Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62416

⸱

14 marca 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę opracowywania, charakteryzowania i śledzenia w czasie rzeczywistym przerzutów nowotworowych w modelu nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego, szczególnie w transgenicznej linii danio pręgowanego z nadekspresją MYCN i LMO1, która rozwija przerzuty spontanicznie.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się ważnym modelem zwierzęcym do badania ludzkich chorób, zwłaszcza raka. Wraz z solidnymi technologiami transgenicznymi i edycji genomu stosowanymi w modelowaniu danio pręgowanego, łatwość konserwacji, wysoka wydajność i potężne obrazowanie na żywo sprawiają, że danio pręgowany jest cennym systemem modelowym do badania przerzutów oraz podstaw komórkowych i molekularnych leżących u podstaw tego procesu in vivo. Pierwszy model przerzutów nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego (NB) został opracowany przez nadekspresję dwóch onkogenów, MYCN i LMO1, pod kontrolą promotora dopaminy-beta-hydroksylazy (dβh). Jednoczesna nadekspresja MYCN i LMO1 doprowadziła do zmniejszenia latencji i zwiększonej penetracji neuroblastomagenezy, a także przyspieszonego odległego przerzutowania komórek nowotworowych. Ten nowy model wiarygodnie powtarza wiele kluczowych cech przerzutowej NB u ludzi, w tym udział klinicznie istotnych i związanych z przerzutami zmian genetycznych; naturalny i spontaniczny rozwój przerzutów in vivo; i zachowane miejsca przerzutów. Dlatego model danio pręgowanego ma wyjątkowe zalety w zakresie analizy złożonego procesu przerzutów nowotworowych in vivo.

Wprowadzenie

Danio pręgowany był szeroko stosowany i stosowany w wielu dziedzinach badań, zwłaszcza w raku. Model ten zapewnia wiele zalet - takich jak solidna reprodukcja, ekonomiczna konserwacja i wszechstronna wizualizacja wzrostu guza i przerzutów - z których wszystkie sprawiają, że danio pręgowany jest potężnym narzędziem do badania i badania komórkowych i molekularnych podstaw nowotworzenia i przerzutów. Nowe techniki mapowania genomu na dużą skalę, transgenezy, nadekspresji lub nokautowania genów, przeszczepu komórek i chemicznych badań przesiewowych ogromnie zwiększyły możliwości modelu danio pręgowanego1. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano wiele linii danio pręgowanego do badania nowotworzenia i przerzutów różnych nowotworów u ludzi, w tym między innymi białaczki, czerniaka, mięsaka prążkowanokomórkowego i raka wątrobowokomórkowego2,3,4,5. Ponadto pierwszy model nerwiaka zarodkowego (NB) zebrywanego został wygenerowany przez nadekspresję onkogenu MYCN w obwodowym współczulnym układzie nerwowym (PSNS) pod kontrolą promotora dopaminy-beta-hydroksylazy (dβh). Dzięki temu modelowi wykazano ponadto, że aktywowany ALK może działać synergicznie z MYCN w celu przyspieszenia wystąpienia guza i zwiększenia penetracji guza in vivo6.

NB wywodzi się z linii współczulno-nadnerczowej komórek grzebienia nerwowego i jest wysoce przerzutowym nowotworem u dzieci7. Jest odpowiedzialny za 10% zgonów związanych z nowotworami u dzieci8. Szeroko przerzutowe w momencie rozpoznania, NB może być klinicznie prezentowane jako guzy pochodzące głównie wzdłuż łańcucha zwojów współczulnych i rdzenia nadnerczy PSNS9,10. Amplifikacja MYCN jest często związana ze słabymi wynikami u pacjentów z NB11,12. Co więcej, LMO1 został zidentyfikowany jako krytyczny gen podatności na NB w przypadkach wysokiego ryzyka13,14. Badania wykazały, że transgeniczna koekspresja MYCN i LMO1 w PSNS modelu danio pręgowanego nie tylko sprzyja wcześniejszemu wystąpieniu NB, ale także indukuje rozległe przerzuty do tkanek i narządów, które są podobne do miejsc powszechnie obserwowanych u pacjentów z klasą wysokiego ryzyka NB13. Całkiem niedawno, inny przerzutowy fenotyp NB zaobserwowano również w nowszym modelu NB danio pręgowanego, w którym zarówno MYCN, jak i Lin28B, kodujące białko wiążące RNA, ulegają nadekspresji pod kontrolą promotora dβh16.

