To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.
Artykuł metodologiczny
Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skoczek kukurydziany, Peregrinus maidis, jest szkodnikiem kukurydzy i wektorem kilku wirusów kukurydzy. Wcześniej opublikowane metody opisują wyzwalanie interferencji RNA (RNAi) u P. maidis poprzez mikroiniekcję dwuniciowych RNA (dsRNA) nimfom i dorosłym osobnikom. Pomimo mocy RNAi, fenotypy generowane za pomocą tej techniki są przejściowe i nie mają długoterminowego dziedziczenia mendlowskiego. W związku z tym zestaw narzędzi P. maidis musi zostać rozszerzony o funkcjonalne narzędzia genomiczne, które umożliwiłyby produkcję stabilnych zmutowanych szczepów, otwierając naukowcom drzwi do wprowadzenia nowych metod zwalczania tego ważnego gospodarczo szkodnika. Jednak w przeciwieństwie do dsRNA używanych do RNAi, składniki używane w edycji genomu i transformacji linii zarodkowej opartej na CRISPR/Cas9 nie przenikają łatwo przez błony komórkowe. W rezultacie, plazmidowe DNA, RNA i/lub białka muszą zostać mikrowstrzyknięte do zarodków, zanim zarodek się uceluloaryzuje, co sprawia, że czas wstrzyknięcia jest krytycznym czynnikiem sukcesu. W tym celu opracowano metodę składania jaj na bazie agarozy, która umożliwia pobieranie zarodków od samic P. maidis w stosunkowo krótkich odstępach czasu. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowe protokoły pobierania i mikroiniekcji przedkomórkowych zarodków P. maidis ze składnikami CRISPR (nukleaza Cas9, która została skompleksowana z przewodnikowymi RNA), a także przedstawiono wyniki nokautu genu P. maidis w kolorze białym, opartego na Cas9. Chociaż protokoły te opisują edycję genomu CRISPR/Cas9 u P. maidis, mogą być również wykorzystywane do produkcji transgenicznego P. maidis poprzez transformację linii zarodkowej poprzez prostą zmianę składu roztworu do wstrzykiwań.
Wprowadzenie
Skoczek kukurydziany, Peregrinus maidis, jest ważnym ekonomicznie szkodnikiem kukurydzy1,2,3. Powodują one bezpośrednie fizyczne uszkodzenia rośliny, zarówno podczas żerowania aparatem gębowym do przekłuwania i ssania, jak i podczas rozmnażania, gdy składają swoje zarodki bezpośrednio w tkance roślinnej2,4. Pomimo wielu dróg bezpośredniego uszkadzania upraw, największy wpływ tych owadów na zdrowie upraw jest pośredni, ponieważ działają jako wektor wirusa mozaiki kukurydzy (MMV) i wirusa pasiastego kukurydzy5,6. MMV jest zdolny do replikacji w ciele wektora P. maidis, co pozwala wirusowi przetrwać w poszczególnych owadach przez całe ich życie, dzięki czemu mogą one kontynuować rozprzestrzenianie wirusa na nowe rośliny żywicielskie7,8. Najczęstszymi metodami zwalczania P. maidis, a tym samym przenoszonych przez niego wirusów, są insektycydy.
Niestety, niewłaściwe zarządzanie tymi produktami spowodowało rozwój odporności u docelowego szkodnika, jak również zanieczyszczenie środowiska9. Dlatego potrzebne są nowe strategie, aby zmniejszyć straty w plonach spowodowane tą kombinacją owadów, wirusów i szkodników. Wcześniejsze prace wykazały, że interferencja RNA (RNAi) może być skuteczną metodą kontroli P. maidis, ponieważ są one podatne na obniżenie ekspresji genów nawet po spożyciu dwuniciowego RNA (dsRNA)10. Jednak najskuteczniejszym sposobem podawania dsRNA w terenie byłyby rośliny, którymi żywią się owady; W związku z tym uprawy mogą być nadal podatne na wszelkie wirusy, które owady już przenoszą. Wraz z pojawieniem się edycji genomu CRISPR/Cas9 możliwe są nowe strategie zwalczania szkodników, w tym oparty na Cas9 napęd genowy 11,12, które można wykorzystać do zmniejszenia wielkości populacji szkodników lub zastąpienia tej populacji osobnikami odpornymi na wirusy, które przenoszą.
Jednak rozwój i wdrożenie jakiegokolwiek rodzaju systemu napędu genowego będzie wymagało rozwoju technik transgenicznych. Takie metody nie były konieczne do przeprowadzenia eksperymentów z RNAi u P. maidis, ponieważ zakłada się, że dsRNA i/lub siRNA są w stanie przenikać przez błony komórkowe ze względu na wydajność RNAi u P. maidis10,13. Nie jest to prawdą w przypadku DNA i/lub białek stosowanych w tradycyjnej transgenezie lub w edycji genów opartej na Cas9, z których każde byłoby prekursorem do stworzenia owadów przenoszących napęd genowy. Aby dokonać edycji genów lub innych form transformacji linii zarodkowej, te DNA i białka są idealnie mikrowstrzykiwane do zarodków na etapie blastodermy syncytialnej, przed momentem, w którym zarodek owada się celularyzuje. Czas ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap syncytialny jest najwcześniejszą częścią rozwoju14,15. Ponieważ samice P. maidis preferencyjnie składają jaja w tkance roślinnej, pobranie wystarczającej ilości zarodków przedkomórkowych do mikroiniekcji może być pracochłonne i czasochłonne. W związku z tym opracowano nowe techniki szybkiego pobierania i mikrowstrzykiwania zarodków P. maidis przed komórkowaniem.
Protokół
1. Hodowla dorosłych P. maidis na poziomie kolonii
- Posadź co najmniej cztery doniczki kukurydzy tygodniowo na klatkę hodowlaną, po 3-4 nasiona w doniczce. Rosną w środowisku wolnym od owadów.
