Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62432

⸱

7 maja 2021

 ,  ,  , 
1Environmental Health Institute, National Environmental Agency

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół badania konkurencyjności godowej samców Aedes aegypti przy użyciu barwnika fluorescencyjnego jako markera. Samice komarów są narażone na kontakt zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami w celu kopulacji. Po kryciu ich plemniki są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia ich partnera godowego.

Streszczenie

Sukces sterylnych lub niekompatybilnych programów tłumienia populacji opartych na technice owadów zależy od zdolności uwolnionych samców do konkurowania o samice dzikiego typu i wywoływania bezpłodności w populacji docelowej. W związku z tym laboratoryjna ocena konkurencyjności samców w okresie kojarzenia jest niezbędna do oceny przydatności szczepu uwalniającego przed wypuszczeniem na rynek. Tradycyjnie taki test przeprowadza się poprzez określenie proporcji zdolnych do życia jaj wytworzonych przez samice po jednoczesnym wystawieniu na działanie dwóch zestawów samców (szczepy typu dzikiego i szczepy uwalniające) w celu kopulacji. Proces ten jest jednak czasochłonny i pracochłonny ze względu na konieczność najpierw nakarmienia samic krwią do produkcji jaj, a następnie wyklucia się i policzenia wyklutych jaj w celu określenia żywotności jaj.

Ponadto, ta metoda nie jest w stanie dostrzec stopnia konkurencyjności między dwoma sterylnymi lub zakażonymi Wolbachią liniami komarów, ponieważ samice komarów typu dzikiego produkują jaja niezdolne do życia tylko po kojarzeniu z obydwoma. Aby obejść te ograniczenia, w artykule opisano bardziej bezpośrednią metodę pomiaru konkurencyjności kojarzenia się samców komarów w warunkach laboratoryjnych przy użyciu barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B (RhB), który może być używany do oznaczania samców poprzez karmienie ich roztworem sacharozy zawierającym RhB. Po teście krycia obecność fluoryzujących plemników w spermathecae samicy może być wykorzystana do określenia jej partnera godowego. Metoda ta jest opłacalna, skraca czas eksperymentu o 90% i pozwala na porównanie dopasowania do krycia między dwiema sterylnymi lub zakażonymi Wolbachią liniami.

Wprowadzenie

Hodowla i wypuszczanie bezpłodnych lub niekompatybilnych samców w celu tłumienia populacji komarów Aedes jest obecnie oceniane w terenie jako nowe narzędzie do zapobiegania wybuchom epidemii dengi i innych chorób przenoszonych przez Aedes1. Strategie tłumienia uwalniania samców, które są obecnie w fazie prób terenowych, obejmują zastosowanie metody genetycznej2, napromienianie (Sterile Insect Technique, SIT)3, endosymbiotyczne bakterie Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4, lub kombinacja dwóch ostatnich technik5,6. Sukces tych podejść zależy w dużej mierze od zdolności wypuszczonych samców do konkurowania z samcami typu dzikiego i poszukiwania samic do zapewnienia kopulacji. W przeciwnym razie nie można wywołać bezpłodności w populacji docelowej.

W klasycznym programie SIT, na przykład, na zdolność krycia samców mogą wpływać takie czynniki jak dawka napromieniowania7,8,9, protokół masowego chowu i zakres chowu wsobnego w kolonii10,11,12,13,14. Co więcej, badania nad konkurencyjnością godową mogą dostarczyć ważnej wiedzy na temat zachowań godowych komarów, która może być wykorzystana do opracowania strategii kontroli wektorów.

W SIT i IIT, konkurencyjność kojarzenia samców komarów jest zazwyczaj oceniana poprzez umożliwienie zarówno szczepowi dzikiemu, jak i szczepowi wypuszczonemu konkurowania o samice typu dzikiego w klatce8,11,15,16. Samice są następnie karmione krwią, a ich jaja wykluwają się w celu określenia żywotności. Zakłada się, że samice, które składają jaja niezdolne do życia lub jaja o niskim wskaźniku wylęgu, kojarzyły się z samcami szczepu uwalniającego, podczas gdy samice, które produkują żywotne jaja, kojarzyły się z samcami typu dzikiego. Konkurencyjność krycia jest następnie obliczana za pomocą Fried Index17. Niestety, metoda ta jest zasobochłonna i czasochłonna, a na ogólny wskaźnik smażenia mogą wpływać zewnętrzne czynniki zakłócające wpływające na żywotność jaj, takie jak złe obchodzenie się z jajami i nadmierne wysuszenie, co może skutkować niskim wskaźnikiem wylęgu w krzyżówce zgodności, co może następnie prowadzić do sztucznie niskiego wskaźnika smażenia.

