Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62442

⸱

12 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology, Third Military Medical University, 2Guanghua School of Stomatology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Stomatological Hospital, Sun Yat-Sen University, 3Shigatse Branch, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Department of Emergency Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 5Cancer Center, The General Hospital of Western Theater Command

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Streszczenie

T odgrywa kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych przeciwko nowotworom, a cytotoksyczne limfocyty T (CTL) odgrywają wiodącą rolę w zwalczaniu komórek rakowych. Jednak pochodzenie i uzupełnianie limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu nowotworowego w mikrośrodowisku guza (TME) pozostaje niejasne. Protokół ten wykorzystuje linię komórkową czerniaka B16F10-OVA, która stabilnie eksprymuje zastępczy neoantygen, albuminę jaja kurzego (OVA) i transgeniczne myszy OT-I TCR, w których ponad 90% limfocytów T CD8 + specyficznie rozpoznaje peptyd OVA257-264 (SIINFEKL) pochodzący z OVA związany z cząsteczką głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy IH2-K b. Cechy te umożliwiają badanie odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia.

Łącząc ten model z chirurgią przeszczepu nowotworu, tkanki nowotworowe od dawców zostały przeszczepione do syngenicznych myszy biorców, aby precyzyjnie śledzić napływ komórek odpornościowych pochodzących od biorcy do przeszczepionych tkanek dawcy, co pozwoliło na analizę odpowiedzi immunologicznych CD8+ inherentycznie związanych z nowotworem i pochodzących z obwodów antygenów. Limfocyty T. Stwierdzono, że między tymi dwiema populacjami zachodzi dynamiczne przejście. Reasumując, ten eksperymentalny projekt zapewnił kolejne podejście do precyzyjnego zbadania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8+ w TME, co rzuci nowe światło na immunologię nowotworów.

Wprowadzenie

Odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem limfocytów T CD8+ odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu wzrostu guza. Podczas nowotworzenia naiwne limfocyty T CD8 + są aktywowane po rozpoznaniu antygenu w sposób ograniczony do MHC klasy I, a następnie różnicują się w komórki efektorowe i infiltrują do masy guza1,2. Jednak w mikrośrodowisku guza (TME) przedłużona ekspozycja na antygen, a także czynniki immunosupresyjne, doprowadzają infiltrowane limfocyty T CD8 + specyficzne dla nowotworu do stanu hiporeaktywnego znanego jako "wyczerpanie"3. Wyczerpani limfocyty T (Tex) różnią się od limfocytów T efektorowych lub pamięciowych generowanych w ostrej infekcji wirusowej, zarówno transkrypcyjnie, jak i epigenetycznie. Te komórki Tex charakteryzują się głównie trwałą i podwyższoną ekspresją szeregu receptorów hamujących, a także hierarchiczną utratą funkcji efektorowych. Co więcej, upośledzona zdolność proliferacyjna wyczerpanych limfocytów T CD8 + powoduje zmniejszenie liczby limfocytów T specyficznych dla nowotworu, tak że pozostałe limfocyty T CD8 + w TME mogą ledwo zapewnić wystarczającą odporność ochronną przed progresją nowotworu3. Tak więc utrzymanie lub wzmocnienie limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu nowotworowego jest niezbędne do represji guza

.

Ponadto, uważa się, że terapia blokująca immunologiczne punkty kontrolne (ICB) ożywia Tex w nowotworach poprzez zwiększenie infiltracji limfocytów T, a co za tym idzie, liczbę limfocytów T i odmładzanie funkcji limfocytów T w celu zwiększenia represji guza. Powszechne zastosowanie leczenia ICB zmieniło krajobraz terapii przeciwnowotworowej, a znaczna podgrupa pacjentów doświadcza trwałych odpowiedzi4,5,6. Niemniej jednak większość pacjentów i typów nowotworów nie reaguje na ICB lub reaguje na nie tylko tymczasowo. Postuluje się, że niewystarczająca infiltracja limfocytów T w TME jest jednym z mechanizmów leżących u podstaw oporności na ICB7,8.

