Artykuł metodologiczny

Wizualizacja 3D populacji komórek odpornościowych w tkankach zakażonych wirusem HIV za pomocą mikroskopii oczyszczającej, immunobarwienckiej, konfokalnej i fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62441

⸱

6 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Medicine, University of California San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Oczyszczanie tkanek, w połączeniu z mikroskopią immunofluorescencyjną, umożliwia przestrzenną wizualizację i kwantyfikację populacji komórek odpornościowych i białek wirusa w nienaruszonych tkankach. Optyczne sekcje oczyszczonych tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej i arkuszowej światła mogą generować modele 3D złożonych środowisk tkankowych i ujawniać niejednorodność przestrzenną wykazywaną podczas zakażenia wirusem HIV.

Streszczenie

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV), czynnik wywołujący zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS), jest głównym globalnym problemem zdrowotnym z prawie 40 milionami osób zarażonych na całym świecie i nie ma powszechnie dostępnego lekarstwa. Pomimo intensywnych wysiłków, szczegółowe zrozumienie interakcji wirusa i komórek gospodarza w tkankach podczas infekcji i w odpowiedzi na terapię pozostaje niepełne. Aby rozwiązać te problemy, techniki oczyszczania tkanek na bazie wody CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) i CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) są stosowane do wizualizacji złożonych interakcji wirus-komórka gospodarza w tkankach zakażonych wirusem HIV z modeli zwierzęcych i ludzi przy użyciu konfokalnej i świetlnej mikroskopii fluorescencyjnej. Optyczne przekroje nienaruszonych tkanek i analiza obrazu pozwalają na szybką rekonstrukcję informacji przestrzennej zawartych w całych tkankach i ilościowe określenie populacji komórek odpornościowych podczas infekcji. Metody te mają zastosowanie do większości źródeł tkanek i różnych zagadnień biologicznych, w tym chorób zakaźnych i raka.

Wprowadzenie

Rosnące zapotrzebowanie na ilościowe przestrzenne obrazowanie tkanek w badaniach biologicznych doprowadziło ostatnio do pojawienia się technik oczyszczania tkanek do generowania obrazów o większej objętości (mm3-cm 3) nienaruszonych tkanek z rozdzielczością pojedynczej komórki. Tkanki obejmują złożone organizacje biomolekuł o unikalnie zdefiniowanych strukturach, składach i funkcjach. Niestety, wiele biomolekuł obecnych w tkankach (np. lipidów i chromoforów) rozprasza się, pochłania lub emituje światło podczas obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej, co utrudnia obrazowanie dużej objętości. Ponadto tkanki często wykazują współczynnik załamania światła niedopasowany do standardowych rozwiązań do obrazowania i soczewek optycznych, co powoduje zniekształcenia optyczne podczas obrazowania. Optymalne podejście do obrazowania dużych objętości tkanek za pomocą mikroskopu świetlnego powinno obejmować dopasowanie współczynnika załamania światła tkanek, roztworów obrazowania i obiektywów, przy jednoczesnym umożliwieniu penetracji światła w głąb tkanki bez naruszania cech biologicznych nienaruszonych tkanek podczas przetwarzania. Pierwsze próby zmniejszenia różnic w indeksie refrakcji między tkankami a roztworami obrazowania poprzez oczyszczanie nieprzezroczystych próbek tkanek zostały przeprowadzone przez niemieckiego anatoma Wernera Spalteholza pod koniec XIX wieku1. Ta technika oczyszczania tkanek obejmowała ostre rozpuszczalniki chemiczne, które mogą uszkadzać próbki tkanek, ale mimo to stanowiła pierwsze zgłoszone obrazowanie nienaruszonych tkanek o większej objętości. Nowoczesne metody mikroskopii świetlnej, w połączeniu z mocą obliczeniową do przechwytywania i analizy obrazów, sprawiły, że oczyszczanie tkanek stało się ostatnio ponownie modne jako metoda obrazowania dużych, nienaruszonych próbek tkanek z rozdzielczością pojedynczej komórki. W ciągu ostatnich dwóch dekad pojawiły się dziesiątki zaawansowanych technik oczyszczania tkanek, w tym zarówno na bazie organicznej, jak i wodnej, z których każda ma mocne i słabe strony w określonych zastosowaniach.

3D obrazowanie tkanek może badać bardziej złożone interakcje biologiczne, które nie mogą być odtworzone w hodowli komórkowej. Na przykład wzorce sygnalizacji komórkowej2, rozkłady przestrzenne różnych typów komórek3 i brain connectivity4 były wcześniej mapowane w sposób ilościowy przy użyciu metod obrazowania całych tkanek/narządów. Opisano tutaj zastosowanie protokołów oczyszczania tkanek na bazie wody do oczyszczania, barwienia immunologicznego i wizualizacji odrębnych populacji komórek docelowych HIV w nienaruszonych tkankach limfatycznych zakażonych wirusem HIV podczas aktywnej infekcji. W organizmie HIV infekuje głównie limfocyty T CD4+ i integruje kopię swojego genomu z genomami zakażonych komórek gospodarza. Wirus następnie przejmuje kontrolę nad zainfekowaną maszynerią komórek gospodarza, aby się replikować, co powoduje rozprzestrzenianie się wirusa, zabijanie komórek gospodarza, dysfunkcję układu odpornościowego i długotrwały postęp w kierunku AIDS. Ważne jest, aby zauważyć, że zachowania zakażonych limfocytów T w tkankach i hodowlach komórkowych są znacznie rozbieżne. Hodowane limfocyty T CD4 + inkubowane z HIV mogą wytwarzać masywną syncytię indukowaną przez HIV, która może obejmować dziesiątki jąder5, podczas gdy podobne eksperymenty z pierwotnymi limfocytami T CD4 + hodowanymi w hydrożelach macierzy zewnątrzkomórkowej 3D (ECM) lub próbkach tkanek od humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV (hu-myszy) na ogół dają syncytię z 2-5 jądrami6. Zrozumienie lokalnej transmisji międzykomórkowej i ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się wirusa wśród osób zakażonych wirusem HIV jest prawdopodobnie jeszcze bardziej skomplikowane, ponieważ obejmuje transport wirusa przez wiele zakażonych typów komórek z tkanek do naczyń krwionośnych do nowych tkanek, gdzie wolne wiriony i komórki produkujące wirusa mogą uzyskać dostęp do dużej liczby podatnych limfocytów7. Scenariusze te nie są obecnie możliwe do odtworzenia w systemach hodowli komórkowych, a tkanki z modeli zwierzęcych i ludzkich pozostają ważnym źródłem zrozumienia patogenezy wirusa w kontekście złożonego organizmu z funkcjonującym układem odpornościowym.

Obecne terapie antyretrowirusowe (ARTs) znacznie zwiększają oczekiwaną długość życia i jakość życia osób z HIV (PWH) poprzez hamowanie replikacji HIV i zatrzymywanie postępu choroby w kierunku AIDS. Niestety, ART nie eliminuje utajonych zakażonych komórek odpornościowych zawierających insercję genomu retrowirusowego, które są w stanie spoczynku i nie wytwarzają aktywnie wirusa. Chociaż wirus nie jest wykrywalny we krwi większości osób na ART, ładunek wirusa szybko się odbija po przerwaniu ART i postępie choroby trwa8. Uporczywy charakter zakażenia wirusem HIV spowodowanego przez utajony rezerwuar zakażonych komórek stanowi ogromną przeszkodę w ustaleniu leku na HIV. Rezerwuary tkankowe wirusa HIV pozostają słabo poznane i kluczowe jest głębsze zrozumienie tych rezerwuarów w tkankach limfatycznych przed, w trakcie i po ART, aby w pełni scharakteryzować patogenezę wirusa i ocenić nowe metody leczenia, które skutecznie eliminują utajone zakażone komórki, które nie wytwarzają aktywnie wirusa.

