Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Podsumowanie

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Streszczenie

Skoczek kukurydziany, Peregrinus maidis, jest szkodnikiem kukurydzy i wektorem kilku wirusów kukurydzy. Wcześniej opublikowane metody opisują wyzwalanie interferencji RNA (RNAi) u P. maidis poprzez mikroiniekcję dwuniciowych RNA (dsRNA) nimfom i dorosłym osobnikom. Pomimo mocy RNAi, fenotypy generowane za pomocą tej techniki są przejściowe i nie mają długoterminowego dziedziczenia mendlowskiego. W związku z tym zestaw narzędzi P. maidis musi zostać rozszerzony o funkcjonalne narzędzia genomiczne, które umożliwiłyby produkcję stabilnych zmutowanych szczepów, otwierając naukowcom drzwi do wprowadzenia nowych metod zwalczania tego ważnego gospodarczo szkodnika. Jednak w przeciwieństwie do dsRNA używanych do RNAi, składniki używane w edycji genomu i transformacji linii zarodkowej opartej na CRISPR/Cas9 nie przenikają łatwo przez błony komórkowe. W rezultacie, plazmidowe DNA, RNA i/lub białka muszą zostać mikrowstrzyknięte do zarodków, zanim zarodek się uceluloaryzuje, co sprawia, że czas wstrzyknięcia jest krytycznym czynnikiem sukcesu. W tym celu opracowano metodę składania jaj na bazie agarozy, która umożliwia pobieranie zarodków od samic P. maidis w stosunkowo krótkich odstępach czasu. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowe protokoły pobierania i mikroiniekcji przedkomórkowych zarodków P. maidis ze składnikami CRISPR (nukleaza Cas9, która została skompleksowana z przewodnikowymi RNA), a także przedstawiono wyniki nokautu genu P. maidis w kolorze białym, opartego na Cas9. Chociaż protokoły te opisują edycję genomu CRISPR/Cas9 u P. maidis, mogą być również wykorzystywane do produkcji transgenicznego P. maidis poprzez transformację linii zarodkowej poprzez prostą zmianę składu roztworu do wstrzykiwań.

Wprowadzenie

Skoczek kukurydziany, Peregrinus maidis, jest ważnym ekonomicznie szkodnikiem kukurydzy^1,2,3. Powodują one bezpośrednie fizyczne uszkodzenia rośliny, zarówno podczas żerowania aparatem gębowym do przekłuwania i ssania, jak i podczas rozmnażania, gdy składają swoje zarodki bezpośrednio w tkance roślinnej^2,4. Pomimo wielu dróg bezpośredniego uszkadzania upraw, największy wpływ tych owadów na zdrowie upraw jest pośredni, ponieważ działają jako wektor wirusa mozaiki kukurydzy (MMV) i wirusa pasiastego kukurydzy^5,6. MMV jest zdolny do replikacji w ciele wektora P. maidis, co pozwala wirusowi przetrwać w poszczególnych owadach przez całe ich życie, dzięki czemu mogą one kontynuować rozprzestrzenianie wirusa na nowe rośliny żywicielskie^7,8. Najczęstszymi metodami zwalczania P. maidis, a tym samym przenoszonych przez niego wirusów, są insektycydy.

Niestety, niewłaściwe zarządzanie tymi produktami spowodowało rozwój odporności u docelowego szkodnika, jak również zanieczyszczenie środowiska⁹. Dlatego potrzebne są nowe strategie, aby zmniejszyć straty w plonach spowodowane tą kombinacją owadów, wirusów i szkodników. Wcześniejsze prace wykazały, że interferencja RNA (RNAi) może być skuteczną metodą kontroli P. maidis, ponieważ są one podatne na obniżenie ekspresji genów nawet po spożyciu dwuniciowego RNA (dsRNA)¹⁰. Jednak najskuteczniejszym sposobem podawania dsRNA w terenie byłyby rośliny, którymi żywią się owady; W związku z tym uprawy mogą być nadal podatne na wszelkie wirusy, które owady już przenoszą. Wraz z pojawieniem się edycji genomu CRISPR/Cas9 możliwe są nowe strategie zwalczania szkodników, w tym oparty na Cas9 napęd genowy ^11,12, które można wykorzystać do zmniejszenia wielkości populacji szkodników lub zastąpienia tej populacji osobnikami odpornymi na wirusy, które przenoszą.

Jednak rozwój i wdrożenie jakiegokolwiek rodzaju systemu napędu genowego będzie wymagało rozwoju technik transgenicznych. Takie metody nie były konieczne do przeprowadzenia eksperymentów z RNAi u P. maidis, ponieważ zakłada się, że dsRNA i/lub siRNA są w stanie przenikać przez błony komórkowe ze względu na wydajność RNAi u P. maidis^10,13. Nie jest to prawdą w przypadku DNA i/lub białek stosowanych w tradycyjnej transgenezie lub w edycji genów opartej na Cas9, z których każde byłoby prekursorem do stworzenia owadów przenoszących napęd genowy. Aby dokonać edycji genów lub innych form transformacji linii zarodkowej, te DNA i białka są idealnie mikrowstrzykiwane do zarodków na etapie blastodermy syncytialnej, przed momentem, w którym zarodek owada się celularyzuje. Czas ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap syncytialny jest najwcześniejszą częścią rozwoju^14,15. Ponieważ samice P. maidis preferencyjnie składają jaja w tkance roślinnej, pobranie wystarczającej ilości zarodków przedkomórkowych do mikroiniekcji może być pracochłonne i czasochłonne. W związku z tym opracowano nowe techniki szybkiego pobierania i mikrowstrzykiwania zarodków P. maidis przed komórkowaniem.

