Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62439

⸱

16 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zbieranie ludzkich zastawek aortalnych pobranych podczas zabiegów chirurgicznej wymiany zastawki aortalnej lub z tkanki zwłok, a następnie izolację, rozszerzanie i charakterystykę specyficznych dla pacjenta komórek śródbłonka i śródmiąższu pierwotnej zastawki. Uwzględniono ważne szczegóły dotyczące procesów potrzebnych do zapewnienia żywotności komórek i swoistości fenotypu.

Streszczenie

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD) występuje u prawie jednej trzeciej starszej populacji. Pogrubienie, usztywnienie i zwapnienie zastawki aortalnej powoduje zwężenie zastawki aortalnej i przyczynia się do niewydolności serca i udaru mózgu. Patogeneza choroby jest wieloczynnikowa, a stresy, takie jak zapalenie, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej, przepływ turbulentny oraz naprężenia mechaniczne i naprężenia, przyczyniają się do osteogennego różnicowania komórek śródbłonka zastawki i śródmiąższu zastawki. Jednak dokładne czynniki inicjujące, które napędzają osteogenną przemianę zdrowej komórki w komórkę zwapniejącą, nie są w pełni zdefiniowane. Co więcej, jedyną obecnie terapią zwężenia zastawki aortalnej wywołanego CAVD jest wymiana zastawki aortalnej, w której usuwa się natywną zastawkę (chirurgiczna wymiana zastawki aortalnej, SAVR) lub wprowadza się całkowicie składaną zastawkę zastępczą za pomocą cewnika (przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej, TAVR). Te zabiegi chirurgiczne wiążą się z wysokimi kosztami i poważnym ryzykiem; W związku z tym konieczne jest zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych do odkrywania leków. W tym celu w niniejszym badaniu opracowano przepływ pracy, w którym chirurgicznie usunięte tkanki od pacjentów i tkanki zwłok dawcy są wykorzystywane do tworzenia specyficznych dla pacjenta pierwotnych linii komórek zastawek do modelowania chorób in vitro. Protokół ten wprowadza wykorzystanie rozwiązania do przechowywania w chłodni, powszechnie stosowanego w przeszczepach narządów, w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych często długim czasem pobierania między wycięciem tkanki a przetwarzaniem laboratoryjnym, z korzyścią dla znacznie stabilizującej komórki wycinanej tkanki. Wyniki niniejszego badania pokazują, że izolowane komórki zastawki zachowują swoją zdolność proliferacyjną oraz fenotypy śródbłonka i śródmiąższu w hodowli przez ponad kilka dni po usunięciu zastawki od dawcy. Wykorzystanie tych materiałów pozwala na pobranie komórek kontrolnych i CAVD, z których tworzone są zarówno linie komórkowe kontrolne, jak i chorobowe.

Wprowadzenie

Zwapnienie zastawki aortalnej (CAVD) jest przewlekłą patologią charakteryzującą się stanem zapalnym, zwłóknieniem i makrozwapnieniem płatków zastawki aortalnej. Postępująca przebudowa i zwapnienie płatków (określane jako stwardnienie aorty) może prowadzić do utrudnienia przepływu krwi (zwężenia zastawki aortalnej), co przyczynia się do udaru mózgu i prowadzi do niewydolności serca. Obecnie jedynym sposobem leczenia CAVD jest chirurgiczna lub przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej (odpowiednio SAVR i TAVR). Nie ma niechirurgicznej możliwości zatrzymania lub odwrócenia progresji CAVD, a bez wymiany zastawki śmiertelność zbliża się do 50% w ciągu 2-3 lat1,2,3. Zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tej patologii pozwoli zidentyfikować potencjalne nowe podejścia terapeutyczne.

U zdrowego dorosłego, płatki zastawki aortalnej mają około jednego milimetra grubości, a ich główną funkcją jest utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi z lewej komory4. Każdy z trzech listków składa się z warstwy komórek śródbłonka zastawki (VEC), które wyściełają zewnętrzną powierzchnię płatka i działają jako bariera. VEC utrzymują homeostazę zastawki poprzez regulację przepuszczalności, adhezji komórek zapalnych i sygnalizacji parakrynnej5,6,7. Komórki śródmiąższowe zastawki (VIC) obejmują większość komórek w ulotce zastawki8. VIC są ułożone w trzech charakterystycznych warstwach w ulotce. Warstwy te są znane jako ventricularis, spongiosa i fibrosa9. Komora jest skierowana w stronę lewej komory i zawiera włókna kolagenu i elastyny. Środkowa warstwa, gąbczasta, zawiera wysoką zawartość proteoglikanów, które zapewniają elastyczność ścinania podczas cyklu pracy serca. Zewnętrzna warstwa zwłóknienia znajduje się blisko powierzchni odpływu po stronie aorty i jest bogata w kolagen fibrylarny typu I i III, który zapewnia siłę do utrzymania koaptacji podczas rozkurczu10,11,12. VIC znajdują się w stanie spoczynku, jednak czynniki takie jak stan zapalny, przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i stres mechaniczny mogą zakłócić homeostazę VIC8,9,13,14,15,16. Wraz z utratą homeostazy, VIC aktywują i uzyskują fenotyp podobny do miofibroblastów, zdolny do proliferacji, kurczenia się i wydzielania białek, które przebudowują zewnątrzkomórkowy millieu17. Aktywowane VIC mogą przekształcać się w komórki wapnienia, co przypomina różnicowanie mezenchymalnej komórki macierzystej (MSC) w osteoblast15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Zwapnienie wydaje się inicjować w warstwie fibrosy bogatej w kolagen z wkładu zarówno VEC, jak i VIC, ale rozszerza się i atakuje inne warstwy ulotki8. Tak więc jasne jest, że zarówno VEC, jak i VIC reagują na bodźce w celu zwiększenia ekspresji genów osteogennych, jednak dokładne zdarzenia napędzające aktywację genów osteogennych, a także złożone wzajemne oddziaływanie między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową ulotki, pozostają nieokreślone. Modele mysie nie są idealnym źródłem do badania niegenetycznych czynników patogenezy CAVD, ponieważ u myszy nie rozwija się CAVD de novo26,27, stąd konieczne jest użycie pierwotnych tkanek ludzkich i pierwotnych linii komórkowych wyizolowanych z tych tkanek. W szczególności konieczne jest uzyskanie tych komórek w dużej liczbie i dobrej jakości, ponieważ dziedzina hodowli komórkowych 3D i modelowania organoidów rozwija się i prawdopodobnie stanie się alternatywą dla modeli mysich opartą na ludziach ex vivo.

Celem obecnej metody jest udostępnienie przepływu pracy, który stworzył warunki do efektywnego izolowania i hodowania VEC i VIC uzyskanych z chirurgicznie usuniętych zastawek od ludzkich dawców. Poprzednie badania wykazały udaną izolację VEC i VIC z świń28 i mysich zastawek29, o ile nam wiadomo, jest to pierwsze opisujące izolację tych komórek w tkankach ludzkich. Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do zastawek wycinanych przez ludzi i znacznie omija i poprawia uszkodzenia spowodowane często długim czasem pobierania między wycięciem tkanki a przetwarzaniem laboratoryjnym poprzez wprowadzenie wykorzystania roztworu do przechowywania w chłodni, roztworu buforowanego klinicznie stosowanego w przeszczepach narządów, który znacznie stabilizuje komórki wycinanej tkanki. Opisany tutaj protokół pokazuje również, w jaki sposób określić fenotyp komórki i zagwarantować wysoką skuteczność przeżycia komórki przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki pacjentów są pobierane od osób zapisanych na badania zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu w Pittsburghu zgodnie z Deklaracją Helsińską. Tkanki zwłok uzyskane za pośrednictwem Centrum Odzyskiwania i Edukacji Narządów (CORE) zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Nadzoru nad Badaniami i Szkoleniem Klinicznym z udziałem Zmarłych Uniwersytetu w Pittsburghu (CORID).

1. Aprobata i bezpieczeństwo

  1. Uzyskać zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) lub notatkę zwalniającą z obowiązku pobierania próbek pacjentów lub tkanek zwłok zgodnie z Deklaracją Helsińską
    2. .
  2. Weź udział w wymaganym szkoleniu instytucjonalnym do pracy z tkankami ludzkimi, takim jak szkolenie w zakresie patogenów przenoszonych przez krew, badania biomedyczne z udziałem ludzi, prywatność i bezpieczeństwo informacji oraz transport i wysyłka materiałów biologicznych.

2. Logistyka i przygotowanie

  1. Próbki chirurgiczne
    1. Upewnij się, że lodówka jest dostępna i znajduje się w pobliżu sali operacyjnej. Stożkowe probówki o pojemności 50 ml wstępnie oznakowane zanonimizowaną nomenklaturą zawierające 40 ml sterylnych porcji roztworu do przechowywania w chłodni należy przechowywać w tej lodówce do użytku przez personel chirurgiczny. Probówki te są stabilne w temperaturze 4 °C do daty ważności podanej na oryginalnym opakowaniu.
    2. Po ekstrakcji umieść tkankę zastawki w tych probówkach. Umieść probówki w szczelnym pojemniku wtórnym, takim jak szczelna plastikowa torba lub plastikowy pojemnik oznaczony etykietą zagrożenia biologicznego. Tkanki są zbierane i transportowane na lodzie zgodnie z instytucjonalnymi protokołami transportu zagrożeń biologicznych.
  2. Próbki zwłok
    1. Zanurz odzyskane organy w roztworze do przechowywania w chłodni, umieść w szczelnym wtórnym naczyniu zabezpieczającym i transportuj na lodzie zgodnie z instytucjonalnymi protokołami transportu zagrożeń biologicznych.

3. Przygotowanie odczynników

  1. Zrób płytki pokryte kolagenem co najmniej dzień wcześniej.
    1. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 5 ml alkoholu izopropylowego, 8,7 ml kwasu octowego i 0,5 μg kolagenu I w proszku. Zalej do 50 ml sterylną wodą. Wymieszaj i przefiltruj przez filtr 0,45 μm.
    2. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowej dodaj tyle roztworu kolagenu do 6 dołków i 10 cm szalek, aby pokryć całe dno. Przykryj talerz i odstaw na 4-6 godzin w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar roztworu za pomocą sterylnej pipety, umieścić w nowej sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml i zachować w temperaturze 4 °C do wykonania dodatkowych płytek. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
    3. Wysuszyć płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie przechowywać je w zamykanej torbie w temperaturze 4 °C. Talerze i szalki pokryte kolagenem można przechowywać przez kilka miesięcy.
  2. Autoklaw następujących przedmiotów: kleszczyki do tkanek, nożyczki do tkanek, waciki i gaziki.
  3. Pożywki wzrostowe VEC: Przygotuj i użyj pożywki do wzrostu komórek śródbłonka zgodnie z protokołami producenta. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. Podgrzać do 37 °C tuż przed użyciem na ogniwa, nie pozostawiać podłoża w kąpieli rozgrzewającej dłużej niż to konieczne (wystarczy 10-15 minut). Pożywkę należy zużyć w ciągu miesiąca od przygotowania.
  4. Pożywka wzrostowa VIC: Suplement Pożywka bazowa DMEM (4,5 g / L glukozy, suplement L-glutaminy, 110 mg / L pirogronianu sodu) < sup class="xref">30 z 10% inaktywowanym termicznie FBS i 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Podgrzać do 37 °C tuż przed użyciem na komórki, nie pozostawiać podłoża w kąpieli rozgrzewającej dłużej niż to konieczne (wystarczy 10-15 minut).
  5. Przygotuj sterylny roztwór do płukania tuż przed użyciem. Uzupełnij sterylny PBS 2,5 μg/ml fungicydu, 0,05 mg/ml gentamycyny i 5 μg/ml środka bakteriobójczego.
  6. Przygotuj sterylny roztwór kolagenazy tuż przed użyciem. Dodaj 5 mg kolagenazy II do 5 ml sterylnej świeżej pożywki bazowej DMEM. Dobrze wymieszaj i wysterylizuj roztwór, przechodząc przez filtr 0,45 μm. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.

4. Przygotowanie i przetwarzanie tkanek

UWAGA: Instytucjonalna zgoda na użycie tkanek ludzkich musi być uzyskana przed rozpoczęciem pracy. Podczas obchodzenia się z tkankami higienicznymi należy nosić następujące środki ochrony osobistej (PPE): jednorazowy fartuch owijany z barierą dla płynów lub specjalny fartuch laboratoryjny zapinany na guziki z fartuchem osłonowym chroniącym przed cieczami oraz jednorazowe koniczynki rękawowe; pełna osłona twarzy lub okulary ochronne z maską chirurgiczną; podwójne rękawice; buty z zakrytymi palcami; i ubranie zakrywające nogi. Kompleksowe schematy przepływu pracy przygotowania tkanek do oceny zwapnienia (sekcja 5) i izolacji komórek (sekcja 6 i 7) są zilustrowane odpowiednio na rysunek 1A, B.

  1. Po otrzymaniu próbki narządu zwłok należy wyciąć korzeń aorty i zanurzyć w stożkowej probówce o pojemności 50 ml ze sterylnym roztworem do płukania. Po otrzymaniu próbki chirurgicznej wyjmij ją z naczyń transportowych i zanurz w stożkowej probówce o pojemności 50 ml ze sterylnym roztworem do płukania. Umieść probówkę zawierającą chusteczkę w pojemniku na lód na kołysce i mieszaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Przetwarzanie tkanek jak najbliżej czasu ekstrakcji zapewni najlepszą regenerację komórek, jednak żywe komórki można zebrać do 61 godzin po wycięciu, a dane pokazują, że VIC są bardziej wytrzymałe niż VEC w miarę upływu czasu. Jeśli tkanka nie może być natychmiast przetworzona, jeśli to możliwe, należy usunąć tkankę, wykonać krok 4.1, a następnie umieścić tkankę z powrotem w świeżym, sterylnym roztworze do przechowywania w chłodni i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania gotowości do kontynuowania. Zastawki pobrane podczas nocnych lub weekendowych operacji mogą być przechowywane w 40 ml roztworu chłodniczego w temperaturze 4 °C i nadal są w stanie dać żywe komórki ponad 2 dni po ekstrakcji.
  2. Spryskaj probówki 70% etanolem i przenieś do sterylnego kaptura. Usuń tkankę i wytnij dwie ulotki zastawki (Rysunek 2A). Umieścić jedną ulotkę w fiolce kriogenicznej (lub 2-3 fiolkach, jeśli do przyszłej analizy potrzebnych jest kilka mniejszych kawałków) i zamrozić błyskawicznie, wrzucając ciekły azot, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
    1. Jeśli zastawka jest dwupłatkowa, należy wyciąć tylko jedną ulotkę. Za pomocą nożyczek przetnij ulotkę na pół od guzka do zawiasu. Użyć jednej połowy ulotki do szybkiego zamrażania, a drugiej połowy do kroku 4.3.
  3. Przetwórz drugą ulotkę do zatapiania parafiny, aby ocenić zawartość zwapnienia, przecinając ją na pół od guzka do zawiasu. Umieść oba kawałki w kasecie zanurzonej w 4% paraformaldehydzie (PFA), a następnie umieść na kołysce w temperaturze RT na co najmniej 2 godziny, ale nie dłużej niż 4 godziny < / > UWAGA: Dłuższe czasy utrwalania tworzą więcej tła dzięki barwieniu immunofluorescencyjnemu. Po wykonaniu kroków 4.2 i 4.3 przejdź natychmiast do sekcji 6 i wróć do kroku 4.4 po kroku 6.12.
  4. Po utrwaleniu umyj tkanki, zanurzając je w świeżym PBS na 1 godzinę 3-4 razy. Po tych myciach próbki mogą pozostawać w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, jeśli zajdzie taka potrzeba. Przejdź do następnego kroku tuż przed osadzeniem.
  5. Stopniowo zmieniaj PBS na 70% etanolu. Myć 30-60 minut na każdym etapie 1:4 70% etanolem:PBS; 1:1 70% etanol:PBS, 4:1 70% etanol:PBS; 70% etanolu.
  6. Osadź tkankę w taki sposób, aby sekcje odsłaniały trzy warstwy ulotki (Rysunek 1A) zgodnie z ustalonymi protokołami31. Alternatywnie, jeśli to możliwe, przynieś tkankę do rdzenia patologicznego w celu osadzenia i przecięcia.
  7. Po kontakcie z chusteczkami należy odpowiednio wyrzucić lub przechowywać środki ochrony osobistej i natychmiast umyć ręce. Odkaż cały sprzęt, powierzchnie oraz odpady stałe i płynne za pomocą wybielacza lub detergentu dezynfekującego rozcieńczonego w stosunku 1:10. Odczekaj 20 minut na odkażenie, a następnie spłucz 70% etanolem. Potraktuj kaptur do hodowli komórkowych sprayem mycoplasma zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Barwienie Von Kossa na zawartość wapnia

UWAGA: To może być zrobione dobrze po wyizolowaniu komórki i ustaleniu linii, ale pamiętaj, aby powiązać poziom zwapnienia tkanki z dokumentami odnoszącymi się do ustalonej podstawowej linii komórkowej.

  1. Plastry parafiny o grubości 5 lub 10 μm pokroić na szkiełka podstawowe i piec szkiełka w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, a następnie schłodzić do temperatury RT.
  2. Używając świeżych roztworów, odparafinować szkiełka, zanurzając je w następujący sposób: 100% ksylen przez 30 min, 2x; 100% etanol przez 3 min, 2x; 90% etanolu przez 3 min; 80% etanolu przez 3 min; 70% etanolu przez 3 min; 50% etanolu przez 3 min; ultraczysta woda przez 3 min; Przechowywać w ultraczystej wodzie do następnych kroków.
    UWAGA: Powyższe czasy są minimalne, każdy krok może się wydłużyć.
  3. Kontynuuj barwienie Von Kossa zgodnie z protokołami producenta.
  4. Oceń pod mikroskopem całą powierzchnię zastawki i przypisz tkankę kontrolną (brak oznak zwapnienia) lub CAVD (wszelkie oznaki zwapnienia, Rysunek 2B).

6. Izolacja, ekspansja i potwierdzenie komórek śródbłonka zastawki (VEC)

  1. W sterylnym kapturze do hodowli komórkowych otwórz stożkową probówkę zawierającą pozostałą ulotkę zastawki i umieść ulotkę w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej lodowatym PBS. Zakręć rurkę i delikatnie odwróć lub umieść na bujaku na 2 minuty w temperaturze RT.
  2. Wyjmij chusteczkę do naczynia o średnicy 60 mm wypełnionego 5-7 ml zimnego roztworu kolagenazy. Za pomocą kleszczy zanurz obie strony ulotki w roztworze 3-4 razy. Inkubować tkankę przez 5-10 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc tkanką co 2 minuty 3-4 razy.
  3. Usuń 2 ml roztworu z naczynia i umieść w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieść kleszcze na guzku i użyj suchego, sterylnego bawełnianego wacika, aby przesunąć od kleszczyków do zawiasu, obracając wacikiem, przesuwając go wzdłuż ulotki. Pomiędzy każdym przeciągnięciem przetrzyj wacik w roztworze w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby usunąć komórki. Powtórz tę czynność, aby w pełni przetrzeć powierzchnię tkanki, a następnie odwróć i powtórz po drugiej stronie.
  4. Trzymając w jednej ręce ulotkę zaworu ze szczypcami, a w drugiej pipetę o pojemności 1 ml, spłucz powierzchnie ulotki roztworem w naczyniu. Po wypłukaniu przenieś cały roztwór zawierający VEC w naczyniu do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml z komórkami z wacika i przejdź do kroku 6.5. Umieść pozostałą tkankę zastawki w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 7 ml sterylnego roztworu kolagenazy i przejdź do kroku 7.1.
  5. Odwirować probówkę zawierającą VEC o stężeniu 180 x g przez 5 minut w celu osadzenia wyizolowanych VEC. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml pożywki wzrostowej VEC. Odwirować jeszcze raz i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wzrostowej i określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego.
  6. Zawiesić osad VEC w 2 ml pożywki wzrostowej VEC i umieścić komórki w wstępnie pokrytym kolagenem dołku na płytce 6-dołkowej o wymiarach około 5 x 105 komórek/cm2. Pozwól komórkom rosnąć co najmniej 3-4 dni, a następnie usuń pożywkę i uzupełnij świeżą pożywką. Powtarzaj wymianę nośnika co 4 dni. VEC będą rosły w płatach w kształcie kostki brukowej (Rysunek 3B, lewe panele).
  7. Gdy plastry VEC pokrywają >80% płytki, podziel komórki w proporcji około 1,3 x 104 komórek/cm2 w zależności od tego, jak szybko rosną (jeśli osiągną 80% w czasie krótszym niż 1 tydzień, podziel je na nieco mniejszą liczbę komórek/cm2).
  8. Aby podzielić, umyj komórki dwa razy 2 ml DPBS, a następnie dodaj tyle odczynnika dysocjacyjnego, aby pokryć powierzchnię komórek. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C, sprawdzając, czy komórki nie są nadmiernie inkubowane. Zatrzymaj trawienie, dodając równą objętość pożywki wzrostowej VEC i przenieś płyn do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 180 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości pożywki dla liczby potrzebnych dołków/płytek.
    UWAGA: Po rozwinięciu do 10-centymetrowej płytki VEC mogą czasami tracić swoją morfologię i zmieniać fenotyp w miarę rozmnażania się. Ma to miejsce, gdy VEC są wysiewane w niskiej konfluencji podczas tworzenia i rozszerzania linii komórkowej.
  9. Aby zagwarantować czystą kulturę, rozważ użycie superparamagnetycznych kulek CD31+ przy każdym rozszczepieniu.
  10. W przypadku 1 x 108 lub mniej komórek (jedno naczynie 10 cm lub mniej) przygotuj 25 μl kulek superparamagnetycznych, myjąc zgodnie z protokołami producenta.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie kroku 6.10 przed trypsynizacją VEC.
  11. Odłączyć komórki jak w kroku 6.8, ale ponownie zawiesić w 500 μl PBS z 0,1% BSA, pH 7,4 i umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Dodać 500 μl umytych i ponownie zawieszonych kulek do probówki z komórkami o pojemności 2 ml i inkubować na rotatorze przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Umieść rurki na magnesie na 2 minuty. Gdy rurka jest nadal w magnesie, ostrożnie usuń supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu, dodaj 1 ml świeżego PBS z 0,1% BSA, delikatnie pipetuj 2-3 razy, a następnie umieść z powrotem na magnesie na 2 minuty. Powtórz jeszcze 2 razy. Po ostatecznym usunięciu buforu, ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej w objętości potrzebnej do ponownego posiewu.
    UWAGA: Komórki nadal będą miały koraliki, ale nie wpłyną one na wzrost i zostaną usunięte w kolejnych przejściach.
  13. Po namnażeniu komórek, oprócz morfologii, potwierdź fenotyp VEC poprzez dodatnie barwienie markerów immunofluorescencyjnych, takich jak czynnik von Willebranda (vWF), kadheryna 5 (CDH5) lub PECAM-1/CD31, oraz ujemne barwienie markerów VIC, takich jak kalponina 1 (CNN) lub aktyna mięśni gładkich alfa-2 (αSMA, Figura 4, lewe panele).

7. Izolacja, rozbudowa i magazynowanie ogniw śródmiąższowych zaworu (VIC)

  1. Jak stwierdzono w kroku 6.4, po usunięciu VEC z tkanki zastawki, ulotkę umieszcza się w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 7 ml roztworu kolagenazy. Inkubować przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych z lekko uchyloną nasadką, aby umożliwić wymianę gazową. Pomyślna izolacja VIC może nadal nastąpić po 18 godzinach w roztworze kolagenazy.
  2. Po inkubacji, w sterylnym kapturze do hodowli komórek, delikatnie wymieszać tkankę, pipetując pipetą serologiczną, aby zapewnić uwolnienie VIC z tkanki ulotki.
  3. Usunąć zawiesinę komórek i przepuścić przez filtr 0,70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Dodać 7 ml pożywki wzrostowej VIC do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 180 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki wzrostowej VIC i określić liczbę komórek. Umieścić VIC w naczyniu o średnicy 60 mm poddanej działaniu kultur tkankowych o wymiarach 1,3 x 104 komórki/cm2.
  5. Pozwól komórkom rosnąć co najmniej 1-2 dni przed wymianą pożywki. Usuń pożywkę i dwukrotnie umyj DPBS, aby usunąć resztki zanieczyszczeń i zastąp je świeżym podłożem wzrostowym. Uzupełniaj podłoże co 2-3 dni. VIC będą rosły w kształcie fibroblastów (Rysunek 3B, prawe panele).
  6. Gdy VIC osiągną zbieżność >90%, przemyj dwukrotnie DPBS w celu usunięcia nadmiaru pożywki i odłącz komórki, dodając odpowiednią objętość wstępnie podgrzanego odczynnika dysocjacyjnego w celu przykrycia płytki (tj. 2-3 ml na 10 cm naczynie). Inkubować naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C. VIC odczepią się od naczynia po 2-3 minutach inkubacji. Dodaj 4-6 ml wstępnie podgrzanego podłoża.
    UWAGA: Jeśli komórki potrzebują więcej niż 3 minuty, aby oderwać się od płytki, odczynnik dysocjacyjny mógł utracić moc. W razie potrzeby można użyć skrobaka do komórek, aby delikatnie podnieść komórki.
  7. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki i delikatnie odwirować przy 180 x g przez 5 minut. Po usunięciu supernatantu delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy we wstępnie podgrzanym podłożu wzrostowym VIC i określić liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Zasiaj żywe komórki o gęstości 1:2 oryginalnej płytki (tj. ~ 1 × 106 komórek na 10 cm szalki lub 1,3 x 104 komórki/cm2).
  8. Oceń fenotyp VIC poprzez barwienie dodatnie dla markerów immunofluorescencyjnych, takich jak αSMA, CNN lub SM22α i barwienie ujemne dla markerów VEC, takich jak CD31, CDH5 lub vWF (Rysunek 4, prawe panele).
    UWAGA: Przedstawiony tutaj przebieg pracy protokołu bezstronnie wybiera jedną ulotkę do izolacji VEC i VIC, podczas gdy pozostałe ulotki są wykorzystywane do barwienia metodą Von Kossa (sekcja 5) i zamrażania zatrzaskowego.

8. Długoterminowe przechowywanie komórek

  1. Po rozwinięciu zamroź komórki w celu długotrwałego przechowywania. Umyj komórki dwukrotnie 2-5 ml DPBS, a następnie dodaj wystarczającą ilość odczynnika dysocjacyjnego, aby odłączyć komórki, jak w krokach 6.8 i 7.6. Zatrzymaj trawienie, dodając równą objętość pożywki wzrostowej VEC lub VIC i przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
  2. Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego.
  3. Wirować przy 180 x g przez 5 min.
  4. Ponownie zawiesić komórki w schłodzonym, kondycjonowanym pożywce wzrostowej do gęstości komórek ~ 3 × 106 komórek/ml.
  5. Delikatnie mieszając, dodaj równą objętość schłodzonego 2x podłoża do krioprezerwacji. Spowoduje to zwiększenie stężenia komórek do ~ 1,5 × 106 komórek/ml.
  6. Podwielokrotność 1 ml do fiolek do krioprezerwacji. Umieść fiolki w pojemniku do zamrażania komórek, zamknij i odwróć 5-6 razy, aby upewnić się, że komórki pozostają zawieszone. Umieść pojemnik w temperaturze -80 °C na 6-72 godzin lub zgodnie z protokołem zamrażania pojemnika. Wyjąć fiolki z temperatury -80 °C i przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powyższy protokół opisuje kroki niezbędne do obróbki tkanek zastawek ludzkich oraz izolacji i tworzenia żywotnych linii komórkowych z tych tkanek. Płatki zastawki aorty są poddawane obróbce w celu zatopienia w parafinie, zamrażane gwałtownie do długoterminowego przechowywania w celu analizy biochemicznej lub genetycznej oraz trawione w celu izolacji VEC i VIC (Rysunek 1). Choć materiały chirurgiczne prawdopodobnie będą posiadały kliniczną diagnozę stenozy aortalnej i mogą wykazywać duże guzk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uzyskanie tkanek kontrolnych i chorobowych od ludzi ma kluczowe znaczenie dla modelowania chorób in vitro i ex vivo; Jednak, podczas gdy często mówi się o wyzwaniach związanych z wypełnieniem luki między ławką a łóżkiem pacjenta, odwrotna kolejność - przejście z sali operacyjnej na ławkę - jest często równie zniechęcająca. Niezbędne dla podstawowego naukowca w celu uzyskania pierwotnych próbek tkanek ludzkich jest współpraca z zaangażowanym naukowcem chirurgiem, który ma zespół pielęgniarek, techników chirurgicznych, asy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Państwo Islamskie otrzymuje instytucjonalne wsparcie badawcze od firm Atricure i Medtronic oraz pełni funkcję konsultanta dla firmy Medtronic Vascular. Żaden z tych konfliktów nie jest związany z tą pracą. Wszyscy pozostali Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Jasonowi Dobbinsowi za wnikliwą dyskusję i krytyczną lekturę tego rękopisu. Chcielibyśmy podziękować Centrum Odzyskiwania i Edukacji Narządów za pomoc i wsparcie oraz podziękować dawcom tkanek i ich rodzinom za umożliwienie przeprowadzenia tego badania. Wszystkie próbki od pacjentów pobierane są od osób biorących udział w badaniach zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu w Pittsburghu zgodnie z Deklaracją Helsińską. Tkanki zwłok uzyskane za pośrednictwem Centrum Odzyskiwania i Edukacji Narządów (CORE) zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Nadzoru nad Badaniami i Szkoleniem Klinicznym z udziałem Zmarłych Uniwersytetu w Pittsburghu (CORID).

Niektóre figurki stworzone za pomocą Biorender.com.

CSH jest wspierany przez National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 i R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m filtrThermo Scientific7211345Przygotowanie płytki z powłoką kolagenową
10 cm płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-One664160Hodowla komórkowa/ekspansja linii komórkowej
10 ml pipeta serologicznaFisher14955234Izolacja VEC/VIC, hodowla komórkowa, ekspansja linii komórkowej
1000 μ Końcówki filtrujące LVWR76322-154Hodowla komórkowa/rozszerzanie linii komórkowej
Końcówki filtrujące 10XLVWR76322-132Hodowla komórkowa/rozszerzanie linii komórkowej
Probówki stożkowe 15 mlThermo Scientific339650Przechowywanie tkanek, izolacja VIC/VEC
16% wodny roztwór paraformaldehyduMikroskopia elektronowa Sciences15710SUtrwalacz tkanek i komórek
190 proof etanolDecon2801Dezynfekcja
1x DPBS: bez wapnia, bez magnezuGibco14190250roztwór soli fizjologicznej. Izolacja VIC/VEC
1x PBSFisherBP2944100roztwór soli fizjologicznej. Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
20 μ L końcówki filtracyjneVWR76322-134Hodowla komórkowa/ekspansja linii komórkowej
200 proof etanolDecon2701Deparafinowanie próbek tkanek
2-propanolFisherA416P 4Wytwarzanie płytek pokrytych kolagenem
Pipta serologiczna 5 mlFisher14955233Izolacja VEC/VIC, hodowla komórkowa, ekspansja linii komórkowej
Probówki stożkowe 50 mlThermo Scientific339652Przechowywanie tkanek, izolacja VIC/VEC
Naczynie 60 mmGenClone25-260VEC izolacja
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCorning3516Hodowla komórkowa / ekspansja linii komórkowej
Kwas octowy, lodowatyFisherBP2401 500Wykonywanie płytek pokrytych kolagenem
AlexaFluor 488 falloidynaInvitrogenA12379Fluorescencyjny Barwienie przeciwbarwiące f-aktyną
Belzer UW Roztwór do przeszczepów w chłodniBridge to LifeBUW0011LRoztwór do przechowywania tkanek
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V - bez kwasów tłuszczowych 25gBioworld220700233potwierdzenie VEC z CD31+ Dynabeads
Przeciwciało kalponiny 1 Abcamab46794Przeciwciało pierwszorzędowe (barwienie VIC dodatnie)
CD31 (PECAM-1) (89C2)Sygnalizacja komórkowa3528Przeciwciało pierwotne (barwienie VEC dodatnie)
CD31 + DynabeadsInvitrogen11155DPotwierdzenie VEC z CD31 + Dynabeads Sygnalizacja
komórkowaCDH52500Przeciwciało pierwotne (barwienie dodatnie VEC)
Sitko komórkowe z 0,70 μ m poryIzolacja Corning431751VIC
Kolagen 1, białko ogona szczuraGibcoA1048301Wytwarzanie płytek pokrytych kolagenem
Kolagenaza IIWorthington Biochemical CorporationLS004176Trawienie tkankowe. Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
Conflikt Gotowy do użycia środek dezynfekujący w sprayuDecon4101Dezynfekcja
Countess II Automatyczny licznik komórekInvitrogenA27977Automatyczny licznik komórek
Countess II Szkiełka nakrywkowe wielokrotnego użytkuInvitrogen2026hWymagana automatyczna osłona do liczenia komórek
Szkiełka nakrywkoweFisher125485EMontaż próbek zaworów
Fiolki kriogeniczneOlympus Plastics24-202Zamrażanie komórek/próbek tkanek
Wybielacz dezynfekujący z CLOROMAX - Formuła skoncentrowana CloroxN/A Dezynfekcja
DMEMGibco10569044Pożywka wzrostowa. Ekspansja VIC
EBM - Pożywka dla komórek śródbłonka, Pożywka podstawowa, wolne od czerwieni fenolowej 500Pożywki wzrostowe Lonza WalkersvilleCC3129. Rozszerzenie VEC
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 zestaw SingleQuot KitLonza WalkersvilleCC4176Suplement podłoża wzrostowego. Rozszerzenie VEC
Mikroskop EVOS FLLife TechnologiesNumer modelu: AME3300Obrazowanie fluorescencyjne
Mikroskop EVOS XLTechnologie życiaAMEX1000Wizualizacja komórek podczas ekspansji linii komórkowej
D SystemsS11550VIC expansion
Cienkie nożyczkiFine Science Tools14088-10Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
Skrobaki komórkowe FisherbrandFisher08-100-241Ekspansja VIC
FungizoneGibco15290-026Przeciwgrzybicze: Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
GentamycynaGibco15710-064Antybiotyk: Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
Szkiełka szklaneGlobe Scientific Inc1358LPróbki zaworów montażowych
Koza anty-mysz 488InvitrogenA11001Fluorescencyjne przeciwciało wtórne
Koza anty-mysz 594InvitrogenA11005Fluorescencyjne przeciwciało wtórne
Koza anty-królik 488InvitrogenA11008Fluorescencyjne wtórne przeciwciało
Koza anty-królik 594InvitrogenA11012Fluorescencyjne przeciwciało wtórne
Invitrogen Countess II FL Szkiełko wielokrotnego użytkuInvitrogenA25750Wymagany automatyczny licznik komórek Odczynnik
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes (DAPI)InvitrogenR37606Fluorescencyjny barwnik przeciwutleniający jądro
LM-HyCryo-STEM - 2X Pożywka do kriokonserwacji dla komórek macierzystychHyClone Laboratories, Inc.SR30002Przechowywanie komórek mrożonych
Podłoże montażoweFisher Chemical PermountSP15-100Zawór montażowy próbki
Mr. Frosty pojemnik do zamrażaniaNalgene51000001Pojemnik do kontrolowanego zamrażania próbek
Mycoplasma-ExS SprayPromoCellPK-CC91-5051Dezynfekcja
Penicylina-StreptomycynaGibco15140163Antybiotyk. Ekspansja VIC
PlasmocinInvivogenANTMPTAnty-mykoplazma. Izolacja i ekspansja VIC/VEC
Przeciwciało SM22aAbcamab14106Przeciwciało pierwotne (barwienie dodatnie VIC)
Nożyczki o standardowym wzorzeNarzędzia do nauki14001-14Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
Sterylny wacik bawełnianyPuritan25806 10WCIzolacja VEC
Kaseta na tkanki ludzkie SwingsetteSimport ScientificM515-2Pojemnik do zatapiania tkanek
Kleszcze Taylora (17 cm)Fine Science Tools11016-17Przygotowanie tkanek, izolacja VIC/VEC
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Roztwór do zliczania komórekGibco15250061
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Rozdzielanie VIC/VECs
Zestaw von KossaPolysciences246331Barwienie skrawków parafinowych tkanek do zwapnienia
przeciwciało czynnika von WillebrandaAbcamab68545Przeciwciało pierwszorzędowe (barwienie dodatnie VEC)
KsylenyFisher ChemicalX3S-4Próbki tkanek deparrafinowających
i przeciwciało alfa SMAAbcamab7817Przeciwciało pierwszorzędowe (barwienie VIC dodatnie)
Surowica bydlęca płodu - Premium Select R& o wysokiej jakości

Bibliografia

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419(2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465(2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934(2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158(2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860(2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja komórek zastawkizwapniała zastawka aortykomórki śródbłonka zastawkikomórki śródmiąższowe zastawkitrawienie kolagenaząbarwienie immunofluorescencyjneroztwór do przechowywania na zimnohodowla tkankowabarwienie metodą Von Kossa
Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.