Artykuł metodologiczny

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62415

⸱

29 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Astbury Centre Structural Molecular Biology, School Molecular and Cellular Biology, Faulty Biological Sciences, University of Leeds, 2Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Streszczenie

Mikroskopia krioelektronowa (cryoEM) to potężna technika określania struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą analizy pojedynczych cząstek (SPA). Cały proces polega na i) zeszkleniu próbki w cienkiej warstwie umieszczonej na siatce krioelektromagnetycznej; (ii) badanie przesiewowe próbki w celu oceny rozmieszczenia cząstek i jakości lodu; (iii) jeżeli siatka jest odpowiednia, gromadzenie zbioru danych dotyczących pojedynczych cząstek do analizy; oraz iv) przetwarzanie obrazu w celu uzyskania mapy gęstości EM. W tym protokole znajduje się przegląd każdego z tych kroków, ze szczególnym uwzględnieniem zmiennych, które użytkownik może modyfikować podczas przepływu pracy, oraz rozwiązywania typowych problemów. W związku z tym, że zdalna obsługa mikroskopu staje się standardem w wielu obiektach, opisane zostaną różne warianty protokołów obrazowania, które pomagają użytkownikom w wydajnej pracy i obrazowaniu, gdy fizyczny dostęp do mikroskopu jest ograniczony.

Wprowadzenie

Kriomikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek (Single particle CryoEM)
Aby badać życie na poziomie molekularnym, musimy zrozumieć strukturę. Dostępnych jest wiele technik badania struktury białek, takich jak NMR, krystalografia rentgenowska, spektrometria mas oraz mikroskopia elektronowa (EM). Do tej pory większość struktur zdeponowanych w Protein Databank (PDB) została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Jednak od ok. 2012 roku kriomikroskopia elektronowa (cryoEM) stała się główną techniką wyznaczania struktury białek, a jej zastosowanie gwałtownie wzrosło. Całkowita liczba map EM zdeponowanych w Electron Microscopy Databank (EMDB) (stan na grudzień 2020 r.) wyniosła 13 421 w porównaniu do 1 566 w 2012 roku (Rycina 1, www.ebi.co.uk). W 2012 roku liczba współrzędnych atomowych wymodelowanych w mapach gęstości cryoEM i zdeponowanych w PDB wynosiła zaledwie 67, ale do grudnia 2020 r. zdeponowano już 2 309 struktur, co stanowi 35-krotny wzrost. Ten podstawowy wzrost jakości i ilości generowanych map gęstości cryoEM, czasem nazywany „rewolucją rozdzielczości'1, był wynikiem splotu postępów w wielu obszarach: opracowania nowych kamer do obrazowania, znanych jako detektory elektronów bezpośrednich; nowego oprogramowania oraz bardziej stabilnych mikroskopów2,3,4.

figure-introduction-1
Rycina 1: Skumulowana liczba zgłoszeń do EMDB od 2012 roku do grudnia 2020 roku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza pojedynczych cząsteczek (SPA) jest potężnym narzędziem służącym do uzyskiwania wiedzy biologicznej na temat szerokiej gamy typów próbek poprzez wyznaczanie struktur o wysokiej rozdzielczości izolowanych kompleksów5, 6, w tym wirusów7,8, białek błonowych9, 10, struktur helikalnych11 oraz innych dynamicznych i heterogennych kompleksów makromolekularnych12, 13, których rozmiary różnią się o rzędy wielkości (od 39 kDa14, 15 do dziesiątek megadaltonów). W niniejszym opracowaniu opisano protokół standardowego procesu cryoEM SPA, obejmujący etapy od przygotowania próbki po wyznaczenie struktury.

Przed rozpoczęciem tej procedury oczyszczoną próbkę należy poddać analizie biochemicznej w celu oceny szans na sukces w dalszych etapach. Przygotowanie odpowiedniej próbki jest prawdopodobnie największą barierą w SPA, szczególnie w przypadku kompleksów przejściowych i heterogenicznych (zarówno pod względem składu, jak i konformacji). Preparat kompleksu makromolekularnego powinien zawierać jak najmniej zanieczyszczeń, znajdować się w stężeniu wystarczającym do uzyskania wielu cząsteczek na każdej mikrografii cryoEM oraz w składzie buforu dobrze dostosowanym do analizy cryoEM. Niektóre składniki buforu, w tym sacharoza, glicerol oraz wysokie (> 350 mM) stężenia soli, w zależności od wielkości próbki, jej właściwości i innych składników buforu, mogą zakłócać proces witryfikacji lub obniżać stosunek sygnału do szumu na obrazach, co utrudnia wyznaczenie struktury16.

Zazwyczaj, w ramach minimum, do oceny czystości próbki należy wykorzystać chromatografię wykluczania cząsteczkowego (SEC) oraz analizę żelową SDS-PAGE17, 18, jednak dichroizm kołowy, testy funkcjonalne, SEC sprzężona z wielokątnym rozpraszaniem światła oraz testy stabilności termicznej stanowią przydatne narzędzia do analizy jakościowej preparatów kompleksów makromolekularnych przed analizą cryoEM. Niemniej jednak wyniki tych analiz biochemicznych mogą dostarczyć niewielkiej wiedzy na temat heterogeniczności strukturalnej próbki i jej zachowania na siatce do cryoEM. Z tego powodu EM z barwieniem negatywowym jest rutynowo stosowane jako szybkie, tanie i skuteczne narzędzie do oceny heterogeniczności składu i konformacji, a tym samym stanowi dobry sposób na ustalenie, która frakcja elucji z procesu oczyszczania jest najbardziej obiecująca lub do screeningu różnych składów buforów19, 20. Po zidentyfikowaniu obiecującej próbki można przejść do procedury SPA cryoEM. Barwienie negatywowe nie zawsze pokrywa się z późniejszymi wynikami uzyskanymi w cryoEM; czasami próbka wygląda słabo w barwieniu negatywowym, ale jej jakość poprawia się w lodzie witryfikowanym w cryoEM. Z kolei niektóre próbki wyglądają doskonale podczas etapów barwienia negatywowego, lecz wymagają znacznej dalszej optymalizacji przy przejściu do cryoEM. Jednak w większości przypadków barwienie negatywowe stanowi przydatny etap kontroli jakości.

Witryfikacja
Surowe warunki panujące w systemie próżniowym mikroskopu elektronowego powodują zarówno dehydratację, jak i uszkodzenia radiacyjne nieutrwalonych preparatów biologicznych21. Dlatego, aby obrazować próbkę w stanie zbliżonym do naturalnego, preparat biologiczny musi zostać zakonserwowany przed obrazowaniem. W przypadku oczyszczonych preparatów kompleksów makromolekularnych, witryfikacja jest preferowaną metodą umożliwiającą ich wizualizację za pomocą cryoEM przy jednoczesnym zachowaniu szczegółów atomowych kompleksu. Odkrycie witryfikacji jako metody przygotowania próbek stanowiło fundamentalny postęp w mikroskopii elektronowej preparatów biologicznych, za co Dubochet został uhonorowany Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 2017 roku. Witryfikacja próbki polega na stworzeniu cienkiej warstwy roztworu zawierającego badany preparat, zazwyczaj o grubości kilkudziesięciu nm, zawieszonej na siatce wspierającej do cryoEM. Cienka warstwa jest następnie zamrażana niezwykle szybko w kriogenie, takim jak ciekły etan w temperaturze ~-175 °C. Szybkość zamrażania wynosi ~106 °C/s, co jest wystarczająco szybkie, aby utworzył się lód amorficzny, czyli szklisty, zawieszający preparat w cienkiej, stałej warstwie22.

Pierwszą zmienną, którą należy rozważyć, jest wybór nośnika siatki do cryoEM23. Siatka EM zazwyczaj składa się z amorficznej folii węglowej z perforacjami (regularnymi lub nieregularnymi), naniesionej na strukturę wsporczą. Struktura wsporcza to zazwyczaj kolista metalowa siatka o średnicy 3,05 mm, najczęściej wykonana z miedzi, choć można stosować inne metale, takie jak złoto lub molibden (który posiada korzystne właściwości rozszerzalności cieplnej24). Czasami na całej siatce nanosi się dodatkowy cienki, ciągły nośnik, taki jak grafen, tlenek grafenu lub cienka (~1-2 nm) warstwa węgla amorficznego. Choć w ogromnej większości opisanych do tej pory struktur stosowano standardowe siatki cryoEM (najczęściej miedziane 400-200 mesh z perforowanym nośnikiem węglowym – choć dostępne jest wiele różnych wzorów; otwory okrągłe o średnicy 1,2 µm oddzielone 1,3 µm węgla (r1.2/1.3) lub 2 µm oddzielone 2 µm węgla (r2/2)), doniesiono o nowych technologiach siatek o poprawionej przewodności i zredukowanym ruchu preparatu25. Wybrane siatki poddaje się obróbce wyładowaniem żarowym/czyszczeniu plazmowemu, aby uczynić je hydrofilowymi i podatnymi na aplikację próbki26.