- Gdy rośliny osiągną wiek ~5 tygodni, umieść je w klatce o wymiarach 30 cm x 30 cm x 60 cm.
- Uzyskaj wystarczającą ilość dorosłych P. maidis (~500) z laboratorium badawczego lub na wolności i umieść w klatce odpornej na owady z 9-12 roślinami kukurydzy (3-4 doniczki).
- Utrzymuj kolonię w inkubatorze do hodowli owadów w temperaturze 25 °C (± 1 °C), przy wilgotności co najmniej 70% i cyklu świetlnym 14:10.
- Aby wygenerować kolonię skalibrowaną pod względem wieku, usuń wszystkie początkowe dorosłe osobniki po czterech dniach składania jaj i pozwól zarodkom złożonym w klatce wykluć się i naturalnie się zestarzeć.
- Przenieś 5-tygodniowe owady P. maidis (dorosłe) do świeżych roślin kukurydzy w celu cotygodniowej subkultury, zbierając je za pomocą aspiratora (Rysunek 1). Następnie wypuść dorosłe osobniki do czystej klatki ze świeżymi roślinami kukurydzy. Aby utrzymać stały dopływ młodych dorosłych do celów eksperymentalnych, co tydzień przygotowuj świeże klatki skalibrowane pod kątem wieku.
- Podlewaj doniczki w klatkach dwa razy dziennie. Okresowo przycinaj łodygi, usuwaj rozkładający się materiał roślinny i w razie potrzeby zastępuj świeżymi doniczkami z kukurydzą.
UWAGA: Przy odpowiednim utrzymaniu kolonia może trwać ~5 tygodni (tj. wystarczająco długo, aby zarodki złożone w klatce mogły stać się dorosłe).
2. Komora do składania jaj na bazie agarozy
- Przygotować naczynia do zbierania jaj (podłoże do składania jaj), wlewając 1% w/v agarozy do wody do czystych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Po zestaleniu się podłoża do składania jaj przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przygotuj 10% w/v roztwór sacharozy do karmienia dorosłych. Roztwór sacharozy należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.
- Zrób komorę do trzymania dorosłych, wycinając otwór w dnie kubka o pojemności 1 uncji (patrz Tabela Materiałów) i przyklejając ekran do wymiany powietrza (Rysunek 2).
- Pokrój plastikową folię parafinową na kwadraty o wymiarach 5 cm x 5 cm; odłóż 2 kwadraty na każdą filiżankę.
- Zbierz ~15 1-tygodniowych dorosłych samic z kolonii P. maidis skalibrowanej pod względem wieku. Aby wybrać samice, zbadaj brzuszną stronę brzucha i poszukaj pokładełka, które jest zazwyczaj ciemniejsze niż reszta brzucha (Ryc. 3). Dorosłe osobniki należy przechowywać do jednej godziny w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml w przypadku ustawiania wielu komór do składania jaj. Przed dobraniem płci owady należy krótko schłodzić na lodzie i przenieść do pojemnika dla dorosłych.
UWAGA: To badanie można wykonać bez mikroskopu. Dorosłe samice, które miały czas na karmienie i kopulację, zazwyczaj mają również większe brzuchy niż dorosłe samce i są bardziej posłuszne; W związku z tym można je łatwiej wybrać z populacji klatkowej. - Przenieś samice do dorosłego pojemnika i zamknij kubek 1 warstwą plastikowej folii wosku parafinowego, równomiernie rozciągając ją 3-4 razy w stosunku do pierwotnego rozmiaru (Rysunek 4A, B).
- Nałóż 400 μl 10% w/v roztworu sacharozy na wierzch plastikowej uszczelki z wosku parafinowego i dodaj drugą warstwę plastikowej folii parafinowej, rozciągając plastikową folię parafinową dokładnie tak, jak powyżej (Rysunek 4C,D).
UWAGA: Kanapka z rozciągniętą plastikową folią parafinową zwiększa ciśnienie roztworu sacharozy, co jest bardzo ważne w przypadku karmienia dorosłych, ale nie zapobiegnie samicom przed przebiciem pokładełek aż do podłoża do składania jaj. - Umieść komorę dla dorosłych na naczyniu do zbierania jaj stroną z plastikową folią parafinową bezpośrednio na podłożu do składania jaj i owiń całą komorę do składania jaj folią spożywczą, nie zakrywając otworów wentylacyjnych, ponieważ są one wymagane do wymiany powietrza (Rysunek 5).
- Inkubować każdą komorę składania jaj w temperaturze 25 °C przy wilgotności 70% i cyklu świetlnym 14:10.
- Codziennie zmieniaj kanapkę z plastikowej folii parafinowej i 10% w/v roztworu sacharozy i usuń wodę, która gromadzi się wewnątrz kubka.
3. Pobieranie i wyrównywanie zarodków w środowisku o wysokiej wilgotności
- Zainstaluj system mikroiniekcji oparty na mikroskopie stereoskopowym w wilgotnym pomieszczeniu lub okapie (nawilżony kaptur; Rysunek 6) aby zapewnić, że środowisko pracy osiąga co najmniej 70% wilgotności podczas całego procesu mikroiniekcji.
- Sprawdź podłoże do składania jaj pod kątem jaj po pożądanym okresie składania jaj. Zrób to w wilgotnym okapie lub innym wilgotnym środowisku.
UWAGA: Okres składania jaj zwykle trwał noc, od 18:00 do 10:00 rano, trwając ~16 godzin. - Jeśli jakieś jaja zostaną złożone w agarozie, użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie je wykopać i umieść je na powierzchni agarozy, aby były wilgotne (Rysunek 7A).
- Nałóż pasek taśmy dwustronnej o wymiarach 1 mm x 15 mm na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 30 mm (Rysunek 7B). Umieść szkiełko nakrywkowe taśmą do góry na podłożu do składania jaj (Rysunek 7C).