Kilka badań wykazało niejednorodność infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8+ (TIL) zarówno u pacjentów, jak i na modelach mysich9,10,11,12. Potwierdzono, że podzbiór limfocytów T CD8 + eksprymujących czynnik limfocytów T-1 (TCF1) w masie guza wykazuje właściwości podobne do komórek macierzystych, które mogą dalej prowadzić do nieuleczalnie wyczerpanych limfocytów T i są odpowiedzialne za wybuch proliferacji po terapii ICB12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Udowodniono jednak, że tylko niewielka część limfocytów T TCF1 + CD8 + specyficznych dla antygenu istnieje w TME i generuje rozszerzoną pulę zróżnicowanego potomstwa w odpowiedzi na ICB23,24,25,26. Nie wiadomo, czy ograniczona wielkość tej populacji jest wystarczająca, aby zapewnić trwałość cytotoksycznych limfocytów T (CTL) w celu kontrolowania progresji nowotworu, a to, czy następuje uzupełnianie z tkanek obwodowych, wymaga dalszych badań. Co więcej, ostatnie badania sugerują niewystarczającą zdolność do rewitalizacji istniejących wcześniej limfocytów T specyficznych dla nowotworu oraz pojawienie się nowych, wcześniej nieistniejących klonotypów po leczeniu białkiem antyprogramowanej śmierci komórki 1. Wskazuje to, że odpowiedź limfocytów T na blokadę punktu kontrolnego może być spowodowana nowym napływem odrębnego repertuaru klonów limfocytów T27. Wraz z obecnością niereagującej z nowotworem cytotoksycznej frakcji limfocytów T w TME, odkrycia te skłoniły do stworzenia modelu alloprzeszczepu guza w celu zbadania roli limfocytów T CD8 + pochodzących z obwodów11.

Do tej pory kilka rodzajów implantacji nowotworów, jak również transfer adoptywny komórek odpornościowych, były szeroko stosowane w dziedzinie immunologii nowotworów28. TIL, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej i komórki odpornościowe reagujące na nowotwór pochodzące z innych tkanek można dobrze scharakteryzować za pomocą tych metod. Jednak podczas badania interakcji między ogólnoustrojową i miejscową odpornością przeciwnowotworową, modele te wydają się niewystarczające do zbadania interakcji między komórkami odpornościowymi pochodzącymi z peryferii a TME. W tym przypadku tkanki nowotworowe przeszczepiono od dawców do myszy biorcy dopasowanych do guza, aby precyzyjnie śledzić napływ komórek odpornościowych pochodzących od biorcy i jednocześnie obserwować komórki pochodzące od dawcy w TME.

W tym badaniu, mysi syngeniczny model czerniaka został stworzony z linią komórkową czerniaka B16F10-OVA, która stabilnie wyraża zastępczą albuminę jaja kurzego neoantygenu. Transgeniczne myszy TCR OT-I, w których ponad 90% limfocytów T CD8 + specyficznie rozpoznaje peptyd OVA257-264 (SIINFEKL) pochodzący z OVA związany z cząsteczką MHC klasy IH2-K b, umożliwiają badanie odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu opracowanych w modelu guza B16F10-OVA. Łącząc ten model z przeszczepem guza, porównano odpowiedzi immunologiczne limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu specyficznych dla nowotworu i pochodzenia obwodowego, aby ujawnić dynamiczne przejście między tymi dwiema populacjami. Podsumowując, ten eksperymentalny projekt zapewnił kolejne podejście do precyzyjnego zbadania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8 + w TME, co rzuca nowe światło na dynamikę odpowiedzi immunologicznej limfocytów T specyficznych dla nowotworu w TME.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. Użyj 6-8-tygodniowych myszy C57BL/6 i naiwnych myszy transgenicznych OT-I o wadze 18-22 g. Używaj zarówno męskich, jak i żeńskich bez randomizacji lub "zaślepiania".

