Artykuł metodologiczny

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62435

⸱

12 kwietnia 2021

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China, 510060

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zwyrodnieniowe siatkówki są głównymi przyczynami nieodwracalnej ślepoty bez skutecznego leczenia. Pluripotencjalne komórki macierzyste, które mają potencjał różnicowania się we wszystkie typy komórek siatkówki, nawet w tkanki minisiatkówki, niosą ze sobą ogromne nadzieje dla pacjentów z tymi chorobami i wiele możliwości w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków. Jednak proces indukcji od hPSC do komórek siatkówki jest skomplikowany i czasochłonny. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół indukcji siatkówki w celu generowania tkanek siatkówki o wysokiej odtwarzalności i wydajności, odpowiednich dla różnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Protokół ten jest wykonywany bez dodatku kwasu retinowego, co korzystnie wpływa na wzbogacenie fotoreceptorów czopków. Zaletą tego protokołu jest ilościowe określenie wielkości EB i gęstości posiewu w celu znacznego zwiększenia wydajności i powtarzalności indukcji siatkówki. Dzięki tej metodzie wszystkie główne komórki siatkówki pojawiają się sekwencyjnie i podsumowują główne etapy rozwoju siatkówki. Ułatwi to dalsze zastosowania, takie jak modelowanie chorób i terapia komórkowa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zwyrodnieniowe siatkówki (RDs), takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP), charakteryzują się dysfunkcją i śmiercią komórek fotoreceptorowych i zazwyczaj prowadzą do nieodwracalnej utraty wzroku bez skutecznych sposobów leczenia1. Mechanizm leżący u podstaw tych chorób jest w dużej mierze nieznany, częściowo z powodu braku modeli chorób ludzkich2. W ciągu ostatnich dziesięcioleci osiągnięto znaczny postęp w medycynie regeneracyjnej dzięki technologii komórek macierzystych. Wielu badaczy, w tym my, wykazało, że ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w tym ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), mogą różnicować się we wszystkie typy komórek siatkówki, nawet w tkanki mini-siatkówki za pomocą różnych podejść różnicowania3,4,5,6,7,8,9,10,11, zapewniając ogromny potencjał w modelowaniu chorób i terapii komórkowej12,13,14.

Jednak proces indukcji od hPSC do komórek siatkówki jest bardzo skomplikowany i czasochłonny z niską powtarzalnością, co wymaga badaczy o bogatym doświadczeniu i wysokich umiejętnościach. Podczas złożonego i dynamicznego procesu indukcji na wydajność tkanek siatkówki będzie miało wpływ wiele czynników15,16,17. Ponadto różne metody indukcji często różnią się znacznie pod względem czasu i silnej ekspresji markerów siatkówki, co może zakłócić pobieranie próbek i interpretację danych3. W związku z tym pożądany byłby prosty protokół różnicowania siatkówki od hPSC ze wskazówkami krok po kroku.

Tutaj, na podstawie naszych opublikowanych badań18,19,20,21, opisano zoptymalizowany protokół indukcji siatkówki do generowania organoidów siatkówki (RO) z bogatymi fotoreceptorami czopków z hPSC, który nie wymaga suplementacji kwasem retinowym (RA). Protokół ten koncentruje się na opisie wieloetapowej metody generowania siatkówki nerwowej i RPE. Tworzenie EB jest zasadniczą częścią wczesnego etapu indukcji. Zarówno rozmiar, jak i gęstość posiewu EB są optymalizowane ilościowo, co naukowo zwiększa wydajność tkanek siatkówki i sprzyja powtarzalności. W drugiej części indukcji pęcherzyki wzrokowe (OV) samoorganizują się w kulturze adhezyjnej, a RO tworzą się w kulturze zawiesinowej; przebiegi czasowe i wydajność tej części różnią się znacznie w różnych liniach hPSC. Dojrzewanie i specyfikacja komórek siatkówki w RO zachodzi głównie w środkowej i późnej fazie indukcji. Bez dodatku RZS można wytwarzać dojrzałe fotoreceptory zarówno z bogatymi czopkami, jak i pręcikami.