Tutaj, CUBIC3 i CLARITY9, dwa wcześniej zaadaptowane protokoły oczyszczania tkanek na bazie wody, zostały zastosowane do obrazowania populacji komórek odpornościowych w licznych nienaruszonych tkankach limfatycznych od myszy zakażonych wirusem HIV z humanizowanym układem odpornościowym (hu-myszy), naczelnych zakażonych SIV/SHIV (NHP) i ludzi zakażonych wirusem HIV. Protokoły te można dostosować zarówno do mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej, jak i fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego, w zależności od celów obrazowania (wyższa rozdzielczość w porównaniu z większą objętością) i dostępnego oprzyrządowania. Chociaż mikroskopia świetlna nie jest w stanie rozdzielić pojedynczych wirionów, zastosowanie immunofluorescencji może zidentyfikować regiony tkanki zawierającej wirusa i komórki produkujące wirusy, które można dalej analizować metodami o wyższej rozdzielczości. Przedstawione tutaj metody można dostosować do wizualizacji prawie każdej tkanki w organizmie z rozdzielczością pojedynczej komórki w celu ilościowego określenia relacji przestrzennych między określonymi typami komórek w różnych warunkach podczas infekcji i można je łatwo przełożyć na bardzo istotne próbki pacjentów do badań nad chorobami zakaźnymi lub rakiem.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi protokołami opieki nad zwierzętami. Wszystkie tkanki ludzkie zostały pozyskane zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na ludziach.

1. Pobieranie i utrwalanie tkanek (to samo dla CUBIC i CLARITY)

  1. Zidentyfikuj i przeprowadź sekcję tkanek limfatycznych zgodnie z wcześniejszym opisem10.
  2. Wytnij tkanki limfatyczne nożyczkami i pęsetą w ciągu kilku minut po sekcji zwłok, jeśli jest to bezpieczne.
  3. Umieść próbki tkanek w świeżo przygotowanym, lodowatym buforze utrwalającym zawierającym 8% paraformaldehydu (PFA), 5% sacharozy w 0,1 M trójwodzianu kakodylanu sodu, aby odpowiednio zakonserwować próbki tkanek do mikroskopii świetlnej (LM), mikroskopii elektronowej (EM) lub immuno-EM. Alternatywnie, utrwalić próbki dla LM za pomocą 4% PFA w 0,1 M PBS. Napraw próbki na noc przed rozpoczęciem procesu usuwania, aby zapewnić pełną dezaktywację wirusa.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny w kontakcie ze skórą i wdychaniu oraz jest łatwopalnym ciałem stałym; Obchodź się ostrożnie i przechowuj w łatwopalnej szafce do przechowywania. Kakodylan sodu trójwodny jest toksyczny w przypadku połknięcia lub wdychania.
  4. Wykonaj zdjęcie referencyjne tkanki przed rozpoczęciem procesu oczyszczania.
    UWAGA: W takich warunkach próbki LM mogą być przechowywane przez co najmniej 1 rok. Aby pracować z próbkami wykazującymi ekspresję endogennych białek fluorescencyjnych, w kolejnych krokach należy zawsze przechowywać próbki w ciemności.

2. Oczyszczanie tkanek CUBIC

  1. Przepłukać próbki tkanki limfatycznej w sterylnym 0,1 M PBS trzykrotnie, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby zapewnić usunięcie PFA podczas każdej zmiany buforu.
    UWAGA: Płyny zawierające PFA należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  2. Zanurzyć próbkę tkanki limfatycznej w odczynniku CUBIC 1 (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C na 3 dni, delikatnie wstrząsając. Wykonuj regularne zdjęcia referencyjne, aby monitorować proces odbarwiania w czasie.
  3. Wymień odczynnik-1 na dodatkowe 3-4 dni zanurzenia lub do momentu całkowitego odbarwienia tkanki. Czas potrzebny do oczyszczenia zależy zarówno od objętości, jak i rodzaju tkanki. Aby przyspieszyć proces odbarwiania tkanek, codziennie odświeżaj odczynnik CUBIC Reagent-1 i używaj większych objętości.
  4. Próbki tkanki limfatycznej przemywać trzykrotnie 0,1 M PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  5. Zanurzyć próbki tkanki limfatycznej w odczynniku CUBIC 2 (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 2-7 dni lub do uzyskania całkowitej przezroczystości. Jeżeli próbki nie osiągną pełnej przezroczystości, należy powtórzyć kroki 2.2-2.5 do momentu, gdy czyszczenie przestanie postępować. Wykonuj regularne zdjęcia referencyjne, aby monitorować proces czyszczenia w czasie.
  6. Próbki tkanki limfatycznej przemywać trzykrotnie 0,1 M PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  7. Próbki należy przechowywać w odczynniku CUBIC 2 z 0,01% objętościowo-objętościowym (V/V) azydkiem sodu w ciemności (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Próbki można przechowywać przez co najmniej 6 miesięcy przy użyciu tej metody.
    UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i stanowi poważne zagrożenie wdychania. Zaleca się zakup rozcieńczonych roztworów o stężeniu 5% lub mniej azydku sodu.

3. Blokowanie i barwienie immunologiczne próbek sześciennych

  1. Próbki tkanki limfatycznej przemyć trzykrotnie 0,1 M PBS przez 30 minut każda w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  2. Aby zobrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego, pokrój tkankę na plastry o grubości ~0,5-1 mm za pomocą matrycy do krajalnicy tkanek. Aby wykonać mikroskopię fluorescencyjną arkusza świetlnego (LSFM), zablokuj cały obszar tkanki.
  3. Zablokować próbki 5 ml sześciennego roztworu blokującego przez noc w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem (patrz tabela materiałów). Podczas pracy z NHP lub próbkami ludzkimi należy stosować anty-ludzki FcR. Podczas pracy z próbkami myszy należy użyć anty-mysiego FcR w roztworze blokującym.
  4. Próbki barwić 5 ml przeciwciał pierwszorzędowych (patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym (bez FcR specyficznego dla gatunku) przez 3 dni w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem (opcjonalnie: przed użyciem odwirować skoncentrowany materiał dowodowy o stężeniu 2 300 x g przez 5 minut, aby zmniejszyć dodanie zagregowanego przeciwciała).
  5. Przepłukać zabarwioną próbkę w temperaturze pokojowej z wstrząsaniem przez okres co najmniej 5 godzin, łącznie z co najmniej pięcioma wymianami buforu roztworu płuczącego (patrz tabela materiałów).
  6. Wybarwić próbki przeciwciałami drugorzędowymi (patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym (bez FcR specyficznego dla gatunku) przez 3 dni w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem (opcjonalnie: przed użyciem odwirować przeciwciała przy 2 300 x g przez 5 minut, aby zminimalizować agregację przeciwciał).
  7. Przebarwioną próbkę przemyć pięciokrotnie roztworem płuczącym o temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez łącznie co najmniej 5 godzin.
  8. Wybarwić próbki 5 ml roztworu barwiącego DAPI (patrz tabela materiałów) do każdej próbki tkanki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pozostawić próbki w roztworze barwienia DAPI w ciemności w temperaturze 4 °C w celu późniejszego obrazowania.
  9. Próbki tkanek limfatycznych przemyć roztworem myjącym trzykrotnie w temperaturze pokojowej, potrząsając przez 30 minut każda.
  10. Zanurz barwioną próbkę w odczynniku CUBIC 2 na noc w temperaturze pokojowej w ciemności przed zamontowaniem próbki.