- Podnieś każde jajko z powierzchni agaru i przenieś na dwustronną taśmę za pomocą cienkiej szczoteczki. Usuń wszystkie jaja, które są całkowicie białe lub mają na sobie czarne zabarwienie. Zdrowe jaja będą półprzezroczyste.
- Jajka w kształcie banana ułożyć na boku, z większym końcem przyklejonym do dwustronnej taśmy (Rysunek 7D).
UWAGA: Zawsze przechowuj jaja w środowisku o wysokiej wilgotności, takim jak szalka Petriego odlana z warstwą 1% agaru na dnie.
4. Przygotowanie odczynników CRISPR i igieł iniekcyjnych
- Wyciągnij igły kwarcowe za pomocą ściągacza do mikropipet typu Flaming/Brown.
- Ukosuj igły kwarcowe za pomocą ukosowarki do mikropipet.
- Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zabezpieczyć wyciągnięte igły w przezroczystym pojemniku, takim jak szalka Petriego, aż będą gotowe do użycia.
- Przygotować roztwór do wstrzykiwań, łącząc 0,5 μl białka Cas9 (5 μg/μl roztworu podstawowego) i 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl roztworu podstawowego; patrz tabela materiałów) z 1 μl buforu czerwieni fenolowej w końcowej objętości 5 μl. Aby wytrącić cząstki, które mogłyby zatkać igłę, należy krótko wymieszać roztwór i wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością.
- Wypełnić igłę do wstrzykiwań, uważając, aby pozostawić mieszankę do wstrzykiwań w pobliżu zwężającego się końca igły. Usunąć pęcherzyki powietrza, jeśli występują, z końcówki igły.
- Ostrożnie umieścić wypełnioną igłę w uchwycie igły i dokręcić kołnierz ze stali nierdzewnej, aby bezpiecznie utrzymać igłę na miejscu podczas mikroiniekcji.
- Wygeneruj niezawodny przepływ roztworu iniekcyjnego z igły, delikatnie głaszcząc ściętą końcówkę drobnym, zwilżonym pędzlem, jednocześnie dostarczając impulsy ciśnienia powietrza do igły za pomocą systemu iniekcyjnego.
UWAGA: Igła jest gotowa do wstrzyknięcia, gdy mieszanka iniekcyjna może opuścić końcówkę w małych ilościach.
5. Mikroiniekcja i pielęgnacja po iniekcji
- Przygotować platformę do mikroiniekcji, wypełniając czystą szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm 1% agarem, aby utworzyć równą warstwę agaru, która jest równo z górną częścią naczynia.
- Umieść wcześniej przygotowane szkiełko nakrywkowe z ~25 zarodkami na platformie agarowej (Rysunek 8A).
UWAGA: Wszystkie etapy iniekcji muszą być wykonywane wewnątrz nawilżonego okapu (~70% wilgotności). - Sprawdzić ciśnienie iniekcji, umieszczając końcówkę igły w kropli wody i rozpoczynając cykl wstrzykiwania.
UWAGA: Niewielka ilość roztworu do wstrzykiwań powinna rozproszyć się w wodzie, jeśli ustawienie ciśnienia jest prawidłowe (Rysunek 8B). - Wbić igłę w większy koniec zarodka, zbliżając się od lewej strony szkiełka nakrywkowego (Ryc. 8C). Dostarczyć roztwór do wstrzykiwań do komórki jajowej i szybko wyciągnąć igłę.
- Po wstrzyknięciu wszystkich jaj umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni nowego naczynia z 1% agaru i przenieś naczynie do komory wilgotnościowej (Rysunek 9).
6. Inkubacja i wylęg zarodków
- Umieścić komorę wylęgową w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 6 dni.
- Przenieść wszystkie ocalałe zarodki, używając czystej wody i cienkiej szczoteczki, na szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm z bibułą filtracyjną zwilżoną wodą, pokrywającą dno szalki. Uszczelnić szalkę Petriego folią z wosku parafinowego z tworzywa sztucznego i utrzymać w temperaturze 25 °C, aby umożliwić wylęg zarodków. Badanie zarodków należy rozpocząć 6 dni po wstrzyknięciu pod kątem przeżycia.
UWAGA: Pierwsze nimfy w stadium rozwojowym zaczną się wykluwać około 8 dnia. - Przenieś nimfy za pomocą cienkiego pędzelka na szalkę Petriego zawierającą ścinki liści. Przykryj naczynie i uszczelnij plastikową folią z wosku parafinowego.
- Inkubować zamknięte naczynie piskląt na sadzonkach liści przez 48 godzin w temperaturze 25 °C.
- Przenieś wszystkie 2-dniowe nimfy z serii wstrzyknięć do klatki hodowlanej z roślinami kukurydzy za pomocą cienkiej szczotki. Jeśli wstrzyknięte osoby z widocznym fenotypem zostaną odzyskane w wystarczającej liczbie, należy je hodować oddzielnie, aby zmaksymalizować odzyskanie cechy docelowej w następnym pokoleniu. W przeciwnym razie należy przeprowadzić masowe krycie wszystkich wstrzykiwaczy.
UWAGA: Pisklęta należy delikatnie umieszczać w okółku kukurydzy, aby zapewnić schronienie i zapewnić odpowiednią wilgotność w ich najbliższym otoczeniu. - Hoduj owady w warunkach opisanych powyżej, zapewniając odpowiednią temperaturę, wilgotność i regularne przenoszenie na świeże rośliny kukurydzy.
- Badanie przesiewowe potomstwa pod kątem oczekiwanych fenotypów. Umieść osobniki wykazujące pożądany fenotyp w ich własnej klatce, aby ustalić linie homozygotyczne.
