używane są programy estymacji CTF i parametry do znajdowania tych punktów) i określić przesunięcie fazowe, w którym używana jest płyta fazowa Volta⁴⁸. Potoki przetwarzania obrazów na bieżąco często zawierają graficzne podsumowanie danych (Rysunek 4A), aby ułatwić użytkownikom szybką ocenę jakości mikrofotografii i podjęcie decyzji, czy wymagane są zmiany w zbieraniu danych.

Selekcja cząstek z mikrofotografii, przy jednoczesnym unikaniu 'fałszywych alarmów', takich jak zanieczyszczenie lub folia nośna siatki, może wymagać optymalizacji. Jednak selektory cząstek, takie jak crYOLO, często działają wystarczająco dobrze, wykorzystując domyślne parametry dla "pierwszego przejścia" danych (Rysunek 4B), umożliwiając przejście do uśredniania klas 2D, w którym łatwiej jest ocenić jakość danych i prawdopodobieństwo dalszego sukcesu. W przypadku większości projektów klasyfikacja 2D ~> 10 tys. cząstek powinna zacząć ujawniać klasy, które mają drugorzędne szczegóły struktury. Aby przejść do 3D, etap klasyfikacji 2D powinien zazwyczaj ujawnić klasy reprezentujące szereg orientacji cząstek. Jeśli preferowana orientacja zostanie ujawniona, może być wymagane więcej iteracji przygotowania próbki¹⁶ lub dalsze pozyskiwanie danych z pochyloną próbką⁴⁹. Wszystkie klasy, które pokazują szczegóły struktury drugorzędnej, powinny być wybrane do analizy 3D, podczas gdy "śmieciowe" cząstki są odrzucane (Rysunek 4C).

Rysunek 4: Wstępne kroki przetwarzania obrazu. A) Dane wyjściowe ze skryptu przetwarzania obrazu "w locie". B) Przykładowa mikrofotografia (po lewej) z odpowiednio automatycznie wybranymi cząstkami zidentyfikowanymi za pomocą ogólnego modelu crYOLO (po prawej, z cząstkami ograniczonymi czerwonymi kwadratami) Podziałka skali (biała) ma długość fali 50 nm. C) Wyniki klasyfikacji 2D pokazujące klasy, które zostały odrzucone w czerwonym kwadracie, oraz klasy, z których wybrano cząstki do dalszej obróbki, w kolorze zielonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mały podzbiór cząstek może być użyty do wygenerowania początkowego modelu (Rysunek 5A). Ten początkowy model może być następnie wykorzystany jako model wyjściowy w klasyfikacji i udoskonalaniu 3D. W przypadku RagAB zestaw danych zawierał trzy odrębne konformery, które można rozdzielić podczas klasyfikacji 3D (Rysunek 5B). Cząstki przyczyniające się do każdej z tych klas mogą być następnie przetwarzane niezależnie i wykorzystywane do udoskonalenia mapy gęstości EM, która może być następnie poddana dalszej interpretacji i budowaniu modelu.

Rysunek 5: Generowanie mapy gęstości 3D EM. A) Typowy model początkowy wygenerowany przy użyciu RELION. B) Klasyfikacja 3D w 5 klasach pokazująca rozdzielenie cząstek na trzy różne stany konformacyjne: otwarty-otwarty (zielony), otwarty-zamknięty (niebieski), zamknięty-zamknięty (fioletowy). C) Proces tworzenia maski. Mapa z udoskonalenia 3D (po lewej) powinna być zwizualizowana w chimerze. Przeglądarka woluminów może być następnie użyta do zidentyfikowania najniższego progu, przy którym mapa jest wolna od rozłącznej, hałaśliwej gęstości (środek). Ta wartość progowa jest wprowadzana jako początkowy próg binaryzacji w zadaniu tworzenia maski RELION. Przykładowe dane wyjściowe maski są pokazane w kolorze szarym (po prawej). D) Mapa gęstości EM o wysokiej rozdzielczości stanu otwartego-zamkniętego RagAB (EMD-10245), przefiltrowana i pokolorowana przez rozdzielczość lokalną (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym protokole opisaliśmy podstawowy potok mający zastosowanie do próbek podatnych na rutynowe SPA. Chociaż ta metoda bibuły filtracyjnej polegająca na tworzeniu cienkich warstw i witryfikacji jest niewątpliwie skuteczna, biorąc pod uwagę jej zastosowanie w zdecydowanej większości dotychczasowych projektów SPA, ma ona szereg wad. Należą do nich: marnotrawstwo próbki, powolne czasy (sekundy) wymagane do uformowania cienkiej warstwy i zamrożenia próbki, zgłoszona nieodtwarzalność²⁷ oraz zgłoszone negatywne skutki stosowania bibuły filtracyjnej do usuwania nadmiaru cieczy⁵⁰. Ostatnio opracowano nowe technologie poprawiające odtwarzalność produkcji cienkich warstw^{51, 52}. Opracowano inne technologie, które skracają czas między nałożeniem próbki a witryfikacją 53,54,55. Podczas gdy metody tworzenia cienkich warstw oparte na bibule filtracyjnej pozostają najbardziej wszechobecną metodą przygotowania próbek krioEM SPA w momencie pisania tego tekstu, te nowe technologie mogą przynieść szereg korzyści w zakresie wydajności i odtwarzalności witryfikacji siatki, a także stworzyć nowe możliwości wprowadzenia dodatkowych wymiarów eksperymentalnych, takich jak rozdzielczość czasowa i szybkie mieszanie przed witryfikacją.