4. PRZEJRZYSTOŚĆ oczyszczanie tkanek

  1. Przepłukać próbki tkanki limfatycznej w sterylnym 0,1 M PBS trzykrotnie, wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 15 minut każda, aby usunąć PFA.
  2. Umieścić próbki tkanek w 15 ml świeżo przygotowanego roztworu akrylamidu i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie mieszając (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Niespolimeryzowany akryloamid jest silną neurotoksyną i łatwo wchłania się przez skórę. Unikać kontaktu ze skórą i natychmiast spłukać, jeśli dojdzie do kontaktu.
  3. Pozwól próbkom tkanek rozgrzać się do temperatury pokojowej.
  4. OPCJONALNIE: Odgazować próbki tkanek poprzez bulgotanie azotu do roztworu akrylamidu przez 1 minutę. Uważaj, aby używać niskiego natężenia przepływu, które pozwala uniknąć rozpryskiwania toksycznego niespolimeryzowanego akrylamidu (~1-2 pęcherzyki/s).
  5. Umieścić próbki tkanek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-3 godziny w celu polimeryzacji, odwracając co 15 minut. Próbki należy usunąć, gdy tylko zostanie wykryta zauważalna polimeryzacja, na co wskazuje lepka ciecz, pojawienie się linii Schlerena podczas mieszania lub utworzenie przezroczystej kapsułki wokół tkanki.
    UWAGA: Jeśli nastąpi całkowita polimeryzacja roztworu akrylamidu, należy odciąć nadmiar hydrożelu od próbki i kontynuować protokół.
  6. Próbki tkanek przemyć sterylnym 0,1 M PBS trzy razy przez 30 minut każda w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając w celu usunięcia roztworu akrylamidu.
  7. Umieść próbki tkanek w 15 ml 8% SDS w 0,1 M PBS w temperaturze 37 °C z delikatnym kołysaniem przez 2-5+ dni, aby umożliwić oczyszczenie. Okresowo odświeżać 8% roztwór SDS i w razie potrzeby użyć do 50 ml roztworu, aby przyspieszyć oczyszczanie. Zatrzymaj proces oczyszczania, gdy próbki są wizualnie przezroczyste lub przestają postępować. Wykonuj regularne zdjęcia referencyjne, aby monitorować proces czyszczenia w czasie.
  8. Próbki tkanek przemyć sterylnym 0,1 M PBS pięć razy w ciągu 1 dnia w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  9. Próbki należy przechowywać tymczasowo w 0,1 M PBS (plus 0,01% objętości/objętości (v/v) NaN3 w przypadku dłuższego przechowywania) w ciemności, aż będą gotowe do zobrazowania fluorescencji endogennej.
  10. Umieść tkankę w 5 ml podłoża do obrazowania RI-2 (patrz tabela materiałów). Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności, aby sprawdzić kompletność procesu oczyszczania przed barwieniem immunologicznym. Wykonaj zdjęcia referencyjne, aby monitorować przezroczystość tkanek.

5. Blokowanie i barwienie immunologiczne próbek CLARITY

UWAGA: Te kroki są podobne do blokowania i barwienia immunologicznego tkanek oczyszczonych przez CABIC, ale używają różnych formuł do blokowania, mycia i barwienia roztworów.

  1. Przemyć próbki tkanki limfatycznej trzykrotnie 0,1 M PBS przez 30 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  2. Aby zobrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego, pokrój tkankę na plastry o grubości ~0,5-1 mm za pomocą krajalnicy do tkanek i matrycy 0,5 mm. Aby wykonać LSFM, zablokuj całą próbkę tkanki.
  3. Próbki należy zablokować 5 ml roztworu blokującego CLARITY (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem.
  4. Wybarwić próbki 5 ml przeciwciał pierwszorzędowych (patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym (bez FcR specyficznego dla gatunku) przez 3 dni w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem (opcjonalnie: przed użyciem odwirować przeciwciała przy 2 300 x g przez 5 minut, aby zminimalizować agregację przeciwciał).
  5. Przebarwioną próbkę przemyć pięciokrotnie roztworem myjącym o temperaturze pokojowej z wytrząsaniem łącznie przez co najmniej 5 godzin (patrz tabela materiałów).
  6. Wybarwić próbki 5 ml przeciwciał drugorzędowych (patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym (bez FcR specyficznego dla gatunku) przez 3 dni w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem (opcjonalnie: przed użyciem odwirować przeciwciała przy 2 300 x g przez 5 minut, aby zminimalizować agregację przeciwciał). Aby skrócić całkowitą długość protokołu, należy użyć przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforami, aby wyeliminować potrzebę inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi.
  7. Przebarwioną próbkę przemyć pięciokrotnie roztworem myjącym o temperaturze pokojowej, wstrząsając łącznie przez co najmniej 5 godzin.
  8. Wybarwić próbki 5 ml roztworu barwiącego DAPI (patrz tabela materiałów) do każdej próbki tkanki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pozostawić próbki w temperaturze 4°C w ciemności w roztworze barwienia DAPI do późniejszego obrazowania.
  9. Próbki tkanki limfatycznej przemyć roztworem myjącym trzy razy w temperaturze pokojowej, za każdym razem wstrząsając przez 30 minut.
  10. Umieścić tkankę w 5 ml pożywki do obrazowania RI-2 (R.I. = 1,46) i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności przed zamontowaniem próbki (patrz krok 6 i 7 protokołu).

6. Montaż i obrazowanie oczyszczonych próbek tkanek do mikroskopii konfokalnej

  1. Oderwij jedną stronę warstwy ochronnej samoprzylepnego izolatora silikonowego.
  2. Przykleić szklaną pokrywę mikroskopu (22 mm x 40 mm, grubość 0,25 mm) do oderwanej strony izolatora silikonowego, aby utworzyć przestrzeń odporną na działanie cieczy dla próbki.
  3. Odklej drugą stronę warstwy ochronnej samoprzylepnego izolatora silikonowego.
  4. Umieść próbkę do obrazowania na środku izolatora silikonowego, a następnie dodaj odpowiednio CUBIC Reagent-2 lub Imaging Media RI-2, aż powierzchnia cieczy znajdzie się tak wysoko, jak krawędź izolatora.
  5. Aby zminimalizować zatrzymywanie pęcherzyków powietrza w izolatorze silikonowym, wyrównaj i delikatnie ułóż drugą szklankę nakrywkową z jednej strony za pomocą kleszczyków EM. Zetrzyj nadmiar płynu. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe wokół dołka (dołków) próbki, używając tylnej części kleszczyków, aby uszczelnić klej. Zamontowane próbki należy przechowywać poziomo w ciemności.
    UWAGA: Próbki mogą być obrazowane od tygodni do miesięcy po zamontowaniu; Jednak jakość obrazowania na ogół pogarsza się z czasem.
  6. Umieść zamontowane szkiełko na stoliku mikroskopu i zlokalizuj próbkę za pomocą białego światła i obiektywu o mniejszym powiększeniu (2-10x).
  7. Ustaw profil akwizycji fluorescencji w oparciu o wybrane poszczególne fluorofory.
    UWAGA: Zaleca się indywidualne pozyskiwanie oddzielnych kanałów fluoroforowych. Skutkuje to dłuższym czasem akwizycji, ale zmniejsza nakładanie się widma i akwizycję niespecyficznego sygnału fluorescencji. Typowy profil fluoroforowy może obejmować DAPI (450 nm), Alexa488, Alexa594 i Alexa647 (lub powiązane kombinacje), aby zminimalizować nakładanie się widma podczas akwizycji obrazu.
  8. Wybierz odpowiedni obiektyw powiększenia, aby obrazować obszary zainteresowania. Użyj obiektywów o mniejszym powiększeniu (2-10x) do obrazowania większej objętości lub całej tkanki z rozdzielczością pojedynczej komórki i użyj obiektywów o większym powiększeniu (20-63x) do wizualizacji szczegółów subkomórkowych w oczyszczonej tkance w wyższej rozdzielczości. Dopasuj współczynnik załamania światła obiektywów, mediów obrazowych i tkanek tak dokładnie, jak to możliwe, aby zminimalizować wprowadzanie zniekształceń optycznych podczas akwizycji obrazu.
  9. Wybierz rozmiar kroku do akwizycji stosu Z. W przypadku obiektywów o mniejszym powiększeniu (2-10x) wybierz rozmiar kroku ~3-5 μm, aby wykryć fluorescencję z pojedynczej komórki w wielu ciągłych warstwach Z do modelowania 3D, jednocześnie skracając całkowity czas akwizycji i ogólny rozmiar pliku. W przypadku obiektywów o większym powiększeniu (20-63x) wybierz rozmiar kroku ~1 μm lub mniejszy, aby zminimalizować utratę informacji subkomórkowej między poszczególnymi warstwami Z.
  10. Powiększ pole widzenia, aby zobrazować cały obszar tkanki w wymiarach X i Y z jak najmniejszą ilością wolnego obszaru. Ustaw współrzędne akwizycji górnego i dolnego stopnia Z, które obejmują cały obszar zainteresowania, który ma być zobrazowany.
  11. Uzyskaj obrazy stosu Z. Zapisz i wyeksportuj plik do późniejszej obróbki za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu. W przypadku niektórych pakietów oprogramowania przekonwertuj pliki na określone typy plików (np. .tiff, .ome-tiff, .jpeg itp.). Dokonaj konwersji za pomocą dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazów mikroskopowych lub bezpłatnego oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJ/Fiji).