Ponadto, ta metoda nie pozwala na bezpośrednie porównanie konkurencyjności godowej między komarami Aedes, które są zarażone różnymi szczepami Wolbachia lub które są narażone na różne dawki promieniowania. W związku z tym potrzebna jest bardziej bezpośrednia metoda, aby sprostać tym wyzwaniom. Ostatnie badania18,19 wykazały skuteczność stosowania barwnika fluorescencyjnego, RhB, do oznaczania płynu nasiennego samców komarów. Oznaczony płyn nasienny jest przenoszony i przechowywany w spermatekach samic komarów po udanym kryciu, co umożliwia bezpośredni pomiar interakcji godowej samicy z oznaczonymi samcami. Rodamina B jest tiolowo-reaktywnym barwnikiem fluoronowym, powszechnie stosowanym jako biomarker w ekologicznych i behawioralnych badaniach naukowych na zwierzętach, w tym owadach20. W przypadku badań nad komarami RhB wprowadza się poprzez karmienie cukrem lub wodą z miodem zawierającą rozpuszczony proszek RhB18,19,21,22,23,24. Po wchłonięciu barwnik RhB wiąże się z białkami, barwiąc tkankę ciała czerwonawo-różowym barwnikiem, który fluoryzuje na jasnopomarańczowo pod fluorescencyjnym źródłem światła.

Silny sygnał fluorescencyjny i stabilność znakowania, w połączeniu z jego zdolnością do barwienia płynów nasiennych owadów, pozwala na monitorowanie transferu oznaczonego płynu nasiennego od oznakowanego samca do narządów magazynujących plemniki samicy owada w celu badań kryjowych18,19,21,24. Zastosowanie RhB w teście konkurencyjności krycia samców nie tylko umożliwia bezpośredni pomiar interakcji godowej samic z oznaczonymi i nieoznakowanymi samcami, ale wyniki można również uzyskać w ciągu 24 godzin, ponieważ eliminuje to proces określania żywotności jaj, który zwykle wymaga około 10 do 14 dni. Co więcej, metoda ta pozwala przezwyciężyć potencjalną utratę danych, gdy samice komarów nie odżywiają się krwią lub umierają przed złożeniem jaj. Jest to szczególnie istotne, ponieważ w próbach półpolowych, gdzie samice komarów są podatne na uszkodzenia i śmierć podczas zbierania po kryciu przy użyciu plecaka lub aspiratora mechanicznego. Aby rozwiązać obecne ograniczenia związane z wykorzystaniem płodności samic, przedstawiamy alternatywną metodę, która wykorzystuje barwienie RhB do bezpośredniego pomiaru konkurencyjności samców komarów. Metoda upraszcza przepływ pracy, skraca czas eksperymentu z około dwóch tygodni do jednego dnia, co pozwala na przeprowadzenie większej liczby eksperymentalnych powtórzeń i umożliwia porównanie między dwoma szczepami o wydaniu. Protokół ten będzie odpowiedni dla laboratoriów, które rozpoczynają programy tłumienia populacji komarów oparte na uwalnianiu samców i może być używany do rutynowej kontroli jakości i oceny szczepów.

Protokół

1. Hodowla komarów

  1. Przeprowadzić wszystkie badania konkurencyjności komarów i konkurencyjności krycia samców w standardowych warunkach owadobójczych w temperaturze 27 ± 1 °C i wilgotności względnej 75-80%, z fotoperiodem 12 godzin: 12 godzin cykli światła: ciemność.
  2. Oznacz dwie grupy rywalizujących samców jako zestaw A i zestaw B, aby ułatwić odniesienie do metodologii opisanej w tym artykule. Hoduj komary w znormalizowanych warunkach, aby zapewnić uczciwe porównanie ich przydatności podczas testu. Wyhoduj komary w zagęszczeniu larw 500 larw w 2 litrach wody i nakarm je mielonym pokarmem dla ryb w proszku ad libitum.
    UWAGA: Dla wygenerowania reprezentatywnych wyników, zestaw A i zestaw B były wsobnymi i krzyżowanymi samcami Ae zakażonego Wolbachia. Aegypti, odpowiednio.
  3. Płciować samce i samice komarów w stadium poczwarki i przechowywać je oddzielnie w klatkach (patrz tabela materiałów) o wymiarach szer. 32,5 cm x gł. 32,5 cm x wys. 32,5 cm, o rozmiarze oczek 150 x 150 i otworze 160 μm. Utrzymuj wszystkie dorosłe komary za pomocą 10% roztworu sacharozy.