Protokół

1. Hodowla dorosłych P. maidis na poziomie kolonii

1. Posadź co najmniej cztery doniczki kukurydzy tygodniowo na klatkę hodowlaną, po 3-4 nasiona w doniczce. Rosną w środowisku wolnym od owadów.
2. Gdy rośliny osiągną wiek ~5 tygodni, umieść je w klatce o wymiarach 30 cm x 30 cm x 60 cm.
3. Uzyskaj wystarczającą ilość dorosłych P. maidis (~500) z laboratorium badawczego lub na wolności i umieść w klatce odpornej na owady z 9-12 roślinami kukurydzy (3-4 doniczki).
4. Utrzymuj kolonię w inkubatorze do hodowli owadów w temperaturze 25 °C (± 1 °C), przy wilgotności co najmniej 70% i cyklu świetlnym 14:10.
5. Aby wygenerować kolonię skalibrowaną pod względem wieku, usuń wszystkie początkowe dorosłe osobniki po czterech dniach składania jaj i pozwól zarodkom złożonym w klatce wykluć się i naturalnie się zestarzeć.
6. Przenieś 5-tygodniowe owady P. maidis (dorosłe) do świeżych roślin kukurydzy w celu cotygodniowej subkultury, zbierając je za pomocą aspiratora (Rysunek 1). Następnie wypuść dorosłe osobniki do czystej klatki ze świeżymi roślinami kukurydzy. Aby utrzymać stały dopływ młodych dorosłych do celów eksperymentalnych, co tydzień przygotowuj świeże klatki skalibrowane pod kątem wieku.
7. Podlewaj doniczki w klatkach dwa razy dziennie. Okresowo przycinaj łodygi, usuwaj rozkładający się materiał roślinny i w razie potrzeby zastępuj świeżymi doniczkami z kukurydzą.
   UWAGA: Przy odpowiednim utrzymaniu kolonia może trwać ~5 tygodni (tj. wystarczająco długo, aby zarodki złożone w klatce mogły stać się dorosłe).

2. Komora do składania jaj na bazie agarozy

1. Przygotować naczynia do zbierania jaj (podłoże do składania jaj), wlewając 1% w/v agarozy do wody do czystych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Po zestaleniu się podłoża do składania jaj przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotuj 10% w/v roztwór sacharozy do karmienia dorosłych. Roztwór sacharozy należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.
3. Zrób komorę do trzymania dorosłych, wycinając otwór w dnie kubka o pojemności 1 uncji (patrz Tabela Materiałów) i przyklejając ekran do wymiany powietrza (Rysunek 2).
4. Pokrój plastikową folię parafinową na kwadraty o wymiarach 5 cm x 5 cm; odłóż 2 kwadraty na każdą filiżankę.
5. Zbierz ~15 1-tygodniowych dorosłych samic z kolonii P. maidis skalibrowanej pod względem wieku. Aby wybrać samice, zbadaj brzuszną stronę brzucha i poszukaj pokładełka, które jest zazwyczaj ciemniejsze niż reszta brzucha (Ryc. 3). Dorosłe osobniki należy przechowywać do jednej godziny w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml w przypadku ustawiania wielu komór do składania jaj. Przed dobraniem płci owady należy krótko schłodzić na lodzie i przenieść do pojemnika dla dorosłych.
   UWAGA: To badanie można wykonać bez mikroskopu. Dorosłe samice, które miały czas na karmienie i kopulację, zazwyczaj mają również większe brzuchy niż dorosłe samce i są bardziej posłuszne; W związku z tym można je łatwiej wybrać z populacji klatkowej.
6. Przenieś samice do dorosłego pojemnika i zamknij kubek 1 warstwą plastikowej folii wosku parafinowego, równomiernie rozciągając ją 3-4 razy w stosunku do pierwotnego rozmiaru (Rysunek 4A, B).
7. Nałóż 400 μl 10% w/v roztworu sacharozy na wierzch plastikowej uszczelki z wosku parafinowego i dodaj drugą warstwę plastikowej folii parafinowej, rozciągając plastikową folię parafinową dokładnie tak, jak powyżej (Rysunek 4C,D).
   UWAGA: Kanapka z rozciągniętą plastikową folią parafinową zwiększa ciśnienie roztworu sacharozy, co jest bardzo ważne w przypadku karmienia dorosłych, ale nie zapobiegnie samicom przed przebiciem pokładełek aż do podłoża do składania jaj.
8. Umieść komorę dla dorosłych na naczyniu do zbierania jaj stroną z plastikową folią parafinową bezpośrednio na podłożu do składania jaj i owiń całą komorę do składania jaj folią spożywczą, nie zakrywając otworów wentylacyjnych, ponieważ są one wymagane do wymiany powietrza (Rysunek 5).
9. Inkubować każdą komorę składania jaj w temperaturze 25 °C przy wilgotności 70% i cyklu świetlnym 14:10.
10. Codziennie zmieniaj kanapkę z plastikowej folii parafinowej i 10% w/v roztworu sacharozy i usuń wodę, która gromadzi się wewnątrz kubka.

