Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Podsumowanie

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Streszczenie

Identyfikacja ligandów specyficznych dla terapeutycznie istotnych receptorów komórkowych jest kluczowa dla wielu zastosowań, w tym projektowania i rozwoju nowych terapii. Receptor białka G-X2 (MRGPRX2) związany z mas jest ważnym receptorem, który reguluje aktywację komórek tucznych, a tym samym kieruje ogólną odpowiedzią immunologiczną. Zidentyfikowano liczne ligandy dla MRGPRX2, które obejmują endogenne peptydy, takie jak PAMP, defensyny, LL-37 i inne fragmenty białek (tj. Zdegradowane albuminy). Dalsza identyfikacja MRGPRX2 specyficznych ligandów wymaga badań przesiewowych dużej liczby peptydów (tj. biblioteki peptydów); Jednak komórki tuczne są trudne i kosztowne w utrzymaniu in vitro, a zatem nie są ekonomiczne w użyciu do badań przesiewowych dużej liczby cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiono metodę projektowania, opracowywania i badania przesiewowego biblioteki małych cząsteczek peptydowych wykorzystujących MRGPRX2 ekspresji komórek HEK. Ta linia komórkowa jest stosunkowo łatwa i niedroga w utrzymaniu i może być wykorzystywana do wysokoprzepustowej analizy in vitro. Do monitorowania aktywacji użyto wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego Fura-2 do oznaczania wewnątrzkomórkowego strumienia wapnia po aktywacji. Do obliczenia stężenia wapnia wykorzystano stosunek intensywności fluorescencji Fura-2 przy długości fali 510 nm do długości fal wzbudzenia 340 i 380 nm. Biblioteka peptydów użyta do weryfikacji tego systemu była oparta na endogennym sekretagogu N-końca 12 proadrenomedulliny (PAMP-12), o którym wiadomo, że wiąże MRGPRX2 z wysoką swoistością i powinowactwem. Kolejne peptydy zostały wygenerowane za pomocą technik skracania aminokwasów i skanowania alaniny zastosowanych do PAMP-12. Opisana tutaj metoda jest prosta i niedroga, a jednocześnie solidna do badań przesiewowych dużej biblioteki związków w celu identyfikacji domen wiążących i innych ważnych parametrów, które odgrywają ważną rolę w aktywacji receptora.

Wprowadzenie

Komórki tuczne są integralną częścią układu odpornościowego i odgrywają kluczową rolę zarówno w wrodzonych, jak i nabytych odpowiedziach immunologicznych. Komórki tuczne są przede wszystkim aktywowane albo przez wiązanie antygenu z kompleksem receptora immunoglobuliny E (IgE) - FcεRI, albo przez niedawno odkryty receptor białka G-X2 (MRGPRX2) związany z mas, ¹. MRGPRX2 aktywacja została powiązana z kilkoma chorobami immunologicznymi i zapalnymi, dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizm wiązania receptora z jego ligandami². W tym celu opracowano bibliotekę małych cząsteczek peptydowych i przebadano je pod kątem receptorów MRGPRX2, które ulegały nadekspresji w komórkach HEK. W badaniu biblioteka peptydów została skonstruowana przy użyciu prostych i wszechstronnych technik skanowania alaniny i obcinania aminokwasów. Skanowanie alaniny polega na zastąpieniu określonych aminokwasów resztą alaniny. Alanina, będąc małą i obojętną, pozbawia peptyd specyficznych właściwości nadawanych przez zastąpioną resztę i kolejno podkreśla znaczenie odpowiednich właściwości fizykochemicznych aminokwasu w oddziaływaniach receptorowych. Wręcz przeciwnie, w przypadku skracania aminokwasów sekwencje peptydowe są zaprojektowane w taki sposób, że brakuje jednej lub więcej reszt aminokwasowych z N-końca, końca C lub obu. Ten zestaw peptydów został wykorzystany do identyfikacji sekwencji aminokwasów kluczowych dla wiązania MRGPRX2.

Doświadczenie z liniami ludzkich komórek tucznych (LAD-2) pokazało, że te komórki są trudne do hodowli i utrzymania in vitro: czas podwojenia wynoszący dwa tygodnie, drogie średnie suplementy i wymagana bezpośrednia uwaga podczas pasażu³. Te cechy sprawiają, że komórki nie nadają się do badań przesiewowych potencjalnych ligandów na dużą skalę. W tym przypadku stabilnie transfekowane komórki HEK eksprymujące receptor MRGPRX2 (HEK-X2) zostały użyte do badania przesiewowego biblioteki peptydów¹. Komórki HEK-293 są szeroko stosowane i badane pod kątem heterologicznej ekspresji receptorów powierzchniowych ze względu na ich wysoką wydajność transfekcji, szybszy wskaźnik podwajania i potrzebę niedrogich suplementów pożywki do hodowli w laboratorium⁴. Protokół transfekcji linii komórkowej HEK-293 został zademonstrowany i jest dobrze znany⁵. Komórki HEK-293 stabilnie eksprymujące receptor MRGPRX2 (pasaż 13-19) były aktywowane peptydami generowanymi przez N-skrócenie, C-skrócenie, N+C-skrócenie i skanowanie alaniny¹. Jako kontrolę użyto komórek HEK typu dzikiego (HEK-WT) (pasaż 16-21). Wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia po aktywacji monitorowano w celu zbadania aktywacji opartej na MRGPRX2.

