Method Article

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

DOI:

10.3791/62423

⸱

June 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application, National Demonstration Center for Experimental Plant Production Education, Department of Agronomy, Beijing University of Agriculture

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq) jest potężną i szeroko stosowaną techniką molekularną do mapowania lokalizacji całego genomu czynników transkrypcyjnych (TF), regulatorów chromatyny i modyfikacji histonów, a także wykrywania całych genomów w celu odkrycia wzorców wiązania TF i potranslacyjnych modyfikacji histonów. Działania modyfikujące chromatynę, takie jak metylacja histonów, są często rekrutowane do określonych sekwencji regulatorowych genów, powodując miejscowe zmiany w strukturach chromatyny i powodując określone efekty transkrypcyjne. Podmuch ryżu jest niszczycielską chorobą grzybiczą na ryżu na całym świecie i jest modelowym systemem do badania interakcji grzyb-roślina. Jednak mechanizmy molekularne w tym, jak modyfikacje histonów regulują swoje geny wirulencji w Magnaporthe oryzae, pozostają nieuchwytne. Więcej badaczy musi użyć ChIP-seq, aby zbadać, w jaki sposób modyfikacja epigenetyczna histonów reguluje ich docelowe geny. ChIP-seq jest również szeroko stosowany do badania interakcji między białkiem a DNA u zwierząt i roślin, ale jest rzadziej stosowany w dziedzinie patologii roślin i nie został dobrze opracowany. W tym artykule opisano proces eksperymentalny i metodę działania ChIP-seq w celu zidentyfikowania rozkładu metylacji histonów (takich jak H3K4me3) w całym genomie, która wiąże się z funkcjonalnymi genami docelowymi u M. oryzae. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetyka to gałąź badań genetycznych, która odnosi się do dziedzicznej zmiany ekspresji genów bez zmiany sekwencji nukleotydów genów. Coraz więcej badań wykazało, że regulacja epigenetyczna odgrywa ważną rolę we wzroście i rozwoju komórek eukariotycznych, w tym chromatyny, która reguluje i wpływa na ekspresję genów poprzez dynamiczny proces składania i składania w struktury wyższego rzędu1,2. Przebudowa chromatyny i kowalencyjna modyfikacja histonów wpływają i regulują funkcję i strukturę chromatyny poprzez zmienność polimerów chromatyny, osiągając w ten sposób funkcję regulacji ekspresji genów3,4,5,6. Potranslacyjne modyfikacje histonu obejmują acetylację, fosforylację, metylację, monoubikwitynację, sumoilację i rybozylację ADP7,8,9. Metylacja histonów H3K4, w szczególności trimetylacja, została zmapowana do miejsc początkowych transkrypcji, w których jest związana z replikacją transkrypcji, rekombinacją, naprawą i przetwarzaniem RNA u eukariontów10,11.

Technologia ChIP-seq została wprowadzona w 2007 roku i stała się eksperymentalnym standardem do analizy całego genomu regulacji transkrypcji i mechanizmów epigenetycznych12,13. Metoda ta jest odpowiednia w skali całego genomu i do uzyskiwania informacji o interakcjach histonów lub czynników transkrypcyjnych, w tym segmentów DNA białek wiążących DNA. Wszelkie sekwencje DNA usieciowane z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania będą współstrącać się jako część kompleksu chromatyny. Techniki sekwencjonowania nowej generacji są również wykorzystywane do sekwencjonowania 36-100 pz DNA, które są następnie dopasowywane do odpowiedniego genomu docelowego.

