Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62448

⸱

6 listopada 2021

 ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, 2School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Streszczenie

Identyfikacja ligandów specyficznych dla terapeutycznie istotnych receptorów komórkowych jest kluczowa dla wielu zastosowań, w tym projektowania i rozwoju nowych terapii. Receptor białka G-X2 (MRGPRX2) związany z mas jest ważnym receptorem, który reguluje aktywację komórek tucznych, a tym samym kieruje ogólną odpowiedzią immunologiczną. Zidentyfikowano liczne ligandy dla MRGPRX2, które obejmują endogenne peptydy, takie jak PAMP, defensyny, LL-37 i inne fragmenty białek (tj. Zdegradowane albuminy). Dalsza identyfikacja MRGPRX2 specyficznych ligandów wymaga badań przesiewowych dużej liczby peptydów (tj. biblioteki peptydów); Jednak komórki tuczne są trudne i kosztowne w utrzymaniu in vitro, a zatem nie są ekonomiczne w użyciu do badań przesiewowych dużej liczby cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiono metodę projektowania, opracowywania i badania przesiewowego biblioteki małych cząsteczek peptydowych wykorzystujących MRGPRX2 ekspresji komórek HEK. Ta linia komórkowa jest stosunkowo łatwa i niedroga w utrzymaniu i może być wykorzystywana do wysokoprzepustowej analizy in vitro. Do monitorowania aktywacji użyto wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego Fura-2 do oznaczania wewnątrzkomórkowego strumienia wapnia po aktywacji. Do obliczenia stężenia wapnia wykorzystano stosunek intensywności fluorescencji Fura-2 przy długości fali 510 nm do długości fal wzbudzenia 340 i 380 nm. Biblioteka peptydów użyta do weryfikacji tego systemu była oparta na endogennym sekretagogu N-końca 12 proadrenomedulliny (PAMP-12), o którym wiadomo, że wiąże MRGPRX2 z wysoką swoistością i powinowactwem. Kolejne peptydy zostały wygenerowane za pomocą technik skracania aminokwasów i skanowania alaniny zastosowanych do PAMP-12. Opisana tutaj metoda jest prosta i niedroga, a jednocześnie solidna do badań przesiewowych dużej biblioteki związków w celu identyfikacji domen wiążących i innych ważnych parametrów, które odgrywają ważną rolę w aktywacji receptora.

Wprowadzenie

Komórki tuczne są integralną częścią układu odpornościowego i odgrywają kluczową rolę zarówno w wrodzonych, jak i nabytych odpowiedziach immunologicznych. Komórki tuczne są przede wszystkim aktywowane albo przez wiązanie antygenu z kompleksem receptora immunoglobuliny E (IgE) - FcεRI, albo przez niedawno odkryty receptor białka G-X2 (MRGPRX2) związany z mas, 1. MRGPRX2 aktywacja została powiązana z kilkoma chorobami immunologicznymi i zapalnymi, dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizm wiązania receptora z jego ligandami2. W tym celu opracowano bibliotekę małych cząsteczek peptydowych i przebadano je pod kątem receptorów MRGPRX2, które ulegały nadekspresji w komórkach HEK. W badaniu biblioteka peptydów została skonstruowana przy użyciu prostych i wszechstronnych technik skanowania alaniny i obcinania aminokwasów. Skanowanie alaniny polega na zastąpieniu określonych aminokwasów resztą alaniny. Alanina, będąc małą i obojętną, pozbawia peptyd specyficznych właściwości nadawanych przez zastąpioną resztę i kolejno podkreśla znaczenie odpowiednich właściwości fizykochemicznych aminokwasu w oddziaływaniach receptorowych. Wręcz przeciwnie, w przypadku skracania aminokwasów sekwencje peptydowe są zaprojektowane w taki sposób, że brakuje jednej lub więcej reszt aminokwasowych z N-końca, końca C lub obu. Ten zestaw peptydów został wykorzystany do identyfikacji sekwencji aminokwasów kluczowych dla wiązania MRGPRX2.

Doświadczenie z liniami ludzkich komórek tucznych (LAD-2) pokazało, że te komórki są trudne do hodowli i utrzymania in vitro: czas podwojenia wynoszący dwa tygodnie, drogie średnie suplementy i wymagana bezpośrednia uwaga podczas pasażu3. Te cechy sprawiają, że komórki nie nadają się do badań przesiewowych potencjalnych ligandów na dużą skalę. W tym przypadku stabilnie transfekowane komórki HEK eksprymujące receptor MRGPRX2 (HEK-X2) zostały użyte do badania przesiewowego biblioteki peptydów1. Komórki HEK-293 są szeroko stosowane i badane pod kątem heterologicznej ekspresji receptorów powierzchniowych ze względu na ich wysoką wydajność transfekcji, szybszy wskaźnik podwajania i potrzebę niedrogich suplementów pożywki do hodowli w laboratorium4. Protokół transfekcji linii komórkowej HEK-293 został zademonstrowany i jest dobrze znany5. Komórki HEK-293 stabilnie eksprymujące receptor MRGPRX2 (pasaż 13-19) były aktywowane peptydami generowanymi przez N-skrócenie, C-skrócenie, N+C-skrócenie i skanowanie alaniny1. Jako kontrolę użyto komórek HEK typu dzikiego (HEK-WT) (pasaż 16-21). Wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia po aktywacji monitorowano w celu zbadania aktywacji opartej na MRGPRX2.

Aktywacja komórek przez MRGPRX2 następuje cytozolowa mobilizacja wapnia. To regulowane wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia w komórkach tucznych jest regulowane przez wejście wapnia obsługiwane przez magazyn (SOCE), koordynowane przez cząsteczkę interakcji zrębowej 1 (STIM1); i ma kluczowe znaczenie dla kaskady odpowiedzi immunologicznej6,7. Do wykrywania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia zastosowano różne metody, w tym patch-clampy i barwniki fluorescencyjne8. Spośród wszystkich dostępnych technik, powszechnie stosowane są fluorometryczne barwniki wapniowe w połączeniu z różnymi technikami wykrywania9. Dwa rodzaje barwników fluorometrycznych, które zyskały zainteresowanie, to mianowicie barwniki o pojedynczej długości fali, takie jak Fluo-4, i barwniki ratiometryczne o podwójnej długości fali, takie jak Indo-1 i Fura-2. Zaletą barwników ratiometrycznych o podwójnej długości fali w porównaniu z barwnikami o pojedynczej długości fali jest to, że barwniki ratiometryczne korygują błędy eksperymentalne, takie jak ładowanie barwnika, wybielanie zdjęć i ustawianie ostrości10,11.

Ester acetoksymetylowy fura-2 (Fura-2 AM) jest przenikającym komórki, zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, którego wzbudzenie zmienia się na niższą długość fali po związaniu wapnia. Eksperymentalnie Fura-2 jest wzbudzana przy 340 i 380 nm, podczas gdy emisja jest rejestrowana przy 510 nm. Po związaniu wapnia intensywność fluorescencji przy 340 nm wzrasta, podczas gdy intensywność 380 nm maleje, jak pokazano na Rysunek 1. Dane są reprezentowane jako stosunek intensywności fluorescencji po wzbudzeniu przy 340 nm (F340) do intensywności po wzbudzeniu przy 380 nm (F380), tj. F340/F380. Stosunek F340/F380 jest proporcjonalny do wewnątrzkomórkowego wapnia, którego wartość można obliczyć za pomocą równania Grynkiewicza12. Ponieważ sygnał fluorescencyjny uzyskuje się ze wzbudzenia barwnika na dwóch długościach fal (340 nm i 380 nm), stosunek sygnałów fluorescencyjnych koryguje się o czynniki eksperymentalne, takie jak obciążenie barwnikiem, wyciek barwnika, fotowybielanie i gęstość komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i opracowanie biblioteki peptydów

  1. Aby zidentyfikować ligandy receptora MRGPRX2 komórek tucznych na podstawie znanego liganda, tj. PAMP-1213, należy wykonać poniższe kroki.
    1. Przygotować bibliotekę peptydów z uciętym końcem N poprzez sukcesywne usuwanie aminokwasowych reszt końca N-końcowego liganda za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS).
    2. Przygotować bibliotekę peptydów z uciętym końcem C poprzez sukcesywne usuwanie aminokwasowych reszt końca C-końcowego znanego liganda za pomocą SPPS.
    3. Na podstawie wyników z kroków 1.1.1 i 1.1.2, przygotować bibliotekę peptydów z uciętymi końcami N+C, wykorzystując SPPS do usunięcia odpowiednich reszt odpowiednio z końca N i C.
    4. Zastosować syntezę peptydów w fazie stałej w celu syntezy peptydów13.
    5. Zmodyfikować koniec N poprzez dodanie grupy acetylowej (Ac), a koniec C poprzez dodanie grupy amidowej.
    6. Określić czystość peptydu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz jego masę za pomocą spektrometru masowego.
  2. Aby zbadać znaczenie konkretnych aminokwasów w cząsteczce macierzystej PAMP-12, należy wykonać poniższe kroki.
    1. Przygotować bibliotekę peptydów do skanowania alaniną poprzez zastępowanie poszczególnych reszt aminokwasowych w cząsteczce peptydu alaniną, pojedynczo, przy użyciu SPPS. Zmodyfikować koniec N poprzez dodanie grupy acetylowej (Ac), a koniec C poprzez dodanie grupy amidowej.
    2. Określić czystość peptydu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz jego masę za pomocą spektrometru masowego.
      UWAGA: Należy upewnić się, że zsyntetyzowane peptydy charakteryzują się wysoką czystością. Scharakteryzować peptydy za pomocą spektrometrii mas i HPLC.

2.  Hodowla komórkowa in vitro

  1. Hoduj komórki HEK-X2 i HEK-WT zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Przygotuj pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM z wysoką zawartością glukozy o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny.
    2. Przesiej komórki do kolbek hodowlanych T-75 traktowanych do hodowli tkanek (TC) i hoduj w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aż osiągną 75-80% konfluencji.
    3. Po osiągnięciu 75% konfluencji przemyj komórki i dodaj 2-3 mL trypsyny na 2-3 min. Inkubuj w inkubatorze w 37 °C, 5% CO2 , aby odlepić komórki.
    4. Po odlepieniu komórek zbierz je wraz z trypsyną. Dodaj 6-9 mL świeżej pożywki.
    5. Odwiruj komórki przy 1620 x g przez 3-5 min.
    6. Po wirowaniu odlej nadsącz, aby otrzymać osad. Resuspenduj komórki w świeżej pożywce hodowlanej. Rozcieńcz komórki do pożądanego stężenia.
      UWAGA: Komórki HEK rosną szybko, dlatego należy zoptymalizować dodatki do pożywki. Komórki HEK są komórkami adherentnymi; przesiewaj je do kolbek traktowanych TC, aby wspomóc adhezję.
  2. Przygotuj 96-dołkową płytkę analityczną do eksperymentu.
    1. Dodaj 200 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 200 000 komórek/mL do każdego dołka, aby zasiać 40 000 komórek/dołek.
    2. Hoduj komórki przez 24 h w inkubatorze w 37 °C, 5% CO2 .
      UWAGA: Zoptymalizuj gęstość komórek na dołek w zależności od rozmiaru płytki i szczepu komórkowego. Przeprowadź eksperyment w trzech powtórzeniach w czarnej, traktowanej TC płytce 96-dołkowej z płaskim, przezroczystym dnem.

3. Analiza poziomu wapnia z użyciem Fura-2 AM

  1. Przygotuj barwnik, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Do przeprowadzenia eksperymentu należy użyć barwnika Fura-2 AM.
    2. Przygotować bufor HEPES-Tyrode'a (HTB) zawierający 25 mM buforu HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glukozy, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz świeżo dodane 1,8 mM CaCl22 woda wysterylizowana w autoklawie.
    3. Dodaj 50 µL DMSO w 50 µg fiolka Fura-2 AM do przygotowania 1 mM roztworu stokowego barwnika Fura-2 AM. Dodać 1 µL barwnika Fura-2 AM w stężeniu 1 mM na 1 ml świeżej pożywki, aby przygotować pożywkę do ładowania barwnika o stężeniu 1 µM stężenie barwnika.
    4. Wyjmij płytkę 96-dołkową z inkubatora i odlej pożywkę. Zastąp pożywkę świeżą pożywką do ładowania barwnika. Dodaj 200 µL podłoża do ładowania barwnika w każdej studzience. Inkubować komórki przez 30-40 min w 37 °C, 5% CO22 inkubator.
    5. Po 40 minutach inkubacji usunąć medium. Przemyć komórki buforem HTB. Dodać 100 µL buforu HTB do pomiaru fluorescencji. Przenieś płytkę do pomiaru fluorescencji.
      UWAGA: Należy zoptymalizować stężenie barwnika w medium do nakładania barwnika. Potencjalnymi problemami związanymi z barwnikiem mogą być wycieki barwnika oraz fotoblaknięcie. Dodać CaCl22 bezpośrednio do buforu HTB, aby uniknąć wytrącenia.

4. Aktywacja komórek i odczyt fluorescencyjny

UWAGA: Czytnik płytek fluorescencyjnych z automatycznym systemem pipetującym umożliwia automatyczny transfer związków ze źródła związków na płytkę testową bez konieczności wyjmowania płytki z czytnika.

  1. Podczas inkubacji komórek należy skonfigurować czytnik płytek.
    1. Ustaw temperaturę na 37 °C.
    2. W sekcji Ustawienia wybierz Flex.
    3. Ustaw tryb odczytu na fluorescencję i odczyt od dołu.
    4. W sekcji Długości fal ustaw liczbę długości fal na 2. Ustaw pobudzenie na 340 nm i 380 nm. Ustaw emisję na 510 nm.
    5. Pozostaw czułość w ustawieniu domyślnym.
    6. W sekcji Czas ustaw interwał na 3,9 s. Ustaw czas pomiaru na 94 s, aby uzyskać 25 odczytów.
    7. Następnie wybierz typ płytki testowej.
    8. Następnie wybierz do odczytu studzienki.
    9. W sekcji Transfer związku ustaw liczba transferów na 1 oraz objętość początkową na 100 µL. Ustaw wysokość pipety na 100 µL, objętość na 50 µL i punkt czasowy na 36 s, aby dodać związek podczas 10. odczytu.
    10. Następnie wybierz typ płytki źródła związku.
    11. Pozostaw opcję mieszanie (triturate) jako nieużywana.
    12. Wybierz końcówki w układzie końcówek pipety.
    13. W przypadku kolumn związków i końcówek upewnij się, że związki do przeniesienia znajdują się w kolumnie 1 płytki ze związkami. Ustaw kolumnę końcówki na 1 i kolumnę związku na 1.
    14. Pozostaw autokalibrację w ustawieniu WŁ.
    15. Kliknij OK.
  2. Po osiągnięciu temperatury 37 °C umieść płytki w czytniku płytek.
    1. Naciśnij komorę odczytu, aby włożyć płytkę testową do fluorescencyjnego czytnika płytek.
    2. Naciśnij źródło, aby włożyć płytkę ze związkami. Przygotuj płytkę ze związkami, dodając po 200 µL odpowiednich peptydów, jonomycyny oraz roztworu etylenoglikolu-bis(β-aminoetylu eteru)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA)-Tritonu X-100.
    3. Naciśnij stojak na końcówki, aby włożyć pudełko z końcówkami. Użyj czarnych końcówek, aby uniknąć autofluorescencji.
    4. Po załadowaniu płytek sprawdź ustawienia oprogramowania i naciśnij Odczytaj.

5. Analiza danych

  1. Wyznacz stężenie wapnia z powodu fluorescencji za pomocą równania Grynkiewicza -
    Równanie stężenia jonów wapnia, wzór analizy fluorometrycznej, reprezentacja badania naukowego.
    gdzie Kd jest stałą dysocjacji Fura-2 AM, R jest stosunkiem emisji po wzbudzeniu przy 340 nm i 380 nm (F340/F380) dla poszczególnych peptydów, Rmax to maksymalny stosunek fluorescencji zaobserwowany po dodaniu 50 µL 30 µM jonomycyny, Rmin to minimalna fluorescencja zaobserwowana po dodaniu 50 µL 100 mM EGTA/2,5% Triton X-100, a F380min i F380max to bezwzględna intensywność fluorescencji Fura-2 AM odpowiednio w stanie wolnym od wapnia i w stanie związanym.
    UWAGA: Urządzenie dozuje ciecz z pewną siłą. Nie ustawiaj wysokości dozowania peptydów zbyt blisko dna płytki, ponieważ może to spowodować oderwanie komórek. Używaj czarnych końcówek do pipet, aby uniknąć autofluorescencji. Odczytuj maksymalną i minimalną fluorescencję dla każdej płytki w każdym eksperymencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tabela 1 zawiera sekwencje peptydów otrzymane poprzez trunkację aminokwasów terminalnych oraz skanowanie alaniną. Jak pokazano w Tabeli 1, sekwencja peptydowa RKKWNKWALSR nie posiada fenyloalaniny (F) na końcu N-terminalnym w stosunku do macierzystego PAMP-12, i tym samym jest reprezentatywnym peptydem w bibliotece N-trunkowanych. Podobnie, w FRKKWNKWALS usunięto serynę C-terminalną PAMP-12, co reprezentuje bibliotekę peptydów C-trunkowanych pochodnych od PAMP-12. W bibliotece peptydów N...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sygnalizacja wapniowa ma kluczowe znaczenie dla degranulacji komórek tucznych i jest szeroko stosowana w badaniach nad interakcjami receptor-ligand, identyfikacją ligandów i odkrywaniem leków14. MRGPRX2 to niedawno odkryty receptor komórek tucznych, który, jak stwierdzono, odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach zapalnych, takich jak między innymi świąd, astma i atopowe zapalenie skóry2. Ponadto wykazano, że kilka zatwierdzonych leków wywołuje reakcję zapalną poprzez recept...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

SR i LDU pragną podziękować Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC i grantowi NSERC-Discovery za ten projekt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Surowica bydlęca AlbuminaSigma Aldrich5470
Chlorek wapniaSigma Aldrich793939
Corning 96 WellSigma AldrichCLS3603
polistyrenowa mikropłytkaSigma AldrichCLS3603
DMEMThermo Fischer11995065Wysoka zawartość glukozy
DMSOThermo FischerD12345Sterylny, biologiczny EGTA
Sigma AldrichE3889
Surowica bydlęca płoduThermo Fischer12483-020
Flexstation 3Urządzenia molekularneFV06060
Fura-2 AMThermo FischerF1221
GlukozaSigma AldrichD8270
HEPES BuforThermo Fischer15630-080
IonomycinSigma AldrichI9657
L GlutaminaThermo Fischer25030-081
Pen StrepThermo Fischer15140122
PeptydyRS SyntehsisCustom≥ 95% czysty; Końcówka
N - grupa acetylowa
Końcówka C - grupa amidowa Chlorek
potasuSigma Aldrich12636
Chlorek soduSigma AldrichS9888
TritonX-100DOW Chemical166704

Bibliografia

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja MRGPRX2przesiewanie biblioteki peptyd waktywacja kom rek tucznychskanowanie alaninpomiar przep ywu jon w wapniabarwnik Fura 2synteza peptyd w na fazie sta ejfluorescencyjny czytnik p ytektrunkacja aminokwasowa
Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.