Po wyładowaniu żarowym kolejnym etapem jest formowanie cienkiej warstwy. Cienką warstwę najczęściej tworzy się przy użyciu papieru filtrującego w celu usunięcia nadmiaru cieczy z siatki. Choć czynność tę można wykonać ręcznie, w sprzedaży dostępnych jest wiele urządzeń do mrożenia w technice plunge freezing, w tym Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) oraz CP3 (Gatan). W urządzeniach tych na siatkę EM nakłada się ~3-5 µL próbki w roztworze, a następnie usuwa nadmiar roztworu za pomocą papieru filtrującego. Siatkę z zawieszoną na niej cienką warstwą zanurza się następnie w etanie w stanie ciekłym, schłodzonym ciekłym azotem (LN2) do temperatury ~-175 °C. Po zamrożeniu siatkę utrzymuje się w temperaturze poniżej punktu dewitryfikacji (-137 °C) przed obrazowaniem oraz w jego trakcie.

Przesiewanie preparatów i zbieranie danych
Po witryfikacji siatki do cryoEM kolejnym etapem jest przesiewanie siatki w celu oceny jej jakości oraz ustalenia, czy nadaje się ona do wysokorozdzielczego zbierania danych. Idealna siatka do cryoEM posiada lód witryfikowany (w przeciwieństwie do lodu krystalicznego) o grubości wystarczającej jedynie do pomieszczenia najdłuższego wymiaru preparatu, co zapewnia, że otaczający lód wprowadza jak najmniej szumu do otrzymanego obrazu. Cząsteczki w lodzie powinny mieć rozmiar i (jeśli jest znany) kształt zgodny z danymi biochemicznymi, a idealnie powinny być monodyspersyjne z losową dystrybucją orientacji cząsteczek. Wreszcie, siatka powinna posiadać wystarczającą liczbę obszarów odpowiedniej jakości, aby zrealizować zamierzony czas zbierania danych. W zależności od preparatu może to wymagać wielu iteracji witryfikacji i przesiewania, aż do uzyskania optymalnych siatek. Zarówno na szczęście, jak i na nieszczęście, istnieje ogromna liczba zmiennych, które można testować empirycznie w celu zmiany dystrybucji cząsteczek na siatkach cryoEM (przegląd w16,27). W niniejszym opracowaniu przedstawiono reprezentatywne wyniki dla projektu dotyczącego białka błonowego10.

Po zidentyfikowaniu odpowiedniej siatki można przystąpić do gromadzenia danych. Kilka modeli krio-transmisyjnych mikroskopów elektronowych do preparatów biologicznych jest zoptymalizowanych pod kątem automatycznego gromadzenia danych o wysokiej rozdzielczości. Zazwyczaj dane są zbierane na systemach 300 kV lub 200 kV. Automatyczne gromadzenie danych można zrealizować przy użyciu oprogramowania takiego jak EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 oraz SerialEM31, 32. Automatyczne gromadzenie danych z użyciem nowoczesnych detektorów zazwyczaj skutkuje uzyskaniem terabajtów (TB) surowych danych w ciągu 24 h (średnie zestawy danych mają rozmiar ~ 4 TB).

Ze względu na ograniczenia związane z COVID-19 obowiązujące w wielu częściach świata (stan na grudzień 2020 r.), wiele ośrodków mikroskopowych przeszło na system zdalnego dostępu. Po załadowaniu siatek do autoloadera mikroskopu, akwizycja danych może być prowadzona zdalnie.

Przetwarzanie obrazów i budowanie modelu
Podczas gdy sesja zbierania danych trwa zazwyczaj od 0,5 do 4 dni, późniejsze przetwarzanie obrazów może zająć wiele tygodni i miesięcy, w zależności od dostępności zasobów obliczeniowych. Standardem jest, aby wstępne etapy przetwarzania obrazów, a mianowicie korekcja ruchu i estymacja funkcji przenoszenia kontrastu (CTF), odbywały się „w locie” 33, 34. Do dalszego przetwarzania dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania. Cząstki są „wybierane” (picking) i ekstrahowane z mikrografii35, 36. Po ekstrakcji cząstek standardowy protokół polega na poddaniu ich kilku rundom klasyfikacji (zarówno w dwóch wymiarach (2D), jak i trzech wymiarach (3D) i/lub w skupieniu na konkretnych obszarach zainteresowania), aby uzyskać jednorodny podzbiór cząstek. Ten jednorodny podzbiór cząstek jest następnie uśredniany w celu stworzenia rekonstrukcji 3D. Na tym etapie dane są często dodatkowo korygowane, aby uzyskać mapę o najwyższej możliwej jakości, na przykład poprzez udoskonalenie CTF, korekcje zniekształceń37 oraz polerowanie bayesowskie (Bayesian polishing)38 . Wynikiem tego przetwarzania obrazów jest 3D mapa cryoEM badanego preparatu biologicznego. Zakres rozdzielczości osiągany w „standardowym” zautomatyzowanym eksperymencie pojedynczych cząstek z siatki o wystarczającej jakości, przy danych zebranych na systemie mikroskopowym 300 kV, wynosi zazwyczaj od 10 Å do 2 Å, w zależności od rozmiaru i elastyczności kompleksu białkowego. Przy idealnym preparacie, stosując workflow SPA, osiągnięto obecnie rozdzielczości rzędu ~1,2 Å5. Choć niniejszy protokół szczegółowo opisuje kroki prowadzące do uzyskania mapy gęstości EM, po jej otrzymaniu można ją dalej interpretować poprzez dopasowanie i udoskonalanie modelu białka (jeśli rozdzielczość jest < 3,5 Å) lub budowanie de novo39. Dane związane z eksperymentami określania struktury mogą być deponowane w publicznych repozytoriach online, w tym mapy gęstości EM (Electron Microscopy Data Bank)40, wynikowe współrzędne atomowe (Protein Data Bank)41 oraz surowe zestawy danych (Electron Microscopy Public Image Archive)42.

W niniejszym protokole jako przykładowy kompleks makromolekularny wykorzystano kompleks białek błony zewnętrznej RagAB (~340 kDa) z Porphyromonas gingivalis10 (EMPIAR-10543). Dla osób rozpoczynających pracę z cryoEM, wsparcie w przygotowaniu próbek w ramach tego procesu – od próbki do struktury – jest dostępne, po przejściu recenzji, poprzez finansowane programy dostępu, takie jak iNEXT Discovery oraz Instruct.

Protokół

1. Zeszklenie siatki

UWAGA: Dla wszystkich kroków w krokach 1 i 2 upewnij się, że wszystkie narzędzia są czyste, suche i mają temperaturę pokojową przed schłodzeniem ich do temperatury LN2, używając świeżo zdekantowanego LN2 w celu zmniejszenia zanieczyszczenia lodem. Jeśli to możliwe, pracuj w środowisku o kontrolowanej wilgotności < wilgotności względnej 20%. Przed rozpoczęciem pracy upewnij się, że masz odpowiednie środki ochrony osobistej i dokumentację BHP.