2. Przygotowanie samców i samic komarów

  1. Płeć samców i samic komarów w stadium poczwarki zgodnie z różnicami w ich wielkości (poczwarki samców są mniejsze niż poczwarki samic) (Rysunek 1).
  2. Dla każdej grupy komarów (zestaw A lub zestaw B) przenieś po 100 poczwarek płci męskiej do wstępnie oznakowanej klatki w celu karmienia sacharozą lub sacharozy RhB.
  3. Poczwarki samic należy umieszczać w małych partiach po 40-50 sztuk w klatce. Po pojawieniu się imagoes sprawdź klatki pod kątem obecności samców komarów.
    UWAGA: Dorosłe samce komarów są mniejsze od samic i mają bardziej krzaczaste i owłosione czułki (Rysunek 2). Do testów konkurencyjności godowej należy używać wyłącznie dziewiczych samic komarów. Użycie wstępnie zapłodnionych samic spowoduje, że wszystkie uzyskane dane będą nieważne. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas określania płci na etapie poczwarek. Nie używaj samic komarów z klatki, która została skażona samcami komarów. Należy przygotować dodatkowe klatki dla samic.

3. Przygotowanie 0,2% RhB - roztwór sacharozy

UWAGA: RhB to zielony proszek w postaci suchej i czerwono-różowy w roztworze. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy nosić standardowe środki ochrony osobistej (PPE: laboratoryjny fartuch ochronny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne). Aby uniknąć wdychania, zważyć proszek RhB w dygestorium.

  1. Aby przygotować 0,2% m/v roztwór RhB-sacharozy, należy rozpuścić 200 mg proszku RhB na każde 100 ml 10% m/v roztworu sacharozy. Dobrze wymieszaj, aby upewnić się, że cały proszek się rozpuścił.
    UWAGA: Ponieważ RhB jest wrażliwy na światło, używaj bursztynowych butelek lub owiń przezroczyste butelki całkowicie folią aluminiową.

4. Karmienie samców komarów

UWAGA: Dane z optymalizacji żywienia sacharozą RhB są przedstawione w Materiałach uzupełniających, sekcja 1.

  1. Przygotuj 20 butelek z podajnikiem cukru z. Dodaj 10 ml 10% sacharozy do 10 butelek zasilających i 10 ml 0,2% roztworu RhB-sacharozy do pozostałych 10 butelek zasilających (użyj bursztynowych butelek lub zawiń butelki w folię aluminiową).
  2. Umieść butelki do karmienia w odpowiednich klatkach męskich (po 5 butelek na klatkę) przygotowanych w krokach 2.2 i 2.3. Pozwól samcom komarów żerować przez trzy dni przed eksperymentem godowym.

5. Sprawdzanie fluorescencji RhB u samców komarów

  1. Odessać samce komarów karmionych sacharozą RhB i obserwować je pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że wszystkie samce komarów karmione sacharozą RhB zostały pomyślnie oznaczone RhB.
  2. Włącz palnik rtęciowy lamp i mikroskop stereoskopowy. Pozwól, aby źródło światła palnika rtęciowego lamp ustabilizowało się przez 10 minut. Ustaw filtry fluorescencyjne dla białka czerwonej fluorescencji 1 (RFP1) (długość fali wzbudzenia 540 nm, długość fali emisji 625 nm).
  3. Odessać niewielką liczbę komarów (cztery lub pięć) na raz do szklanej rurki aspiratora doustnego. Przez szklaną rurkę obserwuj ciało samców komarów pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Wyklucz z eksperymentu samce komarów nieoznaczone RhB.
    UWAGA: Brzuch samców komarów oznaczony RhB będzie wyglądał na różowy w białym świetle (Rysunek 3A) i świecił na jasnopomarańczowo w świetle fluorescencyjnym (Rysunek 3B).
  4. Zestaw transferowy Samce komarów A do 12 papierowych kubków zabezpieczonych siatką (rozmiar oczek 150 x 150, otwór 160 μm); 6 filiżanek każdy z 10 samcami komarów karmionych sacharozą, a pozostałe 6 kubków każdy z 10 samcami komarów karmionych sacharozą RhB. Powtórz ten krok dla samców komarów z zestawu B.