Wyniki
Komora do składania jaj została zaprojektowana specjalnie po to, aby umożliwić samicom P. maidis żerowanie podczas składania jaj w medium ochronnym, z którego jaja można było łatwo odzyskać. Dzięki zastosowaniu tej metody odzyskano wystarczającą ilość embrionów precelularnych do mikroiniekcji DNA, RNA i/lub białek. Dorosłe samice P. maidis zazwyczaj składają jaja wewnątrz tkanki liściowej roślin kukurydzy, co sprawia, że pozyskanie odpowiedniej liczby jaj w krótkim czasie jest trudne, ponieważ wymaga przeprowadzenia licznych sekcji liści. Sztuczne środowisko do składania jaj stanowi rozwiązanie tych problemów. Jak pokazano w Tabeli 1, w ciągu 4 tygodni od łącznie 645 samic zebrano 6 483 jaja. Samice zazwyczaj zaczynają składać jaja po 2. dniu, a najwięcej jaj pozyskuje się od 4. do 6. dnia. Aktywność składania jaj spadła do 9. dnia. Każda komora do składania jaj była przygotowywana w piątek, a obecność jaj sprawdzano od niedzieli do kolejnej niedzieli. Przestrzeganie tego harmonogramu pozwoliło na zebranie większości jaj do mikroiniekcji w dni robocze.
Pierwszym praktycznym zastosowaniem tego systemu składania jaj było przetestowanie skuteczności wywołanego przez Cas9 knockoutu genu, z wykorzystaniem ortologa genu koloru oczu white (Pmw) u P. maidis jako celu. Znane jest, że mutacje w genie white prowadzą do znacznej utraty pigmentacji oczu u innych gatunków owadów, a białko White wykazuje autonomię komórkową, co pozwala na wykrycie mutacji u wstrzykniętych osobników16,17. Aby zwiększyć szansę, że nawet niewielka mutacja spowoduje utratę funkcji, zaprojektowano gRNA tak, aby przecinały region kasety wiążącej ATP, która jest niezbędna dla funkcji White16. Zarodki P. maidis wstrzyknięto albo 20% czerwienią fenolową (bufor do iniekcji), buforem do iniekcji z Cas9 o stężeniu końcowym 800 ng/µL (kontrola Cas9), albo Cas9 w buforze do iniekcji wraz z trzema gRNA dodanymi w stężeniu 400 ng/µL każde. Połączenie trzech przewodników w jednej mieszance iniekcyjnej miało na celu dalszą maksymalizację szans na wygenerowanie mutantów, zarówno poprzez stworzenie dużego delecji, jak i zrekompensowanie możliwości, że którykolwiek z przewodników może być nieskuteczny w przecinaniu. Tempo rozwoju dla każdej grupy traktowanej było porównywalne (Tabela 2), a u 50-60% wstrzykniętych osobników zaobserwowano oznaki rozwoju. Odsetek wylęgłości dla buforu i kontroli Cas9 był również porównywalny; jednak wylęgłość osobników otrzymujących mieszankę trzech przewodników była względnie niższa. Na ten moment nie jest jasne, czy obniżona przeżywalność jest wynikiem utraty funkcji white, czy wynikiem niezamierzonych konsekwencji zastosowania mieszanki trzech przewodników, takich jak efekty off-target (patrz sekcja dyskusji). Jednakże żaden z osobników z całkowitą utratą pigmentacji oczu (t.j. całkowity knockout) nie wykluł się i żadne potomstwo wstrzykniętych osobników nie miało białych oczu. Skuteczność on-target mutagenezy opartej na Cas9 zweryfikowano na dwa sposoby. Po pierwsze, osobników po iniekcji przesiewano pod kątem utraty pigmentacji oczu.
Z 71 osobników z wstrzykniętym przewodnikiem, które się rozwinęły, 23 wykazało pewien stopień utraty pigmentu (Rysunek 10), a 9 z tych osobników się wykluło, co przełożyło się na odsetek knockoutów ≥32%. W żadnej z grup kontrolnych nie zaobserwowano utraty pigmentu oka. Po drugie, mutacje chromosomalne potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)18 oraz sekwencjonowania19. Ponieważ nie udało się uzyskać linii mutantów, analizowano DNA genomiczne z pul embrionów wstrzykniętych albo mieszanką trzech przewodników, albo buforem. Oczekuje się, że mieszanka trzech przewodników usunie ~180 par zasad z locus white. Można to zaobserwować w produktach PCR amplifikowanych z DNA genomicznego wyizolowanego od wstrzykniętych osobników, a także w powiązanych danych sekwencyjnych uzyskanych z tych produktów (Rysunek 11). Te połączone dowody wskazują, że embriony zostały wstrzyknięte przed wystąpieniem celularyzacji.
