$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie eksperymenty z użyciem hPSC zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały przeprowadzone w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej. Wszystkie odczynniki są przeznaczone do hodowli komórkowych, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie kultury inkubuje się w temperaturze 37 °C, 5% atmosferyCO2 . Na wszystkich etapach testu można pobrać ciała zarodkowe lub organoidy nerkowe i utrwalić je lub przygotować do analizy. Linie hPSC użyte do wygenerowania tych danych zostały w pełni scharakteryzowane i opublikowane18.
1. Przygotowanie płytek hodowlanych
UWAGA: Około 1 godziny przed rozszczepieniem hPSC, pokryj 2 x 100 mm płytki hodowli tkankowej ekstraktem z macierzy błony podstawnej (BME) kwalifikowanym do komórek macierzystych. Płytki można wstępnie pokryć, uszczelnić folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C zgodnie z zaleceniami producenta.
- Przygotować 2 płytki o średnicy 100 mm poddane działaniu kultur tkankowych (1 do testu organoidów nerkowych, 1 do utrzymania linii komórkowej) oraz stożkową probówkę o pojemności 15 ml w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
- Porcję 8 ml zimnego, pozbawionego surowicy Zmodyfikowanego Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ~4 ml do każdej z płytek o średnicy 100 mm, co wystarczy, aby pokryć spód każdej płytki pożywką.
- Wyjąć z zamrażarki 100 μl porcji BME (-20 °C). Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml weź ~1 ml zimnego DMEM z probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Powoli rozmrażaj podwielokrotność BME, delikatnie pipetując w górę i w dół zimnym DMEM, unikając tworzenia pęcherzyków.
UWAGA: Nie pozwól, aby podwielokrotność BME znajdowała się w temperaturze pokojowej. Zużyć natychmiast.
- Przenieś rozmrożony DMEM/BME z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z pozostałym DMEM. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie wymieszać rozcieńczony BME, pipetując w górę i w dół co najmniej 8 razy, aby równomiernie rozprowadzić BME, unikając tworzenia pęcherzyków.
- Przenieść 4 ml rozcieńczonego BME do każdej płytki z DMEM i delikatnie zakręcić płytką, aby BME zostało równomiernie rozprowadzone. Inkubować powlekaną płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 30 minut w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Użyj 50 μL BME na płytkę 100 mm. Stosowanie innych pożywek hodowlanych hPSC i linii komórkowych może wymagać różnych stężeń BME.
2. Przekazywanie hPSC
UWAGA: Dla rutynowej hodowli hPSC, linie komórkowe pasażują przy 70-80% konfluencji.
- Odessać pożywkę hodowlaną z płytki hPSC, która ma być pasażowana. Dodaj ~ 8 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco do płytki hPSC i delikatnie zamieszaj, aby umyć komórki.
- Odessać DBPS i dodać 2 ml delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek (GCDR) do płytki o średnicy 100 mm, kropla po kropli na wierzchu, aby pokryć komórki.
UWAGA: Można również stosować inne odczynniki dysocjacyjne. Dostosuj odpowiednio.
- Inkubuj w temperaturze pokojowej przez ~ 6-8 minut, aż kolonie się rozpadną, a komórki zaczną załamywać się pod wpływem kontrastu fazowego ( Rysunek 2A).
UWAGA: Czas może się różnić w zależności od linii komórkowych. Dostosuj odpowiednio.
- Podczas inkubacji przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml pożywki hPSC (8 ml na płytkę 100 mm) i dodać inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCKi) do końcowego stężenia 5 μM.
- Odessać DMEM z płytek pokrytych BME i dodać 8 ml pożywki hPSC plus ROCKi do każdej płytki.
- Gdy komórki są gotowe (jak opisano w punkcie 2.3, Rysunek 2A), odessać GCDR i przechylić płytkę ~45° w kierunku eksperymentatora i zeskrobać komórki za pomocą podnośnika komórkowego.
UWAGA: Jeśli komórki się odczepiają, pomiń zasysanie GCDR i kontynuuj.
- Obróć płytkę o ~90° i ponownie zeskrob, aby podnieść pozostałe komórki. Utrzymuj płytkę w temperaturze ~45° i przemyj komórki 3 ml pożywki hPSC za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
- Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić duże grudki (nie więcej niż 2-3 razy) i wysiewaj komórki w proporcjach odpowiednich dla interesującej nas linii komórkowej na przygotowanych płytkach. Umieść płytkę z komórkami w inkubatorze i delikatnie przesuwaj płytkę ruchami ósemkowymi, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
UWAGA: W tym eksperymencie linie hPSC zostały podzielone w stosunku 1:5, może się to różnić w przypadku innych linii komórkowych i warunków. Pozostaw talerz w spokoju na noc.
- Po ~ 24 h sprawdź komórki pod kątem przyczepienia. Poszukaj przyczepionych małych pojedynczych kolonii. Odessać zużytą pożywkę i uzupełnić 8 ml świeżej pożywki hPSC (bez dodatku ROCKi).