3. Pobieranie i wyrównywanie zarodków w środowisku o wysokiej wilgotności

1. Zainstaluj system mikroiniekcji oparty na mikroskopie stereoskopowym w wilgotnym pomieszczeniu lub okapie (nawilżony kaptur; Rysunek 6) aby zapewnić, że środowisko pracy osiąga co najmniej 70% wilgotności podczas całego procesu mikroiniekcji.
2. Sprawdź podłoże do składania jaj pod kątem jaj po pożądanym okresie składania jaj. Zrób to w wilgotnym okapie lub innym wilgotnym środowisku.
   UWAGA: Okres składania jaj zwykle trwał noc, od 18:00 do 10:00 rano, trwając ~16 godzin.
3. Jeśli jakieś jaja zostaną złożone w agarozie, użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie je wykopać i umieść je na powierzchni agarozy, aby były wilgotne (Rysunek 7A).
4. Nałóż pasek taśmy dwustronnej o wymiarach 1 mm x 15 mm na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 30 mm (Rysunek 7B). Umieść szkiełko nakrywkowe taśmą do góry na podłożu do składania jaj (Rysunek 7C).
5. Podnieś każde jajko z powierzchni agaru i przenieś na dwustronną taśmę za pomocą cienkiej szczoteczki. Usuń wszystkie jaja, które są całkowicie białe lub mają na sobie czarne zabarwienie. Zdrowe jaja będą półprzezroczyste.
6. Jajka w kształcie banana ułożyć na boku, z większym końcem przyklejonym do dwustronnej taśmy (Rysunek 7D).
   UWAGA: Zawsze przechowuj jaja w środowisku o wysokiej wilgotności, takim jak szalka Petriego odlana z warstwą 1% agaru na dnie.

4. Przygotowanie odczynników CRISPR i igieł iniekcyjnych

1. Wyciągnij igły kwarcowe za pomocą ściągacza do mikropipet typu Flaming/Brown.
2. Ukosuj igły kwarcowe za pomocą ukosowarki do mikropipet.
3. Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zabezpieczyć wyciągnięte igły w przezroczystym pojemniku, takim jak szalka Petriego, aż będą gotowe do użycia.
4. Przygotować roztwór do wstrzykiwań, łącząc 0,5 μl białka Cas9 (5 μg/μl roztworu podstawowego) i 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl roztworu podstawowego; patrz tabela materiałów) z 1 μl buforu czerwieni fenolowej w końcowej objętości 5 μl. Aby wytrącić cząstki, które mogłyby zatkać igłę, należy krótko wymieszać roztwór i wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością.
5. Wypełnić igłę do wstrzykiwań, uważając, aby pozostawić mieszankę do wstrzykiwań w pobliżu zwężającego się końca igły. Usunąć pęcherzyki powietrza, jeśli występują, z końcówki igły.
6. Ostrożnie umieścić wypełnioną igłę w uchwycie igły i dokręcić kołnierz ze stali nierdzewnej, aby bezpiecznie utrzymać igłę na miejscu podczas mikroiniekcji.
7. Wygeneruj niezawodny przepływ roztworu iniekcyjnego z igły, delikatnie głaszcząc ściętą końcówkę drobnym, zwilżonym pędzlem, jednocześnie dostarczając impulsy ciśnienia powietrza do igły za pomocą systemu iniekcyjnego.
   UWAGA: Igła jest gotowa do wstrzyknięcia, gdy mieszanka iniekcyjna może opuścić końcówkę w małych ilościach.

5. Mikroiniekcja i pielęgnacja po iniekcji

1. Przygotować platformę do mikroiniekcji, wypełniając czystą szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm 1% agarem, aby utworzyć równą warstwę agaru, która jest równo z górną częścią naczynia.
2. Umieść wcześniej przygotowane szkiełko nakrywkowe z ~25 zarodkami na platformie agarowej (Rysunek 8A).
   UWAGA: Wszystkie etapy iniekcji muszą być wykonywane wewnątrz nawilżonego okapu (~70% wilgotności).
3. Sprawdzić ciśnienie iniekcji, umieszczając końcówkę igły w kropli wody i rozpoczynając cykl wstrzykiwania.
   UWAGA: Niewielka ilość roztworu do wstrzykiwań powinna rozproszyć się w wodzie, jeśli ustawienie ciśnienia jest prawidłowe (Rysunek 8B).
4. Wbić igłę w większy koniec zarodka, zbliżając się od lewej strony szkiełka nakrywkowego (Ryc. 8C). Dostarczyć roztwór do wstrzykiwań do komórki jajowej i szybko wyciągnąć igłę.
5. Po wstrzyknięciu wszystkich jaj umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni nowego naczynia z 1% agaru i przenieś naczynie do komory wilgotnościowej (Rysunek 9).

6. Inkubacja i wylęg zarodków

1. Umieścić komorę wylęgową w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 6 dni.
2. Przenieść wszystkie ocalałe zarodki, używając czystej wody i cienkiej szczoteczki, na szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm z bibułą filtracyjną zwilżoną wodą, pokrywającą dno szalki. Uszczelnić szalkę Petriego folią z wosku parafinowego z tworzywa sztucznego i utrzymać w temperaturze 25 °C, aby umożliwić wylęg zarodków. Badanie zarodków należy rozpocząć 6 dni po wstrzyknięciu pod kątem przeżycia.
   UWAGA: Pierwsze nimfy w stadium rozwojowym zaczną się wykluwać około 8 dnia.
3. Przenieś nimfy za pomocą cienkiego pędzelka na szalkę Petriego zawierającą ścinki liści. Przykryj naczynie i uszczelnij plastikową folią z wosku parafinowego.
4. Inkubować zamknięte naczynie piskląt na sadzonkach liści przez 48 godzin w temperaturze 25 °C.
5. Przenieś wszystkie 2-dniowe nimfy z serii wstrzyknięć do klatki hodowlanej z roślinami kukurydzy za pomocą cienkiej szczotki. Jeśli wstrzyknięte osoby z widocznym fenotypem zostaną odzyskane w wystarczającej liczbie, należy je hodować oddzielnie, aby zmaksymalizować odzyskanie cechy docelowej w następnym pokoleniu. W przeciwnym razie należy przeprowadzić masowe krycie wszystkich wstrzykiwaczy.
   UWAGA: Pisklęta należy delikatnie umieszczać w okółku kukurydzy, aby zapewnić schronienie i zapewnić odpowiednią wilgotność w ich najbliższym otoczeniu.
6. Hoduj owady w warunkach opisanych powyżej, zapewniając odpowiednią temperaturę, wilgotność i regularne przenoszenie na świeże rośliny kukurydzy.
7. Badanie przesiewowe potomstwa pod kątem oczekiwanych fenotypów. Umieść osobniki wykazujące pożądany fenotyp w ich własnej klatce, aby ustalić linie homozygotyczne.