  1. Upewnij się, że próbka, która Cię interesuje, jest gotowa do przygotowania próbki.
  2. Wybierz odpowiednie kratki krioEM i upewnij się, że zostały one unieszkodliwione jako hydrofilowe za pomocą wyładowania jarzeniowego lub obróbki plazmowej. Dostępna jest szeroka gama systemów i wariantów protokołu, ale wszystkie obejmują umieszczenie kratek w systemie wyładowania jarzeniowego/czyszczenia plazmowego i uruchomienie programu, który przepompuje komorę do pożądanego poziomu próżni, przed wprowadzeniem do systemu określonej mieszaniny gazów/oparów chemicznych lub powietrza. Przez system przepływa prąd elektryczny, który jonizuje cząsteczki gazu i powoduje, że powierzchnia siatek staje się bardziej hydrofilowa.
  3. Uruchom urządzenie do zamrażania wgłębnego w celu zeszklenia siatki, włączając system za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu i poczekaj, aż załaduje się ekran dotykowy.
  4. Za pomocą dołączonego rysika lub palców w konsoli ustaw żądaną temperaturę pracy komory (dostępny zakres to 4-60 °C, zalecany dla większości makrocząsteczek 4-6 °C).
  5. Napełnij nawilżacz 50 ml wody laboratoryjnej typu II za pomocą strzykawki, przez gumową rurkę na spodzie nawilżacza. Należy upewnić się, że usunięto powietrze uwięzione w strzykawce przed napełnieniem. Uważaj, aby nie przepełnić nawilżacza, w przeciwnym razie woda będzie wyciekać do komory. Po napełnieniu nawilżacza cofnij tłok strzykawki o 5-10 ml, aby utworzyć uszczelnienie próżniowe.
  6. W konsoli ustaw żądaną wilgotność względną dla komory (dostępny zakres to 0-100%, zwykle używana jest wilgotność 95-100%). Pozostaw wilgotność ustawioną na "wyłączoną" aż do momentu bezpośrednio przed utworzeniem rusztu, aby komora nie była zbyt mokra.
  7. Zaopatrz się w pęsetę do zamrażania wgłębnego i bibułę filtracyjną przyciętą do odpowiedniego rozmiaru, aby pasowała do podkładek, zakupioną lub za pomocą stempla do wycięcia otworu o odpowiednim rozmiarze.
  8. Przygotuj kriogen do zamrażania wgłębnego.
    1. Umieść metalowy uchwyt na kriogeniczną siatkę, kubek kriogeniczny i metalowe nogi pająka w pojemniku na płyn chłodzący.
    2. Schłodzić pojemnik, napełniając komorę zewnętrzną LN2. Utrzymuj komorę zewnętrzną uzupełnioną, aby zakryć górną część uchwytu pudełka z kriosiatką. Dodaj ~ 1 cm dodatkowego LN2 do kubka kriogenicznego, aby wspomóc równowagę systemu do temperatury LN2.
      UWAGA: Pierścień zapobiegający zanieczyszczeniom może być używany do ograniczania kondensacji wilgotnego powietrza wokół kubka kriogenicznego i prowadzącego do zanieczyszczenia chłodziwem kriogenicznym/etanem. Na ogół nie jest to wymagane w środowisku o kontrolowanej wilgotności. W przypadku korzystania z pierścienia zapobiegającego zanieczyszczeniom należy uważać, aby nie przepełnić pojemnika LN2, ponieważ może on się rozlać, gdy pierścień zostanie wciśnięty do pojemnika w dalszej części procesu.
    3. Odczekaj 3-5 minut, aby zaobserwować gotowanie nóg pająka, a następnie odczekaj kolejne 3 minuty, aby upewnić się, że kubek kriogeniczny jest wystarczająco zimny, aby skondensować pożywkę witryfikacyjną.
  9. Skroplić kriogen (ciekły etan) do kubka kriogenicznego.
    1. Weź rurkę butli z etanem z cienkimi rurkami i dyszą, aby dozować gaz. Idealna jest tutaj końcówka do pipety P200 z otworem otwieranym poprzez odcięcie samej końcówki za pomocą żyletki. Potrzebny jest szerszy otwór, aby zapobiec krzepnięciu etanu na końcówce i blokowaniu przepływu gazu.
    2. Upewnij się, że kubek kriogeniczny nie zawiera pozostałego LN2, weź dyszę etanu i umieść ją w kubku kriogenicznym. Za pomocą regulatora butli z gazem uruchom niski przepływ i dozuj gaz kriogeniczny do kubka kriogenicznego, aby skroplić gaz. Końcówkę, z której przepływa gaz, należy przycisnąć bezpośrednio do ścianki pojemnika kriogenicznego, ale delikatnie przesuwaj ją do przodu iz powrotem, stukając o powierzchnię. Reguluj przepływ gazu, aby umożliwić niski, stały przepływ do rozpoczęcia kondensacji/skraplania w kontrolowany sposób w kubku kriogenicznym.
    3. Napełnij kubek tuż poniżej srebrnej krawędzi pająka i zatrzymaj przepływ gazu, a następnie ostrożnie odłącz przewód gazowy, aby uniknąć zanieczyszczenia otaczającego LN2 etanem.
    4. Uzupełnij pojemnik płynu chłodzącego LN2, bardzo uważając, aby nie rozlać go do ciekłego etanu.
    5. Pozostaw nogi pająka na miejscu na ~ 3-5 minut, aby upewnić się, że ciekły etan jest zrównoważony do wystarczająco niskiej temperatury. Kriogen zacznie wyglądać na mętny/lekko nieprzezroczysty. Oznacza to, że jest bliski punktu zamarzania. Na tym etapie użyj pęsety, aby usunąć pająka. Tak długo, jak LN2 jest przechowywany w pojemniku otaczającym kubek kriogeniczny, etan pozostanie skroplony i będzie nadawał się do witryfikacji przez 1-2 godziny. Należy jednak dążyć do jak najszybszego zakończenia procedury, zwłaszcza w pomieszczeniach o niekontrolowanej wilgotności, aby zmniejszyć zanieczyszczenie lodem.
      UWAGA: Jeśli pająk wydaje się być "przyklejony", użyj metalowego przedmiotu, takiego jak nakrętka, i przytrzymaj za nogi pająka, aby je lekko rozgrzać, a następnie zdejmij nogi.
  10. Przygotować urządzenie do zamrażania wgłębnego i akcesoria do witryfikacji próbki.
  11. Dodaj skrzynki do przechowywania siatki do metalowego uchwytu skrzynki kriokratowej i przez cały czas trwania procedury upewnij się, że LN2 jest uzupełniony do poziomu tuż powyżej poziomu skrzynek kratowych (zwykle co ~ 5 minut).
  12. Na ekranie urządzenia do zamrażania wgłębnego, w polu Parametry procesu wprowadź wybrane parametry, w tym: czas osuszania (czas, w którym podkładki urządzenia do zamrażania wgłębnego się zejdą), siłę (odległość podkładek do bibuły od siatki, która zmienia gradient tworzenia się lodu) i sumę (ile razy podkładki do bibuły się spotkają). Wybierz te parametry w oparciu o indywidualne urządzenie do zamrażania wgłębnego i zachowanie makrocząsteczki. Typowe wartości to siła blot z zakresu od 0 do 5, czas blot od 1 do 6 s i suma blot równa 1. Typowy czas oczekiwania (czas między zainicjowaniem blot a jego rozpoczęciem) i czas drenażu (czas po osuszeniu przed zanurzeniem) wynosi 0-2 s.
    UWAGA: W zależności od preferencji użytkownika można wybrać dodatkowe opcje w sekcji Opcje, Różne, w tym Użyj pedału nożnego, aby przejść do następnego kroku przy każdym naciśnięciu, Pomiń transfer siatki (pomija ostatni krok, w którym ramię pęsety jest lekko uniesione), wyłącz wilgotność podczas procesu (podczas nakładania próbki zatrzymuje aktywne nawilżanie komory, co może utrudnić widoczność siatki) i Autoraise Ethanelift (łączy w sobie krok pęsety podnoszonej do komory i podnoszenia pojemnika z płynem chłodzącym - pomija krok Podnieś pojemnik na etan). Tutaj wszystkie te opcje są włączone.
  13. Umieść pojemnik z płynem chłodzącym bezpiecznie na ruchomym ramieniu platformy pod komorą
  14. Włóż świeżą bibułę na każde ramię bibuły, upewniając się, że plastikowe klipsy do pierścieni są zabezpieczone. Każda bibuła filtracyjna pozwoli na 16 blot (ramiona obracają bibułę). Naciśnij przycisk Resetuj papier do bibuły w sekcji Sterowanie.
  15. Uruchom 1 pełny cykl procesu witryfikacji urządzenia do zamrażania wgłębnego, aby upewnić się, że każda ruchoma część zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami.
    1. Naciśnij (lub użyj pedału nożnego), aby umieścić nową siatkę, następnie Rozpocznij proces, następnie Przetwarzaj, a następnie Kontynuuj. Na tym etapie obserwuj, czy ramiona bibułki stykają się ze sobą zgodnie z oczekiwaniami.
  16. Włącz nawilżacz. Wytwarzana będzie para wodna (o ile ustawiona wilgotność będzie wyższa niż aktualnie w komorze).
  17. Interesujący nas okaz można teraz poddać witryfikacji. Użyj pedału nożnego lub umieść nową siatkę, a pręt zanurzający wyjdzie z komory, umożliwiając przymocowanie pęsety do uchwytu.
    1. Za pomocą pęsety do zamrażania wgłębnego podnieś żądaną siatkę cryoEM wyładowaną jarzeniowo/plazmową, zwracając uwagę, aby zanotować, która strona jest właściwą stroną do aplikacji próbki według producenta siatki. Podnieś siatkę za obręcz, uważając, aby uniknąć nadmiernego/niepotrzebnego kontaktu z pęsetą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie podpory. Zabezpiecz siatkę w pęsetie, przesuwając klips w dół do prążkowanej części pęsety. Siatka musi być bezpiecznie trzymana, ale klips nie powinien znajdować się zbyt głęboko w dół, ponieważ będzie stykał się z bibułkami, co doprowadzi do niepowtarzalnego osuszenia, a później pęseta będzie musiała być trzymana poniżej tego punktu podczas zwalniania klipsa.
    2. Umieść pęsetę do zamrażania wgłębnego przytrzymującą siatkę krioEM na ramieniu pneumatycznym prawą stroną skierowaną w stronę dominującej ręki. Konstrukcja pęsety i komory urządzenia do zamrażania wgłębnego jest taka, że próbka może być nakładana przez prawą lub lewą stronę komory, w zależności od ręczności użytkownika.
      UWAGA: Nakładanie próbki na różne strony o tych samych parametrach blottingu rzadko daje porównywalne wyniki, więc leworęczni badacze mogą być zmuszeni do dostrojenia parametrów blottingu niezależnie od swoich praworęcznych kolegów.
    3. Naciśnij Start Process, a siatka trzymana w pęsetie zostanie wniesiona do komory, a pojemnik na płyn chłodzący zostanie podniesiony.
    4. Naciśnij przycisk Proces, a pęseta przesunie siatkę do pozycji, w której można użyć pipety do nałożenia próbki na siatkę. Otwórz boczny port skierowany w stronę właściwej strony siatki i nałóż próbkę przez pipetowanie, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka siatki, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia wspornika siatki/wygięcia siatki, ale dozuj płyn na tyle blisko, aby kropla dozowała się na siatkę. Zazwyczaj stosuje się 3-5 μl.
  18. Naciśnij przycisk Kontynuuj, a predefiniowane parametry użytkownika osuszą siatkę, a następnie zanurzą pęsetę z siatką zamontowaną w miseczce na płyn chłodzący w celu zeszklenia próbki. Pęseta będzie opadać w połączeniu z ramieniem przytrzymującym pojemnik z płynem chłodzącym i płyn chłodzący, utrzymując siatkę zanurzoną w kriogenie.
  19. Przenieś siatkę z kubka kriogenicznego do skrzynki do przechowywania siatki zanurzonej w LN2.
    1. Odłącz pęsetę od ramienia pęsety, bardzo uważając, aby nie zetknąć się z zeszkloną siatką z bokami kubka kriogenicznego. Wyreguluj uchwyt tak, aby pęseta była wygodnie trzymana. Tak szybko i ostrożnie, jak to możliwe, przenieś siatkę z kriogenu na LN2. Jedną ręką przytrzymaj pęsetę palcami, a drugą ręką przesuń klips do góry, przytrzymując pęsetę zaciśniętą. Wyreguluj uchwyt i manipuluj siatką w skrzynce do przechowywania siatki.
    2. Powtarzaj kroki 1.10-1.19, aż wszystkie siatki zostaną utworzone (typowa sesja będzie obejmować wykonanie 4-12 siatek). Przechowuj wszystkie skrzynki do przechowywania siatki zawierające kratki w LN2 dewar do następnych etapów.