1. Przygotowanie pożywki i odczynników

  1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych D10 zgodnie z wcześniejszym opisem29, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy do zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco.
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych R10, uzupełniając RPMI-1640 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
    UWAGA: Pożywki hodowlane D10 i R10 mogą pozostać sterylne i stabilne przez co najmniej 2 tygodnie, jeśli są przechowywane w temperaturze 2-4 °C.
  3. Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), uzupełniając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 2% FBS i 0,01% azydku sodu.
    UWAGA: Po dodaniu azydku sodu bufor FACS może być przechowywany w temperaturze 2-4 °C przez wiele miesięcy.
  4. Przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek (RBL), dodając 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do podwójnie destylowanej wody i dostosować jego pH do 7.3.
    UWAGA: Bufor RBL jest stabilny do 3 miesięcy w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), uzupełniając PBS 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA.
    UWAGA: Roztwór należy przepuścić przez filtr 0,22 μm po rozpuszczeniu odczynnika i zakonserwowaniu go w aseptyce.
  6. Przygotować roztwór roboczy z 2,2,2-tribromoetanolu.
    1. Rozpuścić 2,5 g 2,2,2-tribromoetanolu w 5 ml alkoholu tert-amylowego (2-metylo-2-butanolu). Mieszać przez noc w wibratorze o stałej temperaturze 180 obr./min w temperaturze 40 °C.
    2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm do sterylnego pojemnika. Dodać podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 200 ml i mieszać dokładnie i w sposób ciągły, aż roztwór stanie się klarowny i przezroczysty.
    3. Określić i dostosować wartość pH roztworu do 7,3. Całkowicie owinąć pojemnik folią aluminiową, aby wykluczyć światło i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Końcowe stężenie roztworu roboczego 2,2,2-tribromoetanolu wynosi 12,5 mg/ml. Bardziej stężony roztwór nie jest zalecany, ponieważ materiał jest drażniący w wyższych stężeniach. Przed każdym użyciem należy sprawdzić wartość pH roztworu roboczego i wyrzucić go, jeśli pH jest niższe niż 5.

2. Przygotowanie zawiesiny komórek B16F10-OVA

UWAGA: Hodowla komórek powinna być przeprowadzana w kapturze bezpieczeństwa biologicznego w ściśle aseptycznych warunkach.

  1. Rozmrozić i wyhodować fiolkę z komórkami B16F10-OVA z D10 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Gdy komórki osiągną zbieg około 80-90%, subkulturuj komórki.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipetora i dwukrotnie przepłukać komórki za pomocą PBS.
      UWAGA: Nie dodawać PBS na siłę do przylegających komórek w kolbie lub naczyniu do hodowli komórkowych. Zamiast tego odpipetuj PBS w kierunku ściany bocznej lub dodaj go kroplami do kolby lub naczynia.
    2. Usunąć PBS i dodać 1-2 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do kolby lub naczynia. Kołysz nim w przód iw tył, aby pokryć całą powierzchnię komórki. Umieścić kolbę lub szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na ~1 minutę lub w temperaturze pokojowej do momentu oderwania się komórek.
      UWAGA: Mikroskop odwrócony może być użyty do sprawdzenia, czy komórki się odłączyły.
    3. Dodaj świeżą D10, aby zatrzymać trypsynizację. Pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki są oddzielone od powierzchni kolby lub naczynia
      4. .
    4. Przenieść zawiesinę komórek B16F10-OVA do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki o stężeniu 125 × g przez 5-7 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą D10. Dozować zawiesinę komórek B16F10-OVA do nowej kolby lub naczynia do hodowli komórkowych zawierających D10 i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. W dniu implantacji guza należy pobrać komórki B16F10-OVA, które są ~ 90% zlewające się, jak opisano w krokach 2.2.1 do 2.2.4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.
  4. Policz żywotne komórki za pomocą hemocytometru przy użyciu 0,4% błękitu trypanowego. Dostosuj gęstość komórek do 1 × 106 komórek na 100 μl, dodając PBS. Utrzymuj komórki na lodzie.