Wyniki

Komora do składania jaj została specjalnie zaprojektowana, aby umożliwić samicom P. maidis żerowanie podczas składania jaj w ochronnym podłożu, z którego łatwo można było odzyskać ich jaja. Za pomocą tej metody odzyskano wystarczającą ilość zarodków przedkomórkowych do mikroiniekcji z DNA, RNA i/lub białkami. Dorosłe samice P. maidis zwykle składają jaja w tkance liściowej roślin kukurydzy, co sprawia, że uzyskanie wystarczającej ilości jaj w krótkim czasie jest wyzwaniem, ponieważ wymaga dużej ilości rozcinania liści. Sztuczne środowisko składania jaj stanowi rozwiązanie tych problemów. Jak pokazano w tabeli 1, w ciągu 4 tygodni pobrano 6 483 jaja od łącznie 645 samic. Samice zwykle zaczynają składać jaja po 2 dniu i dostarczają większość jaj od 4 do 6 dnia. Aktywność składania jaj spowolniła do 9 dnia. Każda komora do składania jaj była ustawiana w piątek i sprawdzana pod kątem jaj od niedzieli do następnej niedzieli. Przestrzeganie tego harmonogramu pozwoliło na pobranie większości komórek jajowych do mikroiniekcji w ciągu tygodnia pracy.

Pierwszym praktycznym zastosowaniem tego systemu składania jaj było przetestowanie skuteczności nokautu genu za pośrednictwem Cas9, używając ortologa P. maidis genu koloru oczu, białego (Pmw), jako celu. Wiadomo, że mutacje w kolorze białym powodują znaczną utratę pigmentacji oczu u innych gatunków owadów, a kolor biały jest autonomiczny pod względem komórkowym, co pozwala na wykrycie mutacji u osób, którym wstrzyknięto implant^16,17. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że nawet niewielka mutacja może spowodować utratę funkcji, przewodnikowe RNA zostały zaprojektowane tak, aby przecinały obszar kasety wiążącej ATP, co jest niezbędne dla funkcji White'a¹⁶. Zarodkom P. maidis wstrzyknięto 20% czerwieni fenolowej (bufor do iniekcji), bufor iniekcyjny z Cas9 w końcowym stężeniu 800 ng / μL (kontrola Cas9) lub Cas9 w buforze iniekcyjnym wraz z trzema przewodnikami RNA dodanymi w stężeniu 400 ng / μL każdy. Połączenie trzech prowadnic w ramach jednej mieszanki iniekcyjnej miało na celu dalszą maksymalizację szans na generowanie mutantów, zarówno poprzez tworzenie dużej delecji, jak i poprzez kompensację możliwości, że którykolwiek z nich może być nieskuteczny w przypadku cięcia. Tempo rozwoju dla każdego leczenia było porównywalne (Tabela 2), przy czym 50-60% osób, którym wstrzyknięto zastrzyk, wykazywało oznaki rozwoju. Wskaźniki wylęgu dla bufora i kontroli Cas9 były również porównywalne; Jednak wskaźniki wylęgu osobników otrzymujących mieszankę trzech przewodników były stosunkowo niższe. W tej chwili nie jest jasne, czy zmniejszone przeżycie jest wynikiem utraty funkcji bieli, czy też wynikiem niezamierzonych konsekwencji mieszanki trzech przewodników, takich jak efekty niedocelowe (patrz sekcja dyskusji). Jednak żadna z osób z całkowitą utratą pigmentacji oczu (tj. całkowitym nokautem) nie wykluła się, a żadne z potomstwa osób, którym wstrzyknięto zastrzyk, nie miało białych oczu. Skuteczność mutagenezy opartej na Cas9 na cel zweryfikowano na dwa sposoby. Po pierwsze, osoby, którym przytrzymywano zastrzyki, pod kątem utraty pigmentacji oczu.

Spośród 71 osób, którym wstrzyknięto przewodnik, 23 wykazały pewien stopień utraty pigmentu (Ryc. 10), a 9 z tych osób wykluło się, co spowodowało wskaźnik nokautu ≥32%. Nie zaobserwowano utraty pigmentu w oku w żadnym z leczenia kontrolnego. Po drugie, mutacje chromosomowe potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)¹⁸ i sekwencjonowania¹⁹. Ponieważ nie można było odzyskać zmutowanej linii, analizowano genomowe DNA z puli zarodków, którym wstrzyknięto mieszankę trzech przewodników lub bufor. Oczekuje się, że mieszanka trzech prowadnic usunie ~ 180 par zasad z białego locus. Można to zaobserwować w produktach PCR amplifikowanych z genomowego DNA wyizolowanego od wstrzykniętych osób, a także w powiązanych danych sekwencyjnych wygenerowanych z tych produktów (Figura 11). Te połączone dowody wskazują, że zarodki zostały wstrzyknięte przed wystąpieniem celularyzacji.