Stabilne podejście transgeniczne u danio pręgowanego jest często wykorzystywane do badania, czy nadekspresja interesującego genu może przyczynić się do normalnego rozwoju i patogenezy choroby14,15. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do zademonstrowania znaczenia wielu genów i szlaków w nowotworzeniu NB6,16,17,18,19,20. W tym artykule przedstawimy, w jaki sposób powstała transgeniczna linia ryb, która wykazuje nadekspresję zarówno MYCN, jak i LMO1 w PSNS oraz jak wykazano, że współpraca tych dwóch onkogenów przyspiesza początek nowotworzenia NB i przerzutów13. Po pierwsze, linia transgeniczna, która wykazuje nadekspresję EGFP-MYCN pod kontrolą promotora dβh (oznaczonej linii MYCN), została opracowana przez wstrzyknięcie konstruktu dβh-EGFP-MYCN do jednokomórkowego stadium zarodków AB typu dzikiego (WT), jak opisano wcześniej6,17. Oddzielna linia transgeniczna, która ulega nadekspresji LMO1 w PSNS (oznaczona linia LMO1) została opracowana przez jednoczesne wstrzyknięcie dwóch konstruktów DNA, dβh-LMO1 i dβh-mCherry, do zarodków WT w stadium jednokomórkowym13. Wcześniej wykazano, że współwstrzykiwane podwójne konstrukty DNA mogą być współzintegrowane z genomem ryby; w związku z tym LMO1 i mCherry ulegają koekspresji w komórkach PSNS zwierząt transgenicznych. Gdy wstrzyknięte zarodki F0 osiągną dojrzałość płciową, zostały następnie skrzyżowane z rybami WT w celu identyfikacji ryb z dodatnim wynikiem integracji transgenów. Krótko mówiąc, potomstwo F1 zostało najpierw przebadane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pod kątem ekspresji mCherry w komórkach PSNS. Integracja LMO1 z linią zarodkową u ryb mCherry-dodatnich została dodatkowo potwierdzona za pomocą genomowego PCR i sekwencjonowania. Po pomyślnej identyfikacji każdej linii transgenicznej, potomstwo heterozygotycznych ryb transgenicznych MYCN i LMO1 zostało skrzyżowane w celu wytworzenia złożonej linii ryb wyrażającej zarówno MYCN, jak i LMO1 (oznaczonej jako MYCN; Linia LMO1). MYCN z nowotworem; Ryby LMO1 monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co dwa tygodnie pod kątem dowodów na przerzuty guzów w regionach odległych od miejsca pierwotnego, regionu gruczołu międzynerkowego (IRG, odpowiednik ludzkiego nadnercza)13. Aby potwierdzić przerzuty nowotworów w MYCN; Zastosowano analizy ryb LMO1, histologiczne i immunohistochemiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metody badawcze z wykorzystaniem danio pręgowanego i opieki/konserwacji zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi w Mayo Clinic.

1. Przygotowanie i mikroiniekcja konstruktów transgenowych do rozwoju linii transgenicznego zebrywanego LMO1 z nadekspresją w PSNS

  1. Aby opracować klon wejściowy LMO1-pDONR221, należy amplifikować region kodujący ludzkiego LMO1 z cDNA uzyskanego z ludzkiej linii komórkowej za pomocą PCR.
    1. Wykonaj reakcję 25 μl zgodnie z opisem tutaj: 2,5 μL 10x standardowy bufor reakcyjny Taq, 0,125 μL polimerazy DNA Taq, 0,5 μl 10 mM dNTP, 2 μL matrycy cDNA, 0,5 μL 10 μM startera forward LMO1 ATTB1, 0,5 μL 10 μM odwróconego startera LMO1 ATTB2, i 18,875 μl wody.
      UWAGA: Użyj startera LMO1 ATTB1 do przodu: 5'-GGGGACAAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' i odwrócony podkład LMO1 ATTB2: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. Amplifikacja za pomocą następującego programu: 1 cykl 94 °C, 2 min, a następnie 30 cykli (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) i 72 °C, 7 min.
  2. Sklonuj produkt LMO1 PCR do wektora dawcy bramki pDONR221 za pomocą reakcji rekombinazy BP 6,13 (fragment PCR + wektor dawcy = klon wejściowy).
    1. W przypadku reakcji 10 μl należy zmieszać 1 μl oczyszczonego produktu LMO1 PCR (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) wektora dawcy pDONR221 i 6 μl buforu TE (pH 8,0) z 2 μl mieszanki enzymów BP, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C i przekształcić w E. coli kompetentne dla TOP10 przy użyciu protokołu producenta.
    2. Następnie rozprowadzić 50-200 μl z fiolki transformacyjnej na płytce agarowej Luria Bulion (LB) zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Wybierz klony, zaszczepiając pojedynczą kolonię w 2-5 ml LB z 50 μg/ml kanamycyny i hodując przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37 °C.
    4. Użyj 2 ml nocnej hodowli bakteryjnej do izolacji plazmidu zgodnie z protokołem producenta. Aby zweryfikować plazmid LMO1, wyślij próbkę plazmidu do sekwencjonowania za pomocą startera M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. Aby wygenerować klon wejściowy dβh-pDONRP4-P1R, uzyskaj produkt dβh PCR6,13, amplifikując region promotora 5,2 kb przy użyciu klonu CH211-270H11 BAC jako matrycy do przygotowania reakcji 20 μL, jak opisano wcześniej w kroku 1.1.1. Użyj następujących parametrów programu PCR: 94 °C, 2 min; 10 cykli po 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 cykli po 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (ze starterem 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' i odwrócony starter 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAACTTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    UWAGA: Ze względu na długie matryce DNA na tym etapie, upewnij się, że używasz odpowiedniego systemu PCR do dokładnej amplifikacji PCR.
  4. Sklonuj produkt dβh PCR do wektora dawcy bramki pDONRP4-P1R za pomocą reakcji rekombinazy BP 6,13 (fragment PCR + wektor dawcy = klon wejściowy).
    1. Zmieszać 1 μl oczyszczonego produktu dβh PCR (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) wektora dawcy pDONRP4-P1R i 6 μl buforu TE (pH 8,0) z 2 μl mieszanki enzymów BP w sumie 10 μl reakcji, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
    2. Przekształć do TOP10 kompetentnych E. coli zgodnie z protokołem producenta. Wyizolować plazmid zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.4 i zweryfikować plazmid przez sekwencjonowanie starterami M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') i M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. Wygeneruj konstrukcję wyrażenia dβh:LMO1.
    1. Połącz 1 μl każdego wejściowego klonu (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 i p3E-polyA11) (po 20 fmol), 1 μL (60 ng/μL) zmodyfikowanego wektora docelowego z miejscami rozpoznawania I-SceI i 4 μl buforu TE (pH 8,0) zawierającego 2 μl mieszaniny enzymów rekombinazy LR. Inkubować tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
    2. Postępując zgodnie z protokołem producenta, przekształć bakterie w chemicznie kompetentne TOP10 E. coli. Wyizoluj plazmid zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.4 i zweryfikuj plazmid przez sekwencjonowanie starterami DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3') i LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
  6. Wygeneruj konstrukt DNA dβh:mCherry za pomocą systemu bramy, łącząc klony wejściowe promotora dβh o wielkości 5,2 kb, pME-mCherry i p3E-polyA do zmodyfikowanego wektora docelowego zawierającego miejsca rozpoznawania I-SceI, jak wspomniano wcześniej w kroku 1.5.16. Wyizoluj plazmid zgodnie z opisem w krokach 1.2.2-1.2.4 i zweryfikuj plazmid przez sekwencjonowanie starterem DBH Forward (5'-GAAGCTGTCAGGGTTGTG-3').
  7. Linearyzować konstrukt DNA dβh:LMO1 i konstrukt DNA dβh:mCherry (odpowiednio w stosunku 3:1) w sumie 15 μl objętości reakcyjnej z 1 μl enzymu I-SceI (5 U/μL) i 0,75 μl buforu (10x) i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 godziny lub noc. Upewnij się, że stężenie DNA nie przekracza 750 ng w reakcji.
  8. Następnego dnia i po linearyzacji konstruktów dodać 0,5 μl świeżego enzymu I-SceI (5 U/μL) i 0,5 μl 0,5% czerwieni fenolowej do 5 μl całkowitej mieszaniny DNA z poprzedniego etapu 1,7. Mikrowstrzyknąć cały roztwór (50-80 pg zlinearyzowanego DNA) do jednokomórkowych zarodków AB typu dzikiego (i aż 500 zarodków) za pomocą szklanej igły do mikropipet o średnicy 1,0 mm, jak opisano wcześniej17. Pozostałą mieszaninę DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłych wstrzyknięć.