3. Ektopowa implantacja komórek B16F10-OVA w okolicy pachwinowej myszy

  1. Użyj 6-8-tygodniowych myszy C57BL/6 o wadze 18-22 g. Użyj zarówno samca, jak i samicy bez randomizacji lub "zaślepienia".
  2. Pobrać 100 μl przygotowanej zawiesiny komórek B16F10-OVA do strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml. Postukaj w cylinder, aby przesunąć bąbelki do góry, i delikatnie popchnij tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  3. Unieruchomij mysz i odsłoń jej brzuch. Naciśnij lewą tylną nogę małym palcem, aby napiąć skórę lewej okolicy pachwinowej.
  4. Usuń włosy myszy z lewej dolnej części brzucha za pomocą golarki elektrycznej. Użyj bawełny nasączonej 75% etanolem, aby oczyścić tylną ćwiartkę lewego brzucha.
  5. Trzymając strzykawkę pod bardzo płytkim kątem (0-15°) ze skosem igły skierowanym do góry, wprowadzić ją w miejscu lewej górnej części uda i przesunąć 0,5-1 cm przez tkankę podskórną do okolicy pachwinowej.
  6. Odciągnąć tłok przed wstrzyknięciem. Jeśli występuje podciśnienie, należy całkowicie wcisnąć tłok i obserwować, jak w tkance podskórnej pojawia się mały bolus (tworzenie się kieszonki płynowej).
    UWAGA: Jeśli krew zostanie pobrana z powrotem do piasty igły, wycofaj się i spróbuj ponownie w innym miejscu.
  7. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy usunąć igłę i odpowiednio ją zutylizować. Zwolnij i umieść mysz z powrotem w klatce.
  8. Zmierz wielkość guza w dniach 6-8 za pomocą skali noniusza po implantacji B16F10-OVA. Wybierz myszy z guzem o średnicy ~ 3 mm (wielkości fasoli mung) i podziel je równo i losowo na dwie grupy.
    UWAGA: Myszy z guzami o podobnej wielkości są losowo przydzielane jako myszy dawcy i biorcy; Dopasowana tkanka nowotworowa wycięta od myszy dawcy zostanie przeszczepiona myszom biorcy. Ponadto należy uwzględnić kontrole nieoperacyjne i kontrole pozorowane w celu oceny wpływu operacji na adoptywny transfer komórek i na ogólny stan zdrowia myszy. Tak więc jedna grupa myszy z nowotworem służy jako nieoperowana grupa kontrolna, otrzymując komórki OT-I CD45.1 + CD45.2 + lub CD45.1 +, ale bez operacji. Druga grupa myszy służy jako pozorowana grupa kontrolna, otrzymując komórki OT-I CD45.1 + CD45.2 + lub CD45.1 + i następnie operację podobną do grupy eksperymentalnej, ale bez przeszczepu alloprzeszczepu.