Aktywacja komórek przez MRGPRX2 następuje cytozolowa mobilizacja wapnia. To regulowane wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia w komórkach tucznych jest regulowane przez wejście wapnia obsługiwane przez magazyn (SOCE), koordynowane przez cząsteczkę interakcji zrębowej 1 (STIM1); i ma kluczowe znaczenie dla kaskady odpowiedzi immunologicznej^6,7. Do wykrywania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia zastosowano różne metody, w tym patch-clampy i barwniki fluorescencyjne⁸. Spośród wszystkich dostępnych technik, powszechnie stosowane są fluorometryczne barwniki wapniowe w połączeniu z różnymi technikami wykrywania⁹. Dwa rodzaje barwników fluorometrycznych, które zyskały zainteresowanie, to mianowicie barwniki o pojedynczej długości fali, takie jak Fluo-4, i barwniki ratiometryczne o podwójnej długości fali, takie jak Indo-1 i Fura-2. Zaletą barwników ratiometrycznych o podwójnej długości fali w porównaniu z barwnikami o pojedynczej długości fali jest to, że barwniki ratiometryczne korygują błędy eksperymentalne, takie jak ładowanie barwnika, wybielanie zdjęć i ustawianie ostrości^10,11.

Ester acetoksymetylowy fura-2 (Fura-2 AM) jest przenikającym komórki, zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, którego wzbudzenie zmienia się na niższą długość fali po związaniu wapnia. Eksperymentalnie Fura-2 jest wzbudzana przy 340 i 380 nm, podczas gdy emisja jest rejestrowana przy 510 nm. Po związaniu wapnia intensywność fluorescencji przy 340 nm wzrasta, podczas gdy intensywność 380 nm maleje, jak pokazano na Rysunek 1. Dane są reprezentowane jako stosunek intensywności fluorescencji po wzbudzeniu przy 340 nm (F340) do intensywności po wzbudzeniu przy 380 nm (F380), tj. F340/F380. Stosunek F340/F380 jest proporcjonalny do wewnątrzkomórkowego wapnia, którego wartość można obliczyć za pomocą równania Grynkiewicza¹². Ponieważ sygnał fluorescencyjny uzyskuje się ze wzbudzenia barwnika na dwóch długościach fal (340 nm i 380 nm), stosunek sygnałów fluorescencyjnych koryguje się o czynniki eksperymentalne, takie jak obciążenie barwnikiem, wyciek barwnika, fotowybielanie i gęstość komórek.

Protokół

1. Projektowanie i rozwój biblioteki peptydów

1. Aby zidentyfikować ligandy receptora MRGPRX2 komórek tucznych na podstawie znanego liganda, tj. PAMP-12¹³, wykonaj poniższe czynności.
   1. Generowanie N-skróconej biblioteki peptydów poprzez skrócenie N-końcowych reszt aminokwasowych liganda, kolejno, przez syntezę peptydów w fazie stałej (SPPS).
   2. Wygeneruj bibliotekę peptydów obciętych C, skracając C-końcowe reszty aminokwasowe znanego liganda, kolejno, przez SPPS.
   3. Na podstawie wyników 1.1.1 i 1.1.2 wygeneruj bibliotekę peptydów obciętą N + C za pomocą SPPS, obcinając żądane reszty odpowiednio z końca N i C.
   4. Użyj syntezy peptydów w fazie stałej, aby zsyntetyzować peptydy¹³.
   5. Zmodyfikuj N-koniec do grupy acetylowej (Ac) i C-koniec do grupy amidowej.
   6. Scharakteryzować peptyd pod kątem jego czystości za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz pod względem masy za pomocą spektrofotometru mas.
2. Aby zbadać znaczenie określonych aminokwasów w macierzystej cząsteczce PAMP-12, wykonaj poniższe czynności.
   1. Wygeneruj bibliotekę peptydów skanujących alaninę, zastępując odpowiednie reszty aminokwasowe w cząsteczce peptydu alaniną, pojedynczo za pomocą SPPS. Zmodyfikuj N-koniec do grupy acetylowej (Ac) i C-koniec do grupy amidowej.
   2. Scharakteryzować peptyd pod kątem jego czystości za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz dla masy za pomocą spektrofotometru mas.
      UWAGA: Upewnij się, że zsyntetyzowane peptydy mają wysoką czystość. Scharakteryzować peptydy za pomocą spektroskopii mas i HPLC.