W grzybach fitopatogennych niedawno rozpoczęły się badania nad tym, jak modyfikacje metylacji histonów regulują ich docelowe geny w procesie chorobotwórczości. Niektóre wcześniejsze badania dowiodły, że regulacja genów związanych z metylazą histonów znajduje odzwierciedlenie głównie w wyciszaniu genów i katalizowaniu produkcji metabolitów wtórnych (SM). MoSet1 to metylaza H3K4 w M. oryzae. Nokaut tego genu powoduje całkowitą delecję modyfikacji H3K4me314. W porównaniu ze szczepem typu dzikiego, ekspresja genu MoCEL7C w mutancie jest zahamowana w stanie indukowanym przez CMC, a w stanie nieindukowanym (glukoza lub celobioza) ekspresja MoCEL7C wzrosła15. W Fusarium graminearum, KMT6 może katalizować modyfikację metylacji H3K27me3, regulować normalny rozwój grzybów i pomagać w regulacji "tajemniczego genomu" zawierającego klaster genu SM16,17,18,19. W 2013 roku Connolly poinformował, że metylacja H3K9 i H3K27 reguluje proces patogenny grzybów poprzez metabolity wtórne i czynniki efektorowe, które regulują hamowanie docelowych genów20. W Aspergillus modyfikacja histonów H3K4me2 i H3K4me3 jest związana z aktywacją genów i odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu regulacji poziomu chromatyny w klastrach genów SM 21. U M. oryzae, Tig1 (homologiczny do Tig1 u drożdży i ssaków) jest HADC (deacetylazą histonową)22. Nokaut genu Tig1 prowadzi do całkowitej utraty patogenności i zdolności do produkcji przetrwalników u mutanta zerowego. Jest bardziej wrażliwy na środowisko nadtlenowe, które nie może wytwarzać zakaźnych strzępek22.

Podmuch ryżu spowodowany przez M. oryzae. jest jedną z najpoważniejszych chorób ryżu w większości obszarów uprawy ryżu na świecie19. Ze względu na reprezentatywny proces infekcji, M. oryzae jest podobny do procesu infekcji wielu ważnych grzybów chorobotwórczych. Ponieważ grzyb może z łatwością przeprowadzać molekularne operacje genetyczne, stał się organizmem modelowym do badania interakcji między grzybami a roślinami23. Zablokowanie każdego etapu procesu infekcji M. oryzae może skutkować nieudanym zakażeniem. Zmiany morfologiczne podczas procesu infekcji są ściśle regulowane przez funkcję całego genomu i transkrypcję genów. Wśród nich modyfikacje epigenetyczne, takie jak metylacja histonów, odgrywają istotną rolę w regulacji transkrypcji funkcjonalnych genów24,25. Jednak do tej pory przeprowadzono niewiele badań nad molekularnym mechanizmem modyfikacji epigenetycznych, takich jak metylacja histonów i acetylacja histonów w transkrypcji genów patogenezy u M. oryzae. W związku z tym dalszy rozwój mechanizmu regulacji epigenetycznej grzyba zarazowego ryżu przy jednoczesnym prowadzeniu badań nad siecią regulacyjną tych patogennie powiązanych genów pomoże w opracowaniu strategii zapobiegania i kontroli zarazów ryżu.

Wraz z rozwojem funkcjonalnej genomiki, takiej jak ChIP-seq, szczególnie w epigenetyce, ta wysokoprzepustowa metoda pozyskiwania danych przyspieszyła badania nad chromosomami. Korzystając z eksperymentalnej technologii ChIP-seq, można zidentyfikować rozkład metylacji histonów w całym genomie (takich jak H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) u M. oryzae i innych grzybów strzępkowych. W związku z tym metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tego, w jaki sposób modyfikacje epigenetyczne regulują swoje kandydujące geny docelowe podczas patogenezy grzybów w patologii roślin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie protoplastów z M. oryzae