6. Test konkurencyjności krycia

  1. Ustawić klatki o wymiarach 12 cm szer. 60 cm x gł. 60 cm x wys. 60 cm z otworem o rozmiarze oczek 44 x 32, 650 μm do testu krycia. W każdej z sześciu klatek znajduje się 10 samców komarów z zestawu A (oznaczonych RhB), 10 samców komarów z zestawu B (nieoznaczonych) i 10 dziewiczych samic komarów typu dzikiego. W pozostałych sześciu klatkach znajduje się 10 samców komarów z zestawu A (nieoznaczonych), 10 samców komarów z grupy B (z oznaczeniem RhB) i 10 dziewiczych samic komarów typu dzikiego. Oznacz te koszyki, aby wyraźnie odróżnić dwie współpracujące kombinacje.
    UWAGA: Na podstawie doświadczenia do testu krycia użyto klatki o wymiarach 60 cm x 60 cm x 60 cm, ponieważ mniejsza klatka może zachęcać do krycia mieszanego.
  2. Umieścić odpowiednie kubki samców przygotowane w kroku 5.4 w klatkach do krycia zgodnie z etykietą w kroku 6.1. Zdejmij siatkę i delikatnie postukaj w kubek, aby wypchnąć samce z kubka. Ostrożnie wyjmij papierowy kubek i siatkę z klatki, aby upewnić się, że żadne komary nie wydostają się z klatki. Pozwól samcom komarów zaaklimatyzować się w klatce godowej przez co najmniej godzinę.
  3. Za pomocą aspiratora doustnego przenieś dziewicze samice komarów typu dzikiego do 12 papierowych kubków, z których każdy zawiera 10 komarów.
  4. Po okresie aklimatyzacji samców komarów przenieść jedną miseczkę samic do każdej klatki godowej i zdjąć siatkę. Delikatnie popchnij kubek, aby zachęcić pozostałe samice komarów do wyjścia z kubka. Ostrożnie wyjmij papierowy kubek i siatkę z klatki, aby upewnić się, że żadne komary nie wydostają się z klatki.
  5. Pozwól na krycie przez 3 godziny
    UWAGA: Zalecany czas krycia został określony na podstawie wcześniejszych obserwacji dzikiego typu Ae. aegypti. W doświadczeniach z udziałem 10 samic i 20 samców trzymanych w klatce o wymiarach 60 cm x 60 cm x 60 cm, 90% inseminacji samic osiągnięto w ciągu 3 godzin (Materiał uzupełniający, sekcja 2). W tym okresie nie należy naruszać klatki, ponieważ mieszanie może prowadzić do przerwania i mieszanego krycia. Krycie mieszane (w którym samica kojarzyła się zarówno z oznaczonymi, jak i nieoznaczonymi samcami) powoduje skłonność do samców ze znakiem RhB, ponieważ trudno jest odróżnić nieoznaczone plemniki od plemników oznaczonych RhB pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  6. Aby zakończyć eksperyment godowy, usuń wszystkie komary z każdej klatki za pomocą mechanicznego aspiratora. Znieczulenie komarów na zimno na lodzie przez co najmniej 5 minut. Gdy komary są w pełni znieczulone, delikatnie podnieś samice komarów i umieść je w osobnym papierowym kubku zabezpieczonym siatką (rozmiar oczek 150 x 150, otwór 160 μm). Oznacz kubek papierowy, przenosząc odpowiednią etykietę z pasującej klatki na kubek papierowy.
    UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i utrzymanie samic w 10% roztworze sacharozy. Płyn nasienny oznaczony RhB pozostanie stabilny wewnątrz żeńskich plemników, przez co najmniej tydzień. Najlepiej jest utrzymać samice przy życiu przed sekcją, ponieważ martwe i wysuszone okazy są trudne do wypreparowania.
  7. Aby ocenić żeńskie plemniki, należy znieczulić samice komarów na lodzie przez co najmniej 5 minut, a następnie przeprowadzić sekcję pod mikroskopem stereoskopowym (Wideo 1). Zbadaj plemniki pod złożonym mikroskopem świetlnym (powiększenie 100x) pod kątem ich statusu inseminacji (Ryc. 4). W przypadku osób zapłodnionych należy określić, czy plemniki zawierają płyn nasienny ze znacznikiem RhB, badając je pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr RFP1 i system obrazowania kamerą.
    UWAGA: W przypadku korzystania z fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z dołączonym systemem obrazowania zaleca się wydłużenie czasu ekspozycji (5 s) w celu zwiększenia czułości wykrywania. Jeśli samica komara skojarzyła się z oznaczonym samcem, jej plemniki będą fluoryzować na jaskrawopomarańczowy kolor (Ryc. 5A). Jeśli jednak samica komara kojarzyła się z nieoznakowanym samcem, jej zapłodnione plemniki nie będą fluoryzować (Ryc. 5B).

7. Utylizacja odpadów RhB

  1. Uzdatnianie wodnych odpadów RhB za pomocą węgla aktywnego25 przed odprowadzeniem ich jako ścieków ogólnych. Odpady stałe RhB należy utylizować (komary oznaczone RhB, ręczniki papierowe i nasączone RhB) jako odpady chemiczne. Używaj standardowych środków ochrony osobistej podczas pracy z odpadami RhB.