7. Montaż i obrazowanie próbek w komorze LSFM lub kuwecie

  1. Napełnij komorę obrazowania odczynnikiem CUBIC 2 lub RI-2 w zależności od zastosowanego protokołu. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas przenoszenia cieczy. Usuń nadmiar pęcherzyków za pomocą pipety.
  2. Zanurz próbkę w komorze obrazowania i ogranicz ruch próbki.
    UWAGA: W zależności od konkretnego użytego mikroskopu może to obejmować osadzenie próbki w agarozie, zawieszenie próbki na haczyku lub adapterze jeżozwierza, wydrukowanie 3D uchwytu na próbkę lub przymocowanie próbki za pomocą kleju do plastikowego naczynia.
  3. Umieść obiektyw w roztworze do obrazowania, skupiając się na próbce. Pozostaw zamontowaną próbkę w komorze obrazowania na kilka godzin lub na noc, aby umożliwić pełną równowagę roztworów i tkanek w kuwecie.
  4. Uzyskaj stos Z obszaru zainteresowania (patrz kroki 6.7-6.11 w celu uzyskania obrazu).
    UWAGA: Takie podejście może umożliwić obrazowanie objętości tkanek większych niż 1cm3 z rozdzielczością pojedynczej komórki.

8. Rekonstrukcja powierzchni i kwantyfikacja komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu Imaris

UWAGA: Te kroki są specyficzne dla oprogramowania do analizy obrazu Imaris, ale podobne kroki przetwarzania obrazu można przeprowadzić przy użyciu innych pakietów oprogramowania (np. ImageJ/Fiji, Aivia, Arivis, Amira, itp.).

  1. Użyj konwertera plików Imaris, aby przekonwertować plik obrazu stosu Z na natywny format Imaris .ims. Ułatwi to szybszą konwersję plików, jednocześnie minimalizując błędy konwersji i potencjalne problemy z oprogramowaniem po otwarciu.
    UWAGA: Niektóre nowsze LSFM umożliwiają użytkownikowi zapisywanie plików bezpośrednio w formacie .ims.
  2. Przeciągnij plik .ims, który ma zostać przeanalizowany, do obszaru Arena w oprogramowaniu Imaris. Dostosuj kontrast lub intensywność każdego kanału koloru za pomocą panelu Dopasowanie wyświetlania. Kliknij ikonę Dodaj nowe powierzchnie w lewym górnym rogu.
  3. Kliknij Dalej: Kanał źródłowy (niebieska ikona ze strzałką skierowaną w prawo). Wybierz kanał źródłowy powierzchni do zbudowania. Nie zmieniaj pozostałych parametrów.
  4. Kliknij Dalej: Próg (niebieska ikona ze strzałką skierowaną w prawo).
  5. Aby dostosować próg (intensywność bezwzględną), przeciągnij linię progu w lewo lub w prawo. Włącz opcję Podziel dotykające się obiekty i wprowadź średnią średnicę komórki w mikronach jako standard podziału dla systemu, aby uzyskać wiele punktów jako początek dla każdej pojedynczej powierzchni.
    1. Nie dołączaj sygnałów fluorescencyjnych, które są zbyt małe lub zbyt jasne, ponieważ mogą one reprezentować potencjalne przebarwienia lub artefakty mikroskopowe. Uwzględnij tylko te punkty, które mają akceptowalne rozmiary i intensywność fluorescencji, odpowiednio zmieniając średnią średnicę komórki.
      UWAGA: Średnia średnica komórki będzie się różnić w zależności od tkanek lub typów komórek, ale zazwyczaj mieści się w przedziale 5-15 μm.
  6. Kliknij Dalej: Klasyfikuj powierzchnie (niebieska ikona ze strzałką skierowaną w prawo oznaczona). Dostosuj powierzchnie, które mają zostać uwzględnione, przeciągając linię progu w lewo lub w prawo. Upewnij się, że powierzchnie są dokładnie zbliżone do surowego sygnału fluorescencji, jednocześnie oddzielając sygnał fluorescencyjny od poszczególnych komórek.
  7. Kliknij Zakończ: Wykonaj wszystkie kroki tworzenia i zakończ działanie kreatora (zielona ikona z dwiema strzałkami skierowanymi w prawo jest oznaczona). Nawierzchnia jest oficjalnie wykonana.
  8. Kliknij szóstą ikonę oznaczoną Statystyka na lewym panelu, aby zobaczyć liczbę komórek, w tym przypadku liczbę powierzchni dla określonego analizowanego kanału koloru.
  9. Upewnij się, że cztery zmienne Liczba rozłączonych komponentów na punkt czasowy, Liczba powierzchni na punkt czasowy, Całkowita liczba rozłączonych komponentów i Całkowita liczba powierzchni mają tę samą liczbę, która jest liczbą komórek w danym kanale koloru.

Wyniki

Przejaśnianie tkanek polega na traktowaniu utrwalonych tkanek koktajlami chemicznymi w celu usunięcia z nich nieprzezroczystych biomolekuł przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkanki. Roztwory do przejaśniania tkanek dopasowują współczynnik załamania światła tkanki do otaczającego ośrodka obrazowania, aby zminimalizować zniekształcenia optyczne, poprawić stosunek sygnału do szumu w głębokich warstwach tkanek oraz zminimalizować tło autofluorescencyjne. Dwa protokoły przejaśniania optycznego tkanek oparte na wodzie, CUBIC3 i CLARITY9, zostały zastosowane do przejaśnienia utrwalonych próbek tkanek myszy zhumanizowanych zakażonych HIV/SIV, naczelnych niebędących ludźmi oraz tkanek ludzkich przed barwieniem immunofluorescencyjnym i obrazowaniem za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii arkusza światła.

W protokole CUBIC utrwalone tkanki przemyto PBS w celu usunięcia utrwalaczy, a następnie zanurzono w odczynniku CUBIC Reagent-1, który jest zasadowym roztworem buforowanym aminoalkoholami, wypłukującym chromofory takie jak hem, co prowadzi do odbarwienia i odtłuszczenia tkanki (Rysunek 1, góra). Mniejsze objętości tkanek (~mm3) można odbarwić po 3 dniach traktowania odczynnikiem CUBIC Reagent-1, jednak większe objętości tkanek (~cm3) lub tkanki o dużej zawartości hemu (takie jak wątroba, śledziona lub serce) wymagają dłuższego czasu inkubacji i większych objętości roztworu (>1 miesiąca i ~50 mL), a także częstej wymiany roztworu co 2-3 dni. Po odbarwieniu tkanki przemyto i umieszczono w odczynniku CUBIC Reagent-2, roztworze zawierającym sacharozę o współczynniku załamania światła około 1,48-1,49, który odpowiada współczynnikowi załamania światła tkanki i zwiększa transmitancję światła. Przejaśnione tkanki poddano immunobarwieniu i zamontowano w roztworze CUBIC Reagent-2 przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu arkuszowego (light sheet). Efekty procedury przejaśniania CUBIC obrazowano dla kilku tkanek myszy zhumanizowanych (hu-mouse) oraz naczelnych (NHP) o różnych rozmiarach i stężeniach chromoforów (Rysunek 2). Przejaśnianie optyczne sprawiło, że tkanki stały się widocznie przezroczyste dla gołego oka, co pozwoliło na dostrzeżenie linii siatki i tekstu na arkuszach papieru „przez” tkankę. Tkanki bogate w chromofory, takie jak śledziona, wątroba, szpik kostny i serce, mogą nie odbarwić się całkowicie, lecz nadal pozostają odpowiednie do immunobarwienia i obrazowania (Rysunek 2 i Rysunek 5).