  1. Przygotuj agar owsiano-pomidorowy (OTA).
    1. Odważyć 30-50 g płatków owsianych i gotować je w 800 ml wody (ddH2O) przez 20 min. Przefiltrować przez dwie warstwy gazy i pobrać filtrat.
    2. Zbierz dojrzałe pomidory i obierz je. Wyciśnij sok i przefiltruj przez dwie warstwy gazy, aby zebrać 150 ml przefiltrowanego soku.
    3. Dokładnie wymieszaj cały sok pomidorowy i przygotowany filtrat owsiany i dodaj ddH2O do 1000 ml.
    4. Dodać 250 ml tubyki optycznej i 2,5 g proszku agarowego do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i sterylizować w autoklawie przez 20 minut. Przechowywać w temperaturze 25 °C.
  2. Wlać 25 ml autoklawowanej tuby optycznej do szklanej szalki Petriego o wymiarach 5 cm x 5 cm. Przygotuj w sumie 10 takich szalek Petriego. Po zestaleniu się tuby optycznej na szalkach Petriego, przechowywać szalki do góry nogami w temperaturze 25 °C.
  3. Użyj wysterylizowanej wykałaczki, aby wykopać mały kawałek grzybni z M. oryzae (szczep typu dzikiego P131, szczepy nokautujące Δmobre2, Δmospp1 i Δmoswd2) i umieść je na przygotowanych naczyniach OTA. Hodować je przez 4-6 dni w temperaturze 28 °C w warunkach świetlnych.
    UWAGA: Odwróć szalkę Petriego do góry nogami, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  4. Dodać 1000 μl płynnego Complete Medium (CM) (0,6% ekstraktu drożdżowego, 0,3% enzymatycznego hydrolizatu kazeiny, 0,3% kwaśnego hydrolizatu kazeiny, 1% glukozy) do szalek OTA za pomocą pipety 1000 μL.
    UWAGA: Strzępki rosły na szalkach OTA przez 4-6 dni.
  5. Zeskrobać grzybnię szczepu dzikiego i szczepu nokautującego za pomocą pętli inokulacyjnej.
  6. Zbierz resztki grzybni i przenieś je do 250 ml płynnego Complete Medium (CM).
  7. Hodować szczątki grzybów w trójkątnej kolbie w temperaturze 28 °C przez 36 godzin z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
  8. Użyj lejka, aby przefiltrować i zebrać strzępki grzybów.
  9. Przemyć strzępki grzybów 500 ml 0,7 M roztworu NaCl.
  10. Zbierz grzybnię grzyba i zważ ją.
    UWAGA: Grzybnia nie musi być suszona przed ważeniem.
  11. Dodać ~ 1 ml roztworu przenikającego enzym do lizy na 1 g grzybni.
    1. Przygotować roztwór do przenikania enzymu do lizy o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając enzym do lizy z Trichoderma harzianum w 0,7 M NaCl.
  12. Umieścić strzępki do lizy w temperaturze 28 °C na 3-4 godziny z wytrząsaniem przy 150 obr./min.
  13. Przemyć zlizowane strzępki 50 ml 0,7 M roztworu NaCl.
  14. Zebrać protoplasty i odwirowywać przez 15 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.
  15. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić protoplasty w 20 ml 0,7 M buforu NaCI w temperaturze 4 °C.