Rysunek 1: Aspirator. Skuteczny aspirator można złożyć, łącząc pompę próżniową na wlocie, za pomocą plastikowego wężyka, z plastikową probówką stożkową o pojemności 15 mL. Z dna probówki stożkowej należy ostrożnie usunąć około 0,5 cm. W probówce stożkowej, nad otworem wężyka plastikowego, należy umieścić kuleczkę waty, aby wyłapywać zbierane dorosłe osobniki P. maidis i zapobiec ich przedostaniu się do pompy próżniowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Konstrukcja pojemników dla osobników dorosłych. (A) Potrzebne materiały (zaczynając od lewego górnego rogu, zgodnie z ruchem wskazówek zegara): siatka, pistolet do kleju na gorąco, żyletka, pojemnik 1 oz. (B) W dnie pojemnika 1 oz należy wyciąć duży otwór, a następnie wyciąć kwadrat siatki wystarczająco duży, aby go przykryć. (C) Siatkę należy następnie przykleić nad otworem za pomocą kleju na gorąco. (D) Po zastygnięciu kleju należy usunąć nadmiar siatki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Określanie płci dorosłych osobników P. maidis. Przedstawiono strony brzuszne dorosłych osobników P. maidis płci męskiej (lewo) i żeńskiej (prawo). Wykladacz, widoczny nad odwłokiem samicy, jest najjaśniejszym wskaźnikiem płci osobnika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Zamykanie osobników dorosłych w pojemnikach. (A) Kwadrat z plastikowej folii parafinowej o wymiarach 5 cm x 5 cm. (B) Folię należy rozciągnąć równomiernie do 3-4 krotności jej pierwotnego rozmiaru. (C) Po umieszczeniu osobników dorosłych w pojemniku, rozciągniętą folię należy położyć na otworem, aby zabezpieczyć owady. Następnie na wierzchu folii należy umieścić kroplę 400 µL 10% w/v roztworu sacharozy. (D) Aby zapewnić odpowiednie ciśnienie karmienia dla osobników dorosłych, drugi kwadrat z plastikowej folii parafinowej o wymiarach 5 cm x 5 cm należy w podobny sposób rozciągnąć i położyć na kropli sacharozy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Przygotowanie komory do składania jaj. (A) Potrzebne materiały (zaczynając od lewego górnego rogu, zgodnie z ruchem wskazówek zegara): folia spożywcza, gotowy pojemnik z osobnikami dorosłymi oraz szalka Petriego z 1% agarozą (podłoże do składania jaj). (B) Pojemnik z osobnikami dorosłymi należy umieścić na agarozie, tak aby „kanapka” z filmu parafinowego i 10% sacharozy znajdowała się bezpośrednio na podłożu do składania jaj. (C) Folia spożywcza służy do zabezpieczenia pojemnika z osobnikami dorosłymi na podłożu do składania jaj. Zapobiega to zbyt szybkiemu wysychaniu podłoża. (D) Należy uważać, aby nie zakryć siatki w pojemniku z osobnikami dorosłymi, aby umożliwić dalszą wymianę powietrza. (E) Schemat komory do składania jaj. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Nawilżany dyfuzor. Wokół mikroskopu do iniekcji zainstalowano dyfuzor wyposażony w nawilżacz, aby zminimalizować przeciągi i utrzymać wilgotność podczas manipulacji embrionami. Po zajęciu pozycji przez operatora klapy można złożyć nad wejściem, co pomaga w utrzymaniu odpowiedniego poziomu wilgotności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Zbieranie zarodków w celu przygotowania do iniekcji. (A) Zarodki złożone w podłożu do składania jaj. Para cienkich pęset służy do wyjmowania zarodków z podłoża i układania ich na jego powierzchni. (B) Wąski pasek dwustronnej taśmy o wymiarach 1 mm x 15 mm na szkiełku nakrywce o wymiarach 22 mm x 30 mm. (C) Szkiełko nakrywkę można położyć na podłożu do składania jaj, aby ułatwić przenoszenie zarodków z powierzchni podłoża na taśmę na szkiełku. (D) Zarodki P. maidis mają kształt banana, przy czym jeden koniec jest węższy od drugiego (koniec węższy wskazany czerwoną grotą strzałki; koniec szerszy wskazany żółtą grotą strzałki na przykładowym zarodku). Szeroki koniec zarodka należy przyłożyć do taśmy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Iniekcja. (A) Platforma do iniekcji to szalka Petri wypełniona po brzegi 1% agarem. Szkiełko podstawowe z paskiem taśmy przytrzymującym zarodki należy umieścić bezpośrednio na powierzchni platformy do iniekcji. (B) Ciśnienie iniekcji należy sprawdzić przed wstrzyknięciem substancji do zarodków, „wstrzykując” niewielką ilość roztworu iniekcyjnego do kropli wody. Metodę tę można stosować w dowolnym momencie procesu iniekcji, aby sprawdzić, czy igła nie jest zapchana. (C) Zarodki należy iniekować, wprowadzając igłę w szerszy koniec zarodka. Jeśli iniekcja przebiegła pomyślnie, roztwór iniekcyjny powinien być widoczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 9: Pielęgnacja po wstrzykiwaniu. (A) Po wstrzyknięciu wszystkich embrionów na szkiełku nakrywką, należy umieścić szkiełko w nowej szalce Petriego zawierającej 1% agarozę. (B) Szalkę Petriego ze szkiełkiem można następnie przechowywać w komorze wilgotnościowej (takiej jak ta przedstawiona) aż do momentu wyklucia się embrionów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 10: Fenotyp knockout Pmw . (A) Kontrolne zarodki w tym samym wieku oraz (B) zarodki z nokautem Pmw , gdzie rozwijające się oczy wskazane są czarnymi grotami strzałek. Zarodek w punkcie B jest mozaikowy, co widać po niewielkim pasie pigmentacji. (C) Kontrolne nowo wyklute osobniki w tym samym wieku oraz (D) nowo wyklute osobniki z nokautem Pmw , z wstawkami pokazującymi oczy pod innym kątem. Osobnik w punkcie D również jest mozaikowy. Biała strzałka wskazuje obszar na głównym zdjęciu wykazujący utratę pigmentacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 11: Sekwencja nokautu Pmw . (A) Model mRNA Pmw w skali, z oznaczeniami co 500 bp, z zaznaczonymi