2. Siatki tnące do załadunku do mikroskopu automatycznego ładowania

  1. Przytnij siatki do zespołu automatycznej siatki zgodnie z wcześniej opisanym protokołem 28.

3. Bezpieczne zdalne logowanie do mikroskopów

UWAGA: W związku z kontrolami COVID-19 w chwili pisania tego tekstu, ale także z obawami o środowisko związanymi z podróżami międzynarodowymi, coraz więcej ośrodków mikroskopowych oferuje usługi, w których użytkownik działa zdalnie. Metoda wdrożenia tego rozwiązania będzie się różnić w zależności od lokalnej konfiguracji IT każdego obiektu oraz potrzeb jego wewnętrznej i zewnętrznej społeczności użytkowników. Tutaj opisano proces zdalnego dostępu do krioEM-ów w eBIC i sterowania mikroskopem za pomocą oprogramowania EPU.

  1. Zdalne logowanie do krioEM. Zdalne logowanie odbywa się za pośrednictwem oprogramowania NoMachine w celu uzyskania dostępu do komputera obsługi mikroskopu i jest skonfigurowane tak, aby zezwalać na dostęp tylko użytkownikom, którzy są zarejestrowani podczas wizyty za pośrednictwem danych logowania użytkownika FedID. Dostęp pozostaje aktywny tylko przez czas trwania sesji.
  2. Otwórz NoMachine i rozpocznij nowe połączenie NX, aby nx-cloud.diamond.ac.uk z uwierzytelnianiem za pomocą hasła.
  3. Otwórz połączenie i zaloguj się przy użyciu nazwy użytkownika fedid@fed.cclrc.ac.uk i hasła FedID. Kliknij dwukrotnie ikonę odpowiadającą odpowiedniemu mikroskopowi z dostępnych opcji, aby otworzyć połączenie z odpowiednim komputerem pomocniczym.
  4. Wprowadź nazwę użytkownika clrc\FedID i hasło na ekranie logowania systemu Windows.
  5. Otwórz oprogramowanie TeamViewer za pomocą ikony na pulpicie i połącz się z PartnerID: TEM za pomocą podanego hasła. Spowoduje to nawiązanie połączenia między komputerem pomocniczym a komputerem TEM. Przycisk Next Monitor (Następny monitor) na wstążce programu TeamViewer może służyć do przełączania między interfejsem użytkownika mikroskopu a oknem EPU.
  6. Funkcje mikroskopu mogą być następnie sterowane przez użytkowników bezpośrednio przez interfejs EPU.

4. Ładowanie próbek do mikroskopu automatycznego podajnika i badanie przesiewowe pod kątem jakości lodu i próbki

UWAGA: W tej sekcji do badania próbek używany jest mikroskop z automatycznym ładowaniem i oprogramowaniem EPU, ale można to osiągnąć za pomocą innego oprogramowania oraz systemu bocznego wprowadzania i krioEMÓW innych producentów.

  1. Załaduj przycięte siatki do automatycznego ładowania mikroskopu zgodnie z wcześniejszym opisem28.
  2. Na karcie automatycznego wczytywania w interfejsie użytkownika mikroskopu wyjdź z okna dialogowego Opcje za pomocą strzałki i naciśnij przycisk Inwentaryzacja . Spowoduje to sekwencyjne sprawdzenie każdej pozycji w kasecie, aby określić, czy wkład jest obecny. Zajęte miejsca będą oznaczone kolorem niebieskim. Jeśli wszystkie zajęte miejsca zostały zmapowane, naciśnij ponownie przycisk Ekwipunk, aby zatrzymać się po bieżącej pozycji, w przeciwnym razie pozostaw włączone, dopóki wszystkie zajęte miejsca nie zostaną zmapowane. Oznacz wszystkie zajęte miejsca szczegółami próbki w odpowiednich polach.
  3. Podświetl siatkę, która ma zostać przeniesiona do kolumny mikroskopu, i kliknij przycisk Załaduj. Etykieta miejsca zmieni kolor z niebieskiego na żółty po pomyślnym załadowaniu siatki na scenę. Przejdź do przesiewania siatek.
    1. Otwórz oprogramowanie EPU. Na stronie Preparation (Przygotowanie) wybierz opcję Acquisition optics and settings (Optyka i ustawienia) , a następnie wybierz ustawienie wstępne Atlas (Atlas) z menu rozwijanego. Wybierz odpowiednie ustawienia ustawień wiązki (np. 64x nominalny mag, rozmiar plamki 5, Mikrosonda, z oświetlonym obszarem w równoległym zakresie dla detektora Falcon - więcej informacji na temat wyboru ustawień wiązki można znaleźć w 28). Naciśnij przycisk Set, aby przesłać parametry do mikroskopu.
    2. Naciśnij Otwórz zawory kolumny i włóż FluScreen. Sprawdź, czy wiązka jest widoczna i wystarczająco rozproszona i wyśrodkowana, aby zakryć detektor. W razie potrzeby przejdź do cieńszego obszaru siatki za pomocą joysticka lub menu stage, aby sterować ruchami stage w X i Y.
    3. Podnieś FluScreen i zrób zdjęcie za pomocą przycisku Podgląd w EPU. Na podstawie uzyskanego obrazu dawkę można zwiększyć, przesuwając się do mniejszej liczby rozmiarów plamki i odwrotnie.
    4. W EPU przejdź do strony Atlas i naciśnij Nowa sesja. Wybierz opcję Format obrazu MRC i wprowadź odpowiednią nazwę folderu oraz lokalizację, w której chcesz zapisać sesję przesiewową, a następnie kliknij przycisk Apply (Zastosuj).
    5. Wybierz Screening (Selekcja) z menu po lewej stronie. Zaznacz pola wyboru obok każdej siatki, aby uzyskać montaż atlasu. Rozpocznij sesję przesiewową w EPU. Dla każdej zaznaczonej siatki zostanie zdobyty atlas, z liczbą dostępnych kwadratów siatki wymienionych po ukończeniu. Każdy atlas można wyświetlić, podświetlając go na stronie projekcji, wraz ze znacznikami przedstawiającymi kwadraty siatki o podobnej przewidywanej grubości lodu, pogrupowane według kolorów.
  4. Po zakończeniu należy dokonać przeglądu zebranych atlasów i wskazać siatki odpowiednie do oceny jakości próbki przy większych powiększeniach (tj. takie, które mają odpowiednią liczbę kwadratów siatki, które nie są ani suche, ani zasłonięte grubym lodem). Podświetl wybraną siatkę w menu rastrowania EPU i kliknij przycisk Załaduj próbkę.
    1. Użyj ustawień wstępnych ustawień belki (patrz 28, aby uzyskać wyjaśnienie ustawień belki wymaganych dla każdego etapu) i funkcji podglądu, aby bardziej szczegółowo zbadać żądane kwadraty siatki.
    2. Z menu rastrowania Atlas wybierz aktualnie załadowaną siatkę i przenieś scenę do kwadratu siatki zawierającego wypełnione otwory, klikając prawym przyciskiem myszy żądane miejsce na obrazie siatki i wybierając przejście do kwadratu siatki.
    3. Wróć do EPU, strony Przygotowanie i wybierz ustawienie wstępne GridSquare.
    4. Otwórz stronę EPU, Auto Functions i uruchom Auto-eucentric przez pochylenie stolika z ustawieniem wstępnym GridSquare, aby przesunąć próbkę na wysokość eucentryczną.
      UWAGA: Dostępna jest również funkcja autoeucentryczna z pochyleniem wiązki, która jest szybsza, ale zazwyczaj mniej dokładna niż autoeucentryczna z pochyleniem sceny.
    5. W obszarze EPU, Przygotowanie, utwórz nowy obraz podglądu GridSquare. Zwróć uwagę na różne wartości szarości na różnych otworach, wskazujące na różną grubość lodu. Przesuń scenę nad otwór za pomocą prawego przycisku myszy> przenieść scenę tutaj. Wybierz ustawienie predefiniowane Wysokość otworu/eucentryczności i Podgląd.
      UWAGA: W zależności od masy cząsteczkowej i kształtu interesującej cząstki, może być możliwe zidentyfikowanie jej przy powiększeniu Hole/Eucentric Height.
    6. Wybierz ustawienie wstępne Akwizycji danych i ustaw powiększenie, które umożliwia łatwą identyfikację cząstek (odpowiadające próbkowaniu obiektu o zwykle <2 A/piksel). Ustaw przesunięcie rozmycia na ~-3 do -5 μm przy dawce elektronów ekspozycji ~40-80 e-/ Å2.
  5. Wykonaj iterację przez kroki opisane w punkcie 4.4, aby ocenić zakres grubości lodu pod kątem rozkładu cząstek, orientacji i zanieczyszczenia w siatce. Rozkład cząstek może się różnić w pobliżu krawędzi w stosunku do środka otworu, dlatego ważne jest, aby badać różne miejsca z otworem.
  6. Prześwietl wszystkie siatki, które są obiecujące z atlasów, jako posiadające wystarczającą liczbę kwadratów siatki. Albo należy je przechowywać w mikroskopie i przystępować do akwizycji danych za pomocą EPU, albo wyładować próbki z mikroskopu i przechowywać w LN2 do czasu zaplanowania zbierania danych.

5. Zbieranie danych krioEM pojedynczych cząstek (z naciskiem na zdalną obsługę)

UWAGA: Szczegółowy protokół pozyskiwania danych za pomocą EPU jest opisany w podręczniku producenta i gdzie indziej28. W tym miejscu podkreślono modyfikacje tego protokołu do obsługi zdalnej (a mianowicie ograniczenie wykorzystania paneli ręcznych do wykonywania zadań i korzystanie z alternatyw opartych na oprogramowaniu).

  1. O ile nie został on już zebrany podczas sesji, zbierz Atlas do siatki.
  2. Zdefiniuj każde z ustawień wstępnych belki zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami projektu.
  3. Wykonaj kalibrację przesunięcia obrazu28.
  4. Skonfiguruj sesję EPU.
    1. W EPU wybierz stronę EPU, a następnie Ustawienia sesji, wybierz Nowa sesja, a następnie Nowa w preferencjach.
    2. Wybierz pozycję Nowa sesja, pojawi się wyskakujące okienko z opcją użycia poprzednich ustawień. Tak spowoduje automatyczne załadowanie ustawień z poprzedniego EPU (tj. nośnika próbki, zakresu rozmycia, ustawień autofokusa, typu siatki) do bieżącej sesji EPU. Wybranie opcji Nowy w preferencjach umożliwia użytkownikowi wybranie pliku z zapisanymi preferencjami (tj. zakres ostrości, ustawienia autofokusa, typ siatki), a informacje te zostaną wstępnie załadowane do EPU.
    3. Wpisz nazwę sesji czymś informacyjnym. Lokalna placówka może zasugerować konwencję nazewnictwa.
    4. W polu Type (Typ) wybierz opcję Manual (Ręcznie).
    5. W trybie Akwizycja wybierz dokładne centrowanie otworów lub szybszą akwizycję.
    6. W polu Format obrazu wybierz żądany format.
    7. Wybierz odpowiedni folder przechowywania, a EPU utworzy katalog z nazwą sesji.
    8. Wybierz odpowiedni nośnik próbki, w zależności od rodzaju siatki i stosowanych odstępów między otworami (np. Quantifoil 1.2/1.3) i naciśnij Zastosuj. Protokół ten opisuje proces generowania szablonu dla regularnej tablicy otworów
  5. Wybierz początkowy kwadrat siatki i ustaw szablon przejęcia.
    1. Idź Kwadrat zaznaczenia, jeśli wszystkie kwadraty są zielone, kliknij odznacz wszystko w lewym górnym rogu.
    2. Otwórz kafelki (kliknij prawym przyciskiem myszy> otworzyć kafelek). Wybierz kwadrat (kliknij prawym przyciskiem myszy, > dodać, kliknij prawym przyciskiem myszy > przenieś scenę do kwadratu siatki).
    3. Przejdź do opcji Wybór otworów i naciśnij przycisk Auto eucentryczny. Poczekaj, aż to zostanie zakończone i zostanie zrobiony obraz kwadratu siatki. Jeśli funkcja automatyczna nie powiedzie się, może to być spowodowane tym, że wysokość jest znacznie obniżona; jeśli tak, można go regulować ręcznie za pomocą FluScreen w powiększeniu Grid Square.
    4. Zmierz rozmiar otworu. Przesuń i dostosuj żółte kółka tak, aby znajdowały się nad otworami o odpowiednim rozmiarze i odstępach.
    5. Naciśnij przycisk Znajdź otwory. Sprawdź, czy otwory zostały znalezione prawidłowo. Jeśli nie, zmień rozmiar otworu i ponownie znajdź otwory. Powtarzaj to, aż prawidłowo znajdzie otwór. Jeśli konsekwentnie się nie powiedzie, rozważ przejście do niższego rozmiaru plamki (jaśniejszej) przy powiększeniu siatki do kwadratu.
    6. Użyj histogramu jakości lodu filtra po prawej stronie, aby dostosować wybór otworów. Może to być przydatne do wykluczenia obszarów z grubym lodem i cienkim lodem. Zostanie to zapamiętane dla przyszłych kwadratów siatki wybranych podczas tej sesji.
    7. Zoptymalizuj wybór otworów za pomocą narzędzi w menu Wybierz u góry. Na przykład kliknij Usuń otwory w pobliżu paska siatki.
    8. Przejdź do Definicji szablonu i naciśnij Pobierz.
    9. Kliknij Znajdź i wyśrodkuj otwór. Pojawi się teraz obraz z żółtym kółkiem wokół.
      UWAGA: Jeśli ma trudności ze znalezieniem otworu, włóż otwór obiektywu. Jeśli nadal nie może znaleźć otworu, spróbuj wydłużyć czas naświetlania dla ustawienia wysokości otworu/eucentrycznego lub zwiększyć rozmycie dla tego ustawienia wstępnego lub wbić obraz do kosza. Duża zmiana rozmycia może zmienić wyrównanie przesunięcia obrazu.
    10. Zmień czas opóźnienia po przesunięciu etapu i opóźnienia po przesunięciu obrazu na 1-5 s.
    11. Sprawdź, czy maksymalna wartość przesunięcia obrazu (jeśli opcja jest dostępna) jest zgodna z potrzebami. Jeśli używane jest zbieranie przesunięć obrazu bez aberracji, wartość ta jest zdefiniowana w pliku konfiguracyjnym EPU, w przeciwnym razie 5 μm jest wartością standardową.
    12. Kliknij opcję Dodaj obszar pozyskiwania, a następnie kliknij w dowolnym miejscu obrazu. Przesuń obszar akwizycji w żądane miejsce (tj. na krawędzi otworu), tak aby obszary akwizycji nie były podwójnie naświetlone wiązką (kwadrat w zielonym okręgu reprezentuje obszar detektora, zielone kółko to średnica wiązki).
    13. W prawym górnym rogu dodaj zakres rozmycia. Następnie dodaj inne obszary pozyskiwania. Typowa lista rozmycia dla projektu białka błonowego to rozogniskowanie od -0,8 do -3 μm.
    14. Kliknij Dodaj obszar autofokusa i kliknij w dowolnym miejscu obrazu. Przesuń obszar autofokusa na węgiel otaczający otwór. Standardową praktyką jest autofokus po wyśrodkowaniu podczas korzystania z AFIS lub co 5-15 μm, w zależności od zmiany wysokości z w poprzek kwadratu.
    15. Kliknij Dodaj obszar pomiaru dryftu, pomiar dryftu wykonywany raz na kwadrat siatki, z ustawionym progiem 0,05 nm/s jest ustawieniem standardowym. Obszar pomiaru dryftu może (i jest to dobry pomysł) pokrywać się bezpośrednio z obszarem autofokusa. Upewnij się, że ani dryf, ani obszar autofokusa nie pokrywają się z obszarem akwizycji.
      UWAGA: Szablon można sprawdzić za pomocą funkcji wykonywania szablonu. Jest to dobry pomysł, aby sprawdzić, czy obszary akwizycji wymagają przesunięcia (np. za dużo/za mało węgla na obrazach), ale nie jest to konieczne.
    16. Wróć do wyboru kwadratów i na siatce wybierz kwadraty do przejęcia. Użyj liczby obszarów akwizycji i oczekiwanej szybkości pozyskiwania danych (z obiektu w oparciu o detektory i konfigurację eksperymentalną), aby przewidzieć, ile obszarów akwizycji jest wymaganych.
    17. Po wybraniu wszystkich żądanych kwadratów naciśnij przycisk Przygotuj wszystkie kwadraty.
    18. Po zebraniu każdego kwadratu nawiguj między kwadratami siatki i dostosuj otwory za pomocą pędzla wyboru.
  6. Przejdź do lokalizacji sceny nad próbką i użyj funkcji automatycznych, aby ustawić wysokość eucentryczną. Wykonuj wyrównanie mikroskopu zgodnie z wcześniejszym opisem28, ale zamiast wykonywać wyrównanie bez komy i ręcznie korygować astygmatyzm obiektywny, skorzystaj z narzędzi do wyrównania w oprogramowaniu. Krótko mówiąc, ustaw warunki wiązki akwizycyjnej, upewnij się, że apertura obiektywu (OA) została usunięta, a stolik jest umieszczony nad stabilnym obszarem wiązki próbki na wysokości eucentrycznej. Wykonaj wyrównanie bez komy w ramach funkcji automatycznych przed ponownym włożeniem i wyśrodkowaniem OA oraz korekcją astygmatyzmu soczewki obiektywu za pomocą EPU. Upewnij się, że oba ułożenia zbiegają się na odpowiednich wartościach (<150 nm komy i bliski zeru astygmatyzm.
    1. Przed rozpoczęciem automatycznego przebiegu akwizycji upewnij się, że pompa turbo automatycznej ładowarki jest wyłączona, a otwór obiektywu jest włożony.
  7. W obszarze Automatyczne pobieranie naciśnij przycisk Rozpocznij uruchamianie, aby rozpocząć automatyczne pobieranie danych.