Rysunek 1: Aspirator. Skuteczny aspirator można zmontować, podłączając pompę próżniową na wlocie, za pomocą plastikowej rurki, do plastikowej rurki stożkowej o pojemności 15 ml. Około 0,5 cm należy ostrożnie usunąć z dna stożkowej rurki. Wacik należy umieścić w stożkowej rurce, nad otworem plastikowej rurki, aby złapać dorosłe osobniki P. maidis podczas ich zbierania i trzymać je z dala od pompy próżniowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Budowa pojemników dla dorosłych. (A) Potrzebne materiały (zgodnie z ruchem wskazówek zegara od lewego górnego rogu): ekran, pistolet do klejenia na gorąco, żyletka, pojemnik o pojemności 1 uncji. (B) W dnie pojemnika o pojemności 1 uncji powinien zostać wycięty duży otwór, a kwadrat sitka powinien być wycięty na tyle duży aby otwór ten zakrył. (C) Ekran jest następnie przyklejany do otworu za pomocą gorącego kleju. (D) Po związaniu kleju należy usunąć nadmiar siatki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Płeć dorosłych P. maidis. Pokazane są brzuszne strony samca (po lewej) i samicy (po prawej) dorosłego osobnika P. maidis. Pokładełko, widoczne nad brzuchem samicy, jest najwyraźniejszym wskaźnikiem płci osobnika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zamykanie dorosłych w pojemnikach. (A) Kwadrat o wymiarach 5 cm x 5 cm z plastikowej folii parafinowej. (B) Film powinien być równomiernie rozciągnięty do 3-4 razy większego niż oryginalny rozmiar. (C) Po umieszczeniu dorosłych w pojemniku dla dorosłych, rozciągniętą folię należy umieścić nad otworem w celu zabezpieczenia dorosłych. Następnie na folię należy umieścić kroplę 400 μl 10% w/v roztworu sacharozy. (D) Aby zapewnić odpowiednie ciśnienie karmienia dla dorosłych osobników, drugi kwadrat folii parafinowej z tworzywa sztucznego o wymiarach 5 cm x 5 cm powinien być podobnie rozciągnięty i umieszczony na kropli sacharozy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ustawianie komory do składania jaj. (A) Potrzebne materiały (zgodnie z ruchem wskazówek zegara od lewego górnego rogu): folia, kompletny pojemnik dla dorosłych (z dorosłymi) i szalka Petriego z 1% agarozą (podłoże do składania jaj). (B) Pojemnik dla dorosłych powinien być umieszczony na agarozie z plastikową folią parafinową / "kanapką" z 10% sacharozą umieszczoną bezpośrednio na podłożu do składania jaj. (C) Folia plastikowa służy do mocowania pojemnika dla dorosłych do podłoża do składania jaj. Dzięki temu podłoże nie wysycha zbyt szybko. (D) Należy zachować ostrożność, aby nie zasłaniać osłony pojemnika dla dorosłych, tak aby wymiana powietrza mogła być kontynuowana. (E) Schemat komory składania jaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Nawilżony kaptur. Wokół lunety iniekcyjnej ustawiono kaptur wyposażony w nawilżacz, aby zminimalizować przeciągi powietrza i utrzymać wilgotność podczas obchodzenia się z zarodkami. Klapy można złożyć nad wejściem po tym, jak pracownik znajdzie się na miejscu, aby pomóc w utrzymaniu odpowiedniego poziomu wilgotności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Pobieranie zarodków w ramach przygotowań do iniekcji. (A) Zarodki, które zostały zdeponowane w pożywce do składania jaj. Para cienkich kleszczy służy do ekstrakcji zarodków z podłoża i umieszczania ich na jego powierzchni. (B) Wąski pasek taśmy dwustronnej o wymiarach 1 mm x 15 mm na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 30 mm. (C) Szkiełko nakrywkowe można umieścić na pożywce do składania jaj w celu ułatwienia przenoszenia zarodków z powierzchni podłoża na taśmę na szkiełku nakrywkowym. (D) Zarodki P. maidis mają kształt banana, z jednym końcem węższym od drugiego (wąski koniec oznaczony czerwonym grotem strzały; szerszy koniec oznaczony żółtym grotem strzałki w przykładzie zarodka). Szeroki koniec zarodka należy umieścić na taśmie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Wtrysk. (A) Platforma iniekcyjna to szalka Petriego wypełniona po brzegi 1% agarem. Szkiełko nakrywkowe z paskiem taśmy przytrzymującej zarodki należy umieścić bezpośrednio na powierzchni platformy iniekcyjnej. (B) Ciśnienie iniekcji powinno być badane przed wstrzyknięciem zarodków poprzez "wstrzyknięcie" niewielkiej ilości roztworu do wstrzykiwań do kropli wody. Metodę tę można również zastosować w dowolnym momencie procesu wstrzykiwania w celu sprawdzenia, czy igła nie jest zatkana. (C) Zarodki powinny być wstrzykiwane poprzez wkłucie igły w większy koniec zarodka. Roztwór do wstrzykiwań powinien być widoczny, jeśli wstrzyknięcie się powiodło. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Opieka po iniekcji. (A) Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków na szkiełku nakrywkowym, szkiełko nakrywkowe powinno zostać umieszczone na świeżej szalce Petriego zawierającej 1% agarozy. (B) Szalka Petriego ze szkiełkiem nakrywkowym może być następnie przechowywana w komorze wilgotnościowej (takiej jak pokazana) do czasu wyklucia się zarodków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Fenotyp nokautu Pmw. (A) Kontrola dopasowana do wieku i (B) zarodki z nokautem Pmw, z rozwijającymi się oczami oznaczonymi czarnymi grotami strzał. Zarodek w B jest mozaikowy, ponieważ widać mały pasek pigmentacji. (C) Kontrola dopasowana do wieku i (D) pisklęta z nokautem Pmw, z wstawkami pokazującymi inny kąt na oczach. Pisklę w D jest również mozaikowe. Biała strzałka wskazuje obszar na głównym zdjęciu pokazujący utratę pigmentacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Sekwencja nokautowania Pmw. (A) Model toskalowy mRNA Pmw, oznaczony w odstępach co 500 pz, z zaznaczonymi lokalizacjami miejsc wiązania gRNA: G1, kolor niebieski; G2, żółty; G3, różowy. Wszelkie mutacje powodujące przesunięcie ramki dźwięku wygenerowane w tym momencie zakłócą działanie większości produktu tłumaczeniowego. (B) Kontekst genomowy miejsc gRNA, wszystko w jednym eksonie (pogrubiony tekst pisany wielkimi literami). Miejsca powiązań linii pomocniczych są wyróżnione tymi samymi kolorami co A, a PAM są podkreślone. Rozpiętość wynosi ~300 pz. Tłumaczenie egzonu w ramce pokazano powyżej jako jednoliterowe skróty w wielkim tekście. Zaznaczono dwa motywy charakterystyczne dla transporterów pigmentu do oczu. Motyw CDEPT domeny funkcjonalnej Walkera B jest obramowany kolorem fioletowym, a motyw IHQP domeny pętli H jest obramowany kolorem zielonym. Obie domeny mają kluczowe znaczenie dla funkcji transportera ATP. (C) Obszar docelowy Pmw został amplifikowany przy użyciu dwóch rund PCR. Produkt z drugiej rundy został zbadany na żelu pod kątem dowodów na zmianę rozmiaru spowodowaną udanym usunięciem obszaru między prowadnicami. Pasy ruchu: L = drabinka 100 pz; 1 = kontrola wody PCR; 2 = jaja z wstrzyknięciem buforu; 3-4 = dwa oddzielne zestawy jaj wstrzyknięte mieszanką trójprowadnicową. Tylko zarodki, które otrzymały mieszankę trójprowadnicową, wytwarzały zarówno prążek WT (czerwona strzałka), jak i prążek powstały w wyniku całkowitego wycięcia (biała strzałka). (D) Aby potwierdzić tożsamość dolnego pasma (białej strzałki), DNA to zostało oczyszczone, sklonowane i zsekwencjonowane. Górna linia to sekwencja typu dzikiego. Pozostałe dwie linie to sekwencje z dwóch klonów. Trzy dodatkowe klony pasowały do dolnej sekwencji. Niebieskie podświetlenie wskazuje miejsce wiązania Przewodnika 1, a różowe podświetlenie wskazuje miejsce wiązania Przewodnika 3. W obu allelach usunięto cały region między tymi dwoma miejscami przewodnika. Skróty: Pmw = Peregrinus maidis biały gen; gRNA = przewodnik RNA; PAM = motyw przylegający do protospaceru; ATP = trifosforan adenozyny; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; WT = typ dziki; KO = nokaut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