2. Sieciowanie in vivo i sonikacja

  1. Dodaj 55 μl 37% formaldehydu (dodawaj formaldehyd kropla po kropli, aż końcowe stężenie wyniesie 1%) do 2 ml buforu NaCI zawierającego protoplast do sieciowania.
  2. Inkubować protoplasty w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
  3. Dodaj 20 μl 10x glicyny do każdej probówki, aby ugasić nieprzereagowany formaldehyd.
  4. Mieszać do mieszania i inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
  5. Wirować przez 15 minut przy 2.000 x g i 4 °C.
  6. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml 0,7 M roztworu NaCI
    7. .
  7. Wirować przez 10 minut przy 2.000 x g i 4 °C.
  8. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 750 μl buforu RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS i inhibitory proteazy).
  9. Dodaj 37,5 μl 20x inhibitora proteazy.
  10. Przenieś protoplasty z poprzedniego kroku do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  11. Wykonaj sonikację (25% W, wyjście 3 s, zatrzymanie 5 s, 4 °C) natychmiast za pomocą sonikatora na około 10 minut. Celem tego etapu jest sonikacja usieciowanego lizatu przez pewien czas w celu określenia najlepszych warunków.
    UWAGA: Na tym etapie lizat można zamrozić w temperaturze -80 °C.
  12. Jeśli optymalne warunki do sonikacji zostały już określone, przejdź do następnego kroku.
  13. W razie potrzeby usuń 5 μl protoplastów do analizy w żelu agarozowym (nieścięte DNA).
  14. Ścinać chromatynę przez sonikację za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego przez 8 minut (25% W, moc 3 s, zatrzymanie 5 s, 4 °C).
  15. Po rozbiciu próbki ultradźwiękowo wyjmij część próbki jako "wejście".. Dane wejściowe nie przeprowadzają eksperymentu ChIP i zawierają całe DNA i białka uwolnione po sonikacji próbki.
  16. Po sonikacji należy przeprowadzić elektroforezę w 1% żelu agarozowym, aby przeanalizować długość fragmentów DNA.
    UWAGA: Wyniki elektroforezy w żelu agarozowym pokazują, że długość fragmentu DNA wynosi 200-500 pz (Ryc. 4).
  17. Umieść soniczną probówkę na lodzie, aby zapobiec degradacji białka.
  18. Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C.
  19. Po odwirowaniu przenieść odwirowany supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Otrzymany w tym etapie roztwór chromatyny może być użyty do kolejnego IP.
  20. Przed wykonaniem eksperymentu IP należy rozcieńczyć każdą próbkę chromatyny w stosunku 1:10 za pomocą 1x buforu RIPA (np. dodać 10 μl próbki chromatyny do 1 μl buforu 1×RIPA).

3. IP usieciowanego białka/DNA

  1. Odpipetować 50 μl superparamagnetycznych kulek białkowych do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Niech koraliki magnetyczne wytrącą się. Usunąć supernatant.
  2. Dodaj 1 ml 1x buforu RIPA (wstępnie schłodzonego na lodzie) do probówki i trzykrotnie umyj superparamagnetyczne kulki białkowe. Po umyciu umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Dodać 100 μl 1x buforu RIPA do każdej probówki.
  3. Do probówki dodać 300 μl próbki chormatyny (użyto 2 x 107 komórek), 100 μl superparamagnetycznych kulek białkowych i 4 μl przeciwciała H3K4me3.
  4. Użyj próbek z mysią IgG jako kontrolą ujemną.
    UWAGA: Mysia IgG używana w tym protokole zawiera 0,01 M buforu fosforanowego i 0,15 M NaCl i pozostanie zamrożona w temperaturze poniżej 20 °C (patrz Tabela materiałów).
  5. Po dokładnym wymieszaniu umieścić próbki na wytrząsarce obrotowej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, 30 x g.
    UWAGA: Możliwe jest skrócenie czasu inkubacji immunoprecypitacji (IP). Czas inkubacji zależy od różnych czynników (np. przeciwciała, celu genu, typu komórki itp.) i będzie musiał zostać przetestowany empirycznie.