Celem tego protokołu jest ilościowe opisanie i wyszczególnienie każdego kroku dla niedoświadczonych badaczy do powtórzenia. Różne linie hPSC zostały z powodzeniem indukowane do RO za pomocą tego protokołu, uzyskując solidną wydajność tkanek siatkówki bogatych w czopki i wysoką powtarzalność. RO pochodzące z HPSC z tym protokołem mogą podsumować główne etapy rozwoju siatkówki in vivo i przetrwać w dłuższej perspektywie, co ułatwia dalsze zastosowania, takie jak modelowanie chorób, badania przesiewowe leków i terapia komórkowa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultura i ekspansja hPSC

  1. Kultura HPSC
    1. Pokryj dwie studzienki 6-dołkowej płytki macierzą zewnątrzkomórkową (ECM, matryca kwalifikowana do hESC). Przygotować 50 ml roztworu ECM zawierającego 8-12 μg/ml ECM w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Do 49 ml DMEM dodać 1 ml rozmrożonego roztworu podstawowego ECM (50x). Dodać 1 ml roztworu ECM do każdego dołka na płytce 6-dołkowej. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Przygotować pożywkę konserwacyjną hPSC (MM) zgodnie z instrukcją producenta.
    3. Wstępnie podgrzej MM w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min.
    4. Rozmrażać kriogeniczną fiolkę z hPSC (hiPSC lub hESC) (około 1 x 106) ze zbiornika z ciekłym azotem przez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 s.
    5. Wyjąć fiolkę i ostrożnie zdezynfekować ją za pomocą 75% sprayu do dezynfekcji nasączonego alkoholem. Umieść go w szafie bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Przenieść zawiesinę komórek z fiolki do probówki o pojemności 15 ml, dodać 5 ml wstępnie podgrzanego MM kropla po kropli do probówki za pomocą pipety o pojemności 5 ml. W międzyczasie delikatnie potrząśnij probówką, aby zmiksować hPSC .
    7. Odwirować probówkę o stężeniu 170 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć większość supernatantu za pomocą pipety o pojemności 1 ml i pozostawić około 50 μl supernatantu, aby uniknąć utraty komórek.
    8. Dodać 1 ml MM do probówki i ponownie zawiesić granulkę, delikatnie pipetując raz lub dwa razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Przeżywalność pojedynczych komórek hPSC jest niska. Małe skupiska komórek z 3-5 komórkami są preferowane, aby utrzymać wzrost hPSC w koloniach.
    9. Usunąć ECM z wstępnie pokrytych studzienek (krok 1.1.1), dodać 1,5 ml MM do każdego dołka, a następnie rozprowadzić 0,5 ml zawiesiny komórek na studzienkę.
    10. Delikatnie wstrząsnąć płytką w celu równomiernego rozprowadzenia hPSC, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Nie należy przesuwać płytki przez co najmniej 24 godziny, aby ułatwić przyleganie komórek.
    11. Zmieniaj MM co drugi dzień i przechodź przez hPSC, gdy zbieg osiągnie około 80%.
  2. Pasażowanie hPSCs
    UWAGA: Utrzymanie stanu niezróżnicowanego w hPSC jest dość krytyczne dla dalszych zastosowań. W warunkach przylegania hPSC rosną w koloniach o dobrze zdefiniowanej granicy. Komórki powinny być pasażowane, gdy zbieg hPSC osiągnie około 80%.
    1. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Oznaczyć i mechanicznie usunąć wyraźnie widoczne zróżnicowane komórki (<5%) przed pasażem.
    2. Przygotować płytkę pokrytą ECM zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.
    3. Wstępnie podgrzany MM i 1x sól fizjologiczna buforu fosforanowego (PBS) bez Ca2+ i Mg2+ w temperaturze pokojowej.
    4. Podgrzej wstępnie 0,5 mM roztwór EDTA (w 1x PBS) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    5. Usunąć pożywkę z płytki hodowlanej za pomocą systemu aspiracji próżniowej, dodać 1 ml 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i powtórzyć dwukrotnie.
    6. Dodać 1 ml roztworu EDTA do studzienki, aby zdysocjować hPSC w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Nie należy przekraczać zalecanego czasu inkubacji, aby uniknąć dysocjacji na pojedyncze komórki.
    7. Wyjmij płytkę i sprawdź, czy komórki nie oderwały się pod mikroskopem. Zbiegające się hPSC rozluźniają się i można zobaczyć każdą granicę komórki, ale komórki nie mogą łatwo odpadnąć poprzez delikatne potrząsanie płytką komórkową.
    8. Usuń roztwór EDTA za pomocą pipety o pojemności 1 ml i dodaj 1 ml MM, aby zatrzymać dysocjację. Delikatnie odpipetować hPSC raz lub dwa razy pipetą o pojemności 1 ml w celu ponownego zawieszenia komórek. Nie ma potrzeby wirowania w celu zebrania komórek.
      UWAGA: Jeśli większość komórek odpadnie z płytki po inkubacji z EDTA, komórki można pobrać za pomocą wirówki.
    9. Usunąć ECM z wstępnie pokrytych studzienek (krok 1.2.2) i dodać 1,5 ml MM na studzienkę.
    10. Przenieś 150-200 μl grudek komórek do każdej studzienki. Ogólnie rzecz biorąc, hPSC mogą być pasażowane w stosunku 1:6. Na przykład komórki z jednego dołka na płytce 6-dołkowej mogą być rozprowadzone do sześciu nowych dołków.
    11. Delikatnie wstrząsnąć płytką w celu równomiernego rozprowadzenia hPSC i hodować hPSC w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny, nie dotykając płytki.
    12. Zmieniaj MM co drugi dzień, zgodnie z opisem w kroku 1.1.