Wyniki

wAlbB-SG to zlokalizowana (Singapur) Ae. aegypti linia stabilnie zainfekowana szczepem wAlbB bakterii Wolbachia. Stosując protokół opisany w niniejszej pracy, oceniliśmy konkurencyjność kopulacyjną samców linii inbredowej oraz linii krzyżowej wAlbB-SG, aby określić, czy inbreeding prowadzi do utraty sprawności kopulacyjnej samców. Linia inbredowa była utrzymywana w insektarium przez 11 pokoleń, natomiast linię outcrossową uzyskano poprzez krzyżowanie wsteczne samic z samcami Ae. aegypti typu dzikiego. Samce z linii inbredowej i outcrossowej rywalizowały ze sobą o kopulację z samicami typu dzikiego. Ae. aegyptiTest konkurencyjności kopulacyjnej przeprowadzono w trzech powtórzeniach.  

Wyniki wskazały, że RhB nie wpłynęło na kondycję rozrodczą samców, ponieważ dane dotyczące inseminacji samic nie wykazały preferencji ani niechęci do kojarzenia z samcami karmionymi sacharozą z RhB (Tabela 1 oraz Rysunek 6). Ponieważ RhB nie wpływa na kondycję kopulacyjną samców, przystąpiono do analizy danych w oparciu o odsetek samic inseminowanych przez samce linii inbredowej lub outcrossowej (Tabela 2 oraz Rysunek 7). Wyniki we wszystkich trzech powtórzeniach eksperymentalnych były spójne; w każdym z nich odsetek samic kopulujących z samcami outcrossowymi był istotnie wyższy niż w przypadku samców inbredowych (P ≤ 0.05, test U Manna-Whitneya). Wyniki te sugerują potencjalny spadek kondycji kopulacyjnej samców po kilku pokoleniach inbreedingu laboratoryjnego.

Porównanie larw owadów; samce i samice komarów Culex w wodzie, badanie entomologiczne.
Rysunek 1: Widok boczny poczwarki samca (lewo) i samicy (prawo) Aedes aegypti. W tych samych warunkach hodowli płeć Ae. aegypti można określić na etapie poczwarki na podstawie wielkości; samce są znacznie mniejsze od samic. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat anatomii komara z zaznaczonymi czerwonymi strzałkami cechami czułków i trąbki.
Rysunek 2: Różnice między osobnikami dorosłymi płci męskiej (lewa strona) a żeńskiej (prawa strona) Aedes aegypti. Samce dorosłe (lewa strona) mają bardziej puszyste i owłosione czułki niż samice; czerwone strzałki wskazują czułki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie komarów; mikroskopia fluorescencyjna z uwzględnieniem cech anatomicznych; analiza porównawcza.
Rycina 3: Znakowanie samca komara Rodaminą B. (A) mikroskopia świetlna; (B) mikroskopia fluorescencyjna. Komar po lewej stronie jest nieznakowany (karmiony 10% w/v sacharozą), natomiast komar po prawej jest znakowany (karmiony 0,2% RhB-sacharozą). Znakowane komary mają widoczny różowy odwłok w świetle białym (komar po prawej w A), który fluorescuje na jasnopomarańczowo w mikroskopii fluorescencyjnej (B). Paski skali = 5 mm. Skrót: RhB = Rodamina B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia pokazująca komórki zapłodnione i niezapłodnione; etykiety wskazują stan komórek.
Rycina 4: Zapłodnione i niezapłodnione spermateki samic pod złożonym mikroskopem świetlnym (powiększenie 100x). Stan zapłodnienia samicy komara można określić, obserwując jej spermateki pod złożonym mikroskopem świetlnym. Zapłodniona samica komara będzie posiadać co najmniej jedną wypełnioną spermatekę, podczas gdy u niezapłodnionej samicy wszystkie trzy spermateki będą puste. W wypełnionej spermatekach pod złożonym mikroskopem świetlnym widoczne będą nitkowate, ruchliwe plemniki. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy skupisk komórkowych; powiększenie 100 μm; analiza różnicowania komórek.
Rycina 5: Spermateki samicy komara zapłodnione płynami nasiennymi pod stereomikroskopem fluorescencyjnym. (A) Spermateki znakowane RhB oraz (B) nieznakowane, zapłodnione płynami nasiennymi znakowanymi RhB, wykazują jaskrawopomarańczową fluorescencję w mikroskopii fluorescencyjnej. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sukces kopulacji komarów przeanalizowany na wykresach rozrzutu A i B w powtórzeniach eksperymentalnych.
Rycina 6: Liczba samic typu dzikiego zapłodnionych przez samce inbredowane lub outcrossowe w trzech powtórzeniach eksperymentalnych z wzajemnym znakowaniem. (A) Samce inbredowane zostały znakowane RhB, podczas gdy samce outcrossowe pozostały nieoznaczone. (B) Samce outcrossowe zostały znakowane RhB, podczas gdy samce inbredowane pozostały nieoznaczone. Zaobserwowano, że większa liczba samic kopulowała z samcami outcrossowymi, niezależnie od ich statusu znakowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sukces kopulacji komarów; wykres słupkowy; inbred vs. outcross; porównanie statystyczne; badanie zachowania owadów.
Rycina 7: Procent zapłodnionych samic kopulujących z samcami inbred lub outcross w 3 powtórzeniach eksperymentalnych. W każdym powtórzeniu eksperymentalnym odnotowano istotnie wyższy odsetek samic kopulujących z samcami outcross (P ≤ 0.05, test U Manna-Whitneya). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo 1: Disekcja samicy Aedes aegypti w celu wyizolowania zbiorników nasiennych przy użyciu stereomikroskopu świetlnego. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