Proces przesiewania siatki dla większości użytkowników jest obecnie procesem jakościowym, który obejmuje pozyskiwanie atlasów o małym powiększeniu, a następnie wykonywanie obrazów w dużym powiększeniu w poprzek siatki w celu oceny rozkładu cząstek. Chociaż jest to wystarczająco solidne podejście dla niektórych typów próbek, może być trudno ocenić, czy próbka jest rzeczywiście tym, co badacz ma nadzieję zobrazować, czy też ma preferowaną orientację, na przykład w przypadku małych (<200 kDa) próbek lub gdy morfologia o niskiej rozdzielczości utrudnia identyfikację wzrokową, czy obecny jest zakres rozkładów cząstek. W przypadku niektórych projektów niemożliwe jest określenie, czy próbka jest zgodna z oczekiwaniami, na przykład gdzie związany jest ligand lub gdzie próbka jest badana przesiewowo w celu oceny, czy mała (np. 10 kDa) podjednostka jest nadal obecna w połączeniu z kompleksem. W przypadku tych projektów w pełni zautomatyzowane potoki do analizy danych w połączeniu z "krótkimi" zbiorami trwającymi od 0,5 do 1 godziny, które mogą przechodzić przez kolejne etapy przetwarzania obrazu do klasyfikacji 2D, a nawet klasyfikacji i udoskonalania 3D, pomogłyby skutecznie określić, czy uzasadniona jest dłuższa kolekcja. Rurociągi te są nadal w fazie rozwoju i nie są obecnie powszechnie stosowane, ale mają potencjał, aby poprawić wydajność przesiewania siatek krioEM, zwłaszcza w przypadku trudnych próbek.

Ulepszenia w bezpośrednich detektorach elektronów, a także modyfikacje mikroskopii w połączeniu z postępami w przetwarzaniu obrazów, takich jak gromadzenie danych o przesunięciach obrazu, zwiększyły przepustowość i jakość obrazów wytwarzanych podczas pozyskiwania danych. Ten wzrost szybkości gromadzenia danych podkreśla potrzebę dokładnych badań przesiewowych sieci krioelektromagnetycznych przed pozyskaniem wielu TB danych.

CryoEM SPA stało się naprawdę główną techniką biologii strukturalnej, a w wielu przypadkach podejściem "go-to" dla niektórych klas próbek, takich jak heterogeniczne i labilne kompleksy makromolekularne. Podczas gdy niniejszy protokół opisuje podstawowy przegląd rurociągu SPA, każda omówiona tutaj sekcja (witryfikacja i przesiewanie siatki, krioEM i przetwarzanie obrazu) jest tematem samym w sobie i wartym zbadania podczas opracowywania projektu SPA. Wraz z postępem technologii przygotowywania próbek i mikroskopii oraz pojawianiem się nowych algorytmów i podejść do przetwarzania obrazu, SPA będzie nadal rozwijać się jako rurociąg, pomagając naukowcom w uzyskiwaniu wglądu w złożone systemy biologiczne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pęseta	Agar Scientific	AGT5022
Okrągłe pudełko do przechowywania Cryo EM	Agar Scientific	AGG3736
Pudełka z autosiatką CryoEM	ThermoFisher Scientific	1084591
Siatki CryoEM	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Etan	Boc	270595-F
LN2  pianka dewar	Agar Scientific	AG81760-500
LN2  przechowywanie dewar	Worthington industries	HC 34
Końcówki do pipet	Gilson	10082012
Star	labs	s1111-1706
Strzykawka	BD	BD 300869
Woda laboratoryjna typu II	Suez	select fusion
Vitrobot	ThermoFisher Scientific	1086439
Vitrobot	Whatman	1001-055
Zespół pojemników styrophome Vitrobot	Pęsety ThermoFisher Scientific	1086439
Vitrobot	ThermoFisher Scientific	72882-D
Software
EPU	Serwer TEM ThermoFisher Scientific	2.8.1.10REL
ThermoFisher	Scientific	6.15.3.22415REL
Tia	ThermoFisher Scientific	5.0.0.2896REL
Mikroskop Titan Krios	ThermoFisher Scientific	Titan Krios G2