4. Zbieranie i płukanie produktów IP

  1. Granuluj superparamagnetyczne kulki białkowe, umieszczając je na stojaku magnetycznym. Odessać i wyrzucić supernatant.
  2. Przemyć superparamagnetyczny kompleks kulek białkowych, przeciwciała i chromatyny, ponownie zawieszając kulki w 1 ml buforu 1x RIPA.
  3. Przepłukać probówkę na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut i usunąć supernatant o stężeniu 30 x g.
  4. Dodać 1 ml niskosolnego kompleksu immunologicznego do płukania (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 i 150 mM NaCl).
  5. Płukać probówkę na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut i usunąć supernatant.
  6. Dodać 1 ml wysokosolnego kompleksu immunologicznego do płukania (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 i 500 mM NaCl) do probówki wirówkowej.
  7. Umieścić probówkę na wytrząsarce obrotowej na 5 minut i usunąć supernatant.
  8. Przepłukać 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% kwasu deoksycholowego, 1 mM EDTA i 10 mM Tris-HCl pH 8,1) w probówce wirówkowej.
  9. Umieścić probówkę na wytrząsarce obrotowej na 5 minut i usunąć supernatant.
  10. Ponownie przepłukać probówkę 1 ml 0,25 M buforu LiCI, usunąć supernatant za pomocą pipety, a następnie wyrzucić supernatant.
  11. Dodać 1 ml buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
  12. Umieść probówkę na wytrząsarce obrotowej na 5 minut przy 30 x g.
  13. Ponownie przemyć probówkę 1 ml buforu TE i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  14. Zbierz koraliki.

5. Elucja kompleksów białkowo-DNA

  1. Przygotować bufor elucyjny (10 μl 20% SDS, 20 μl 1 M NaHCO3, 170 μl sterylnego destylowanegoH2O) dla wszystkich IP i probówek wejściowych.
  2. Dodać 100 μl buforu elucyjnego do każdej probówki wirówkowej.
  3. Elucja w temperaturze 65 °C przez 15 min.
  4. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do nowych probówek wirówkowych.
  5. Powtórzyć kroki 5.2 - 5.4 i połączyć eluaty. Dodać 190 μl buforu elucyjnego do 10 μl wejściowego DNA. (objętość całkowita = 200 μL).

6. Odwrotne sieciowanie kompleksów białko/DNA

  1. Dodać 8 μl 5 M NaCl do wszystkich probówek i inkubować w temperaturze 65 °C przez 4-5 godzin lub przez noc, aby odwrócić wiązania krzyżowe DNA-białko.
    UWAGA: Po tym etapie należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C i w razie potrzeby kontynuować protokół następnego dnia.
  2. Dodać 1 μl RNazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 4 μl proteinazy K (rozpuszczonej wH2Ow stężeniu 20 mg/ml i przechowywanej w temperaturze -20 °C) do każdej probówki i inkubować w temperaturze 45 °C przez 1-2 godziny.

7. Oczyszczanie i odzyskiwanie DNA

  1. Dodać 550 μl mieszaniny fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (w stosunku 25:24:1) do probówki wirówkowej.
  2. Dokładnie mieszaj mieszaninę przez 1 minutę.
  3. Wirować przez 15 minut przy 10 000 x g i odessać supernatant.
  4. Przenieść wyekstrahowany supernatant z poprzedniego etapu do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Dodać 1/10 objętości 3 M roztworu octanu sodu, 2,5 objętości absolutnego etanolu i 3 μl glikogenu (20 mg/ml) do probówki.
  6. Umieścić próbkę w lodówce w temperaturze -20 °C na noc w celu wytrącenia się.
  7. Wirować przez 15 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C.
  8. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Umyj granulkę trzy razy 1 ml 75% etanolu (musi być przygotowana na świeżo) w temperaturze 10 000 x g.
  9. Umyty osad umieścić na czystej ławce, aby alkohol wysechł.
  10. Dodać 50 μl sterylnego dejonizowanegoH2O, aby wystarczająco rozpuścić osad.
  11. Zwiąż adapter sekwencjonowania do fragmentu DNA i użyj wysokoprzepustowej platformy sekwencjonowania do sekwencjonowania DNA.