JEZDNYCH TGL SZT. SZT. SZT. TGL szt. szt. TGL szt. TGL szt. TGL TGL TGL ODDZIAŁÓW SZT. szt. TGL

Ustaw	# kubków	# samic w każdej filiżance	# jaj								Całkowita liczba # jaj
			Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 5	Dzień 6	Dzień 7	Dzień 8	Dzień 9
1	10	15	0	26	Rozdział 166	Okręg wyborczy 355	Okręg wyborczy 530	193	91	37	Rok 1398
cyfra arabska	15	15	22 Rozdział 22	238	Okręg wyborczy 489	699	520	Okręg wyborczy 379	Rozdział 203	Rozdział 58	Numer katalogowy: 2608
3	8	15	0	57	230	Rozdział 190	Rozdział 116	Rozdział 80	Rozdział 34	1	Okręg wyborczy 708
4	10	15	0	226	Okręg wyborczy 446	Lokal mieszkalny 519	Rozdział 301	Rozdział 179	24	15	Rok 1710
łączny	Rozdział 43	15	23	Okręg wyborczy 547	1331	Rok 1763	1467	831	Okręg wyborczy 352	Rozdział 111	Numer katalogowy: 6483

Tabela 1: Reprezentatywne kolekcje jaj ze sztucznego środowiska składania jaj. Pokazane są dane z czterech zestawów kubków do zbierania jaj, przy czym liczenie jaj rozpoczyna się drugiego dnia po ustawieniu i trwa do dziewiątego dnia.

powiedział: szt.

Leczenie iniekcyjne	Ogółem wstrzyknięte	Ogółem Opracowane	Całkowita liczba zakreskowanych	Tempo rozwoju (%)	Wskaźnik wylęgu (%)
bufor	39 Rozdział 39	20	12	51 Rozdział 51	Rozdział 31
Certyfikat Cas9	39 Rozdział 39	24	14	61	36
Cas9 + Pmw gRNA	Rozdział 121	71 Rozdział 71	28	59 Rozdział 59	28

Tabela2: Wskaźniki przeżycia i nokautowania po wstrzyknięciach 3 różnych mieszanek iniekcyjnych.

Dyskusja

Jakość i wartości odżywcze jaj nieśnych
Niedawno naukowcy pracujący z pokrewnym gatunkiem, Nilaparvata lugens, uzyskali jaja, których używali do mikroiniekcji, bezpośrednio z liścia, utrzymując wstrzyknięte jaja w tkance liścia do czasu wyklucia się¹⁷. Chociaż ta metoda oparta na liściach zapewniła bardziej naturalne środowisko do rozwoju embrionalnego, zwiększyła również ryzyko infekcji i uszkodzenia jaj podczas procesu usuwania. Przedstawiony tutaj system sztucznego składania jaj zapewnia bardziej jednolite środowisko i zmniejsza ryzyko uszkodzenia jaj podczas obchodzenia się z nimi. Dzięki ustawieniu miseczek do składania jaj w piątek, większość jaj z jaj została zebrana w ciągu typowego tygodnia pracy, z korzyścią dla osób wykonujących prace związane z mikroiniekcją. Jednym zastrzeżeniem do tej metody jest jednak to, że brak składników odżywczych w diecie zawierającej 10% roztwór sacharozy ostatecznie wpłynie na zdrowie owadów, a samice w miseczkach zwykle zaczynają umierać już po 10 dniach. Jakość jaj również zaczyna spadać po 6 dniach, o czym świadczy wzrost liczby martwych lub niezdrowo wyglądających jaj. W związku z tym ważne jest, aby być selektywnym w stosunku do jaj używanych do mikroiniekcji i nie trzymać samic po 6 dniu.

Przeżywalność i wilgotność
Dwa czynniki wydają się mieć kluczowe znaczenie dla przeżycia zarodka w procesie mikroiniekcji. Najtrudniejszym aspektem obchodzenia się z zarodkami P. maidis jest zapobieganie ich wysuszeniu po wyjęciu z pożywki do składania jaj i podczas mikroiniekcji. Ponieważ jaja są zwykle składane w tkance roślinnej, brakuje im odpowiedniej skorupy, aby zapobiec odwodnieniu. Nawet w nawilżonym kapturze z powodu wysuszenia gubiły się całe zestawy jaj. Jednak zbyt wysoka wilgotność może również wpływać na mikroiniekcje, jeśli woda gromadzi się na taśmie dwustronnej lub na lunecie. Niestety, odwodnienie jaj zwykle nie było łatwe do zauważenia podczas procesu mikroiniekcji i często wydawało się normalne aż do 2 lub 3 dni później, kiedy stały się całkowicie przezroczyste, nie wykazując żadnych oznak rozwoju.

Jakość igieł również wydaje się odgrywać ważną rolę w przetrwaniu. Igła powinna być skośna, aby zminimalizować niepotrzebne uszkodzenia jaja. Gdy igła jest zablokowana, użycie funkcji czyszczenia na wstrzykiwaczu podczas delikatnego głaskania końcówki igły zwilżonym pędzlem (patrz krok 4.7) zazwyczaj przywracało igłę do stanu funkcjonalnego. Niezależnie od tego, zaleca się umieszczanie tylko niewielkich ilości roztworu do wstrzykiwań (~0,25 μl) do każdej igły i zmienianie igły na nową igłę co kilka szkiełek (~50-60 jaj), aby zapewnić utrzymanie jakości igły przez cały proces wstrzykiwania.

Pomyślne generowanie fenotypu nokautującego
Aby skutecznie przekształcić komórki rozrodcze, mikroiniekcje zarodków zwykle muszą być wykonane jak najwcześniej przed komórką. W zależności od gatunku owadów, okno czasowe na wykonanie mikroiniekcji waha się od zaledwie kilku godzin do nawet całego dnia 14,15,20. Nadal nie jest jasne, kiedy zarodki P. maidis ulegają celalizacji. Nokaut za pośrednictwem Cas9 testowano na zarodkach w wieku od 4 godzin po złożeniu jaj (pel) do nawet 16 godzin pel, a oczekiwane fenotypy obserwowano we wszystkich eksperymentach, co sugeruje, że wszystkie mikroiniekcje zostały wykonane w oknie preceluryzacji.

Ortolog genu koloru oczu, biały, P. maidis został wybrany, ponieważ oczekiwano, że fenotyp nokautu będzie łatwy do zbadania u osób otrzymujących zastrzyki ze względu na jego autonomiczną naturę komórkową. Rzeczywiście, zgodnie z oczekiwaniami, zarówno mozaikowe, jak i całkowite nokautowanie były wyraźnie identyfikowalne wśród zarodków otrzymujących mieszaninę iniekcyjną zawierającą Cas9 i prowadzące RNA. Niestety, nie wykluły się żadne iniekcje z całkowitym nokautem, a masowe krycie ocalałych iniekcji nie przyniosło potomstwa białookiego. Jednak później udało się wygenerować zmutowaną linię poprzez celowanie w inny gen (Klobasa i wsp., w toku). Sugerowałoby to, że niepowodzenie w ustaleniu linii białych mutantów jest najprawdopodobniej spowodowane albo efektami niecelowymi (tj. Cas9 przecinającymi ważne regiony w innym miejscu genomu) generującymi ściśle powiązaną mutację śmiertelną, albo nieprzewidywalną krytyczną rolą bieli u P. maidis.