2. Hodowla komórkowa in vitro

1. Hoduj komórki HEK-X2 i HEK-WT, wykonując poniższe czynności.
   1. Przygotować pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM o wysokiej zawartości glukozy 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
   2. Pasaż komórek w kolbach hodowlanych T-75 poddanych działaniu kultur tkankowych (TC) i hodowanie w inkubatorze w temperaturze 37 °C zawierającej 5% CO_{2 ,} aż osiągną 75-80% zlewania się.
   3. Po zlewaniu się w 75% umyj komórki i dodaj 2-3 ml trypsyny przez 2-3 minuty. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 w} celu odłączenia komórek.
   4. Gdy komórki się odłączą, zbierz je w trypszynie. Dodaj 6-9 ml świeżej pożywki.
   5. Odwirować komórki przy 1620 x g przez 3-5 minut.
   6. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant w celu zebrania osadu. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej. Rozcieńczyć komórki zgodnie z pożądanym stężeniem.
      UWAGA: Komórki HEK są szybko rosnącymi komórkami, a zatem optymalizują suplementy pożywki komórkowej. Komórki HEK są komórkami przylegającymi; przepuścić je w kolbach hodowlanych poddanych działaniu TC w celu wsparcia adhezji.
2. Do eksperymentu należy przygotować 96-dołkową płytkę testową.
   1. Dodaj 200 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, o stężeniu 200 000 komórek/ml, aby wysiać 40 000 komórek/studzienkę.
   2. Hoduj komórki przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%_CO2.
      UWAGA: Zoptymalizuj gęstość komórek na studzienkę w oparciu o rozmiar płytki i typ szczepu komórki. Przeprowadź eksperyment w trzech egzemplarzach na czarnej 96-dołkowej płytce poddanej działaniu TC z płaskim przezroczystym dnem.

3. Test wapnia Fura-2 AM

1. Przygotuj barwnik, wykonując poniższe czynności.
   1. Do eksperymentu użyj barwnika Fura-2 AM.
   2. Przygotować bufor HEPES-Tyrode (HTB) zawierający 25 mM buforu HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glukozy, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i świeżo dodane 1,8 mM CaCl₂ w sterylizowanej wodzie w autoklawie.
   3. Dodać 50 μl DMSO do 50 μg fiolki Fura-2 AM, aby przygotować 1 mM roztwór podstawowy barwnika Fura-2 AM. Dodać 1 μl 1 mM barwnika Fura-2 AM na ml świeżej pożywki, aby przygotować pożywkę o stężeniu barwnika 1 μM.
   4. Wyjąć płytkę 96-dołkową z inkubatora i wyrzucić pożywkę. Zastąp pożywkę świeżą pożywką ładującą barwnik. Dodać 200 μl pożywki do barwienia do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 30-40 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
   5. Po 40 minutach inkubacji usunąć pożywkę. Przemyć komórki buforem HTB. Dodaj 100 μl buforu HTB do odczytu fluorescencji. Weź płytkę do odczytu fluorescencji.
      UWAGA: Zoptymalizuj stężenie barwnika w podłożu obciążającym barwnik. Wyciek barwnika i fotowybielanie to możliwe problemy związane z barwnikiem. Dodać CaCl₂ na świeżo do buforu HTB, aby uniknąć wytrącania się.

4. Aktywacja komórek i odczyt fluorescencyjny

UWAGA: Czytnik płytek fluorescencyjnych z automatycznym systemem pipetowania pozwala na automatyczne przenoszenie związków ze źródła związków na płytkę testową bez wyjmowania płytki z czytnika płytek.