8. Naprawa DNA i budowa biblioteki Solexa

  1. Napraw końce DNA, aby wygenerować tępo zakończone DNA za pomocą zestawu do naprawy końców DNA (1-34 μl DNA, 5 μl 10x buforu do naprawy końców, 5 μl po 2,5 mM każdy dNTP, 5 μl 10 mM ATP, 1 μl mieszanki enzymów naprawy końców iH2O, aby dostosować objętość reakcji do 49 μL).
  2. Użyj zestawu do oczyszczania PCR lub ekstrakcji fenolem: chloroformem, aby oczyścić DNA. Eluować lub ponownie zawiesić DNA w 30 μL 1x TE pH 7,4.
  3. Dodaj "A" do końców 3' (30 μl DNA z kroku 2, 2 μl H2O, 5 μl 10x buforu Taq, 10 μl 1 mM dATP i 3 μl polimerazy DNA Taq). Dodać odczynniki do probówki wirówkowej PCR o pojemności 0,2 ml, dobrze wymieszać i reagować w maszynie do PCR w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
  4. Wykonaj ligację łącznika, mieszając 10 μl DNA, 9,9 μl H2O, 2,5 μl buforu ligazy DNA T4, 0,1 μl mieszanki oligazoligografii adaptera i 2,5 μl ligazy DNA T4. Dodaj odczynniki do probówki wirówkowej PCR o pojemności 0,2 ml i dobrze wymieszaj. Inkubować je w temperaturze 16 °C przez 4 godziny.
  5. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta. Eluować za pomocą 20-25 μl buforu elucyjnego.
  6. Zanim biblioteka DNA zostanie ustanowiona, należy określić stężenie oczyszczonego DNA, aby potwierdzić jego użycie w kolejnych eksperymentach sekwencjonowania.
  7. Wykryj stężenie DNA za pomocą fluorometru. Po stopieniu próbki na lodzie należy ją dokładnie wymieszać i odwirowywać przez 30 s w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C. Następnie należy pobrać odpowiednią ilość próbki i zmierzyć ją we fluorometrze o długości fali 260 nm.
  8. Umieść próbki DNA o kwalifikowanej jakości i stężeniu na platformie sekwencjonowania Illumina w celu sekwencjonowania.
  9. Przed sekwencjonowaniem amplifikuj DNA za pomocą starterów PCR, PE1.0 i PE2.0 oraz 2x wysokiej jakości mieszanki głównej (10,5 μl DNA, 12,5 μl 2 wysokiej jakości mieszanki głównej, 1 μl startera PCR PE1.0 i 1 μl startera PCR PE2.0). Dodaj odczynniki do probówki wirówkowej PCR o pojemności 0,2 ml i dobrze wymieszaj.
  10. Uruchomić reakcję PCR w maszynie do PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 15 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Na koniec przeprowadzić inkubację reakcji w temperaturze 4 °C.
  11. Użyj DNA do generowania klastrów i wykonaj sekwencjonowanie przez syntezę na Illumina Hiseq 2000.
    UWAGA: W tym protokole do generowania klastrów użyto komórek przepływowych Illumina. Sekwencjonowanie przez syntezę przeprowadzono na analizatorze genomu Illumina zgodnie z instrukcjami producenta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cały schemat blokowy metody ChIP-seq jest pokazany w Rysunek 1. Eksperymenty ChIP-seq przeprowadzono przy użyciu przeciwciał przeciwko H3K4me3 w dzikim szczepie P131 i trzech zmutowanych szczepach zerowych, które były pozbawione genu mobre2, mospp1 i moswd2, w celu zweryfikowania całego profilu dystrybucji histonów H3K4me3 w całym genomie u M. oryzae. Protoplasty szczepu typu dzikiego, Δmobre2, Δmospp1 i Δmoswd2, przygotowano i p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio ChIP-seq stał się szeroko stosowaną metodą analizy genomowej do określania miejsc wiązania TF lub miejsc wzbogacania zmodyfikowanych przez określone histony. W porównaniu z poprzednią technologią ChIP-seq, nowa technologia ChIP-seq jest bardzo czuła i elastyczna. Wyniki są dostarczane w wysokiej rozdzielczości bez negatywnych skutków, takich jak sygnał szumu spowodowany niespecyficzną hybrydyzacją kwasów nukleinowych. Chociaż jest to powszechna analiza ekspresji genów, wiele metod obliczeniowych zostało zwalidow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31871638), Specjalny Projekt Badań Naukowych Pekińskiego Uniwersytetu Rolniczego (YQ201603), Projekt Naukowy Pekińskiego Komitetu Edukacyjnego (KM201610020005), Projekt Kultywacji Badań Naukowych Wysokiego Poziomu BUA (GJB2021005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