2. Przesiewanie i weryfikowanie transgenicznej linii rybnej LMO1 pod kątem transmisji LMO1 i mCherry w linii zarodkowej

  1. Po 3-4 dniach od zapłodnienia (dpf) znieczulić wstrzyknięte zarodki 0,02% trikainą i przeprowadzić je pod kątem fluorescencyjnej ekspresji mCherry, która występuje w dowolnym miejscu ciała ryby w wyniku transgenezy mozaiki. Przenieś zarodki mCherry-dodatnie na szalkę Petriego ze świeżą wodą z jaj i wyhoduj zarodki do dojrzałości płciowej zgodnie z książką danio pręgowanego21.
    UWAGA: Spodziewaj się, że stosunek ryb dodatnich będzie się różnić w zależności od wiedzy i doświadczenia personelu badawczego. Na przykład początkujący amatorzy mogą mieć niski wskaźnik integracji wynoszący 10%, w porównaniu do eksperta wynoszący ≥50%.
  2. Aby określić rybę założycielską z transgenami dβh:LMO1 i dβh:mCherry zintegrowanymi z komórkami rozrodczymi, należy krzyżować pojedyncze pary wstrzykniętych mCherry-dodatnich ryb dojrzałych płciowo F0 z poprzedniego kroku (2.1) z rybami WT AB. Przebadaj pokolenie F1 pod kątem zarodków mCherry-dodatnich przy 3-4 dpf.
  3. Aby potwierdzić, że ryby mCherry-dodatnie są nosicielami transgenu LMO1, należy wyizolować gDNA z pojedynczego zarodka F1 mCherry-dodatniego za pomocą buforu do ekstrakcji gDNA, który zawiera: 12,5 μl 4x buforu do lizy (500 μL 1 M Tris o pH 8,4, 2,5 ml 1 M chlorku potasu i 47 ml oczyszczonej wody), 35 μL oczyszczonej wody, i 2,5 μl proteinazy K w stężeniu 10 mg/ml. Inkubować próbkę przez 16 godzin w temperaturze 55 °C, a następnie przez 10 minut w temperaturze 98 °C.
  4. Użyć wyekstrahowanego gDNA (2 μL) jako matrycy do genotypowania PCR ze starterami: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAGTACTGGCA -3' i LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3' oraz następujący program PCR: 1 cykl 94 °C, 10 min; 35 cykli (94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s; 68 °C, 30 s); i 68 °C przez 7 min. Potwierdź amplifikowany fragment 182 pz przez sekwencjonowanie.
  5. Po potwierdzeniu genotypu należy doprowadzić pozostałe zarodki F1 mCherry-dodatnie do dojrzałości zgodnie ze standardowymi wytycznymi danio pręgowanego book21. Przytnij płetwy i genotypuj je w wieku 2-3 miesięcy, wykonując kroki 2.3-2.4 z powyższego protokołu, aby dodatkowo potwierdzić integrację transgenu LMO1 w rybach.
    UWAGA: Ryba F1-dodatnia LMO1 będzie stabilną rybą transgeniczną [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (oznaczoną jako linia LMO1).
  6. Wyhoduj stabilną rybę transgeniczną F1 LMO1 z rybą WT i powtórz w razie potrzeby, aby rozmnożyć tę linię.