6. Przetwarzanie obrazu w celu uzyskania mapy gęstości EM

UWAGA: Większość urządzeń krioEM oferuje wstępne przetwarzanie filmów mikrograficznych 'w locie'. W tym celu dostępnych jest wiele różnych pakietów oprogramowania i podejść, w tym RELION pipelines28,33, cryoSPARC43, Scipion34 i WarpEM44. Opisany jest tutaj potok oparty na RELION i zakłada się, że użytkownik przeniósł filmy z mikrofotografii do odpowiedniej lokalizacji przechowywania z dostępem do zasobów obliczeniowych. Przedstawiono przegląd procesu i reprezentatywne wyniki dla projektu dotyczącego białek błonowych, szczegółowy opis i samouczek krok po kroku można znaleźć na stronie internetowej RELION: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.

  1. Wykonuj "w locie" analizę korekcji ruchu mikrograficznego i estymacji CTF. Uruchom RELION w katalogu projektu. Zaplanuj zadania importu, korekcji ruchu i szacowania CTF tak, aby zapętlały się w taki sposób, aby były współbieżne z gromadzeniem i przesyłaniem danych. Skrypt do analizy mikrograficznej28 dostarcza w czasie rzeczywistym wizualnej informacji zwrotnej na temat astygmatyzmu i szacowanych wartości rozmycia (zobacz reprezentatywne wyniki).
  2. Wybieraj cząstki ze wstępnie przetworzonych mikrofotografii. Do wyboru jest wiele pakietów oprogramowania do automatycznego zbierania cząstek. Opcje kompletacji bez odniesień i oparte na szablonach są dostępne w zakładce Automatyczne wybieranie w RELION37. Inne programy mogą być używane do różnych kroków, na przykład za pomocą crYOLO do zbierania cząstek35.
  3. Wyodrębnij cząstki z mikrofotografii z korektą CTF.
    UWAGA: Aby skrócić czas obliczeniowy wymagany do wczesnych, "oczyszczających" etapów przetwarzania, należy zmniejszyć skalę/zaśmiecić cząstki podczas ekstrakcji. Szczegółowe informacje na temat uruchamiania zadania wyodrębniania można znaleźć w samouczku RELION 3.1. W tym projekcie cząstki zostały początkowo zabyliżowane przez współczynnik 2.
  4. Wykonaj uśrednianie klas 2D. Klasyfikacja w 100–200 klasach działa dobrze w przypadku większości zestawów danych zawierających ≥100 000 cząstek. Nie zaleca się używania wielu więcej niż 200 klas lub mniej niż 50 klas, nawet jeśli zestawy danych są małe, chyba że próbka ma wysoką symetrię (tj. wirus dwudziestościenny), w którym to przypadku mniej niż 50 klas może nadal dawać dobry wynik. Ustaw średnicę maski na tyle dużą, aby zmieścić najdłuższy wymiar cząstki, ale na tyle ciasną, aby wykluczyć wszelkie sąsiednie cząstki (może to wymagać kilku prób i błędów).
  5. Wybierz dobre klasy (tj. te z detalami strukturalnymi) za pomocą zadania wyboru podzbioru. Przykłady dobrych i złych średnich klas 2D można znaleźć w sekcji reprezentatywnych wyników.
  6. Wygeneruj początkowy model de novo na podstawie danych za pomocą zadania początkowego modelu 3D w RELION.
    UWAGA: Mniej czyste stosy cząstek mogą skorzystać z wieloreferencyjnego udoskonalenia ab initio SGD (stochastic gradient descent), ponieważ daje to dodatkową możliwość odsiewania śmieci/nieoptymalnych cząstek. Wybierz średnicę maski, która może pomieścić interesującą cząstkę, i pozostaw domyślne wartości dla pól w zakładce "SGD", ponieważ rutynowo działają one dobrze. Upewnij się, że początkowy model wygląda rozsądnie w Chimerze (lub innym odpowiednim programie do wizualizacji) (patrz reprezentatywne wyniki).
  7. Wykonaj klasyfikację 3D, aby rozwiązać problem niejednorodności danych, używając danych wyjściowych z kroku 6.6 jako modelu referencyjnego. Oceń wynikowe mapy w Chimerze. Przetwarzaj niezależnie stosy cząstek odpowiadające unikalnym stanom konformacyjnym. Użyj zadania wyboru podzbioru, aby wybrać klasę/klasy zainteresowania i wygenerować pliki particles.star dla powiązanych stosów cząstek.
  8. Uruchom automatyczne udoskonalanie 3D. Średnie klasy 3D uzyskane w poprzednim kroku można wykorzystać jako punkty odniesienia do uściślenia odpowiadających im stosów cząstek. Jeśli rozdzielczość zagęszczenia zbliża się do limitu Nyquista danych, ponownie wyodrębnij cząstki bez zmniejszania skalowania. Po ponownym wyodrębnieniu powtórz zadanie automatycznego uszlachetniania 3D z nieskinningowanym stosem cząstek. W takim przypadku modele referencyjne 3D muszą zostać przeskalowane w taki sposób, aby rozmiary pikseli i ramek były zgodne z rozmiarami ponownie wyodrębnionych obrazów cząstek. Użyj narzędzia wiersza poleceń relion_image_handler, aby wykonać tę operację.
  9. W razie potrzeby wykorzystaj symetrię w udoskonaleniu. Jeśli zrekonstruowana mapa ma symetrię, wyrównaj mapę do odpowiedniej osi symetrii za pomocą narzędzia wiersza poleceń relion_align_symmetry. Wynikowej mapy wyrównanej można użyć jako odniesienia w nowym zadaniu automatycznego udoskonalania 3D z odpowiednim operatorem symetrii określonym na karcie odniesienia.
  10. Wyostrzanie map dzięki automatycznemu poprawianiu 3D. Odbywa się to za pomocą zadania post-processingu w RELION, ale najpierw należy utworzyć odpowiednią maskę z dopracowanej mapy. Etapy tworzenia maski i przetwarzania końcowego są szczegółowo opisane w samouczku RELION (zobacz również reprezentatywne wyniki).
    UWAGA: Rozdzielczość wielu rekonstrukcji można dodatkowo poprawić, korzystając z funkcji polerowania bayesowskiego i udoskonalania CTF w RELION. Użyj zadania uściślania CTF, aby oszacować i skorygować aberracje wyższego rzędu (nachylenie wiązki, aberracje koniczyny i aberracje 4. rzędu) oraz, jako oddzielne zadania, powiększenie anizotropowe i rozogniskowanie na cząstkę. Następnie użyj zadania polerowania bayesowskiego (wytrenowanego lub z wartościami domyślnymi), aby zająć się ruchem wywołanym wiązką na podstawie cząstki. Jak omówiono w samouczku RELION 3.1, te zadania prawdopodobnie skorzystają z podejścia iteracyjnego (udoskonalanie CTF → polerowanie bayesowskie → automatyczne udoskonalanie 3D → →pętla przetwarzania końcowego), ponieważ oba korzystają z modeli o wyższej rozdzielczości.
  11. W razie potrzeby należy skorygować ręczność map gęstości EM. Zbadaj mapy, aby określić, czy ręczność jest poprawna, próbując dopasować do istniejącego modelu atomowego lub oceniając ręczność regionów alfa helis. Tam, gdzie jest to wymagane, odwróć mapę wzdłuż osi z w UCSF Chimera45 za pomocą polecenia 'vop zflip'.