4. Adoptywny transfer genetycznie oznaczonych komórek T OT-I do myszy z nowotworem

  1. Na dzień przed transferem należy podać 4 mg cyklofosfamidu rozpuszczonego w 200 μl PBS we wstrzyknięciu dootrzewnowym każdej myszy z nowotworem.
    UWAGA: Leczenie cyklofosfamidem ma na celu wywołanie limfopenii w gospodarzu, która wytwarza "przestrzeń" dla przenoszonych komórek, sprzyjając ich przetrwaniu i naprowadzaniu do narządów limfatycznych w celu efektywnego funkcjonowania.
  2. Użyj naiwnych myszy transgenicznych OT-I z wyraźnymi markerami kongennymi (6-8 tygodni, 18-22 g, tej samej płci co myszy z nowotworem). Użyj myszy CD45.1 + OT-I i myszy CD45.1 + CD45.2 + OT-I do adoptywnego przeniesienia limfocytów T specyficznych dla antygenu OVA257-264 odpowiednio do myszy dawcy i biorcy nowotworu.
    UWAGA: Pochodzenie adoptywnie przenoszonych komórek OT-I można łatwo zidentyfikować, jeśli wykazują one wyraźne markery kongeniczne lub fluorescencyjne. Na przykład wstrzyknąć limfocyty T CD45.1 + OT-I myszom z dawcą B16F10-OVA, jednocześnie wstrzykując limfocyty T CD45.1 + CD45.2 + OT-I myszom biorcom noszącym B16F10-OVA. CD45.1 i CD45.2 są izoformami markera pan-limfocytów CD45 (Ly5). Inne powszechnie stosowane markery kongenne obejmują różne izoformy CD90 (Thy1). Protokół ten może być stosowany u myszy z różnymi markerami kongenicznymi. Myszy OT-I powinny być tej samej płci co myszy otrzymujące transfer komórek OT-I, aby uniknąć problemów z odrzuceniem.
  3. Odizoluj limfocyty od śledziony i węzłów chłonnych myszy OT-I.
    UWAGA: Następujące procedury na tym etapie należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać ścisłą aseptykę.
    1. Przygotuj dwie szalki Petriego o średnicy 60 mm × 10 mm. Dodaj 3 ml pożywki R10 do jednego naczynia, dodając 3 ml buforu RBL do innego naczynia. Umieść sitko nylonowe o średnicy 70 μm w naczyniu zawierającym bufor RBL.
    2. Poddaj eutanazji mysz OT-I w komorze izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Pobrać śledzionę, pachwinowe (podbiodrowe) i pachowe węzły chłonne myszy i przenieść je do szalki o średnicy 60 mm × 10 mm z 3 ml R10 na lodzie.
      UWAGA: Liczba uśmierconych myszy OT-I może być dostosowana w zależności od liczby myszy z guzem, które mają zostać przeniesione. Typowa wydajność limfocytów T OT-I CD8 + ze śledziony oraz obustronnych pachwinowych i pachowych węzłów chłonnych komórek T OT-I CD8 + wynosi ~ 30-100 × 106 komórek na mysz.
    4. Używając końcówki strzykawki o pojemności 1 ml, zmacerować śledzionę w 3 ml buforu RBL przez sitko. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i zakończyć reakcję przez dodanie 3 ml zimnego podłoża R10.
    5. Zetrzyj węzły chłonne, aż pozostaną tylko tkanki łączne. Wypłucz filtr za pomocą R10. Przenieść zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 500 × g, 4 °C przez 6 min.
    6. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml buforu MACS. Przepuść zawiesinę komórek przez nowe sitko do komórek o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie kłaczki.
    7. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
    8. Użyj mysiego zestawu do izolacji limfocytów T CD8+ (patrz tabela materiałów), aby oczyścić limfocyty T CD8+ metodą selekcji ujemnej, zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: W przypadku korzystania z zestawów innych firm należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. Oczyszczoną zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie. Weź małą próbkę komórek i wymieszaj z błękitem trypanowym, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  4. Określ procent komórek OT-I (żywych/martwych-CD8 + Va2 +) za pomocą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Należy przeprowadzić jednoczesne barwienie markerów kongennych i transgenicznego TCR w celu sprawdzenia prawidłowego fenotypu komórek przed transferem.
    1. Dodać 5 × 104-1 × 105 komórek do 1 ml buforu FACS w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 350 × g w temperaturze 4 °C przez 3 min.
    2. Odrzucić supernatant i rozproszyć komórki, przesuwając spód probówki. Umieść rurkę na lodzie.
    3. Przygotować następujące mieszaniny przeciwciał sprzężonych (rozcieńczonych w 100 μl buforu FACS): anty-CD8, 1:200; anty-TCR Vα2, 1:100; anty-CD45.1, 1:200; anty-CD45.2, 1:200; i żywe/martwe, 1:200 (patrz Tabela materiałów).
    4. Wirować koktajl przeciwciał i odwirować przy 15 000 × g przez 3 minuty, aby zebrać agregaty przeciwciał. Przechowuj koktajl na lodzie i chroń go przed światłem.
    5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl koktajlu przeciwciał i dokładnie wymieszać, przesuwając probówkę. Inkubować w ciemności przez 30 minut na lodzie.
      UWAGA: Unikaj naruszania agregatów przeciwciał na dnie probówki.
    6. Przemyć granulki dwukrotnie 1 ml buforu FACS. Wirować w temperaturze 350 × g, 4 °C przez 3 min. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i przenieść zawiesinę komórek do probówki FACS.
      UWAGA: Aby utrzymać żywotność komórek OT-I, które mają być przeniesione, należy jak najszybciej przetestować próbkę. Jeżeli wybarwione komórki OT-I nie mogą być natychmiast zbadane, należy je przechowywać w ciemności na lodzie lub przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu analizy. Alternatywnie, próbki można ponownie zawiesić w 1-4% paraformaldehydzie w celu przedłużenia przechowywania (16 godzin), aby zapobiec zepsuciu.
    7. Uruchom próbkę na cytometrze przepływowym. Oblicz procent żywych/martwych komórek CD8 + Va2 +, dzieląc liczbę żywych/martwych komórek CD8 + Vα2 + przez liczbę żywych/martwych komórek.
  5. Określ bezwzględną liczbę komórek OT-I (żywe/martwe-CD8+Va2+), mnożąc procent żywych/martwych komórek CD8+Va2+ przez liczbę żywotnych komórek uzyskaną w kroku 4.3.9.
  6. Dostosuj stężenie komórek OT-I (żywe/martwe-CD8 + Va2 +) do 1,5 ×10 6 / ml za pomocą PBS.
  7. Wstrzyknąć 3 × 105 odrębnych, genetycznie oznaczonych komórek OT-I (żywych/martwych-CD8 + Va2 +) w 200 μl PBS dożylnie dwóm grupom myszy zawierających B16F10-OVA (myszy z guzem podzielone na myszy dawcy i biorcy z kroku 3.8).
    1. Pobrać 200 μl zawiesiny komórek OT-I (żywy/martwy-CD8+Va2+) do strzykawki insulinowej 100 j. (29 G) i usunąć pęcherzyki, jak w kroku 3.2.
    2. Umieść mysz osobno w klatce z lampą podczerwoną nad klatką na 5-10 minut, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Unieruchomij mysz za pomocą urządzenia krępującego o odpowiednim rozmiarze. Pociągnij za ogon, aby go wyprostować i spryskaj 75% etanolem, aby żyła była widoczna.
    3. Trzymać strzykawkę równolegle do żyły i wprowadzić ją do żyły pod kątem 0-15°. Lekko odciągnąć tłok, a jeśli krew dostanie się do cylindra, powoli i równomiernie wstrzykiwać zawiesinę z szybkością nie większą niż 1 ml/min.
      UWAGA: Opór lub obrzęk w miejscu wstrzyknięcia wskazuje, że igła nie znajduje się wewnątrz żyły; Miejsce wstrzyknięcia należy przesunąć proksymalnie.
    4. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy wyjąć strzykawkę i delikatnie uciskać miejsce wprowadzania przez 3-5 sekund, aby zatrzymać krwawienie. Umieść mysz z powrotem w klatce i uważnie obserwuj ją przez kilka minut pod kątem działań niepożądanych. Jeśli ma normalną ruchomość i wydzielinę z nosa, umieść ją z powrotem w towarzystwie innych myszy.