3. Krzyżowanie linii transgenicznych LMO1 i MYCN w celu stworzenia modelu przerzutowego

  1. Po wygenerowaniu transgenicznej linii ryb pręgowanego LMO1 krzyżuj się z linią MYCN6,17, aby rozwinąć heterozygotyczną transgeniczną linię ryb z nadekspresją zarówno MYCN, jak i LMO1.
  2. Przy 1 dpf posortuj potomstwo krzyżówki pod kątem ekspresji EGFP za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, który przedstawia się jako punkty dodatnie EGFP w okolicy tyłomózgowia.
    UWAGA: Alternatywnie, jeśli nie wszystkie zarodki są sortowane pod kątem MYCN w 1 dpf, należy podnieść zarodki do dorosłości i genotypu poprzez obcinanie płetw i stosowanie wcześniej określonych wytycznych z kroków 2.3-2.4 dotyczących izolacji gDNA i genotypowania PCR, ze starterami: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC, ATC, CTC, ACT, CCC, CAC, GTA-3', oraz następujący program z wzorcową polimerazą Taq: 1 cykl 94 °C przez 3 min, 35 cykli (94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 68 °C przez 3 min) i 68 °C przez 7 min z oczekiwaną wielkością amplikonu 145 pz.
  3. Po posortowaniu pod kątem EGFP w ilości 1 dpf, wyizolować przesiane zarodki na oddzielne szalki Petriego i oznaczyć szalki jako: MYCN+ (EGFP-dodatnie) lub MYCN- (EGFP-ujemne).
  4. Przy 3-4 dpf wizualizuj i sortuj zarodki obu grup (krok 3.3) pod kątem ekspresji LMO1 za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. Szukaj ekspresji białka czerwonej fluorescencji jako plamek zarówno w górnym zwoju szyjnym, jak i w dopaminergicznych komórkach neuronalnych innych niż PSNS w okolicy głowy, zwłaszcza w rdzeniu przedłużonym tyłomózgowia6,13.
    UWAGA: Badanie przesiewowe w kierunku mCherry/LMO1 należy wykonać, zanim zarodki osiągną 5 dpf, ponieważ pęcherze pławne wypełnione powietrzem w pełni rozwijają się do tego czasu i spowodują unoszenie się zarodków, co spowoduje trudne mikroskopijne ogniskowanie komórek PSNS podczas procesu sortowania.
  5. Po zakończeniu sortowania wyizoluj posortowane ryby do czterech grup o różnych genotypach i oznacz jak poniżej. Hoduj posortowane ryby w identycznych warunkach zgodnie ze standardowymi protokołami z książki danio pręgowanego21.
    1. Tylko MYCN (EGFP-dodatni),
    2. tylko LMO1 (mCherry-dodatni),
    3. MYCN; LMO1 (podwójnie dodatnie EGFP i mCherry),
    4. WT (EGFP i mCherry podwójnie ujemne).

4. Wizualizacja obciążenia nowotworem w transgenicznych liniach danio pręgowanego

  1. Po 4 tygodniach od zapłodnienia (wpf) znieczulij posortowane ryby z kroku 3.5 0,02% tricainą na szalce Petriego.
  2. Wizualizuj guzy za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, delikatnie obracając rybę metalową szpatułką po obu bocznych stronach, aby zobaczyć guz. Spodziewaj się, że guzy będą prezentować się jako pojedyncze masy EGFP-, pojedyncze mCherry lub podwójne EGFP-i-mCherry-dodatnie, które powstają z obszaru gruczołu międzynerkowego (w pobliżu głowy i nerki).
    UWAGA: Możliwe, że początkowy początek guza jest zwykle prezentowany z jaśniejszą i większą masą dodatnią fluorescencyjną po jednej stronie gruczołu międzynerkowego, dlatego tak ważne jest, aby uwidocznić obie strony ryby, aby uniknąć przegapienia wczesnego początku guza.
  3. Po zidentyfikowaniu możliwej ryby będącej nosicielem nowotworu, należy wyizolować ryby w oddzielnym zbiorniku z odpowiednimi etykietami, które zawierają datę urodzenia, datę badania przesiewowego guza i genotyp.
  4. Przy 6 wpf powtórz poprzednie kroki 4.1-4.3, aby ponownie przeprowadzić badania przesiewowe ryb z nowotworem i ryb niebędących nosicielami nowotworu, aby potwierdzić obecność guzów odpowiednio dla wcześniej przebadanych ryb z guzem lub zidentyfikować nowe możliwe ryby z nowotworem. Szukaj trwałego lub zwiększonego rozmiaru masy fluorescencyjnie dodatniej u ryb z potwierdzonym nowotworem.
  5. Po zidentyfikowaniu ryb zawierających nowotwór, monitoruj je co dwa tygodnie pod kątem dowodów na migrację komórek nowotworowych, które objawiają się jako maleńkie masy guza EGFP i / lub mCherry-dodatnie daleko od pierwotnego miejsca nowotworu (obszar gruczołu międzynerkowego). W razie potrzeby wyizolować te ryby w oddzielnych zbiornikach i odpowiednio oznaczyć, aby wskazać możliwe przerzuty.
  6. Aby dodatkowo potwierdzić przerzuty, kontynuuj śledzenie tych ryb regularnie (co dwa tygodnie), aż odległe masy guza fluorescencyjnie dodatnie wykażą wyraźnie zwiększony rozmiar, co wskazuje na wzrost guzów w miejscach przerzutów.

5. Przetwarzanie tkanek i sekcja parafinowa ryb z nowotworami

UWAGA: Wykonaj ten krok, aby scharakteryzować spontanicznie rozwijające się guzy pierwotne i/lub przerzutowe w MYCN i MYCN; Ryba transgeniczna LMO1.