♀ x Inbred (RhB) ♂ a♀ x Outcross (nieoznakowany) ♂ b♀ x Inbred (nieoznakowany) ♂ c♀ x Outcross (RhB) ♂ dOgólny wskaźnik zapłodnienia
(a+b+c+d/120)
Powtórzenie 1113574077.5% (93/120)
Powtórzenie 262983161.7% (74/120)
Powtórzenie 363663367.5% (81/120)

Tabela 1: Liczba samic sprzężonych z oznaczonymi RhB i nieoznaczonymi wAlbB-Sg Aedes aegypti samcami inbrednymi i outcrossowymi. W każdej powtórce wykorzystano łącznie 120 samic.

Procent zapłodnionych samic
Samce inbredoweSamce krzyżowane zewnętrznie
Powtórzenie 119% (18/93)81% (75/93)
Powtórzenie 219% (14/74)81% (60/74)
Powtórzenie 315% (12/81)85% (69/81)

Tabela 2: Procent zapłodnionych samic sprzężonych z wAlbB-Sg Aedes aegypti samcami inbredowymi i outcrossowymi.

Rysunek uzupełniający S1: Porównanie schematu postępowania dla testu konkurencyjności kojenia opartego na RhB oraz konwencjonalnego testu konkurencyjności kojenia. W porównaniu z konwencjonalnym testem konkurencyjności kojenia, uproszczony i skrócony schemat postępowania dla testu konkurencyjności kojenia opartego na RhB znacznie skraca czas trwania eksperymentu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy S2: Krzywe przeżywalności Kaplana-Meiera dorosłych samców Aedes aegypti podczas i po karmieniu 0,2% i 0,4% roztworem rodaminy B-sacharozy. Procent przeżywalności (A) samców typu dzikiego oraz (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti podczas i po trzech dniach karmienia 0,2% i 0,4% RhB-sacharozą, w porównaniu do grup kontrolnych karmionych samą sacharozą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Odsetek zapłodnienia samic w klatce o wymiarach szer. 60 cm x gł. 60 cm x wys. 60 cm (stosunek 10 samic do 20 samców) w punktach czasowych 1, 2 i 3 h. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Znakowanie jest powszechnie stosowane w badaniach entomologicznych do badania dynamiki populacji owadów, dyspersji, zachowania i biologii godowej26. W programach SIT i IIT znakowanie przeprowadza się w celu odróżnienia szczepu uwalniającego od populacji terenowej w celu zbadania ich rozproszenia i optymalizacji współczynnika uwalniania. Stosowane metody znakowania obejmują znakowanie genetyczne27,28, włączenie izotopów do pokarmu larwalnego29,30, pył fluorescencyjny31 i barwnik32. W celu tłumienia populacji komarów za pomocą SIT lub IIT, gdzie zdolność godowa samców jest krytycznym elementem, barwniki fluorescencyjne zostały użyte jako markery do badania biologii kojarzenia komarów18,19.

Tradycyjnie ocenę konkurencyjności krytkowej samców szczepu uwalniającego oceniano za pomocą testów płodności samic. Jednak test ten jest czasochłonny i pracochłonny ze względu na dalsze procesy eksperymentalne po kryciu (rysunek uzupełniający S1). Procesy te obejmują karmienie samic krwią, zbieranie jaj, wylęganie się jaj oraz liczenie proporcji wyklutych jaj w celu określenia żywotności jaj. Średnio test ten wymaga 30 roboczogodzin i dwóch tygodni pracy eksperymentalnej (począwszy od ustawienia klatek do oznaczania konkurencyjności) do ostatecznego określenia konkurencyjności samców.