Dane fenotypowe i molekularne (ryc. 8 i ryc. 9) potwierdzają, że w próbce wstrzykniętych zarodków powstał znaczny nokaut w białym locus, co skutkowałoby całkowitą utratą funkcji genu. Co więcej, podczas gdy mutacje u bieli są żywotne u niektórych gatunków, istnieje precedens, w którym zmniejszona aktywność bieli jest szkodliwa^21,22. To powiedziawszy, nie można całkowicie wykluczyć efektów off-target. Przewidywanie prawdopodobnych nietrafionych celów wymaga dokładnych danych dotyczących sekwencji genomu²³, co jest obecnie niemożliwe ze względu na obecny stan zasobów genomowych P. maidis. Niezależnie od tego, dzięki tym nowym metodom, testowanie innych genów docelowych może być przeprowadzone bez obaw, a nawet przejście do bardziej tradycyjnej transgenezy w celu wprowadzenia nowych narzędzi genetycznych do tego szkodliwego szkodnika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 oz Pojemniki	Dart	P100N	Pojemnik dla dorosłych do składania jaj
15 ml Rurki stożkowe	Olympus	Genesee 28-103	Służy jako probówka zbiorcza w konfiguracji aspiratora próżniowego
15 ml Probówki stożkowe	Olympus	Genesee 28-106	Do sporządzania 10% roztworu sacharozy i do trzymania dorosłych podczas schładzania przed badaniem przesiewowym
Aspirator	Bioquip	1135A	Do obsługi skoczków
Aspirator próżniowy	Fischer Technical	LAV-3	Odkurzacz do zasysania większej liczby owadów
Niebieskie światła LED Spectrum Home	Depot	GLP24FS/19W/LED	Oświetlenie do uprawy doniczkowych roślin kukurydzianych Zbiorniki żywią się
Cas9	TrueCut Cas9 Protein v2	A36498	Endonukleaza do cięcia genów skoczka
Przezroczyste rurki winylowe	Home Depot	3/8 cala ID x 1/2 cala OD x 10 stóp	Łączy rurkę zbiorczą z pompą w konfiguracji aspiratora próżniowego
Skoczki kukurydziane	Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej	Nie dotyczy Prośba	z laboratorium dr Anny Whitfield
Waciki	Genessee	51-101	Służy jako filtr/łapacz owadów w probówce zbiorczej w konfiguracji aspiratora próżniowego
Taśma dwustronna	Scotch Dwustronna taśma	NA	Trzymanie jaj do mikroiniekcji
Wczesny blask kukurydzy	Park Seed Company	05093-PK-N	Kukurydza do hodowli skoczków
epTIPS Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	C2554691	Końcówki do napełniania igłami
System mikroiniekcji Femtojet	Eppendorf	5247	Kontroluje ciśnienie wtrysku (12-20 psi, w zależności od wielkości otworu igły)
Nutri-Fly Drosophila Agar	Genessee	66-103	Podłoże do wszystkiego oprócz naczynia do składania jaj
Drobne kleszcze	Bioquip	4731	Obchodzenie się z jajami
ogólnego przeznaczenia LE Agarose	Apex	20-102	Podłoże i naczynie do składania jaj (podłoże do składania jaj)
Przewodnik RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol)	Prowadnice RNA do celowania w skoczek roślinny white gene
Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol)	Przewodniki RNA do celowania w skoczka roślinnego white gene
Przewodnik RNA 3 - GAGGGCAGAGUCUCGCUUUCUU	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol)	Prowadnice RNA do celowania w skoczek roślinny white gene
Nawilżacz	Homedics	UHE-CM45	Do dostarczania wilgoci w nawilżanym kapturze
Komora wilgotnościowa	Billups-Rothenberg	MIC-101	Do przetrzymywania wstrzykniętych zarodków do czasu wyklucia
Klatki do hodowli owadów	Bioquip (na specjalne zamówienie)	Blisko 1450 l (ma plastikowy przód i boki z siatki)	Klatka dla skoczków na kukurydzy
Laserowy ściągacz Micropipiette	Sutter Instruments	P-2000/G	Do wytwarzania igieł iniekcyjnych / Ciepło = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC Stereoskop fluorescencyjny	Leica	M165 FC	Przesiewanie skoczków roślinnych
Zakres mikroiniekcji	Leica	MZ12-5	Luneta do mikroiniekcji wyposażona w stolik XY
Mikromanipulator	Narishige	MN-151	Do pozycjonowania igły do mikroiniekcji
Skośnik do mikropipet	Sutter Instruments	FG-BV10-D	Do ukosowania igieł iniekcyjnych / Używana płytka o "drobnym" stopniu pod kątem 20& stopni
Stolik	mikroskopowy AmScope	GT100 X-Y Stół ślizgowy	Do pozycjonowania i przenoszenia zarodków pod mikroskopem
Miniaturowy pędzel do malowania	Testor #2 8733	Sprzedawane w 3 opakowaniach 281206	Drobne pędzle do obróbki zarodków
Uchwyt na igły	Narishige	HI-7	Do trzymania igły do mikroiniekcji
Inkubator	Percival	I41VLH3C8	Odchów iniekcji do momentu wyklucia
Szalki Petriego (100 x 15 mm)	VWR	89038-968	Przygotowanie naczynia agarowego do składania jaj
pGEM-T Zestaw do klonowania Easy Vector System I	Promega	A1360	Klonowanie Pm biały miejsce docelowe
Phenol Red	Sigma	143-78-8	Bufor do mikroiniekcji
Zwykły mikroskop Szkiełka podstawowe lub szkiełko nakrywkowe	Fisher Scientific	12-549-3	Trzymaj jaja do mikroiniekcji
Plasmid DNA Midi Kit	Zymo	D4200	Oczyszczanie plazmidowych DNA gotowych do wstrzyknięcia
Plastikowa folia parafinowa	Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego	PM-996	Rozmiar rolki 4 cale x 125 stóp
Folia	plastikowa Glad ClingWrap Folia	plastikowa NA	Owiń całą komorę składania jaj
Podkład - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA	IDT	25 nmole DNA Oligo	Podkład pierwszej rundy do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white
Starter - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGTGT	IDT	25 nmole DNA Oligo	Podkład pierwszej rundy do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white
Starter - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC	IDT	25 nmole DNA Oligo	Starter drugiej rundy do amplifingu w miejscu docelowym w genie Pm white
Primemer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA	IDT	25 nmole DNA Oligo Drugorundowy	podkład do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white
Kapilary kwarcowe	Sutter Instruments	QF100-50-10	Do wykonywania igieł do mikroiniekcji / średnica zewnętrzna 1 mm, Średnica wewnętrzna 0,7 mm, długość 10 cm
Ekran (biała tkanina z organzy)	Joann Tkaniny	16023889	Do przykrycia pojemnika dla dorosłych
Sparkleen	Fisher Scientific	04-320-4	Umyj naczynia
Sacharoza Fisher	Scientific	BP220-1	Aby zrobić 10% roztwór sacharozy