kwaśny hydrolizat kazeinyWAKO65072-00-6Agar w proszku o średniej konfiguracji
scientan9002-18-0Konfiguracja podłoża
kwas deoksycholowyMedChemExpress83-44-3białko i rozpuszczanie
DNA Zestaw naprawczyNovoBiotecER81050Naprawa DNA lub cDNA uszkodzone przez ścinanie
enzymatyczne lub mechaniczneDynabeadsInvitrogenno.100.02DBinding target
EB bufferJIMEIJC2174Membrana i płyn
EDTAThermoFisherAM9912inhibitor proteazy
enzymatyczny hydrolizat kazeinySigma91079-40-2Średnia konfiguracja
glukozySigma50-99-7Glikogen w średniej konfiguracji
ThermoFisherAM9510Przeciwciała o działaniu strącającym
H3K4me3Abcamab8580Odpowiedź immunologiczna na białko H3K4me3
illumina Analizator genomu illumina illuminaHiseq 2000Duża konfiguracja
Startery Illumina PCRilluminaCleanPlexLosowy uniwersalny starter
alkohol izoamylowyksiążka chemiczna30899-19-5Oczyszczone DNA
LiClThermoFisherAM9480specyficzne usuwanie RNA
lizująceSigmaL1412-10GBufor do lizy komórek
Mysie IgGYeasen36111ES10Normalna immunoglobulina zwierzęca
Roztwór NaClThermoFisher7647-14-5Konfiguracja medium
NaHCO3SeebioSH30173.08*Przygotowanie eluentu z kompleksu białkowego
NP-40ThermoFisher85124lizat komórkowy wspomagający lizę
komórek PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28004Procedura oczyszczania usuwa startery z próbek DNA
inhibitory proteazyThermoFisherA32965Inhibitor białka, który zmniejsza aktywność białka
Proteinaza KOdczynnik
do ekstrakcji DNA ThermoFisher AM2546Qubit 4.0ThermoFisherQ33226Konfiguracja medium
Bufor RIPA Buforlizy komórekThermoFisher9806S
RNaza AThermoFisherAM2271Oczyszczone DNA
SDSThermoFisherAM9820zakrywa różnice ładunków
roztwór octanu soduThermoFisherR1181Bufor
kwasu octowegodeoksycholan soduThermoFisher89904hamowanie degradacji proteazy
Ligaza DNA T4ThermoFisherEL0011W warunkach ATP jako koenzymu, ligazy DNA
T4 Bufor ligazy DNA Bufor ligazyThermoFisherB69Bufor ligazy DNA
Tris-HClThermoFisher1185-53-1działanie buforowe
Triton X-100ThermoFisherHFH10utrzymuje stabilny ekstrakt drożdżowy z białkiem błonowym
OXOIDLP0021Konfiguracja podłoża
enzymy do DNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  4. Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
  5. Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
  6. Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
  7. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
  8. Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
  9. Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
  10. Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
  11. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  12. Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520(2020).
  13. Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
  14. Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385(2015).
  15. Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
  16. Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
  17. Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324(2012).
  18. Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
  19. Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).
  20. Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916(2013).
  21. Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4(2013).
  22. Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
  23. Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
  24. Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
  25. Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
  26. Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chromatin ImmunoprecipitationChIP SeqHistone ModificationsGenome Wide AnalysisMagnaporthe OryzaeFungal PathogenesisHistone MethylationProtein DNA InteractionH3K4me3 AntibodyDNA Fragmentation

Related Articles