2. Różnicowanie siatkówki od hPSC

UWAGA: Gdy kolonie osiągną ~80% konfluencji (Rysunek 1B), można je poprowadzić do rozróżnienia w organoidy siatkówki zgodnie z protokołem opisanym w Rysunek 1A. Aby zapewnić wysoką jakość i dobrą wydajność hPSC, należy regularnie oceniać pluripotencję za pomocą markerów molekularnych, takich jak OCT4 lub NANOG, przy użyciu IFC lub QPCR. HPSC należy odrzucić, jeśli zróżnicowane komórki stanowią więcej niż 5% wszystkich komórek. Sprawdź, czy nie ma zanieczyszczenia mykoplazmą za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazmy zgodnie z instrukcjami producenta. Należy stosować wyłącznie hPSC wolne od mykoplazmy, ponieważ mykoplazma może zmieniać zdolność różnicowania hPSC.

  1. Przygotowanie pożywek i odczynników
    1. Przygotuj pożywkę do indukcji neuronalnej (NIM), mieszając następujące elementy: 500 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F-12, 1:1), 5 ml suplementu 1% N2, 0,5 ml 0,1% heparyny (2 mg / ml w 1x PBS) i 5 ml 1% MEM Non-Essential Amino Acid (NEAA).
    2. Przygotować pożywkę różnicującą siatkówkę (RDM) zawierającą 300 ml DMEM/F-12, 200 ml zasady DMEM, 10 ml suplementu 2% B27, 5 ml 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 5 ml 1% MEM NEAA.
      UWAGA: Zarówno NIM, jak i RDM nie są filtrowane, ale przeprowadzany jest test sterylności. Wyjmij 1 ml pożywki i dodaj ją do naczynia o średnicy 35 mm i hoduj przez 3-7 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C i powinna być zużyta w ciągu 2 tygodni, aby zapewnić aktywność składników.
    3. Przygotuj 10 mM blibistatyny (1,000x) w DMSO. Dodać 1,710 μl DMSO, aby rozpuścić 5 mg Blebbisstatin w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego (1,000x), podwielokrotności w stężeniu 10 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Wszystkie podłoża i odczynniki należy przed użyciem podgrzać w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chyba że zaznaczono inaczej.
  2. Tworzenie ciała zarodka (EB)
    1. W dniu 0 (D0) zainicjuj różnicowanie. Wyjmij jedną studzienkę hPSC z płytki 6-dołkowej, która urosła do ~80% konfluencji. Zebrać komórki za pomocą roztworu dysocjacyjnego EDTA, jak opisano w krokach 1.2.1 do 1.2.6.
    2. Usunąć roztwór EDTA, dodać 1 ml MM zawierającego 10 μM blibistatyny, aby zatrzymać dysocjację komórek, i zebrać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wielkość kęp komórkowych jest jednym z kluczowych czynników wpływających na wydajność EB. W przybliżeniu preferowanych jest pięć komórek na kępkę, aby wytworzyć odpowiedni rozmiar EB na D5 do D7,
      UWAGA: Jest to kluczowy krok. Nie należy pipetować komórek zbyt wiele razy, ponieważ trudno jest utworzyć agregaty podobne do EB z pojedynczych komórek hPSC.
    3. Przenieść zawiesinę komórek (około 2 x 106 komórek) na szalkę Petriego o bardzo niskim nakładzie o bardzo niskim nakładzie o średnicy 100 mm i dodać do szalki 9 ml MM zawierającej 10 μM bróbstatyny.