1. Podczas inkubacji komórek ustaw czytnik płytek.
   1. Ustaw temperaturę na 37 °C.
   2. W obszarze Ustawienia wybierz opcję Flex.
   3. Ustaw tryb odczytu na Fluorescencja i odczyt od dołu.
   4. W polu Długości fal ustaw liczbę długości fal na 2. Ustaw wzbudzenie na 340 nm i 380 nm. Ustaw emisję na 510 nm.
   5. Pozostaw czułość na wartość Domyślna.
   6. W polu Timing (Czas) ustaw Interwał na 3,9 s (Czas działania) Ustaw Run Time (Czas wykonywania) na 94 s, aby uzyskać 25 odczytów.
   7. Następnie wybierz typ płytki testowej.
   8. Następnie wybierz studnie do odczytania.
   9. W obszarze Transfer związków ustaw opcję Transfery na 1, a Objętość początkową na 100 μL. Ustaw wysokość pipety na 100 μl, objętość na 50 μl, a punkt czasowy na 36 s, aby dodać związek przy 10. odczycie.
   10. Następnie wybierz typ blachy źródłowej złożonej.
   11. Pozostaw Triturate do nieużywania.
   12. Wybierz końcówki w układzie końcówek do pipet.
   13. W przypadku kolumn złożonych i końcówek upewnij się, że związki, które mają być przenoszone, znajdują się w kolumnie 1 płyty złożonej. Ustaw kolumnę Porada na 1, a kolumnę złożoną na 1.
   14. Pozostaw autokalibrację jako WŁĄCZONĄ.
   15. Kliknij przycisk OK.
2. Gdy temperatura osiągnie 37 °C, załaduj płytki do czytnika płytek.
   1. Naciśnij komorę odczytu, aby włożyć płytkę testową do czytnika płytek fluorescencyjnych.
   2. Naciśnij źródło, aby umieścić płytkę złożoną. Przygotować płytkę złożoną, dodając 200 μl odpowiednich peptydów, roztworów jonomycyny i glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA)-Triton X-100.
   3. Naciśnij stojak na napiwki, aby umieścić pudełko na napiwki. Użyj czarnej końcówki, aby uniknąć autofluorescencji końcówki.
   4. Po załadowaniu płyt ponownieview ustawienia oprogramowania i naciśnij Odczyt.

5. Analiza danych

1. Określić stężenie wapnia na podstawie współczynnika fluorescencji za pomocą równania Grynkiewicza -
   
   gdzie, K_d jest stałą dysocjacji Fura-2 AM, R jest stosunkiem emisji po wzbudzeniu przy 340 nm i 380 nm (F340/F380) dla odpowiednich peptydów, R_max jest maksymalnym współczynnikiem fluorescencji obserwowanym przez dodanie 50 μL 30 μM jonomycyny, R_min jest minimalną fluorescencją obserwowaną przez dodanie 50 μL 100 mM EGTA/2,5%Triton X-100, a F380_min i F380_max są bezwzględną intensywnością fluorescencji Fura-2 AM odpowiednio w stanie wolnym od wapnia i związanym.
   UWAGA: Maszyna dozuje płyn z pewną siłą. Nie ustawiaj wysokości dozowania peptydów zbyt blisko dna płytki; Może to spowodować odłączenie komórek. Używaj czarnych końcówek do pipet, aby uniknąć autofluorescencji. Odczytaj maksymalną fluorescencję i minimalną fluorescencję dla każdej płytki dla każdego eksperymentu.

Wyniki

Tabela 1 zawiera sekwencje peptydowe wygenerowane przez końcowe obcinanie aminokwasów i skanowanie alaniny. Jak pokazano w tabeli 1, sekwencja peptydowa RKKWNKWALSR nie ma N-końcowej fenyloalaniny (F) w stosunku do swojego rodzica PAMP-12, a zatem jest reprezentatywnym peptydem w bibliotece N-skróconej. Podobnie, w FRKKWNKWALS, C-końcowa seryna PAMP-12 została usunięta, reprezentując C-skróconą bibliotekę peptydów pochodzącą z PAMP-12. W bibliotece peptydów skróconych N + C aminokwasy są...

Dyskusja

Sygnalizacja wapniowa ma kluczowe znaczenie dla degranulacji komórek tucznych i jest szeroko stosowana w badaniach nad interakcjami receptor-ligand, identyfikacją ligandów i odkrywaniem leków¹⁴. MRGPRX2 to niedawno odkryty receptor komórek tucznych, który, jak stwierdzono, odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach zapalnych, takich jak między innymi świąd, astma i atopowe zapalenie skóry². Ponadto wykazano, że kilka zatwierdzonych leków wywołuje reakcję zapalną poprzez recept...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldrich	5470
Chlorek wapnia	Sigma Aldrich	793939
Corning 96 Well	Sigma Aldrich	CLS3603
polistyrenowa mikropłytka	Sigma Aldrich	CLS3603
DMEM	Thermo Fischer	11995065	Wysoka zawartość glukozy
DMSO	Thermo Fischer	D12345	Sterylny, biologiczny EGTA
	Sigma Aldrich	E3889
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fischer	12483-020
Flexstation 3	Urządzenia molekularne	FV06060
Fura-2 AM	Thermo Fischer	F1221
Glukoza	Sigma Aldrich	D8270
HEPES Bufor	Thermo Fischer	15630-080
Ionomycin	Sigma Aldrich	I9657
L Glutamina	Thermo Fischer	25030-081
Pen Strep	Thermo Fischer	15140122
Peptydy	RS Syntehsis	Custom	≥ 95% czysty; Końcówka N - grupa acetylowa Końcówka C - grupa amidowa Chlorek
potasu	Sigma Aldrich	12636
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S9888
TritonX-100	DOW Chemical	166704