- Kontynuuj obserwację i karmienie codziennie, aż komórki osiągną ~60% zbieżności, aby rozpocząć test organoidów nerkowych (zwykle osiągany od 48 do 72 godzin po pasażowaniu). Idealnie byłoby, gdyby kolonie były dyskretne i nie łączyły się (Rysunek 2B).
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby ograniczyć komórki do nie więcej niż 80% zbieżności, aby utrzymać ich stan pluripotencji. Zlewające się ze sobą kultury, nieostrożne obchodzenie się z nimi lub wyższe pasaże mogą prowadzić do niepożądanego spontanicznego różnicowania lub niskiej efektywności tworzenia organoidów nerkowych.
3. Dzień 0 - Konfiguracja testu na organoidy nerkowe
- Przed rozpoczęciem należy przygotować zarówno pożywkę E5-ILP, jak i pożywkę etapu II zgodnie z recepturami (tabela 1 i tabela 2).
UWAGA: Nośnik można przechowywać do 14 dni w temperaturze 4 °C.
- Dla jednego testu organoidowego nerki (jedna płytka hodowlana 100 mm jest potrzebna na jedną płytkę 6-dołkową), przygotuj kompletną pożywkę E5-ILP w stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 18 ml E5-ILP uzupełnionych 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-merkaptoetanolu (32,7 μL).
- Umieścić 2 ml kompletnej pożywki E5-ILP w każdym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu.
- Przemyj hPSC przy ~60% konfluencji (Rysunek 2B) dwukrotnie ~ 8 ml DPBS. Odessać DPBS, a następnie dodać 2 ml dypazy na 100 mm płytkę, kropla po kropli, aby przykryć komórki i inkubować przez 6 minut w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Po 6 minutach krawędzie kolonii zaczną się zwijać (Rysunek 2C, czerwone strzałki), podczas gdy reszta kolonii pozostanie przyczepiona. Jeśli nie zostanie to uzyskane po 6 minutach, umieść komórki z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 30 sekund. Inne nośniki i matryce hPSC mogą nie być zgodne z tym timingiem. Powłoka BME na bazie laminy nie jest kompatybilna z dypasą. Jeżeli BME na bazie lamininy jest standardową matrycą hPSC, należy pokryć jedną z płytek w sekcji 1 BME opisanym w tej metodzie, który ma być użyty do testu organoidów nerkowych.
- Umyj komórki 3x ~10 ml DPBS. Zassać DPBS, a następnie przechylić płytkę o ~45° i zeskrobać ją za pomocą podnośnika komórkowego.
UWAGA: Dispase nie jest dezaktywowany, dlatego należy go dokładnie zmyć. Nie zmniejszaj liczby prań.
- Przepłukać kolonie od góry 6 ml kompletnej pożywki E5-ILP za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić duże kolonie (zwykle wystarczają 2 lub 3 razy).
- Rozprowadź skupiska kolonii równomiernie, dodając 1 ml na dołek do płytki 6-dołkowej. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej (ustawienia: orbitalna = 30, odwrotna = 330°, wibracja = 5° - 2 s), która jest umieszczona w inkubatorze o temperaturze 37 °C (Rysunek 2D).
UWAGA: Funkcja wibracji jest ważna dla odpowiedniego rozprowadzenia organoidów i zapobiegania zbrylaniu.
4. Dzień 2 - Karmienie przez połowę średniej zmiany
UWAGA: W ciągu 48 godzin klastry kolonii utworzą ciała embrionalne.
- Przygotuj kompletne podłoże: Na jedną płytkę 6-dołkową przygotuj 12 ml pożywki E5-ILP + 8 μM CHIR99021 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
UWAGA: Beta-merkaptoetanol i ROCKi nie są wymagane.
- Pozwól ciału zarodka osiąść na dnie płytki, przechyl płytkę o ~ 45°, a następnie powoli odsysaj pożywkę od góry, pozostaw ~ 1 ml na dołek.
UWAGA: Ciała zarodkowe na tym etapie szybko się zbijają. Nie zostawiaj ich na > 5 minut.
- Dodać 2 ml przygotowanej kompletnej pożywki (sekcja 4.1) do dołka. Umieść płytkę z powrotem na shakerze.
5. Dzień 3 - Transfer ciał embrionalnych na pożywkę Stadium II
- Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml i DMEM (niski poziom glukozy). Pozwól ciału zarodka osiąść na dnie płytki. Przechylić płytkę o ~45° i powoli zasysać pożywkę od góry, pozostawić ~1 ml na studzienkę.
- Ostrożnie zebrać wszystkie ciała zarodków z każdej studzienki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Umyj każdą studzienkę, aby zebrać pozostałe ciała zarodkowe ~ 1 ml DMEM (niski poziom glukozy) i dodaj je do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Pozostaw ciała zarodkowe, aby osiadły na dnie probówki, ~5 min. Czekając, dodaj 2 ml pożywki etapu II do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Wyodrębnij duże ciała embrionoidalne (>300 μm) za pomocą sitka komórkowego o średnicy 200 μm (Rysunek 2E).
- Użyj nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umieść na niej sitko o pojemności 200 μm. Ostrożnie odpipetować wszystkie ciała zarodków za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml nad sitkiem do komórek.
- Przepłucz sitko komórkowe dodatkowym ~5 ml DMEM (niski poziom glukozy), aby zebrać wszelkie ciała embrionalne, które utknęły w sitku komórkowym. Pozwól ciału zarodka osiąść na dnie stożkowej rurki.
- Gdy ciała zarodkowe zostaną osadzone, odessać supernatant i przemyć ~10 ml DMEM (niski poziom glukozy).
- Odessać DMEM i ponownie zawiesić ciała zarodków w 6 ml pożywki w stadium II.
- Przenieś ciała zarodkowe z powrotem do 6-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie, rozprowadzając je równomiernie między 6 dołkami.
- Wprowadzaj zmiany w połowie podłoża zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.3 co drugi dzień.
UWAGA: Począwszy od 3 dnia, ciała embrionów będą miały "złoty" i gładki, kulisty wygląd (Ryc. 2F). Od ~ dnia 6 tworzenie się kanalików w poszczególnych ciałach embrionalnych stanie się widoczne, przy czym rosnąca liczba w ciągu następnych dni osiągnie optymalną liczbę i wzrost do 14 dnia (Rysunek 2G,H). W celu wyeliminowania sporadycznego tworzenia się zlepialni, po wzrokowej obserwacji organoidów nerkowych lub bardzo małych ciał zarodkowych bez kanalików, należy przesiać organoidy o wielkości <200 i dużych >500 μm za pomocą siatek do komórek o średnicy 500 i 200 μm, jak opisano w krokach 5.4.1 i 5.4.2.
6. Przeniesienie do kolby obrotowej i karmienie
UWAGA: Kolba obrotowa może być używana w dowolnym momencie od 3 dnia do eksperymentów, które wymagają dużej liczby organoidów. Rutynowy transfer organoidów odbywa się w naszym laboratorium między 6 a 8 dniem. Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi rozwiązaniami, jeśli sprzęt nie jest dostępny.
- Przenieść ciała zarodków do kolby wirowej o pojemności 125 ml z 45 ml pożywki II stopnia. Ustaw prędkość mieszadła magnetycznego na 120 obr./min i umieść w inkubatorze ( Rysunek 2I).
- Aby nakarmić ciała zarodkowe lub organoidy nerkowe, pozwól organoidom nerkowym na chwilę osiąść na dnie kolby przędzarki. Podnieść pokrywkę z jednego bocznego ramienia kolby i umieścić pipetę zasysającą w środku, tak aby końcówka dotykała przeciwległej ścianki wewnętrznej.
- Powoli pochylić pipetę zasysającą w dół i zassać około połowy pożywki. Uzupełnić 20 ml świeżej pożywki etapu II, pipetując ją przez ten sam otwór.
7. Ustawianie 6-dołkowej płytki mieszającej magnetycznej (6MSP)
UWAGA: Format 6MSP może być używany zamiast kolb obrotowych, jeśli konieczne jest przetestowanie wielu warunków. Stosuj 6MSP do leczenia złożonego lub nefrotoksynami. Pozwala to zaoszczędzić ilość pożywki użytej w drugim etapie przy jednoczesnym zachowaniu dostępności składników odżywczych poprzez dyfuzję.
- Wyczyść owalne mieszadła magnetyczne w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, myjąc krótko w odpowiednim detergencie do kultur tkankowych (jeśli nigdy nie był używany) lub moczyć przez > 1 godzinę, jeśli był wcześniej używany.
- Krótko umyć 3x w sterylnym DPBS.
- Prać 1x przez 5 min w 70% etanolu, 1x w sterylnym DPBS.
- Spłukać roztworem zapobiegającym zaleganiu chorób i umyć 1x w sterylnym DPBS i aspirat.
- Ostrożnie, używając długich sterylnych kleszczy, umieść jedno mieszadło magnetyczne w każdym dołku 6-dołkowej płytki z ciałami zarodkowymi lub organoidami nerkowymi.
- Umieść płytkę na 6MSP i ustaw prędkość na 120 obr./min (Rysunek 2J). Utrzymać organoidy nerkowe z połową zmiany pożywki, zgodnie z sekcjami 4.2 i 4.3.
UWAGA: Aby mieszadła magnetyczne zatrzasnęły się na swoim miejscu i zaczęły się obracać, może być konieczne najpierw krótkie ustawienie poziomu mocy na 100, a następnie, gdy wszystkie zaczną się obracać, obniżenie poziomu mocy do 25.