    4. Delikatnie potrząśnij naczyniem dwukrotnie, aby równomiernie rozprowadzić komórki, i umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Na D1, po hodowli komórek przez co najmniej 24 godziny, wyjmij szalkę i obserwuj ją pod mikroskopem. Do tego czasu spontanicznie uformuje się duża liczba agregatów małych komórek (Rysunek 1C).
    6. Przygotować 12 ml mieszaniny z MM i NIM w stosunku 3:1 (9 ml MM i 3 ml NIM) w probówce o pojemności 15 ml.
    7. Przenieść kultury komórkowe do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 10 ml prostopadle i dodać 10 ml wstępnie podgrzanej mieszaniny do naczynia.
    8. Odwirować probówkę o sile 60 x g przez 3 minuty w celu zebrania kruszyw, usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 ml i pozostawić około 500 μl, aby uniknąć utraty komórek.
    9. Dodać 2 ml mieszaniny do probówki i przenieść zawiesinę do tego samego naczynia (krok 2.2.7).
    10. Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić agregaty komórek, a następnie włóż naczynie z powrotem do inkubatora.
    11. Na D2 przygotować 12 ml nowej mieszaniny z MM i NIM w stosunku 1:1 (6 ml MM i 6 ml NIM) w probówce o pojemności 15 ml. Zmienić pożywkę komórkową ze świeżo przygotowaną mieszaniną, powtarzając kroki od 2.2.5 do 2.2.10.
    12. Na D3 zmień pożywkę komórkową na 15 ml NIM, jak opisano powyżej. Hodować komórki przez co najmniej 5 dni w warunkach zawiesiny.
      UWAGA: W okresie od D1 do D3 pożywka powinna być zmieniana każdego dnia, zapewniając wystarczającą ilość składników odżywczych. Od D3 NIM może być zmieniany co drugi dzień. Ponadto EB można podzielić na kilka potraw, aby zapewnić obfite wartości odżywcze.
  3. Wysiewaj EBs
    UWAGA: Na poziomach od D5 do D7 wybierz odpowiedni punkt czasowy, aby ułożyć EB na naczyniach pokrytych ECM zgodnie z rozmiarem EB. EB o przybliżonej średnicy 200 μm jest odpowiednie do różnicowania siatkówki. Ogólnie rzecz biorąc, jedna studzienka hPSC w płytce 6-dołkowej może wytworzyć około 300 do 1,000 EB. Zmienność plonu EB jest zróżnicowana przez linie hPSC.
    1. Na D4 przygotuj naczynia pokryte ECM dla kultur przylegających do EB. Dodać 5 ml ECM do każdego 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej (poddanego obróbce powierzchniowej) i umieścić je na noc w inkubatorze.
    2. Na D5 wyjmij ECM z wstępnie pokrytych naczyń i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego NIM do każdego naczynia.
    3. Wyjmij naczynie zawierające EBs. Sprawdź jakość EB pod mikroskopem i upewnij się, że są dość jasne i okrągłe. Wielkość EB wynosi około 200 μm średnicy. Zbierz wszystkie EB w probówce o pojemności 15 ml. Przenieś EB z naczyń do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Pozwól EB uspokoić się na 5 minut. Usunąć większość supernatantu, pozostawiając około 2 ml pożywki.
    4. Rozprowadzić EBs w powlekanych naczyniach zawierających 10 ml NIM kropla po kropli za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wysiewaj EB o gęstości około 2-3 EB nacm2. Na przykład dodaj około 120-180 EB do naczynia o średnicy 100 mm. Aby z grubsza ocenić liczbę EB, umieść jedną kroplę zawiesiny EB na szkiełku nakrywkowym i policz liczbę EB pod mikroskopem.
      UWAGA: Gęstość poszycia EB jest jednym z kluczowych czynników wpływających na skuteczność indukcji siatkówki. Gęstość można również regulować za pomocą każdej linii hPSC.
    5. Delikatnie potrząśnij naczyniami, aby równomiernie rozprowadzić EB. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Nie przesuwaj naczyń przez co najmniej 24 godziny, aby zwiększyć przyczepność EB.
  4. Indukcja pęcherzyków wzrokowych (OV) i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w warunkach przylegających
    UWAGA: Po wysianiu EB na powierzchni pokrytej ECM, hPSC mogą rozwinąć struktury podobne do OV, które można zaobserwować już w D20 po różnicowaniu. W tym protokole specyficzne czynniki wzrostu lub cząsteczki sygnałowe nie są wymagane do kierowania hPSC do losu siatkówki, z wyjątkiem dodania suplementów N2 i B27 w pożywce.
    1. W D8-D9 wyjmij szalki i obserwuj EB pod mikroskopem. Wszystkie EB zostaną przymocowane i rozłożone na naczyniach (Rysunek 1D). Dodać 10 ml świeżego NIM do każdego naczynia o średnicy 100 mm zawierającego 10 ml starej pożywki. Umieść je z powrotem w inkubatorze.
      UWAGA: Nie wyjmuj starego nośnika.
    2. W przypadku D12 zmień połowę pożywki za pomocą NIM za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Trzymaj kulturę w inkubatorze.
    3. W D16 usuń wszystkie NIM z naczyń za pomocą systemu zasysania próżniowego. Dodaj 20 ml RDM do każdego naczynia. Kontynuuj hodowlę w RDM i zmieniaj połowę pożywki co drugi dzień.
    4. Podczas D10-D30 obserwuj zmiany morfologiczne komórek dwa razy w tygodniu pod mikroskopem i oceń skuteczność różnicowania siatkówki.
      UWAGA: Od D10 domeny pola gałki ocznej (EF) organizują się samoorganizując się w strefach peryferyjnych przylegających EB. Struktury podobne do OV pojawiają się między D20 a D25, stopniowo wystają z czaszy i samoczynnie tworzą miseczkę optyczną, która jest otoczona pigmentowanym RPE (Ryc. 1E). OV można łatwo rozpoznać po jasnym, załamanym i grubym pierścieniu NR.
  5. Odłącz i hoduj OV i RPE w zawiesinie w celu uzyskania organoidów siatkówki (RO)
    1. Na D28-D35 większość OV pojawia się w naczyniach. Użyj igły wolframowej lub igły ze strzykawką o pojemności 1 ml, aby mechanicznie odłączyć morfologicznie identyfikowalne OV wraz z sąsiednim RPE. Hoduj je w zawiesinie.
      UWAGA: Wygląd i wydajność OV i RPE różnią się znacznie w różnych liniach hPSC. W związku z tym punkt czasowy odłączania OV i RPE jest elastyczny. Oczywiste OV z sąsiednim RPE można odłączyć, a następnie przenieść do naczynia hodowlanego o niskim nasadce zawierającej RDM. Kontynuuj hodowlę pozostałych komórek, aż wszystkie OV i RPE zostaną podniesione.
    2. Umieść 50-60 OV w każdym 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym o niskim nasadce, zawierającym 15 ml RDM do tworzenia RO (Rysunek 1F).
    3. Zmieniaj RDM co 2-3 dni aż do D42, kiedy RO są dobrze zaokrąglone.

3. Rozwój i dojrzewanie siatkówki

UWAGA: W tym protokole, surowica jest wymagana, aby RO rosły i dojrzewały do długotrwałej hodowli.

  1. Laminowanie i specyfikacja siatkówki w RO
    1. Przygotuj 10 ml 100 mM tauryny (1,000x) w 1x PBS. Odważyć 125 mg tauryny i rozpuścić w 10 ml 1x PBS. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Podwielokrotność w stężeniu 500 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować pożywkę hodowlaną siatkówki 1 (RC1). Wymieszaj następujące składniki: 250 ml DMEM/F-12, 175 ml DMEM basic, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 10 ml suplementu 2% B27, 5 ml 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego, 5 ml 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM tauryny i 5 ml 2 ml L-alanylo-L-glutaminy.
    3. Przygotować pożywkę hodowlaną siatkówki 2 (RC2) zawierającą 450 ml DMEM/F-12, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml 1% suplementu N2, 5 ml 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego, 0,5 ml 100 μM tauryny, 5 ml 1% MEM NEAA i 5 ml 2 ml L-alnylo-L-glutaminy.
      UWAGA: RC1 i RC2 nie są filtrowane, ale przechodzą test sterylności. Wyjmij 1 ml pożywki, dodaj ją do naczynia o średnicy 35 mm i hoduj przez 3-7 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby zapewnić sterylność przed użyciem. Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C i powinna zostać zużyta w ciągu 2 tygodni, aby zapewnić aktywność składników. Wszystkie podłoża i odczynniki należy przed użyciem wstępnie podgrzać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    4. W D42 zmień pożywkę hodowlaną z RDM na RC1.
    5. Przechyl naczynia pod kątem około 30° i pozwól RO osiąść na 30 sekund. Wyjmij stary RDM za pomocą pipety 10 ml, pozostawiając około 1 ml pożywki, aby uniknąć utraty RO. Dodaj 15 ml świeżego RC1 do każdego naczynia.
    6. Delikatnie potrząśnij naczyniami, aby równomiernie rozprowadzić RO. Włóż naczynia z powrotem do inkubatora. Następnie zmieniaj całe podłoże dwa razy w tygodniu.
    7. Podczas D50-D90 wybierz wysokiej jakości RO do długotrwałej hodowli, które mają okrągły kształt z grubym i jasnym NR. Umieść 30-40 RO w naczyniu o niskim nasadce 100 mm z 20 ml RC1 i zmieniaj całe podłoże dwa razy w tygodniu.
    8. W celu długotrwałej hodowli zawiesiny RO należy pipetować RO, aby uniknąć ponownego zakładania RO-RO za pomocą pipety. Raz w miesiącu przenieś RO do nowych szalek hodowlanych, aby uniknąć przywierania RO do powierzchni naczyń.
      UWAGA: W warunkach hodowli zawiesinowej RO są okrągłe, z jasnym i grubym pierścieniem NR przymocowanym z mniej więcej RPE po jednej stronie. Rozwija się laminowana siatkówka nerwowa i sekwencyjnie pojawiają się podtypy komórek siatkówki z najpierw generowanymi komórkami zwojowymi siatkówki, a następnie komórkami fotoreceptorowymi, komórkami amakrynowymi i komórkami dwubiegunowymi.
  2. Dojrzewanie ludzkich fotoreceptorów ze wzbogaceniem czopków w RO
    1. Po D90 zmień pożywkę z RC1 na RC2, która jest odpowiednia do dojrzewania fotoreceptorów.
    2. Zmień nośnik zgodnie z opisem w krokach 3.1.7-3.1.8.
      UWAGA: W tych warunkach hodowli RO mogą rosnąć długoterminowo (Rysunek 1G), do przetestowanych do D300. Komórki siatkówki w RO stają się dojrzałe, a także nabywane są wszystkie podtypy komórek siatkówki nerwowej, w tym komórki glejowe Mullera, pręciki i czopki. Bez dodatku RZS fotoreceptory czopków są również bogate w RO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces indukcji siatkówki w tym protokole naśladuje rozwój siatkówki ludzkiego płodu. Aby zainicjować różnicowanie siatkówki, hPSC rozdzielono na małe grudki i wyhodowano w zawiesinie w celu wywołania tworzenia EB. Na D1 utworzyły się ujednolicone agregaty komórek lub EB (Rysunek 1C). Pożywka hodowlana była stopniowo przekształcana w NIM. Na D5 EB zostały posiane na szalkach hodowlanych pokrytych ECM. Komórki stopniowo migrowały z EB (Rysunek 1D). Od D10 pola oczne samoorganizowały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym wieloetapowym protokole indukcji siatkówki hPSC były prowadzone krok po kroku, aby uzyskać los siatkówki i samoorganizować się w organoidy siatkówki zawierające laminowane NR i RPE. Podczas różnicowania hPSC podsumowały wszystkie główne etapy rozwoju siatkówki człowieka in vivo, od EF, OV i RPE, do laminacji siatkówki, generując wszystkie podtypy komórek siatkówki, w tym komórki zwojowe siatkówki, komórki amakrynowe, komórki dwubiegunowe, fotoreceptory pręcikowe i czopkowe oraz komórki glejowe Müllera w po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xiufeng Zhong jest wynalazcą patentu związanego z generowaniem komórek siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Fundusz Projektów Naukowych i Technologicznych Guangzhou (201803010078), Projekt Naukowo-Technologiczny Prowincji Guangdong (2017B020230003), Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (NSF) (81570874, 81970842), Program Stu Talentów Uniwersytetu Sun Yat-sen (PT1001010) oraz Fundusze Badań Podstawowych Państwowego Kluczowego Laboratorium Okulistyki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(−)-BlebbistatynaSigmaB0560-5mgROCK-inhibitor
1 ml końcówkiKirgenKG13131 ml
10 ml pipetaSorfa3141001Pipeta
100 mm Hodowla tkankowaBIOFILTCD000100100 mm szalka Petriego
100 mm Hodowla tkankowaSokół353003100 mm szalka Petriego
15 ml Probówki wirówkoweBIOFILCFT011150Probówki wirówkowe
35 mm Szalki do kultur tkankowychFalcon35300135 mm szalka Petriego
5 ml pipetaSorfa313000Pipeta
50 ml Probówki wirówkoweBIOFILCFT011500Probówki wirówkowe
6-dołkowe płytki do kultur tkankowychCostar3516Płytki hodowlane
Anti-AP2α PrzeciwciałoDSHB3b5Podstawowe  przeciwciało
ANTYBIOTYK PRZECIWGRZYBICZY 100XGibco15240062Antybiotyk-Antybiotyk
Anty-ISL1 PrzeciwciałoBosterBM4446Podstawowe  przeciwciało
Anty-Ki67 PrzeciwciałoAbcamab15580Podstawowe  przeciwciało
Przeciwciało anty-L/M opsyna Prezentod Dr. jeremy/Primary  przeciwciało
Anty-PAX6 PrzeciwciałoDSHBpax6Podstawowe  przeciwciało
Anty-królik 555InvitrogenA31572Osioł anty-królik IgG (H+L)
Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555
Przeciwciało anty-rewindykacyjneMilliporeab5585Podstawowe  przeciwciało
Przeciwciało anty-rodopsynyAbcamab5417Podstawowe  przeciwciało
Anty-owce 555InvitrogenA21436Przeciwciało anty-owcze IgG (H+L)
Przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555
Przeciwciało anty-SOX9AbclonalA19710Podstawowe  przeciwciało
Przeciwciało anty-VSX2Milliporeab9016Podstawowe  przeciwciało
B-27 suplement W/O VIT A (50X)Gibco12587010Suplement
Fiolka CryotubeThermo scientific-NUNC3754181,8 ml
DAPIDOJINDOD532dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu
; wielu dostawców
Sulfoxide dimetylu (DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100MLWielu dostawców
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200,5 M PH 8,0
FBSNATOCORSFBEFiltr surowicy
MilliporeSLGP033RB0,22μ m, sterylny filtr Millex
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanylo-L-glutamina
HeparynaSigmaH31492 mg/ml w PBS do użycia
Matrigel, 100xCorning354277Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1KOMÓRKA MACIERZYSTA85850pożywka podtrzymująca hPSC (MM)
Suplement N2Gibco17502048Bufor
soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS)GNMGNM10010Bez Ca+,Mg+,PH7,2± 0,1 0,1 M
TaurynaSigmaT0625Suplement
Naczynia hodowlane o bardzo niskim nasadce Szalka Petriego 100 mm,szalka PetriegoCorningCLS3262-20EA
Suplement o niskim nasadce

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  4. Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
  5. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  6. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
  7. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  8. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047(2014).
  9. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  10. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
  13. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  14. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  15. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179(2019).
  16. Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
  17. Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
  18. Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658(2018).
  19. Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
  20. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  21. Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212(2019).
  22. Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
  23. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766(2017).
  24. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  25. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  26. Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
  27. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286(2015).
  28. da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
  29. Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483(2015).
  30. Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
  31. Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
  32. Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
  33. Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
  34. Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  35. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  36. Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
  37. DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy siatk wkiindukcja siatk wkitr jwymiarowe tkanki siatk wkitworzenie cia embrionalnychr nicowanie siatk wkiizolacja p cherzyka optycznegofotoreceptory czopkowemodelowanie chor bterapia kom rkowa

Powiązane artykuły