W protokole CLARITY utrwalone tkanki przemyto PBS w celu usunięcia utrwalaczy, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C w 40% roztworze akrylamidu z inicjatorem termicznym, aby utworzyć wiązania kowalencyjne między białkami w próbce a monomerami akrylamidu (Rysunek 1, dół). Następnego dnia, po wyrównaniu temperatury tkanki do temperatury pokojowej i jej ogrzaniu w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, zainicjowano polimeryzację akrylamidu, która szybko zamknęła próbkę w hydrożelu. Próbkę traktowano roztworem 8% SDS przez okres od 2 do 5 dni w celu usunięcia nieprzezroczystych lipidów. Bezpośrednio przed barwieniem fluorescencyjnym próbkę zanurzono w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła (RIMS) do metody CLARITY (Imaging Media RI-2) zawierającym 90% niejonowego medium gradientu gęstości. W przypadku tkanek zawierających duże ilości hemu, na koniec etapu delipidacji można dodać krok odbarwiania9,11,12. Postępy utrudniania (clearing) metodą CUBIC oraz CLARITY porównano na różnych przekrojach tej samej próbki ludzkiej śledziony (Rysunek 3). Utrudnianie metodą CLARITY powoduje powstanie widocznego żelu poliakryloamidowego, który otacza roztwór i zazwyczaj wykazuje mniejszy stopień odbarwienia w porównaniu z metodą CUBIC, chyba że zastosowano dodatkowy krok odbarwiania9,12.

Następnie w obu protokołach, oczyszczone, nienaruszone tkanki poddano immunobarwieniu w celu wykrycia specyficznych populacji komórek odpornościowych. Próbki przemyto, zablokowano odczynnikiem zawierającym α-FcR w celu ograniczenia niespecyficznego wiązania przeciwciał, a następnie barwiono przez 3 dni w przypadku zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego bezpośrednio sprzężonego z fluoroforem. Alternatywnie, próbki barwiono przez 3 dni nie sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie przez kolejne 3 dni przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem. Tkanki ponownie przemyto, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z barwnikiem DAPI w celu wizualizacji jąder komórkowych. Próbki przemyto i inkubowano albo w CUBIC Reagent-2 przez 24-36 h, albo w Imaging Media RI-2 (CLARITY) przez noc w ciemności. Do mikroskopii konfokalnej tkanki zamontowano na szkiełku przedmiotowym w odpowiednim RIMS przed obrazowaniem (Rysunek 4). W przypadku fluorescencyjnej mikroskopii arkusza światła (LSFM), próbki całkowicie zanurzono w RIMS w kuwecie do obrazowania przez noc przed przeprowadzeniem analizy.

Mikroskopia konfokalna nienaruszonych, przejrzystych i immunostynowanych tkanek limfatycznych pozwoliła na jednoczesną wizualizację wielu sygnałów fluorescencyjnych, w tym jąder komórkowych, markerów komórek odpornościowych oraz białek CA (kapsydu) HIV/SIV (Rycina 5). Komórki produkujące wirusa określono na podstawie kolokalizacji fluorescencyjnej markerów komórek odpornościowych i białek HIV. Przejrzysta i barwiona śledziona ludzka zainfekowana HIV ujawniła liczne limfocyty T CD3+ kolokalizujące z HIV p24, co wskazuje na obecność komórek produkujących wirusa w obrębie nienaruszonej tkanki (Rycina 5A-D). Przejrzyste i immunostynowane węzły chłonne NHP zainfekowane SHIV ujawniły rozkład limfocytów T CD3+ i makrofagów CD68+ w obszarach tkanki, w których nie wykryto wirusa (Rycina 5E), a także w obszarach z licznymi komórkami produkującymi wirusa (Rycina 5F). Wyniki te wykazały, że komórki produkujące wirusa z różnych źródeł tkankowych były odróżnialne od innych komórek w danym polu widzenia, co umożliwiło wykrycie rzadkich zdarzeń biologicznych w złożonym środowisku tkankowym.

W celu wygenerowania stosów Z (Z-stacks) oraz trójwymiarowych modeli powierzchni zastosowano sekcjonowanie optyczne utrwalonych i przejrzyście przygotowanych tkanek przy użyciu mikroskopu konfokalnego, co pozwoliło na ujawnienie heterogeniczności komórkowej występującej podczas infekcji HIV (Rycina 6). Stosy Z zostały połączone w obraz projekcji Z przy użyciu pakietu oprogramowania Imaris (Rycina 6A), a kanał jądrowy DAPI usunięto, aby umożliwić wyraźną wizualizację fluorescencji limfocytów T CD3+ oraz białka kapsydu HIV (p24) w całej objętości tkanki (Rycina 6B). Fluorescencja z projekcji Z została automatycznie segmentowana w programie Imaris w celu wygenerowania zrekonstruowanego trójwymiarowego modelu powierzchni do wizualizacji przestrzennej i ilościowego oznaczenia sygnału fluorescencji w całym stosie Z (Rycina 6C). Analiza modelu 3D wykazała obecność 546 limfocytów T CD3+ i 218 komórek produkujących HIV p24. Podsumowując, pozyskiwanie stosów Z z immunofluorescencji w przejrzyście przygotowanych tkankach limfatycznych zakażonych HIV pozwoliło na stworzenie modeli 3D składu komórkowego tkanki oraz automatyczną kwantyfikację populacji komórek odpornościowych w objętości tkanki.