lokalizacjami miejsc wiązania gRNA: G1, niebieski; G2, żółty; G3, różowy. Wszelkie mutacje przesuwające ramkę odczytu powstałe w tym punkcie zakłócą większość produktu translacji. (B) Kontekst genomiczny miejsc gRNA, wszystkie w jednym eksonie (pogrubiony tekst pisany wielkimi literami). Miejsca wiązania przewodników są wyróżnione tymi samymi kolorami co w punkcie A, a sekwencje PAM są podkreślone. Zakres wynosi ~300 bp. Powyżej przedstawiono translację eksonu w ramce, jako jednoliterowe skróty pisane wielkimi literami. Zaznaczono dwa motywy specyficzne dla transporterów pigmentu oka. Motyw CDEPT funkcjonalnej domeny Walkera B jest obramowany na fioletowo, a motyw IHQP domeny pętli H jest obramowany na zielono. Obie domeny są kluczowe dla funkcji transportera ATP. (C) Region docelowy Pmw został namnożony w dwóch rundach PCR. Produkt z drugiej rundy zbadano na żelu w celu znalezienia dowodów na zmianę wielkości wynikającą z pomyślnego usunięcia regionu pomiędzy przewodnikami. Ścieżki: L = drabinka 100 bp; 1 = kontrola wodna PCR; 2 = jaja wstrzyknięte buforem; 3-4 = dwa oddzielne zestawy jaj wstrzykniętych mieszaniną trzech przewodników. Tylko zarodki, które otrzymały mieszaninę trzech przewodników, wykazały zarówno prążek WT (czerwona strzałka), jak i prążek będący wynikiem całkowitej ekscyzji (biała strzałka). (D) Aby potwierdzić tożsamość dolnego prążka (biała strzałka), DNA to oczyszczono, sklonowano i zsekwencjonowano. Górna linia to sekwencja typu dzikiego. Pozostałe dwie linie to sekwencje z dwóch klonów. Trzy dodatkowe klony były zgodne z dolną sekwencją. Niebieskie wyróżnienie wskazuje miejsce wiązania Przewodnika 1, natomiast różowe wyróżnienie wskazuje miejsce wiązania Przewodnika 3. W obu allelach cały region pomiędzy tymi dwoma miejscami przewodników został usunięty. Skróty: Pmw = gen Peregrinus maidis white; gRNA = przewodnie RNA; PAM = motyw przylegający do protospacera; ATP = trifosforan adenozyny; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; WT = typ dziki; KO = nokaut. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Zestaw | Liczba kubków | Liczba samic w każdym kubku | Liczba jaj | Całkowita liczba jaj | |||||||
| Dzień 2 | Dzień 3 | Dzień 4 | Dzień 5 | Dzień 6 | Dzień 7 | Dzień 8 | Dzień 9 | ||||
| 1 | 10 | 15 | 0 | 26 | 166 | 355 | 530 | 193 | 91 | 37 | 1398 |
| 2 | 15 | 15 | 22 | 238 | 489 | 699 | 520 | 379 | 203 | 58 | 2608 |
| 3 | 8 | 15 | 0 | 57 | 230 | 190 | 116 | 80 | 34 | 1 | 708 |
| 4 | 10 | 15 | 0 | 226 | 446 | 519 | 301 | 179 | 24 | 15 | 1710 |
| Suma | 43 | 15 | 23 | 547 | 1331 | 1763 | 1467 | 831 | 352 | 111 | 6483 |
Tabela 1: Reprezentatywne kolekcje jaj z artificialnego środowiska składania jaj. Przedstawiono dane z czterech zestawów kubków do zbierania jaj, z liczbą jaj liczona od drugiego dnia po przygotowaniu do dziewiątego dnia.
| Leczenie za pomocą iniekcji | Łączna ilość wstrzyknięta | Łącznie opracowane | Łączna liczba wyklutych osobników | Szybkość rozwoju (%) | Wskaźnik wykluwalności (%) |
| Bufor | 39 | 20 | 12 | 51 | 31 |
| Cas9 | 39 | 24 | 14 | 61 | 36 |
| Cas9 +Słowo „Pmw” nie jest standardowym terminem naukowym, skrótem technicznym ani jednostką miary w kontekście materiałów JoVE. Proszę o podanie pełnego tekstu źródłowego lub kontekstu, aby możliwe było wykonanie wiernego i dokładnego tłumaczenia naukowego. gRNA | 121 | 71 | 28 | 59 | 28 |
Tabela 2: Wskaźniki przeżywalności i nokautu po iniekcjach trzech różnych mieszanin wstrzykiwalnych.
Dyskusja
Jakość i wartości odżywcze jaj nieśnych
Niedawno naukowcy pracujący z pokrewnym gatunkiem, Nilaparvata lugens, uzyskali jaja, których używali do mikroiniekcji, bezpośrednio z liścia, utrzymując wstrzyknięte jaja w tkance liścia do czasu wyklucia się17. Chociaż ta metoda oparta na liściach zapewniła bardziej naturalne środowisko do rozwoju embrionalnego, zwiększyła również ryzyko infekcji i uszkodzenia jaj podczas procesu usuwania. Przedstawiony tutaj system sztucznego składania jaj zapewnia bardziej jednolite środowisko i zmniejsza ryzyko uszkodzenia jaj podczas obchodzenia się z nimi. Dzięki ustawieniu miseczek do składania jaj w piątek, większość jaj z jaj została zebrana w ciągu typowego tygodnia pracy, z korzyścią dla osób wykonujących prace związane z mikroiniekcją. Jednym zastrzeżeniem do tej metody jest jednak to, że brak składników odżywczych w diecie zawierającej 10% roztwór sacharozy ostatecznie wpłynie na zdrowie owadów, a samice w miseczkach zwykle zaczynają umierać już po 10 dniach. Jakość jaj również zaczyna spadać po 6 dniach, o czym świadczy wzrost liczby martwych lub niezdrowo wyglądających jaj. W związku z tym ważne jest, aby być selektywnym w stosunku do jaj używanych do mikroiniekcji i nie trzymać samic po 6 dniu.
Przeżywalność i wilgotność
Dwa czynniki wydają się mieć kluczowe znaczenie dla przeżycia zarodka w procesie mikroiniekcji. Najtrudniejszym aspektem obchodzenia się z zarodkami P. maidis jest zapobieganie ich wysuszeniu po wyjęciu z pożywki do składania jaj i podczas mikroiniekcji. Ponieważ jaja są zwykle składane w tkance roślinnej, brakuje im odpowiedniej skorupy, aby zapobiec odwodnieniu. Nawet w nawilżonym kapturze z powodu wysuszenia gubiły się całe zestawy jaj. Jednak zbyt wysoka wilgotność może również wpływać na mikroiniekcje, jeśli woda gromadzi się na taśmie dwustronnej lub na lunecie. Niestety, odwodnienie jaj zwykle nie było łatwe do zauważenia podczas procesu mikroiniekcji i często wydawało się normalne aż do 2 lub 3 dni później, kiedy stały się całkowicie przezroczyste, nie wykazując żadnych oznak rozwoju.