Wyniki

Podczas screeningu siatki mogą zostać odrzucone na etapie tworzenia atlasu, gdy cechy widoczne przy niskim powiększeniu wskazują, że siatka nie nadaje się do akwizycji danych. Przykładem jest sytuacja, w której siatka uległa znacznym uszkodzeniom mechanicznym i większość pól siatki jest pęknięta (Rysunek 2A), lub gdy siatka wydaje się być „sucha”, bez lodu witryfikowanego (Rysunek 2B). Takie siatki są zazwyczaj możliwe do zidentyfikowania, ponieważ krawędzie pól siatki wydają się ostre i wyraźne. W większości siatek przygotowanych za pomocą urządzenia do mrożenia przez zanurzenie obserwuje się gradient lodu (Rysunek 2C,D). Rozkład cząsteczek, w zależności od badanego preparatu, może drastycznie różnić się wraz z grubością lodu, dlatego zaleca się screening wielu pól siatki w celu oceny rozkładu cząsteczek. W oprogramowaniu EPU, podczas etapu screeningu atlasu, zaimplementowano narzędzia pomagające użytkownikowi zidentyfikować pola siatki o podobnej lub różnej grubości lodu, co może być szczególnie pomocne dla osób rozpoczynających pracę z siatkami do cryoEM (Rysunek 2E, F).

figure-results-1
Rycina 2: Przykładowe montaże „atlasu” o niskim powiększeniu z sesji przesiewowych. A) Siatka, która uległa znacznym uszkodzeniom, przy czym większość pól siatki jest pęknięta – nieodpowiednia do zbierania danych. B) Sucha siatka bez lodu witryfikowanego – nieodpowiednia do zbierania danych. C) Siatka wykazująca gradient lodu, z ok. 50% powierzchni nadającej się do użytku. D) Gradient lodu z ok. 33% powierzchni siatki nadającej się do użytku. Zarówno C, jak i D nadają się do zbierania danych, jeśli użyteczne pola siatki mają grubość lodu odpowiednią do akwizycji, a liczba obszarów akwizycji jest wystarczająca, aby spełnić minimalny czas zbierania danych (np. 24 h). E) Przykładowy atlas z różnymi grubościami lodu. F) Ten sam atlas przedstawiony w E, ale z polami siatki skategoryzowanymi i pokolorowanymi przez oprogramowanie EPU zgodnie z grubością lodu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Podczas oceny rozkładu cząstek należy upewnić się, że parametry obrazowania, takie jak powiększenie i całkowna dawka elektronów, są zbliżone do tych, których planuje się użyć podczas akwizycji danych, aby uzyskać wierny obraz oczekiwanych wyników. Podczas przeglądu idealny rozkład cząstek powinien być monodyspersyjny, z widocznym zakresem orientacji cząstek (zależnie od próbki i istniejącej wiedzy na temat morfologii cząstek, może to być trudne do ustalenia) (Rycina 3A). Lód powinien być tak cienki, jak to możliwe, przy jednoczesnym pomieszczeniu największego wymiaru cząstek; jeśli lód jest zbyt cienki, może ulec stopieniu pod wpływem wiązki elektronów. Powoduje to nadmierny ruch na mikrografii, a obszary wykazujące tę charakterystykę należy pomijać (Rycina 3B). Z doświadczenia wynika, że efekt ten najczęściej występuje, gdy w buforze znajduje się detergent. Może to prowadzić do powstania bardzo cienkiego lodu w centrum otworu, przez co cząstki mogą zostać fizycznie wykluczone i wypchnięte w stronę krawędzi. Efekt ten widoczny jest na Rycynie 3C, jednak w tym przypadku nie jest on ekstremalny i takie obrazy nadal mogłyby użytecznie wnieść wkład do zbioru danych. Wreszcie, lód musi być amorficzny; z akwizycji danych należy wykluczyć wszelkie obszary siatki (lub siatek), w których większość lub wszystkie wykonane obrazy wykazują lód krystaliczny (Rycina 3D). Często lód nieamorficzny obserwuje się na krawędziach pól siatki. W celu uzyskania dalszych informacji czytelników odsyłamy do szczegółowych przeglądów zmiennych, które można modyfikować podczas witryfikacji siatki16, oraz do opisów zachowania cząstek w środowisku cienkiej warstwy46, 47 .

figure-results-2
Rysunek 3: Reprezentatywne mikrografie przedstawiające różne rozkłady cząsteczek. A) „Idealny” rozkład monodyspersyjnych cząsteczek przyjmujących różne orientacje. B) Zbyt cienki lód w środku otworu, który odkształca się pod wpływem wiązki elektronów, powodując nadmierny ruch na mikrografii. Efekt ten obserwuje się najczęściej w przypadku obecności detergentu w buforze. C) Gdy lód jest cieńszy w centrum otworu, fizycznie wypycha to cząsteczki z centrum, powodując ich zagęszczenie przy krawędzi otworu. W tym przypadku zjawisko nie jest na tyle silne, aby uniemożliwić wykorzystanie tych obrazów, ale sugeruje to, że warto przeszukać obszary o nieco większej grubości. D) Lód nie jest witryfikowany; dane nie powinny być zbierane z obszarów wyglądających jak na tej przykładowej mikrografii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przetwarzanie obrazów w czasie rzeczywistym pozwala na wykrywanie błędów i problemów z akwizycją danych, dlatego jest zawsze zalecane, gdy tylko jest to możliwe. Na przykład nadmierny ruch na mikrografiach może wskazywać na aktywność pompy turbo autoloadera lub na to, że dane są zbierane z pękniętego pola siatki, w którym lód przesuwa się znacząco w wiązce elektronów, co oznacza, że pole to należy pominąć. Estymacja CTF w czasie rzeczywistym może ujawnić sytuacje, w których zastosowano dodatnią wartość punktu ostrości (zamiast defokusowania) (przy użyciu programów i parametrów do estymacji CTF służących do znajdowania tych punktów) oraz określić przesunięcie fazowe w przypadku zastosowania płytek fazowych Volta48 . Potoki przetwarzania obrazów w czasie rzeczywistym często zawierają graficzne podsumowanie danych (Rycina 4A), aby ułatwić użytkownikom szybką ocenę jakości mikrografii i decyzję, czy konieczne są korekty w procesie zbierania danych.

Wybór cząsteczek z mikrografii, przy jednoczesnym unikaniu „fałszywie dodatnich” wyników, takich jak zanieczyszczenia czy folia wspierająca siatkę, może wymagać optymalizacji. Jednak programy do wyboru cząsteczek, takie jak crYOLO, często działają wystarczająco dobrze przy użyciu domyślnych parametrów podczas „pierwszego przejścia” przez dane (Rycina 4B), co umożliwia przejście do uśredniania klas 2D, gdzie łatwiej jest ocenić jakość danych i prawdopodobieństwo sukcesu w dalszych etapach. W większości projektów klasyfikacja 2D ~> 10 tys. cząsteczek powinna zacząć ujawniać klasy posiadające szczegóły struktury drugorzędowej. Aby przejść do etapu 3D, etap klasyfikacji 2D powinien zazwyczaj ujawnić klasy reprezentujące szereg orientacji cząsteczek. Jeśli ujawniona zostanie orientacja preferencyjna, może być wymaganych więcej iteracji przygotowania próbki16 lub dalsza akwizycja danych z próbką nachyloną49. Do analizy 3D należy wybrać wszystkie klasy wykazujące szczegóły struktury drugorzędowej, natomiast cząsteczki „śmieciowe” należy odrzucić (Rycina 4C).

figure-results-3
Rycina 4: Początkowe etapy przetwarzania obrazów. A) Wynik działania skryptu do przetwarzania obrazów w czasie rzeczywistym („on the fly”). B) Przykładowa mikrografia (po lewej) z odpowiednio automatycznie wybranymi cząsteczkami zidentyfikowanymi przy użyciu ogólnego modelu crYOLO (po prawej, cząsteczki obramowane czerwonymi kwadratami). Paski skali (białe) wynoszą 50 nm. C) Wyniki klasyfikacji 2D pokazujące klasy, które zostały odrzucone (w czerwonym kwadracie), oraz klasy, z których wybrano cząsteczki do dalszego przetwarzania (w kolorze zielonym). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mały podzbiór cząsteczek można wykorzystać do wygenerowania modelu początkowego (Rysunek 5A). Model ten może następnie posłużyć jako model startowy w klasyfikacji 3D i udoskonalaniu (refinement). W przypadku RagAB zestaw danych zawierał trzy odrębne konformery, które można rozdzielić podczas klasyfikacji 3D (Rysunek 5B). Cząsteczki przypisane do każdej z tych klas mogą być następnie przetwarzane niezależnie i wykorzystane do udoskonalenia mapy gęstości EM, która może być następnie poddana dalszej interpretacji i budowie modelu.