LSFM nienaruszonych, oczyszczonych i poddanych immunobarwieniu tkanek limfatycznych umożliwiło obrazowanie immunofluorescencyjne (IF) większych objętości w celu analizy rozkładu komórek odpornościowych i komórek produkujących wirusy w tkankach limfatycznych (Rysunek 7). Immunobarwienie tkanki jelita grubego pobranej od zakażonej HIV myszy hu-mouse pod kątem limfocytów T hCD3+ oraz białka HIV p24 ujawniło ogniska komórek produkujących wirusa, rozproszone wśród dużych obszarów tkanki bez oznak infekcji (Rysunek 7A). Powiększony widok ogniska komórek produkujących wirusa ukazał wiele takich komórek w bliskim sąsiedztwie potencjalnych komórek docelowych (Rysunek 7B). Autofluorescencja tkanki (czerwona mgiełka) posłużyła do wizualizacji całej architektury tkanki, przy jednoczesnym wyróżnieniu specyficznych populacji komórek odpornościowych, które barwiły się jaśniej niż autofluorescencja (czerwone owale). Model 3D całego wolumenu stosu Z z LSFM ukazał przestrzenny rozkład ognisk komórek produkujących wirusa w obrębie nienaruszonej tkanki i pozwolił na mapowanie miejsc produkcji wirusa w odniesieniu do ogólnej architektury tkanki (Rysunek 7C). Co zaskakujące, ogniska komórek produkujących wirusa były często przeplatane z dużymi obszarami tkanki bez oznak produkcji wirusa. Wyniki te mogą umożliwić kwantyfikację parametrów rozkładu wirusa i gęstości zakażonych komórek w różnych tkankach, w różnych odstępach czasu od zakażenia lub w odpowiedzi na różne metody leczenia.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat typowego procesu utrudniania tkanek metodami CUBIC i CLARITY, barwienia immunocytochemicznego oraz obrazowania. Czas utrudniania w metodach CUBIC (góra) i CLARITY (dół) może się znacznie różnić w zależności od rozmiaru i rodzaju tkanki. W przypadku utrudniania metodą CLARITY, przed barwieniem immunocytochemicznym wymagany jest dodatkowy etap inkubacji w mediach dopasowanych pod względem współczynnika załamania światła, aby zweryfikować przejrzystość tkanki. Barwienie immunocytochemiczne trwa zazwyczaj 3 dni, gdy przeciwciała pierwszorzędowe są koniugowane z fluoroforami, i 6 dni, jeśli wymagane jest zastosowanie fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych. Próbki można obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego lub LSFM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przezroczystość CUBIC próbek tkanek myszy humanistycznej (hu-mouse) i naczelnych (NHP). W zależności od różnej gęstości hemu i lipidów w próbkach tkanek, czas potrzebny na uzyskanie przezroczystości każdego rodzaju tkanki jest różny. Na przykład jelito grube i dwunastnica zazwyczaj wymagają stosunkowo krótkich okresów (~7 dni), podczas gdy śledziona i wątroba mogą potrzebować więcej czasu, aby stać się przezroczyste (~30 dni). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Porównanie podłużne metod utrudniania tkanek (tissue clearing) na próbkach ludzkich. Śledziona osoby zakażonej HIV w trakcie terapii antyretrowirusowej utrudniona metodą CUBIC (panele górne) oraz CLARITY (panele dolne). Obie metody zapewniły odpowiednie utrudnienie tkanki do 32. dnia w celu przeprowadzenia immunobarwienia i obrazowania. Etap odbarwiania w metodzie CUBIC widocznie redukuje autofluorescencję wywołaną obecnością hemu w próbkach śledziony. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Montaż próbek do mikroskopii konfokalnej. Próbki zamontowano pomiędzy szkiełkami podstawowymi rozdzielonymi klejonymi izolatorami silikonowymi o grubości 0.5-1 mm. Izolatory silikonowe przyklejono do pierwszego szkiełka, a tkankę umieszczono w centrum otworu (góra). Otwór wypełniono RIMS, aż menisk zrównał się z górną krawędzią otworu lub znalazł się nieco powyżej niej (lewo). Drugie szkiełko ostrożnie opuszczono na miejsce, przykładając je od jednej strony do drugiej, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza (dół). Szkiełka całkowicie przyklejono do izolatora silikonowego, delikatnie przesuwając tępy instrument wokół obwodu otworu (prawo). Obrazowanie próbek wykonano przy użyciu standardowego mikroskopu konfokalnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Mikroskopia konfokalna oczyszczonej, nienaruszonej ludzkiej śledziony oraz węzłów chłonnych NHP. (A-D) Oczyszczona ludzka tkanka zakażona HIV została zabarwiona na HIV-1 p24 (zielony), limfocyty T hCD3+ (czerwony) oraz jądra komórkowe (cyjan). (E) Przekrój Z (Z-slice) w mikroskopii konfokalnej węzła chłonnego oczyszczonego metodą CUBIC od NHP zakażonego SHIV 8 tygodni po zakażeniu, poddanego immunobarwieniu na limfocyty T CD3+ (magenta), makrofagi CD68+ (mac/czerwony), SHIV p27 (zielony) oraz jądra komórkowe (niebieski). Pole widzenia zawiera limfocyty T, makrofagi i inne typy komórek, ale nie wykazuje obecności komórek produkujących SHIV (zielony). F) Przekrój Z w mikroskopii konfokalnej przyległego regionu tego samego węzła chłonnego, wykazujący różnice w gęstości i liczbie komórek wraz z obecnością produkujących wirusa limfocytów T CD3+ (zielone strzałki) i makrofagów CD68+ (żółte strzałki). (G-I) Powiększenie wybranych obszarów barwienia na p27 z (F). Paski skali oznaczają 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Objętość stosu Z oraz zrekonstruowana powierzchnia 3D z ludzkiej śledziony zakażonej HIV. (A) Obraz z projekcji Z ze stosu Z o wymiarach 600 µm x 600 µm x 100 µm tkanki ludzkiej śledziony zakażonej HIV, barwionej na HIV-1 p24 (zielony), limfocyty T hCD3+ (czerwony) oraz jądra komórkowe (cyjan). (B) Ten sam obraz z projekcji Z bez barwienia jąder DAPI. (C) Zrekonstruowany 3D model powierzchni fluorescencji CD3 (czerwony) i p24 (zielony) z całej objętości stosu Z. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rycina 7: LSFM i rekonstrukcja 3D objętości powierzchniowych z tkanek zakażonych HIV (A) Przekrój Z (1 000 µm x 1 000 µm) okrężnicy z myszy hu-mouse zakażonej HIV, poddanej immunobarwieniu na limfocyty T CD3+ (czerwony) i HIV p24 (zielony). Matowa czerwona poświata reprezentuje autofluorescencję tkanki, natomiast wyraźne czerwone punkty wskazują limfocyty T. W obrębie peryferii widoczne są kosmki skierowane w stronę centralnego światła jelita, z kilkoma ogniskami aktywnej produkcji wirusa (białe strzałki) rozproszonymi wśród dużych obszarów pozbawionych wirusa. Ramka wskazuje przybliżony obszar zainteresowania dla panelu B. (B) Powiększony obszar tkanki pokazujący pojedyncze produkujące wirusa limfocyty T hCD3+ (żółty) w bliskim sąsiedztwie niezakażonych limfocytów T (czerwony). Obraz został obrócony i zmieniony na sąsiedni przekrój Z, aby ukazać ognisko komórek p24-dodatnich w jednej płaszczyźnie Z. Czerwona autofluorescencja tła ukazuje ogólną architekturę tkanki oprócz specyficznego barwienia limfocytów T hCD3+ (czerwone punkty; białe strzałki). (C) Model powierzchniowy 3D pełnej objętości (1 000 µm x 1 000 µm x 200 µm) wygenerowany za pomocą oprogramowania Imaris, obrócony w celu pokazania ognisk zakażenia HIV (żółty) w różnych lokalizacjach jelita. Białe strzałki wskazują pojedyncze ogniska w obrębie objętości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Tkanki limfatyczne będące przedmiotem zainteresowania należy szybko pobrać po uśmierceniu i natychmiast umieścić we wstępnie schłodzonych utrwalających, aby uniknąć martwicy tkanek (ciemnej lub czarnej tkanki), która może negatywnie wpływać na barwienie i obrazowanie. Po pobraniu pożądanych tkanek natychmiast zanurz tkanki w lodowatym 4%-8% paraformaldehydzie (PFA) na noc w celu utrwalenia, co również dezaktywuje potencjalne patogeny związane z próbkami. 4% PFA jest optymalne do utrwalania próbek LM, podczas gdy 8% PFA może odpowiednio konserwować tkanki zarówno dla LM, jak i EM. Postępowanie zgodnie z tymi procedurami i przechowywanie próbek w utrwalaczu w temperaturze 4 °C w ciemności może skutecznie zachować tkanki do obrazowania LM przez kilka lat. Jednym z zastrzeżeń jest to, że długotrwałe przechowywanie w utrwalaczu może prowadzić do wprowadzenia artefaktów barwiących, zwłaszcza maskowania antygenu, które jest spowodowane sieciowaniem sąsiednich białek z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, co może uniemożliwić dostęp przeciwciał barwiących do epitopu13,14. Jeśli tkanki zawierają endogennie eksprymowane białka fluorescencyjne, należy podjąć środki w celu uniknięcia wystawiania tkanek na działanie światła, gdy tylko jest to możliwe przez cały czas trwania protokołu. Zazwyczaj endogenne białka fluorescencyjne zachowują fluorescencję przez 6-12 miesięcy po utrwaleniu, ale poszczególne próbki tkanek mogą się różnić przez dłuższy lub krótszy czas. Jeśli endogeniczna fluorescencja zostanie utracona w wyniku degradacji białka, białka fluorescencyjne można często wykryć przy użyciu przeciwciała pierwszorzędowego specyficznego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Perfuzja to kolejna opcja szybkiego utrwalania tkanek przed usunięciem12; jednak ze względu na obawy związane z pracą z patogenami, takimi jak HIV, wybrano drogę sekcji zwłok tkanek, a następnie zanurzenie w lodowatym utrwalaczu, aby przygotować próbki tak bezpiecznie, jak to możliwe.