5. Wypreparuj masę guza od myszy dawcy z guzem

UWAGA: Utrzymuj sterylne warunki podczas operacji w sekcjach 5 i 6. Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie przed i po każdym użyciu. Zdezynfekować obszar operacyjny w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą 75% etanolu, a następnie naświetlić go promieniowaniem ultrafioletowym. Noś czysty fartuch, czepek, maskę na twarz i sterylne rękawiczki.

  1. Osiem do dziesięciu dni po transferze adopcyjnym wybierz myszy dawcy o porównywalnej masie guza o średnicy ~ 5 mm (wielkości soi) do operacji przeszczepu.
  2. Przygotuj naczynie o średnicy 100 mm × 20 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 10 ml sterylnego, lodowatego PBS.
  3. Poddaj eutanazji mysz dawcy z nowotworem w komorze izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zanurz mysz w 75% etanolu na 3-5 minut i przenieś do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Następujące procedury na tym etapie należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać ścisłą aseptykę.
  4. Umieść mysz na desce sekcyjnej pokrytej czystym papierem chłonnym w pozycji leżącej. Unieruchamić kończyny myszy za pomocą igieł preparacyjnych.
  5. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej od góry ujścia cewki moczowej do mieczyka mieczykowatego nożyczkami. Rozciągnij skórę w kierunku lewej strony ciała myszy za pomocą pęsety i przytrzymuj skórę igłami do preparowania.
  6. Wytnij guz, zachowując jego torebkę w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Ostrożnie i delikatnie usuń tkankę łączną w pobliżu guza nożyczkami chirurgicznymi.
    UWAGA: Aby zachować integralność guza, nie odklejaj kapsułki nowotworowej ani nie przecinaj tkanki nowotworowej na kawałki.
  7. Umieść tkankę nowotworową w naczyniu o średnicy 100 mm × 20 mm zawierającym 10 ml sterylnego, lodowatego PBS do późniejszego przeszczepu.

6. Podskórne przeszczepienie guza pochodzącego od dawcy na myszy biorców z dopasowanym nowotworem

UWAGA: Przeszczep allogeniczny powinien być wszczepiony w dolną stronę myszy po tej samej stronie, co poprzednio istniejący guz, aby dwa guzy drenażały do identycznego węzła chłonnego. W przedstawionym tutaj protokole, ponieważ guz B16F10-OVA został wszczepiony podskórnie w lewej okolicy pachwinowej myszy (sekcja 3), tkanka nowotworowa pochodząca od dawcy została przeszczepiona na lewym boku biorcy na tym etapie. Miejsce przeszczepu można dostosować do miejsca pierwszego implantacji nowotworu.