figure-results-4
Rysunek 5: Generowanie trójwymiarowej mapy gęstości EM. A) Typowy model początkowy wygenerowany przy użyciu programu RELION. B) Klasyfikacja 3D na 5 klas wykazująca podział cząsteczek na trzy odrębne stany konformacyjne: otwarty-otwarty (zielony), otwarty-zamknięty (niebieski), zamknięty-zamknięty (fioletowy). C) Proces tworzenia maski. Mapę z udoskonalenia 3D (lewo) należy zwizualizować w programie Chimera. Następnie można użyć przeglądarki wolumetrycznej do zidentyfikowania najniższego progu, przy którym mapa jest wolna od rozłączonej, szumowej gęstości (środek). Wartość tego progu jest wprowadzana jako początkowy próg binaryzacji w zadaniu tworzenia maski w programie RELION. Przykład wyjściowej maski pokazano na kolor szary (prawo). D) Wysokorozdzielcza mapa gęstości EM stanu otwartego-zamkniętego RagAB (EMD-10245), przefiltrowana i pokolorowana według lokalnej rozdzielczości (Å). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole opisaliśmy podstawowy potok mający zastosowanie do próbek podatnych na rutynowe SPA. Chociaż ta metoda bibuły filtracyjnej polegająca na tworzeniu cienkich warstw i witryfikacji jest niewątpliwie skuteczna, biorąc pod uwagę jej zastosowanie w zdecydowanej większości dotychczasowych projektów SPA, ma ona szereg wad. Należą do nich: marnotrawstwo próbki, powolne czasy (sekundy) wymagane do uformowania cienkiej warstwy i zamrożenia próbki, zgłoszona nieodtwarzalność27 oraz zgłoszone negatywne skutki stosowania bibuły filtracyjnej do usuwania nadmiaru cieczy50. Ostatnio opracowano nowe technologie poprawiające odtwarzalność produkcji cienkich warstw51, 52. Opracowano inne technologie, które skracają czas między nałożeniem próbki a witryfikacją 53,54,55. Podczas gdy metody tworzenia cienkich warstw oparte na bibule filtracyjnej pozostają najbardziej wszechobecną metodą przygotowania próbek krioEM SPA w momencie pisania tego tekstu, te nowe technologie mogą przynieść szereg korzyści w zakresie wydajności i odtwarzalności witryfikacji siatki, a także stworzyć nowe możliwości wprowadzenia dodatkowych wymiarów eksperymentalnych, takich jak rozdzielczość czasowa i szybkie mieszanie przed witryfikacją.

Proces przesiewania siatki dla większości użytkowników jest obecnie procesem jakościowym, który obejmuje pozyskiwanie atlasów o małym powiększeniu, a następnie wykonywanie obrazów w dużym powiększeniu w poprzek siatki w celu oceny rozkładu cząstek. Chociaż jest to wystarczająco solidne podejście dla niektórych typów próbek, może być trudno ocenić, czy próbka jest rzeczywiście tym, co badacz ma nadzieję zobrazować, czy też ma preferowaną orientację, na przykład w przypadku małych (<200 kDa) próbek lub gdy morfologia o niskiej rozdzielczości utrudnia identyfikację wzrokową, czy obecny jest zakres rozkładów cząstek. W przypadku niektórych projektów niemożliwe jest określenie, czy próbka jest zgodna z oczekiwaniami, na przykład gdzie związany jest ligand lub gdzie próbka jest badana przesiewowo w celu oceny, czy mała (np. 10 kDa) podjednostka jest nadal obecna w połączeniu z kompleksem. W przypadku tych projektów w pełni zautomatyzowane potoki do analizy danych w połączeniu z "krótkimi" zbiorami trwającymi od 0,5 do 1 godziny, które mogą przechodzić przez kolejne etapy przetwarzania obrazu do klasyfikacji 2D, a nawet klasyfikacji i udoskonalania 3D, pomogłyby skutecznie określić, czy uzasadniona jest dłuższa kolekcja. Rurociągi te są nadal w fazie rozwoju i nie są obecnie powszechnie stosowane, ale mają potencjał, aby poprawić wydajność przesiewania siatek krioEM, zwłaszcza w przypadku trudnych próbek.

Ulepszenia w bezpośrednich detektorach elektronów, a także modyfikacje mikroskopii w połączeniu z postępami w przetwarzaniu obrazów, takich jak gromadzenie danych o przesunięciach obrazu, zwiększyły przepustowość i jakość obrazów wytwarzanych podczas pozyskiwania danych. Ten wzrost szybkości gromadzenia danych podkreśla potrzebę dokładnych badań przesiewowych sieci krioelektromagnetycznych przed pozyskaniem wielu TB danych.

CryoEM SPA stało się naprawdę główną techniką biologii strukturalnej, a w wielu przypadkach podejściem "go-to" dla niektórych klas próbek, takich jak heterogeniczne i labilne kompleksy makromolekularne. Podczas gdy niniejszy protokół opisuje podstawowy przegląd rurociągu SPA, każda omówiona tutaj sekcja (witryfikacja i przesiewanie siatki, krioEM i przetwarzanie obrazu) jest tematem samym w sobie i wartym zbadania podczas opracowywania projektu SPA. Wraz z postępem technologii przygotowywania próbek i mikroskopii oraz pojawianiem się nowych algorytmów i podejść do przetwarzania obrazu, SPA będzie nadal rozwijać się jako rurociąg, pomagając naukowcom w uzyskiwaniu wglądu w złożone systemy biologiczne.

Oświadczenia

Nie zgłasza się żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej. J. B. R. White jest finansowany przez Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). Mikroskopy FEI Titan Krios zostały ufundowane przez Uniwersytet w Leeds (nagroda UoL ABSL) i Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Dziękujemy M. Iadanzie za skorzystanie z jego skryptu do analizy mikrograficznej. Dziękujemy firmie Diamond Light Source za dostęp i wsparcie urządzeń kriogenicznych w brytyjskim krajowym Centrum Bioobrazowania Elektronów (eBIC) finansowanych przez Wellcome Trust, MRC i BBRSC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pęsetaAgar ScientificAGT5022
Okrągłe pudełko do przechowywania Cryo EMAgar ScientificAGG3736
Pudełka z autosiatką CryoEMThermoFisher Scientific1084591
Siatki CryoEMQuantifoilN1-C14nCu30-01
EtanBoc270595-F
LN2  pianka dewarAgar ScientificAG81760-500
LN2  przechowywanie dewarWorthington industriesHC 34
Końcówki do pipetGilson10082012
Starlabss1111-1706
StrzykawkaBDBD 300869
Woda laboratoryjna typu IISuezselect fusion
VitrobotThermoFisher Scientific1086439
VitrobotWhatman1001-055
Zespół pojemników styrophome VitrobotPęsety ThermoFisher Scientific1086439
VitrobotThermoFisher Scientific72882-D
Software
EPUSerwer TEM ThermoFisher Scientific2.8.1.10REL
ThermoFisherScientific6.15.3.22415REL
TiaThermoFisher Scientific5.0.0.2896REL
Mikroskop Titan KriosThermoFisher ScientificTitan Krios G2
Bibuła filtracyjna

Bibliografia

  1. Kuehlbrandt, W. The Resolution Revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R. Direct Electron Detectors. Methods in Enzymology. , (2016).
  3. Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
  4. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  5. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
  6. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
  7. Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
  8. Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369(2018).
  9. Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
  10. Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
  11. Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
  12. Scarff, C., et al. Structure of the shutdown state of myosin-2. Nature. , (2020).
  13. Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465(2020).
  14. Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
  15. Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
  16. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, Pt 6 560-571 (2018).
  17. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  18. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  19. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  20. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
  21. Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation Damage in Electron Cryomicroscopy. Methods in enzymology. 481, 371-388 (2010).
  22. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (02), 129-228 (1988).
  23. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
  24. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
  25. Sgro, G. G., Biosciences, T. R. D. C. F. 2018 Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. researchgate.net. , Available from: http://www.researchgate.net/profile/Tiago_Costa12/publication/326710861_Cryo-EM_Grid_Preparation_of_Membrane_Protein_Samples_for_Single_Particle_Analysis/links_EM-Grid-Preparation-of-Membrane-Protein-Samples-for-Single-Parti (2018).
  26. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
  27. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
  28. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  29. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  30. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
  31. Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
  32. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
  33. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, Pt 6 496-502 (2017).
  34. Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
  35. Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
  36. Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
  37. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163(2018).
  38. Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
  39. Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
  40. Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
  41. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
  42. Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
  43. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
  44. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
  45. Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
  46. Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
  47. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32(2018).
  48. Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
  49. Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
  50. Armstrong, M., Han, B. -G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
  51. Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
  52. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
  53. Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, Pt 12 1063-1070 (2019).
  54. Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
  55. Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza pojedynczych cząsteczekskrining siatekprzygotowanie próbkiakwizycja danychprzetwarzanie obrazówmapa gęstości EMzdalne sterowanie mikroskopemklasyfikacja 3Dwyznaczanie struktury białka
Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.