Jego praca przedstawia zastosowanie barwnika fluorescencyjnego, RhB, (podawanego komarom jako 0,2% RhB-sacharozy, rysunek uzupełniający S2) do bezpośredniego pomiaru interakcji godowych między samicami a samcami oznaczonymi RhB. Chociaż protokół ten wymaga fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, eliminuje potrzebę wykonywania czasochłonnych procedur eksperymentalnych, o których mowa powyżej. Średnio ten test oparty na RhB wymaga około 10 roboczogodzin i około jednego dnia, aby uzyskać dane równoważne z testami płodności kobiet. To >90% oszczędność czasu pozwala naukowcom na przeprowadzenie wielu powtórzeń eksperymentalnych, zapewniając bardziej solidną walidację sprawności samców do krycia. Ponadto test ten można wykorzystać do porównania konkurencyjności godowej między dwiema sterylnymi lub zakażonymi Wolbachią liniami komarów.

Tego typu porównanie nie jest możliwe w przypadku konwencjonalnych testów płodności samic, ponieważ samice dałyby niezdolne do życia jaja po kojarzeniu z obiema tymi liniami. Niezależnie od tego, każde mieszane krycie w eksperymencie spowoduje stronniczość w kierunku oznaczonej populacji, ponieważ trudno jest zidentyfikować nieoznaczone plemniki w samicach spermateki, które zawierają płyn nasienny zarówno od samców oznaczonych RhB, jak i nieoznaczonych. Podobny wniosek wyciągnięto w badaniu oceniającym konkurencyjność krycia Anopheles gambiae przy użyciu RhB18, w którym stwierdzono, że większy odsetek samic w teście krycia był kryty przez oznaczone samce. Ponieważ poliandria jest bardziej prawdopodobna u samic, które wcześniej angażowały się w przerwane krycie33, prawdopodobieństwo jej wystąpienia zostało zmniejszone w tym badaniu poprzez użycie mniejszej liczby komarów (20 samców na 10 samic) w większej objętości klatki (0,216 m3) w tych eksperymentach.

Wyniki nie wykazały odchylenia w stosunku do populacji oznaczonej RhB, co wskazuje, że krycie mieszane było ograniczone. Podsumowując, włączenie RhB do oznaczania samców w teście konkurencyjności krycia jest ekonomicznym i szybkim sposobem oceny zdolności krycia samców. Metoda ta pozwala również na bezpośrednie porównanie konkurencyjności godowej między samcami narażonymi na różne dawki promieniowania, hodowanymi w różnych reżimach chowu lub zakażonymi różnymi szczepami Wolbachia, co czyni ją cennym narzędziem do oceny zdolności godowej samców dla dowolnego programu tłumienia populacji komarów opartego na uwalnianiu samców.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Agencję Środowiska (NEA), Singapur. Dziękujemy panu Chew Ming Fai, zastępcy dyrektora generalnego ds. zdrowia publicznego, NEA, za zgodę na publikację badania, oraz A/Prof Ng Lee Ching, dyrektorowi grupy (Grupa Instytutu Zdrowia Środowiskowego), NEA, za jej wsparcie w tym badaniu. Dziękujemy również dr Shuzhen Sim i dr Denise Tan za korektę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Złożony mikroskop świetlnyOlympusCX23Aby uzyskać wynik za inseminację plemników
, kleszcze preparacyjneKleszcze BioquipRubis (4524)
Fluorescencyjny mikroskop stereo-świetlny z filtrem RFP1OlympusSZX16Aby sprawdzić sygnał fluorescencji rodaminy B
Klatki na komaryBugdorm4F3030szer. 32,5 cm x gł. 32,5 cm x wys. 32,5 cm; rozmiar oczek sieci 150 x 150; 160 i mikro; m otwór Do przetrzymywania samców i samic dorosłych komarów przed badaniem krycia
6M610szer. 60 cm x gł. 60 cm x wys. 60 cm; rozmiar oczek sieci 44 x 32; 650 &mikro; m apertura
Do krycia test
Moskitiera150 x 150, 160 i mikro; m apertura
Rhodamine BSigma AldrichR6626≥ 95% (HPLC)
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ61Do rozwarstwiania spermateki
SacharozaMP BiomedicalsSKU 029047138
Płatki tropikalne TetraMinTetra77101Pokarm dla ryb do karmienia larw
konkurencyjności klasy spożywczej