  1. Znieczulić mysz biorcy dopasowaną do guza 250 mg/kg 2,2,2-tribromoetanolu we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Uszczypnij palec u nogi prostownika myszy, aby ocenić poziom znieczulenia i poczekaj na brak odruchu bólowego, który wskazuje na odpowiednią głębokość znieczulenia do wykonania zabiegu. Jeśli zaobserwuje się wokalizację lub wycofanie kończyn tylnych, należy wstrzyknąć 0,01−0,03 ml 2,2,2-tribromoetanolu.
    UWAGA: Mysz biorcy dopasowana do guza powinna być tej samej płci co mysz dawcy, która dostarcza przeszczep allogeniczny, aby uniknąć problemów z odrzuceniem.
  2. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Ogol lewy bok myszy golarką elektryczną. Nałóż krem do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy.
    UWAGA: Unikaj ścierania skóry, co może zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia i infekcji.
  3. Umieść mysz w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Umieść go w pozycji leżącej na desce sekcyjnej pokrytej czystym papierem absorpcyjnym, z pionową osią myszy równoległą do i jej głową po prawej stronie eksperymentatora.
    UWAGA: Następujące procedury na tym etapie należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać ścisłą aseptykę.
  4. Natrzyj skórę ogolonego obszaru bawełną nasączoną powidonem-jodem.
    UWAGA: Do sterylizacji używaj jodu powidonu zamiast 75% etanolu, aby zapobiec utracie ciepła ciała.
  5. Podnieś skórę w środkowym punkcie między stawami biodrowymi myszy za pomocą pęsety chirurgicznej. Użyj nożyczek, aby wykonać pionowe wycięcie o długości 5 mm. Rozciągnij cięcie rostralnie wzdłuż grzbietowej linii środkowej do ~10-15 mm.
  6. Wykonaj ostre rozwarstwienie, wkładając zamknięte końcówki nożyczek do nacięcia, a następnie otwórz, aby oddzielić otrzewną lewego boku od skóry i tkanek miękkich.
    UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanki podskórnej i otrzewnej, unieś skórę w środku nacięcia, a następnie włóż zamknięte nożyczki jak najbliżej skóry.
  7. Zrób kieszeń skórną na lewym skrzydle, wykonując kilka razy ostrą sekcję. Umieść kapsułkowaną, nienaruszoną masę guza pochodzącą od dawcy w kapsułce.
    UWAGA: Myszy w grupie kontrolnej operowanej pozorowo otrzymują tę samą operację chirurgiczną bez przeszczepu guza pochodzącego od dawcy.
  8. Zamknij nacięcie za pomocą przerwanego szwu (patrz Lista materiałów). Umieść 2-3 szwy na każde nacięcie. Zdezynfekuj skórę wokół nacięcia bawełną nasączoną jodopowidonem.
    UWAGA: Między dwoma kolejnymi ściegami powinno być 5 mm i 3 mm odległości od nacięcia.
  9. Umieść mysz w pozycji bocznej w czystej i ciepłej klatce. Monitoruj go w sposób ciągły, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać leżący mostek.
  10. Buprenorfinę należy podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg masy ciała co 8 godzin trzy razy po zabiegu w celu złagodzenia bólu. Monitoruj jedzenie, picie, poruszanie się myszy i operowany obszar. Biorca przeszczepu powinien zostać odesłany do towarzystwa innych zwierząt dopiero po jego całkowitym wyzdrowieniu.
    UWAGA: Mysz zazwyczaj wraca do zdrowia po urazie związanym z operacją w ciągu 3 dni. Jeśli mysz nie wróciła do normalnego karmienia i mobilności oraz wykazuje jakiekolwiek objawy infekcji, skonsultuj się z weterynarzem w celu interwencji lub poddaj ją eutanazji.
  11. Złożyć zwierzęta w ofierze (poddać je eutanazji jak w kroku 4.3.2) myszy we wskazanych punktach czasowych i odzyskać komórki będące przedmiotem zainteresowania do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat tego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Osiem dni po inokulacji guza, komórki CD45.1+ oraz CD45.1+CD45.2+ OT-I wstrzyknięto myszom C57BL/6 z guzami B16F10-OVA. Guz wycięto chirurgicznie z myszy z implantowanymi komórkami CD45.1+ OT-I (dawca) w 8. dniu po transferze i przeszczepiono myszom z implantowanymi komórkami CD45.1+CD45.2+ OT-I (biorca) w okolice grzbietowe boku, po tej samej stronie co pierwotny guz. Dzięki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odporność zależna od limfocytów T odgrywa kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych przeciwko nowotworom, przy czym CTL odgrywają wiodącą rolę w eliminowaniu komórek rakowych. Jednak pochodzenie CTL specyficznych dla antygenu nowotworowego w TME nie zostało wyjaśnione30. Zastosowanie tego protokołu przeszczepu guza dostarczyło ważnej wskazówki, że limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu nowotworowego mogą nie utrzymywać się przez długi czas, pomimo istnienia komórek T CD8 +...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (nr 31825011 do LY) oraz National Natural Science Foundation of China (nr 31900643 do QH, nr 31900656 do ZW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m filtrMilliporeSLGPR33RB
1 ml strzykawka tuberkulinowaKDLBB000925
1,5 ml probówka wirówkowaKIRGENKG2211
100 U strzykawkaBD Biosciences320310
15 ml rurka stożkowaBEAVER43008
2,2,2-tribromoetanol (Avertin)SigmaT48402-25G
2-metylo-2-butanolSigma240486-100ML
70 μ m nylonowe sitko komórkoweBD Falcon352350
APC anty-mysie CD45.1BioLegend110714Klon: A20
B16F10-OVA linia komórkowabluefbioBFN607200447
BSA-V (albumina surowicy bydlęcej)Biossbs-0292P
BV421 Mysz Anti-Mouse CD45.2BD Horizon562895Clone:
naczyniedo hodowli komórkowych 104Wirówka BEAVER43701/43702/43703
Eppendorf5810R-A462/5424R
cyklofosfamidSigmaC0768-25G
Zmodyfikowana mysz Dulbecco's Eagle MediumGibcoC11995500BT
EasySep CD8+ Zestaw do izolacji komórek TStemcell Technologies19853
EDTARurki FACS SigmaEDS-500g
BD Falcon352052
płodowa surowica bydlęcaGibco10270-106
cytometr przepływowyBDFACSCanto II
hemocytometrPorLab ScientificHM330
izofluranRWD nauki przyrodniczeR510-22-16
KHCO3 Sangon BiotechA501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nmLife TechnologiesL10199
nośnik igiełRWD Life ScienceF31034-14
NH4ClSangon BiotechA501569-0500
paraformaldehydBeyotimeP0099-500ml
PE przeciw myszom TCR Vα 2BioLegend127808klon: B20.1
Paciorkowiec glutaminy (100x)Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD8aBioLegend100734Klon: 53-6,7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
azydek soduSigmaS2002
kleszcze chirurgiczneRWD Life ScienceF12005-10
nożyczki chirurgiczneRWD Life ScienceS12003-09
nić do szwówRWD Life ScienceF34004-30
trypsyna-EDTASigmaT4049-100ml
insulinowa