Jakość igieł również wydaje się odgrywać ważną rolę w przetrwaniu. Igła powinna być skośna, aby zminimalizować niepotrzebne uszkodzenia jaja. Gdy igła jest zablokowana, użycie funkcji czyszczenia na wstrzykiwaczu podczas delikatnego głaskania końcówki igły zwilżonym pędzlem (patrz krok 4.7) zazwyczaj przywracało igłę do stanu funkcjonalnego. Niezależnie od tego, zaleca się umieszczanie tylko niewielkich ilości roztworu do wstrzykiwań (~0,25 μl) do każdej igły i zmienianie igły na nową igłę co kilka szkiełek (~50-60 jaj), aby zapewnić utrzymanie jakości igły przez cały proces wstrzykiwania.
Pomyślne generowanie fenotypu nokautującego
Aby skutecznie przekształcić komórki rozrodcze, mikroiniekcje zarodków zwykle muszą być wykonane jak najwcześniej przed komórką. W zależności od gatunku owadów, okno czasowe na wykonanie mikroiniekcji waha się od zaledwie kilku godzin do nawet całego dnia 14,15,20. Nadal nie jest jasne, kiedy zarodki P. maidis ulegają celalizacji. Nokaut za pośrednictwem Cas9 testowano na zarodkach w wieku od 4 godzin po złożeniu jaj (pel) do nawet 16 godzin pel, a oczekiwane fenotypy obserwowano we wszystkich eksperymentach, co sugeruje, że wszystkie mikroiniekcje zostały wykonane w oknie preceluryzacji.
Ortolog genu koloru oczu, biały, P. maidis został wybrany, ponieważ oczekiwano, że fenotyp nokautu będzie łatwy do zbadania u osób otrzymujących zastrzyki ze względu na jego autonomiczną naturę komórkową. Rzeczywiście, zgodnie z oczekiwaniami, zarówno mozaikowe, jak i całkowite nokautowanie były wyraźnie identyfikowalne wśród zarodków otrzymujących mieszaninę iniekcyjną zawierającą Cas9 i prowadzące RNA. Niestety, nie wykluły się żadne iniekcje z całkowitym nokautem, a masowe krycie ocalałych iniekcji nie przyniosło potomstwa białookiego. Jednak później udało się wygenerować zmutowaną linię poprzez celowanie w inny gen (Klobasa i wsp., w toku). Sugerowałoby to, że niepowodzenie w ustaleniu linii białych mutantów jest najprawdopodobniej spowodowane albo efektami niecelowymi (tj. Cas9 przecinającymi ważne regiony w innym miejscu genomu) generującymi ściśle powiązaną mutację śmiertelną, albo nieprzewidywalną krytyczną rolą bieli u P. maidis.
Dane fenotypowe i molekularne (ryc. 8 i ryc. 9) potwierdzają, że w próbce wstrzykniętych zarodków powstał znaczny nokaut w białym locus, co skutkowałoby całkowitą utratą funkcji genu. Co więcej, podczas gdy mutacje u bieli są żywotne u niektórych gatunków, istnieje precedens, w którym zmniejszona aktywność bieli jest szkodliwa21,22. To powiedziawszy, nie można całkowicie wykluczyć efektów off-target. Przewidywanie prawdopodobnych nietrafionych celów wymaga dokładnych danych dotyczących sekwencji genomu23, co jest obecnie niemożliwe ze względu na obecny stan zasobów genomowych P. maidis. Niezależnie od tego, dzięki tym nowym metodom, testowanie innych genów docelowych może być przeprowadzone bez obaw, a nawet przejście do bardziej tradycyjnej transgenezy w celu wprowadzenia nowych narzędzi genetycznych do tego szkodliwego szkodnika.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
North Carolina State University, Department of Entomology and Plant Pathology, jest częścią zespołu wspierającego program DARPA Insect Allies Program. Wyrażone poglądy, opinie i/lub ustalenia są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalne poglądy lub politykę Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. MDL, DR i AEW wymyśliły projekt i zapewniły pozyskanie funduszy, administrację projektu i zasoby. FC, WK, NG i MDL wymyśliły i zaprojektowały eksperymenty z mikroiniekcją; OH wymyślił i zaprojektował metodę składania jaj. FC i WK przeprowadziły eksperymenty; FC i WK przeanalizowały wyniki; a FC, WK, NG i MDL napisały manuskrypt. Autorzy pragną złożyć specjalne podziękowania Kyle'owi Sozanskiemu i Victorii Barnett za ich pomoc w utrzymaniu kolonii P. maidis.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 oz Pojemniki | Dart | P100N | Pojemnik dla dorosłych do składania jaj |
| 15 ml Rurki stożkowe | Olympus | Genesee 28-103 | Służy jako probówka zbiorcza w konfiguracji aspiratora próżniowego |
| 15 ml Probówki stożkowe | Olympus | Genesee 28-106 | Do sporządzania 10% roztworu sacharozy i do trzymania dorosłych podczas schładzania przed badaniem przesiewowym |
| Aspirator | Bioquip | 1135A | Do obsługi skoczków |
| Aspirator próżniowy | Fischer Technical | LAV-3 | Odkurzacz do zasysania większej liczby owadów |
| Niebieskie światła LED Spectrum Home | Depot | GLP24FS/19W/LED | Oświetlenie do uprawy doniczkowych roślin kukurydzianych Zbiorniki żywią się |
| Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonukleaza do cięcia genów skoczka |
| Przezroczyste rurki winylowe | Home Depot | 3/8 cala ID x 1/2 cala OD x 10 stóp | Łączy rurkę zbiorczą z pompą w konfiguracji aspiratora próżniowego |
| Skoczki kukurydziane | Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej | Nie dotyczy Prośba | z laboratorium dr Anny Whitfield |
| Waciki | Genessee | 51-101 | Służy jako filtr/łapacz owadów w probówce zbiorczej w konfiguracji aspiratora próżniowego |
| Taśma dwustronna | Scotch Dwustronna taśma | NA | Trzymanie jaj do mikroiniekcji |
| Wczesny blask kukurydzy | Park Seed Company | 05093-PK-N | Kukurydza do hodowli skoczków |
| epTIPS Końcówki do mikroładowarek | Eppendorf | C2554691 | Końcówki do napełniania igłami |
| System mikroiniekcji Femtojet | Eppendorf | 5247 | Kontroluje ciśnienie wtrysku (12-20 psi, w zależności od wielkości otworu igły) |
| Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Podłoże do wszystkiego oprócz naczynia do składania jaj |
| Drobne kleszcze | Bioquip | 4731 | Obchodzenie się z jajami |