  1. Po zidentyfikowaniu i zweryfikowaniu ryb z nowotworem, należy złożyć ryby z kroku 4.6 na szalce Petriego, zanurzając ryby w 0,02% tricainie w celu znieczulenia, a następnie zwiększając dawkę tricainy, aż ryba przestanie oddychać. Pokrój rybę na dwie części - z których jeden zawiera głowę i część środkowej części ciała (w tym guz), a drugi kawałek z resztą środkowej części i ogona ryby.
  2. Utrwal obie części ryby za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na bujaku. Aby zwiększyć skuteczność utrwalania, zastąp bufor świeżym 4% PFA, aby skutecznie i szybko zwiększyć penetrację narządów wewnętrznych. Pozostawić ryby ze świeżym buforem utrwalającym na bujaku w temperaturze 4 °C na noc lub na 48 h.
    UWAGA: PFA jest toksyczny. Ponieważ procedury ostrożności i właściwa utylizacja odczynnika zależą od przepisów obowiązujących w Twojej instytucji, przed użyciem i utylizacją odczynnika należy zapoznać się z odpowiednimi wytycznymi.
  3. Przed przetworzeniem należy umieścić próbkę (próbki) w 100% roztworze szybkiego odkamieniacza na 15-20 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że używasz niemetalowego pojemnika i sprawdzasz próbkę (próbki) przez cały czas inkubacji, aby zapobiec nadmiernemu odwapnieniu. Jeśli tkanka próbki wygląda na mocno zdegradowaną, umieść próbkę w wodzie lub w temperaturze 4 °C, aby spowolnić proces odwapniania.
  4. Po utrwaleniu i odkamienieniu umyj próbkę (próbki) ryb pod bieżącą wodą z kranu przez 1 godzinę i umieść ją w kasecie (kasetach) procesora. Jeśli jest więcej niż jedna próbka, rozdziel każdą z nich do osobnej kasety.
  5. Odwodnić i przygotować tkankę do zatopienia w parafinie, umieszczając kasetę (kasety) z rybami w procesorze tkankowym, gdzie próbka (próbki) jest zanurzona w różnych roztworach, odpowiednio, w następujący sposób: 70% etanolu (60 min, 40 °C), 85% etanolu (50 min, 40 °C), 95% etanolu (40 min, 40 °C) dwukrotnie, 100% etanolu (30 min, 40 °C), kolejny świeży roztwór 100% etanolu (50 min, 40 °C) dwukrotnie, ksylen (30 min, 40 °C), kolejny świeży roztwór ksylenu (50 min, 40 °C), kolejny świeży ksylen (50 min, 45 °C), parafina (30 min, 45 °C), parafina (20 min, 58 °C) trzy razy.
  6. Po przetworzeniu tkanki należy rozładować kasetę (kasety) z procesora, zachowując porządek każdej kasety i upewniając się, że nie dopuścić do pomieszania próbek ryb.
  7. Wybierz odpowiedni rozmiar formy w zależności od wielkości ryby, upewniając się, że forma będzie pasować do całej kasety z próbką ryby. Przykryj dno formy płynną parafiną o temperaturze 60 °C.
  8. Natychmiast umieść kasetę z rybą na wierzchu formy (upewniając się, że ryba jest ułożona na płaskiej bocznej stronie w przypadku odcinków strzałkowych) z płynną parafiną i zakończ napełnianie parafiną do górnej części formy, aby całkowicie osadzić rybę.
  9. Umieść gotową formę na zimnej płycie mikrotomu do sekcji, aż parafina stwardnieje.
  10. Gdy blok parafinowy jest twardy, co można ocenić, obserwując wzrokowo większą nieprzezroczystość i mocny dotyk bloku, delikatnie wyjmij blok z formy. Ostrożnie zeskrob nadmiar parafiny z boków kasety.
  11. Blok rybny zatopiony w parafinie należy pokroić na kawałki w odległości strzałkowej na 4 mikrony na mikrotomie i umieścić skrawki na ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 40 °C zawierającej wodę destylowaną.
  12. Ostrożnie przenieś sekcje na dodatnio naładowane szkiełka i piecz w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 30 minut przed barwieniem przed przejściem do kroku 6, 7 lub 8.

6. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) skrawków parafiny do przeglądu patologicznego

  1. Umieść szkiełka zawierające skrawki parafiny z kroku 5.12 w uchwycie na szkiełka. Wewnątrz dygestorium chemicznego odparafinować ksylenem 3 razy po 5 minut. Wyrzuć roztwór po każdym użyciu.
  2. Nawadniaj sekcje 100% etanolem przez 3 minuty i powtórz dwa razy ze świeżym 100% etanolem. Zamień 100% etanol na 95% etanol na 3 minuty, a następnie 80% etanolu na 3 minuty.
  3. Płukać sekcje wodą destylowaną przez 5 min. Podczas mycia sekcji w wodzie należy usunąć utlenione cząstki z hematoksyliny, filtrując lub czyszcząc powierzchnię hematoksyliny niestrzępiącą się chusteczką.
  4. Nadmiar wody z uchwytu szkiełka należy osuszyć niestrzępiącymi się chusteczkami klasy profesjonalnej i zabarwić szkiełka w 50% hematoksylinie (rozcieńczenie 1:1 wodą destylowaną) przez 2-5 minut, w zależności od pożądanych preferencji barwienia i pogorszenia jakości odczynników. Wyrzuć hematoksylinę, gdy kolor roztworu zmieni się ze śliwkowego na niebieski/brązowy lub gdy czas barwienia staje się nadmierny. Szkiełka należy płukać bieżącą wodą z kranu przez 20 minut.
  5. Odbarwić skrawki w 1% kwaśnym etanolu (3,3 ml kwasu solnego z 50 ml 70% etanolu), szybko zanurzając szkiełka kilka razy. Zjeżdżalnie można zanurzać do 3 s, ale im dłużej slajdy są zanurzone, tym lżejsze stają się sekcje.
  6. Opłucz szkiełka w wodzie z kranu dwa razy przez 1 minutę i raz wodą dejonizowaną. Opcjonalnie na tym etapie zjeżdżalnie można pozostawić na noc, mocząc się w wodzie.
  7. Zanurz skrawki w 1,36% roztworze węglanu litu (47 g węglanu litu, 3500 ml wody) na 3 s. Upewnij się, że nie inkubujesz nadmiernie skrawków, ponieważ im dłuższy czas w roztworze węglanu litu, tym większe prawdopodobieństwo, że tkanka będzie unosić się na wodzie.
  8. Opłucz sekcje w wodzie z kranu przez 5 minut i osusz nadmiar wody z uchwytu szkiełka niestrzępiącymi się profesjonalnymi chusteczkami.
  9. Przeciwbarwić szkiełka w 100% gotowej do użycia eozynie przez 15-30 s i natychmiast odwodnić 95% etanolem dwa razy po 5 minut każde. Zastąp 100% etanolem dwa razy po 5 minut, wyrzucając roztwory po każdym użyciu.
  10. Oczyść skrawki z ksylenu przez 15 minut i powtórz dwa razy w sumie 3 razy. Opcjonalnie szkiełka można pozostawić na noc w ksylenie w temperaturze pokojowej, aby lepiej usunąć nadmiar wody.
  11. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w okapie oparów chemicznych, a następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą medium montażowego, aby uszczelnić próbkę tkanki.
  12. Wizualizuj i obrazuj barwione skrawki tkanek pod mikroskopem. Dokładnie zbadaj guzy w miejscu pierwotnym (obszar gruczołu międzynerkowego w nerce głowy) oraz odległe sporadyczne przerzuty w innych tkankach i narządach ryby. Wyślij wybarwione szkiełka do wycinków tkanek do oceny przez patologów. Opierając się na podobnych cechach patologicznych modelu ryb do ludzkiego nerwiaka zarodkowego, spodziewaj się guzów, które powstały tylko w MYCN lub MYCN; Ryba LMO1 zostanie najpierw zdiagnozowana jako nerwiak zarodkowy przez patologów.

7. Analiza immunohistochemiczna (IHC) z przeciwciałami przeciwko markerowi NB i nadekspresji transgenów w celu dalszego potwierdzenia rozprzestrzeniania się guza i ich właściwości linii współczulno-nadnerczowej

  1. Barwienie za pomocą w pełni automatycznego systemu barwienia
    1. Aby lepiej porównać wynik IHC z wynikiem barwienia H&E, wybierz sąsiednie szkiełka z kroku 5.12 dla barwienia IHC.
      UWAGA: Chociaż zautomatyzowany system barwienia pozwala na uzyskanie szybszych i mniej pracochłonnych wyników, w przypadku jego braku można zastosować ręczny protokół barwienia IHC, odwołując się do kroków opisanych w podrozdziale 7.2.
    2. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) (1:500), markerowi nerwiaka zarodkowego, w oparciu o pożądane stężenie i całkowitą potrzebną ilość za pomocą odpowiedniego rozcieńczalnika przeciwciała pierwszorzędowego systemu automatycznego.
      UWAGA: Optymalne stężenia przeciwciał mogą się różnić w zależności od przeciwciała i tkanki.
    3. Ponieważ zautomatyzowany system wykorzystuje pokładowe pobieranie antygenu indukowane ciepłem z roztworem do pobierania epitopów przez 20 minut i odpowiednim odczynnikiem wykrywającym systemu, upewnij się, że parametry maszyny są ustawione jako: Blokowanie peroksydazy, 5 min; Przeciwciało pierwszorzędowe o pożądanym stężeniu, 15 min; biotynylowane przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (1:500), 8 min; Streptawidyna HRP, 8 min; mieszane intensywne podłoże DAB, 5 min; i Hematoksyliny, 5 min.
    4. Po ustawieniu ustawień umieść tackę na przeciwciała w urządzeniu. Skonfiguruj slajdy, tworząc nowe etui, które oznaczy slajdy. Maszyna jest teraz załadowana i gotowa do pracy (odparafinowanie, barwienie i przeciwbarwienie).
    5. Po odparafinowaniu, wybarwieniu i barwieniu przeciwstawnym szkiełek za pomocą automatycznej maszyny, należy je odwodnić w gradientach etanolu 70%, 95% i 100% przez 5 minut każde. Ponownie zanurz szkiełka sekcji w 100% świeżym etanolu na 5 minut.
    6. Oczyść sekcje w ksylenie przez 5 minut, dwa razy lub pozostaw szkiełka w ksylenie na noc, aby lepiej usunąć nadmiar wody.
    7. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w okapie oparów chemicznych, a następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą medium montażowego. Wizualizacja i obraz barwionych skrawków tkanek za pomocą mikroskopii.
    8. Aby jednoznacznie potwierdzić przerzuty w modelu rybim, porównaj szkiełka barwione przeciwciałami przeciwko markerowi nerwiaka zarodkowego z kroku 7 z tymi wybarwionymi przez H&E z kroku 6.
      UWAGA: Spodziewaj się dodatniego barwienia markera nerwiaka zarodkowego, TH, we wszystkich komórkach nowotworowych zidentyfikowanych przez barwienie H&E. Należy również spodziewać się braku dodatniego barwienia dla TH w sąsiednich tkankach, w których zidentyfikowano guzy przerzutowe w LMO1; Ryba MYCN. Upewnij się, że wybierasz kontrolne ryby tylko WT i MYCN, które są w podobnym wieku do MYCN; LMO1 ryb do tej analizy, aby wykluczyć możliwość, że guzy przerzutowe są wieloogniskowymi guzami pierwotnymi.
  2. Ręczne barwienie bez automatycznego systemu barwienia IHC
    1. Po wypaleniu szkiełek wybierz sąsiednie szkiełka z kroku 5.12, aby umożliwić lepsze porównanie barwienia H&E i IHC w celu deparafiny. Wewnątrz dygestorium chemicznego odwoskować i ponownie nawodnić szkiełka ksylenem, wykonując odpowiednio poprzednie kroki 6.1 i 6.2.
    2. Po odparafinowaniu i ponownym uwodnieniu namoczyć szkiełka w endogennym roztworze blokującym nadtlenek (1x PBS zawierający 0,1% azydku sodu i 0,3% nadtlenku wodoru) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka w świeżym 1x PBS przez 3 minuty i powtórz dwa razy, w sumie 3 razy.
      UWAGA: Azydek sodu jest silnie toksyczny. Upewnij się, że przestrzegasz procedur ostrożności i właściwej utylizacji odczynnika w zależności od przepisów Twojej instytucji.
    3. Pobrać antygen przez inkubację szkiełek w roztworze z proteinazą K (1:500 w 1x PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 3 razy za pomocą 1x PBS przez 3 minuty każda.
    4. Zablokuj szkiełka, inkubując z 5% kozią surowicą w 1x PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na bujaku. Umyj szkiełka świeżym 1x PBS dwa razy po 3 minuty każde.
    5. Dodaj 4 krople roztworu blokującego Avidin bezpośrednio na szkiełko i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu szkiełek świeżym 1x PBS dwa razy przez 3 minuty każde, dodać 4 krople roztworu blokującego biotynę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    6. Po zablokowaniu szkiełek inkubować w pierwszorzędowym przeciwciałie hydroksylazy tyrozynowej (TH) (1:500) przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wybarwić dodatkowymi przeciwciałami przeciwko transgenom i innym odpowiednim markerom, aby zająć się fizjologią i aktywnością guza pierwotnego i innych miejsc przerzutów. Optymalne stężenia przeciwciał mogą się różnić w zależności od przeciwciała i tkanki.
    7. Myj szkiełka świeżą 1x PBS przez 3 minuty, powtarzając dwa razy, w sumie 3 razy.
    8. Inkubować szkiełka w przeciwciałie drugorzędowym biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego anty-króliczego IgG (1:500) rozcieńczonego w roztworze blokującym przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć poprzedni etap prania 7.2.7.
    9. Dodać Avidin sprzężony z HRP (1:300 w 1x PBS) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 3 razy świeżym 1x PBS przez 5 minut każde.
    10. Przygotować roztwór 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) (2,5 ml wody destylowanej, 1 kropla buforu zestawu, 1 kropla nadtlenku wodoru i 2 krople DAB z zestawu) i umieścić krople DAB bezpośrednio na szkiełkach w pobliżu mikroskopu. Po dodaniu DAB obserwuj reakcję zmiany koloru na szkiełkach pod mikroskopem. Po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia należy zatrzymać reakcję, umieszczając sekcje szkiełka w zimnej wodzie destylowanej.
    11. Przeciwbarwić szkiełka świeżą 50% hematoksyliną, zanurzając lub zanurzając próbki na kilka krótkich sekund i umieszczając je z powrotem w wodzie destylowanej. Powtórz w razie potrzeby, ale zwykle raz powinno wystarczyć, ponieważ odcinki tkanek są cienkie.
    12. Odwodnić próbki tkanek na szkiełkach w gradiencie alkoholu, jak opisano wcześniej w kroku 7.1.5 i kontynuować przez pozostałe kroki (z ostatnim krokiem jako 7.1.8) w celu zakończenia analizy IHC.

8. Barwienie parą Picrosiriusa szkiełek parafinowych w celu akumulacji kolagenu w nowotworach jako badanie mechanizmu

  1. Powtórz kroki 6.1-6.3, aby odwoskować, uwodnić i umyć skrawki parafiny na szkiełkach.
  2. Po osuszeniu nadmiaru wody z uchwytu szkiełka profesjonalnymi, niestrzępiącymi się chusteczkami, zabarwić 50% hematoksyliną przez 10 minut. Szkiełka płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
  3. Przenieś szkiełka do Picrosirius Red i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Umyć szkiełka w zakwaszonej wodzie (5 ml lodowatego kwasu octowego w 1 litrze wody z kranu lub destylowanej) dwukrotnie, inkubując przez 5 minut na shakerze.
  5. Najpierw zdezynfekuj większość wody ze zjeżdżalni, a następnie fizycznie potrząśnij i osusz sekcje na szkiełkach, aby usunąć jak najwięcej wody.
  6. Szybko umieść szkiełka w trzech zmianach 100% etanolu, aby odwodnić sekcje parafiny.
  7. Powtórz kroki 6.10 i 6.11, aby wyczyścić szkiełka w ksylenie i zamontować próbkę. Następnie obraz za pomocą mikroskopu złożonego, który jest wyposażony w kamerę.
  8. Za pomocą ImageJ policz czerwono-dodatnie włókna kolagenowe picrosiriusa w co najmniej trzech losowych polach dla każdej sekcji. Porównaj slajdy MYCN i MYCN; Sekcje rybne LMO1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ustalić, czy LMO1 synergizuje z MYCN w celu wywarcia wpływu na patogenezę NB, konstrukty transgeniczne napędzające ekspresję albo LMO1 (dβh:LMO1 i dβh:mCherry) lub MYCN (dβh:EGFP-MYCN) w komórkach PSNS pod kontrolą dβh promotory wstrzyknięto do zarodków rybek danio-ostropływych13Jak przedstawiono w Rycina 1Apo opracowaniu stabilnych linii transgenicznych i walidacji ich gen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany jest powszechnie stosowany w badaniach naukowych od kilku dekad, zwłaszcza w badaniach nad rakiem, z oczywistych powodów, takich jak łatwość konserwacji, solidna reprodukcja i wyraźne zalety obrazowania in vivo 1,28. Model danio pręgowanego może być łatwo manipulowany embrionalnie ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie i rozwój, co dobrze uzupełnia organizmy modelowe ssaków, takich jak szczury i myszy, do badań genetycznych na dużą ska...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem R01 CA240323 (S.Z.) z National Cancer Institute; grantem W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) z Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych (DoD); nagrodą V Scholar od V Foundation for Cancer Research (S.Z.) oraz grantem platformowym z Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); oraz wsparciem z Mayo Clinic Cancer Center i Center for Individualized Medicine (S.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw wektorów 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)VectorSK-4100
Kwas octowyFisher Scientific / Acros Organic64-19-7
Agaroza GP2Midwest Scientific009012-36-6
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozyny (TH)Pel-FreezP40101
Zestaw blokujący awidynę/biotynęVectorSP-2001
Detekcja BOND Intense R LeicaBiosystemsDS9263
BOND Rozcieńczalnik przeciwciał pierwotnychLeica Biosystems Newcastle, Ltd.Instrument AR9352
BOND-MAX IHCLeica Biosystems Newcastle, Ltd.Nie dotyczyw pełni zautomatyzowany system barwienia IHC
CH211-270H11 Klon BACCentrum zasobów BACPAC (BRFC)Nie dotyczy
Mikroskop złożony wyposażony w kamerę DP71OlympusAX70
Cytoseal XYL (medium montażowe na bazie ksylenu)Richard-Allan Scientific8312-4
EosinLeica3801601gotowy do użycia (nie wymaga przygotowania)
EtanolCarolina86-1263
Rozwiń system PCR z długimi matrycamiRoche Applied Science, IN11681834001
Gateway BP Mieszanka enzymów klonazy IIInvitrogen, CA11789-020
Brama LR Mieszanka enzymów klonazy IIInvitrogen, CA11791-100
Przeciwciało wtórne kozie anty-Rb (biotynylowane)DakoE0432
Roztwór hematoksyliny, Harris ModifiedSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFCHHS-32-1L
HRP Avidin DVectorA-2004
Kwas solnyAqua Solutions4360-1L
Nadtlenek wodoru, 3%Fisher ScientificH324-500
Enzym SceINew England Biolabs, MAR0694L
Siarczan kanamycynyTeknova, Inc.K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science KimwipesFisher Scientific34133
Węglan lituSigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC554-13-2
Mikrotom do cięciaLeica BiosystemsRM2255
One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogenC404006
p3E-polyA Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Ahojny dar
(Proszę zapoznać się ze stroną internetową http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page, aby uzyskać materiał, który jest swobodnie rozpowszechniany zgodnie z opisem.)
Wosk parafinowySurgipath Paraplast39603002Parrafin do parafiny
ParaformaldehydAlfa AesarA11313
wektor pDEST (zmodyfikowany wektor docelowy zawierający miejsca rozpoznawania I-SceI)Dr. C. Grabher, Instytut Technologii w Karlsruhe, Karlsruhe, NiemcyNie dotyczyhojny prezent
pDONR 221 wektor dawcy bramkiThermo Fisher Scientific12536-017
Wektor dawcy pDONRP4-P1R Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of UtahN/Ahojny dar
Czerwień fenolowa, 0,5%Sigma Aldrich  P0290
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10XBioRad1610780
Zestaw czerwonych plam PicrosirriusPolysciences24901-250
pME-mCherryAddgene26028
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRRoche21712520
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
RDO Szybki odkamieniaczApex EnginerringRDO04
Azydek sodu (NaN3)Sigma Aldrich26628-22-8
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjnyLeicaMZ10F
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny wyposażony w cyfrowy celownik Kamera DS-U1 do obrazowaniaNikonSMZ-1500
Taq DNA PolimerazaNew England Biolabs, MAM0273L
Tissue-Tek VIP®   6 Procesor infiltracji próżniowej AISakuraN/AModel #: VIP-6-A1
Tricaine-SWestern Chemical Incorporated20513
XyleneThermo Fisher ScientificX3P1GAL

Bibliografia

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343(2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567(2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

rozprzestrzenianie si guzaobrazowanie in vivotransgeniczne rybki zebrafishnadekspresja MYCNnadekspresja LMO1mikroskopia fluorescencyjnamigracja kom rek nowotworowychprzesiew druggowy
Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.