Bibliografia

  1. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
  2. Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).
  3. McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer. Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).
  4. Davis, M. M., Brodin, P. Rebooting human immunology. Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Littman, D. R. Releasing the brakes on cancer immunotherapy. Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).
  7. Verma, V., et al. PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance. Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).
  8. Hashimoto, M., et al. CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions. Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).
  9. Dammeijer, F., et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).
  10. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867(2020).
  11. Philip, M., Schietinger, A. Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections. Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).
  12. Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).
  13. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579, 274-278 (2020).
  14. Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).
  15. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  16. Myers, L. M., et al. A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression. Nature Communications. 10 (1), 794(2019).
  17. Jansen, C. S., et al. An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells. Nature. 576, 465-470 (2019).
  18. Jadhav, R. R., et al. Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).
  19. Li, H., et al. Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma. Cell. 176 (4), 775-789 (2018).
  20. Kurtulus, S., et al. Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).
  21. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), 124507(2018).
  22. E, J. F., et al. CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer. Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).
  23. Snell, L. M., et al. CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity. Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).
  25. Wang, Y., et al. The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Frontiers in Immunology. 10, 169(2019).
  26. Krishna, S., et al. Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer. Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).
  27. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).
  28. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  29. Li, Y., et al. Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis. Frontiers in Immunology. 11, 806(2020).
  30. Yu, D., Ye, L. A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells. Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).
  31. Bracci, L., et al. Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration. Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).
  32. Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).
  33. Thorsson, V., et al. The Immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.

Step 6.10 of the Protocol was updated from:

Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

to:

Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

Tagi

Limfocyty T naciekające guzlimfocyty T CD8-dodatniemikrośrodowisko guzaczerniak B16F10-OVAmyszy OT-Iantygenowo swoiste limfocyty Tcytometria przepływowaadoptywny transfer komórekimmunologia nowotworów
Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.