| ogólnego przeznaczenia LE Agarose | Apex | 20-102 | Podłoże i naczynie do składania jaj (podłoże do składania jaj) |
| Przewodnik RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol) | Prowadnice RNA do celowania w skoczek roślinny white gene |
| Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol) | Przewodniki RNA do celowania w skoczka roślinnego white gene |
| Przewodnik RNA 3 - GAGGGCAGAGUCUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol) | Prowadnice RNA do celowania w skoczek roślinny white gene |
| Nawilżacz | Homedics | UHE-CM45 | Do dostarczania wilgoci w nawilżanym kapturze |
| Komora wilgotnościowa | Billups-Rothenberg | MIC-101 | Do przetrzymywania wstrzykniętych zarodków do czasu wyklucia |
| Klatki do hodowli owadów | Bioquip (na specjalne zamówienie) | Blisko 1450 l (ma plastikowy przód i boki z siatki) | Klatka dla skoczków na kukurydzy |
| Laserowy ściągacz Micropipiette | Sutter Instruments | P-2000/G | Do wytwarzania igieł iniekcyjnych / Ciepło = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
| Leica M165 FC Stereoskop fluorescencyjny | Leica | M165 FC | Przesiewanie skoczków roślinnych |
| Zakres mikroiniekcji | Leica | MZ12-5 | Luneta do mikroiniekcji wyposażona w stolik XY |
| Mikromanipulator | Narishige | MN-151 | Do pozycjonowania igły do mikroiniekcji |
| Skośnik do mikropipet | Sutter Instruments | FG-BV10-D | Do ukosowania igieł iniekcyjnych / Używana płytka o "drobnym" stopniu pod kątem 20& stopni |
| Stolik | mikroskopowy AmScope | GT100 X-Y Stół ślizgowy | Do pozycjonowania i przenoszenia zarodków pod mikroskopem |
| Miniaturowy pędzel do malowania | Testor #2 8733 | Sprzedawane w 3 opakowaniach 281206 | Drobne pędzle do obróbki zarodków |
| Uchwyt na igły | Narishige | HI-7 | Do trzymania igły do mikroiniekcji |
| Inkubator | Percival | I41VLH3C8 | Odchów iniekcji do momentu wyklucia |
| Szalki Petriego (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Przygotowanie naczynia agarowego do składania jaj |
| pGEM-T Zestaw do klonowania Easy Vector System I | Promega | A1360 | Klonowanie Pm biały miejsce docelowe |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Bufor do mikroiniekcji |
| Zwykły mikroskop Szkiełka podstawowe lub szkiełko nakrywkowe | Fisher Scientific | 12-549-3 | Trzymaj jaja do mikroiniekcji |
| Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Oczyszczanie plazmidowych DNA gotowych do wstrzyknięcia |
| Plastikowa folia parafinowa | Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego | PM-996 | Rozmiar rolki 4 cale x 125 stóp |
| Folia | plastikowa Glad ClingWrap Folia | plastikowa NA | Owiń całą komorę składania jaj |
| Podkład - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Podkład pierwszej rundy do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white |
| Starter - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGTGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Podkład pierwszej rundy do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white |
| Starter - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Starter drugiej rundy do amplifingu w miejscu docelowym w genie Pm white |
| Primemer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo Drugorundowy | podkład do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white |
| Kapilary kwarcowe | Sutter Instruments | QF100-50-10 | Do wykonywania igieł do mikroiniekcji / średnica zewnętrzna 1 mm, Średnica wewnętrzna 0,7 mm, długość 10 cm |
| Ekran (biała tkanina z organzy) | Joann Tkaniny | 16023889 | Do przykrycia pojemnika dla dorosłych |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Umyj naczynia |
| Sacharoza Fisher | Scientific | BP220-1 | Aby zrobić 10% roztwór sacharozy |
Bibliografia
- Namba, R., Higa, S. Y. Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).
- Singh, B. U., Seetharama, N. Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems. Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).
- Tsai, J. Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis. Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).
- Chelliah, S., Basheer, M. Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum. Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).
- Lastra, J., Esparza, J. Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus. Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).
- Nault, L. R., Ammar, E. -D. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).
- Ammar, E. -D., Tsai, C. -W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 14(2016).
- Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae). Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).
- Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper. PloS One. 8 (8), 70243(2013).
- Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 3, 03401(2014).
- Gantz, V. M., Bier, E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector. Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).
- Kimelman, D., Martin, B. L. Anterior-posterior patterning in early development: three strategies. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).
- Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm. Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).
- Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes. Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).
- Xue, W. H., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998(2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).
- Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497(2018).
- Brent, C. S., Hull, J. J. RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527(2019).
- Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).
Przedruki i uprawnienia