Jedną z zalet opisanych protokołów oczyszczania na bazie wody jest to, że są one na ogół łagodniejsze niż protokoły organiczne, które czasami mogą uszkadzać tkanki, które są bardziej wrażliwe, takie jak wątroba. Protokoły oczyszczania oparte na wodzie będą na ogół wymagały dłuższego czasu na całkowite usunięcie próbki (tygodnie w porównaniu z dniami) w porównaniu z protokołami oczyszczania opartymi na organikach. Protokoły CLARITY i CUBIC mogą być przeprowadzane szybciej przy użyciu perfuzji w celu jednoczesnego oczyszczenia wszystkich narządów w obrębie gryzonia 11,12; jednak nie była to wykonalna opcja dla NHP i autopsji ludzi. Próbki przetworzone za pomocą CLARITY wykazują tendencję do wykazywania pewnego rozszerzenia objętości, podczas gdy CUBIC wykazały zmniejszony wpływ na objętość próbki9. Chociaż na ogół jest to szybsze, wiele protokołów oczyszczania tkanek opartych na organiach powoduje kurczenie się tkanek15, co może utrudnić wykrycie szczegółów jednokomórkowych lub subkomórkowych w tkankach o dużej gęstości komórek, takich jak węzły chłonne i śledziona. Ekspansja indukowana przez oczyszczanie może skutecznie zwiększyć rozdzielczość obrazowania, ułatwiając obserwację aspektów, które byłyby trudne do zaobserwowania w oryginalnym rozmiarze tkanki. Alternatywnie, kurczenie się tkanek może skutecznie zmniejszyć ogólny rozmiar próbki, co może umożliwić obrazowanie całego narządu bez sekcji. Zaletą zarówno protokołu CLARITY, jak i CUBIC jest to, że zachowują one fluorescencję z endogennie eksprymowanych białek fluorescencyjnych w tkance, pozostając jednocześnie podatnymi na barwienie immunofluorescencyjne11,12. Barwienie immunologiczne można przeprowadzić przy użyciu wodnych lub organicznych metod oczyszczania tkanek; Jednak osobiste doświadczenia wykazały wyższy odsetek zgodności przeciwciał przy użyciu protokołów opartych na wodzie w porównaniu z protokołami opartymi na produktach organicznych. Naukowcy muszą rozważyć, którą metodę oczyszczania tkanek zastosować w oparciu o zobrazowaną tkankę (tkanki) i poruszone pytania biologiczne (np. obrazowanie całego narządu w porównaniu z obrazowaniem określonego regionu zainteresowania). Nie ma uniwersalnej techniki oczyszczania tkanek, która umożliwiałaby solidną analizę "pod klucz" dla wszystkich pytań dotyczących obrazowania wielkoobjętościowego, a dostępne metody wykazują wyraźne zalety i wady w zależności od zastosowania biologicznego.

Podczas barwienia przeciwciał należy wziąć pod uwagę wiele aspektów. Ponieważ próbki CLARITY są zatopione w hydrożelu akrylowym, zwykle wymagają dłuższego czasu inkubacji12. Czas potrzebny na inkubację przeciwciał zależy również od objętości i grubości każdej próbki. Większość opisanych tutaj próbek miała grubość ~2-3 milimetrów, a 3 dni wystarczyły do całkowitego zabarwienia całej tkanki. Jeśli celem jest zobrazowanie całego mózgu myszy, czas inkubacji przeciwciał może trwać 1 tydzień lub dłużej12. Wybór metody oczyszczania tkanek wodnych lub organicznych do obrazowania immunofluorescencyjnego może zależeć od kompatybilności przeciwciał. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku CUBIC lub CLARITY wskaźnik trafień dla przeciwciał działających w hodowanych komórkach i tkankach wynosi ~70%. Niezależnie od tego, czy stosuje się wodną, czy organiczną metodę oczyszczania tkanek, konieczna jest ocena zgodności i skuteczności wszystkich przeciwciał przy użyciu określonej zastosowanej metody. Jak pokazano w tej sekcji protokołu, barwienie immunologiczne dla próbek przetworzonych metodą CUBIC i CLARITY odbywa się po zakończeniu oczyszczania. Wręcz przeciwnie, etap ten ma miejsce przed procedurą rozliczeń w przypadku niektórych protokołów opartych na produktach organicznych, po której następuje utrwalenie.

Niezwykle ważne jest, aby tkanki były całkowicie zanurzone w podłożu obrazowym, które odpowiada ich indeksowi załamania światła. Niezastosowanie się do tego spowoduje aberracje sferyczne podczas obrazowania i zniekształci światło uchwycone podczas akwizycji obrazu. Należy zachować ostrożność, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z nośników obrazowania podczas montowania próbek zarówno dla konfokalnych, jak i LSFM, ponieważ pęcherzyki mogą zakłócać drogę światła do lub od próbki. Pęcherzyki można usunąć ręcznie za pomocą pipety przed ostatecznym montażem próbki. W przypadku obrazowania grubszych próbek za pomocą mikroskopu konfokalnego, wiele silikonowych przekładek można nakładać na siebie, aby pomieścić tkanki o grubości większej niż 0,5 mm. Jednym z zaleceń jest zrównoważenie wszystkich tkanek w RIMS przez kilka godzin lub noc podczas montażu na mikroskopie bez dodatkowego ruchu próbki. Pełna równowaga tkanki i pożywki obrazowej zapobiegnie mieszaniu się roztworów o niedopasowanych współczynnikach załamania światła, które mogą powodować aberracje podczas obrazowania. Należy pamiętać, że w przypadku montażu oczyszczonych próbek tkanek nie ma jednej metody montażu "pod klucz", aby zobrazować wszystkie próbki we wszystkich mikroskopach. W niniejszym protokole omówiono opcje mocowania próbek, które działały optymalnie w jednym kontekście, ale istnieje wiele podejść do montażu próbki w zależności od użytego mikroskopu i poruszonego problemu biologicznego. Podejścia te mogą obejmować między innymi osadzanie próbki w agarozie, zawieszanie próbki na haczyku lub plastikowej linii dopasowanej do współczynnika załamania światła, używanie adaptera jeżozwierza, drukowanie 3D uchwytu na próbkę lub przymocowanie próbki za pomocą kleju do plastikowego naczynia.

Mikroskopy konfokalne mogą dobrze sprawdzać się do obrazowania objętości tkanek ~1 mm3-1 cm3. W przypadku mikroskopów konfokalnych użyj obiektywu 2-10x, aby wstępnie zlokalizować obszary zainteresowania i uzyskać stosy Z o większej objętości lub całych tkankach z rozdzielczością pojedynczej komórki. Przełącz się na obiektywy 20-63x, aby uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości określonych obszarów zainteresowania z informacjami subkomórkowymi. Idealnym obiektywem do obrazowania tkanek oczyszczonych metodą CUBIC i CLARITY jest obiektyw specyficzny dla CLARITY/Scale, który jest dokładnie dopasowany do współczynnika załamania światła tkanki i roztworu do obrazowania. Jeśli ten typ obiektywu nie jest dostępny, optymalne jest obrazowanie próbek za pomocą obiektywu immersyjnego z glicerolem lub olejem (np. obiektyw LD LCI Plan-Apochromat 25 x 0,8 NA Imm Corr DIC M27 multi-immersion: odległość robocza = 0,57 mm), a nie obiektyw powietrzny. Zminimalizuje to wprowadzanie zniekształceń optycznych spowodowanych niedopasowanymi współczynnikami załamania światła podczas przechwytywania obrazu. Obiektywy o powiększeniu 20-25x mogą zrównoważyć pozyskiwanie obrazów o większej objętości z uzyskiwaniem szczegółów barwienia z pojedynczych komórek w złożonym środowisku tkankowym. Co ważne, większość mikroskopów konfokalnych zawiera moduły, które umożliwiają kafelkowanie objętości obrazowania w 3D. Ten rodzaj akwizycji obrazu może idealnie generować stosy Z o większej objętości, które zawierają informacje subkomórkowe.

Obrazowanie LSFM może umożliwić wizualizację 3D określonych populacji komórek w kontekście dużych objętości tkanek (>1cm3), a nawet całych narządów. W ciągu ostatnich 10 lat oczyszczanie tkanek w połączeniu z LSFM w dużej mierze koncentrowało się na zrozumieniu połączeń mózgowych u gryzoni; Jednak nowsze zastosowania obejmują wizualizację krajobrazów przerzutów nowotworowych16, rozmieszczenie komórek w przedziałach anatomicznych 9,17 i dyspersję patogenów18. W porównaniu z hodowanymi komórkami, większość zdarzeń biologicznych w tkankach jest niejednorodna, a LSFM może być szczególnie biegły w wizualizacji i ilościowym określaniu przestrzennej niejednorodności tkanek tych zdarzeń (np. replikacji wirusa, sygnalizacji immunologicznej, dystrybucji komórek itp.).