Bibliografia

  1. Achee, N. L., et al. A critical assessment of vector control for dengue prevention. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003655(2015).
  2. Carvalho, D. O., et al. Suppression of a field population of Aedes aegypti in Brazil by sustained release of transgenic male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003964(2015).
  3. Lees, R. S., Gilles, J. R. L., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B., Bourtzis, K. Back to the future: the sterile insect technique against mosquito disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 156-162 (2015).
  4. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  5. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R. L., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II--A safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), 0135194(2015).
  6. Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
  7. Balestrino, F., et al. Gamma ray dosimetry and mating capacity studies in the laboratory on Aedes albopictus males. Journal of Medical Entomology. 47 (4), 581-591 (2010).
  8. Bellini, R., et al. Mating competitiveness of Aedes albopictus radio-sterilized males in large enclosures exposed to natural conditions. Journal of Medical Entomology. 50 (1), 94-102 (2013).
  9. Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. Radiation biology of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 6(2009).
  10. Aldersley, A., et al. Too "sexy" for the field? Paired measures of laboratory and semi-field performance highlight variability in the apparent mating fitness of Aedes aegypti transgenic strains. Parasites & Vectors. 12 (1), 357(2019).
  11. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
  12. Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malaria Journal. 8 (2), 4(2009).
  13. Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56124(2017).
  14. Ross, P. A., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. A comprehensive assessment of inbreeding and laboratory adaptation in Aedes aegypti mosquitoes. Evolutionary Applications. 12 (3), 572-586 (2019).
  15. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3294(2014).
  16. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Bourtzis, K., Gilles, J. R. Combining the sterile insect technique with the incompatible insect technique: III-Robust mating competitiveness of irradiated triple Wolbachia-infected Aedes albopictus males under semi-field conditions. PloS One. 11 (3), 0151864(2016).
  17. Fried, M. Determination of sterile-insect competitiveness. Journal of Economic Entomology. 64 (4), 869-872 (1971).
  18. Aviles, E. I., Rotenberry, R. D., Collins, C. M., Dotson, E. M., Benedict, M. Q. Fluorescent markers rhodamine B and uranine for Anopheles gambiae adults and matings. Malaria Journal. 19 (1), 236(2020).
  19. Johnson, B. J., et al. Use of rhodamine B to mark the body and seminal fluid of male Aedes aegypti for mark-release-recapture experiments and estimating efficacy of sterile male releases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005902(2017).
  20. Fisher, P. Review of using rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  21. Blanco, C. A., Perera, O., Ray, J. D., Taliercio, E., Williams, L. Incorporation of rhodamine B into male tobacco budworm moths Heliothis virescens to use as a marker for mating studies. Journal of Insect Science. 6, 5(2006).
  22. Mascari, T. M., Foil, L. D. Laboratory evaluation of the efficacy of fluorescent biomarkers for sugar-feeding sand flies (Diptera: Psychodidae). Journal of Medical Entomology. 47 (4), 664-669 (2014).
  23. Sarkar, D., Muthukrishnan, S., Sarkar, M. Fluorescent marked mosquito offer a method for tracking and study mosquito behaviour. International Journal of Mosquito Research. 4, 5-9 (2017).
  24. South, A., Sota, T., Abe, N., Yuma, M., Lewis, S. M. The production and transfer of spermatophores in three Asian species of Luciola fireflies. Journal of Insect Physiology. 54 (5), 861-866 (2008).
  25. Üner, O., Geçgel, Ü, Kolancilar, H., Bayrak, Y. Adsorptive removal of rhodamine B with activated carbon obtained from okra wastes. Chemical Engineering Communications. 204 (7), 772-783 (2017).
  26. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annual Review of Entomology. 46, 511-543 (2001).
  27. Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). New Biotechnology. 25 (1), 76-84 (2008).
  28. Ahmed, H. M. M., Hildebrand, L., Wimmer, E. A. Improvement and use of CRISPR/Cas9 to engineer a sperm-marking strain for the invasive fruit pest Drosophila suzukii. BMC Biotechnology. 19 (1), 85(2019).
  29. Botteon, V., Costa, M. L. Z., Kovaleski, A., Martinelli, L. A., Mastrangelo, T. Can stable isotope markers be used to distinguish wild and mass-reared Anastrepha fraterculus flies. PloS One. 13 (12), 0209921(2018).
  30. Hood-Nowotny, R., Mayr, L., Islam, A., Robinson, A., Caceres, C. Routine isotope marking for the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 102 (3), 941-947 (2009).
  31. Schroeder, W. J., Mitchell, W. C. Marking Tephritidae fruit fly adults in Hawaii for release-recovery studies. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 23 (3), 437-440 (1981).
  32. Akter, H., Taylor, P. W., Crisp, P. Visibility and persistence of fluorescent dyes, and impacts on emergence, quality, and survival of sterile Queensland fruit fly Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 113 (6), 2800-2807 (2020).
  33. Oliva, C. F., Damiens, D., Benedict, M. Q. Male reproductive biology of Aedes mosquitoes. Acta Tropica. 132, Suppl 12-19 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie rodamin Btechnika sterylnych owad wkomary zainfekowane Wolbachiaanaliza z u yciem barwnika fluorescencyjnegosekcja spermateksupresja populacjimetoda znakuj wypu od wocena kondycji komar w
Wykorzystanie barwnika fluorescencyjnego, rodaminy B, do badania konkurencyjności godowej samców komarów Aedes aegypti
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.