Zestawy danych 3D pozyskane za pomocą konfokalnego lub LSFM mogą być przetwarzane za pomocą wielu platform analizy obrazu. Pakiet oprogramowania Imaris może być używany do budowy powierzchni, generowania animacji 3D i kwantyfikacji komórek; Dostępnych jest jednak wiele systemów analizy obrazu, które umożliwiają wydajne przetwarzanie i analizę obrazu. ImageJ/Fiji freeware19 to atrakcyjna alternatywna platforma przetwarzania obrazów dostępna dla większości laboratoriów, ale nie ma jednego uniwersalnego oprogramowania do analizy, które wyróżniałoby się we wszystkich formach analizy i wizualizacji obrazu. Wiele pakietów oprogramowania do analizy obrazu może być zbyt drogich, jeśli nie są dostępne za pośrednictwem funkcji wspólnego użytku. Wreszcie, krytycznym aspektem LSFM lub dużych kafelkowych konfokalnych zestawów danych 3D jest zarządzanie danymi. Te platformy obrazowania mogą generować ogromne pliki (>1 TB), które wymagają wyższej klasy stacji roboczych do wizualizacji danych i kwantyfikacji. Ostatecznie ten proces obrazowania może usprawnić pozyskiwanie i kwantyfikację przestrzennie odrębnych populacji komórek w całych tkankach i ma szerokie zastosowanie w większości źródeł tkanek i systemów biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Biologii Genomowej Uniwersytetu Illinois w Urbana-Champaign za korzystanie z konfokalnych i świetlnych mikroskopów fluorescencyjnych. Dziękujemy niesamowitym osobom z kohorty "The Last Gift" za próbki tkanek ludzkich, które zostały sfinansowane z następujących grantów: I147821, DA051915, AI131385 i P30 AI036214. Dziękuję Nancy Haigwood i Ann Hessell za próbki tkanek NHP zakażone SHIV.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór akrylamidu (w 0,1 M PBS, łącznie 40 ml)
40% Akrylamid: 4 mlBio-Rad1610144
VA-044 Inicjator termiczny: 0,1 gFujifilm011-19365
CLARITY Roztwór blokujący (w 0,1 M PBS, łącznie 5 ml)
Płodowa surowica bydlęca (FBS): 200 &mikro; LAtlas BiologicalsF-0500-D Szczur
anty-ludzki lub anty-mysi FcR: 50 &mikro; LMiltenyi130-092-575 (mysz) / 130-059-901 (człowiek)
Azydek sodu (z roztworu podstawowego): 5 &mikro; LSigma71289-50G
Tween-20: 5 i mikro; LFisher ScientificBP337-500
CLARITY roztwór myjący (w 0,1 M PBS, łącznie 50 ml)
Azydek sodu (z roztworu podstawowego): 50 &mikro; LSigma71289-50G
Tween-20: 50 i mikro; LFisher ScientificBP337-500
CUBIC Roztwór blokujący (w 0,1 mln PBS, łącznie 5 ml)
Surowica bydlęca płodu (FBS): 200 &mikro; LAtlas BiologicalsF-0500-D Szczur
anty-ludzki lub anty-mysi FcR: 50 &mikro; LMiltenyi130-092-575 (mysz) / 130-059-901 (człowiek)
Azydek sodu (z roztworu podstawowego): 5 &mikro; LSigma71289-50G
Triton X-100: 5 i mikro; LVWRM143-1L
CUBIC Reagent-1 (w 0,1 mln PBS, łącznie 50 ml)
N, N, N', N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiamina: 12,5 gAldrich122262
Triton X-100: 7,5 gVWRM143-1L
Mocznik: 12,5 gFisher chemicalU15-500
CUBIC Reagent-2 (w 0,1 mln PBS, łącznie 50 ml)
sacharoza: 25 gSigmaS1888-500G
Azydek sodu (w postaci proszku): 10 gSigma71289-50G
Roztwór podstawowy azydku sodu (w DI H2O, łącznie 50 ml)Sigma71289-50G
Trietanoloamina: 5 gSigma90270-500mL
Triton X-100: 50 i mikro; LVWRM143-1L
Mocznik: 12,5 gFisher chemicalU15-500
CUBIC roztwór do mycia (w 0,1 M PBS, łącznie 50 ml)
Azydek sodu (z roztworu podstawowego): 50 &mikro; LSigma71289-50G
Triton X-100: 50 i mikro; LVWRM143-1L
DAPI roztwór do barwienia (0,5 &mikro; g/ml)
roztwór podstawowy DAPI: 1 &mikro; L
Roztwór do mycia: 10 ml
DAPI roztwór podstawowy (5 mg/ml)
DAPI w proszku: 5 mgSigma-AldrichD9542-1MG
DMSO (100%): 1 mlThermoFisherD12345
Imaging Media RI-2 (w dH2O)
90% HistodenzSigmaD2158-100G
0,01% Azydek soduSigma71289-50G
0,02 Bufor fosforanu sodu, pH 7,5 Sigma-AldrichS9638-250G
0,1% Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Przeciwciała pierwszorzędowe (w roztworze blokującym bez szczurzego anty-mysiego FcR, łącznie 2 ml)
Goat anty-HIV p24: 10 i mikro; L (1:200)Creative DiagnosticsDPATB-H81692
Mysz anty-ludzka CD68: 10 i mikro; L(1:200)DakoM0876
Królik anty-ludzki CD3: 10 &mikro; L (1:200)DakoA0452
8% roztwór SDS (w 0,1 M PBS, łącznie 50 ml)
SDS w proszku: 4 gSigma-AldrichL3771-500G
Przeciwciała drugorzędowe (w roztworze blokującym bez szczurzego anty-mysiego FcR, łącznie 2 ml)
Donkey anty-kozioł skoniugowany z AlexaFluor647: 2 i Mikro; LInvitrogenA21447
Osioł anty-mysz sprzężony z AlexaFluor594: 2 &mikro; LInvitrogenA21203
Osioł anty-królik sprzężony z AlexaFluor488: 2 &mikro; LInvitrogenA21206

Bibliografia

  1. Spalteholz, W., Barker, L. F., Mall, F. P. Hand-Atlas of Human Anatomy. , J.B. Lippincott Co. Philadelphia. Second edition in English (1907).
  2. Jacob, T., Gray, J. W., Troxell, M., Vu, T. Q. Multiplexed imaging reveals heterogeneity of PI3K/MAPK network signaling in breast lesions of known PIK3CA genotype. Breast Cancer Research and Treatment. 159 (3), 575-583 (2016).
  3. Kieffer, C., Ladinsky, M. S., Ninh, A., Galimidi, R. P., Bjorkman, P. J. Longitudinal imaging of HIV-1 spread in humanized mice with parallel 3d immunofluorescence and electron tomography. eLife. 6, 23282(2017).
  4. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  5. Compton, A. A., Schwartz, O. They might be giants: Does syncytium formation sink or spread HIV infection. PLoS Pathogens. 13 (2), 2-8 (2017).
  6. Symeonides, M., et al. HIV-1-induced small T cell syncytia can transfer virus particles to target cells through transient contacts. Viruses. 7 (12), 6590-6603 (2015).
  7. Sharova, N., Swingler, C., Sharkey, M., Stevenson, M. Macrophages archive HIV-1 virions for dissemination in trans. The EMBO Journal. 24 (13), 2481-2489 (2005).
  8. Colby, D. J., et al. Rapid HIV RNA rebound after antiretroviral treatment interruption in persons durably suppressed in Fiebig I acute HIV infection. Nature Medicine. 24 (7), 923-926 (2018).
  9. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. eLife. 8, 46916(2019).
  10. Buettner, M., Bode, U. Lymph node dissection--understanding the immunological function of lymph nodes. Clinical and Experimental Immunology. 169 (3), 205-212 (2012).
  11. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10, 1860-1896 (2015).
  12. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  13. Sompuram, S. R., Vani, K., Bogen, S. A. A molecular model of antigen retrieval using a peptide array. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 91-98 (2006).
  14. Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. The journal of histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  15. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  16. Guldner, I. H., et al. An Integrative platform for three-dimensional quantitative analysis of spatially heterogeneous metastasis landscapes. Scientific Reports. 6, 24201(2016).
  17. Muntifering, M., et al. Clearing for deep tissue imaging. Current Protocols in Cytometry. 86 (1), 38(2018).
  18. DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 00796(2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przezrocznienie tkanektechnika CUBICtechnika CLARITYmikroskopia konfokalnamikroskopia arkusza wiat asekcjonowanie optyczneinterakcje wirus gospodarz
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły