Artykuł metodologiczny

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

DOI:

10.3791/62457

⸱

1 kwietnia 2021

 ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Hepatology), Albert Einstein College of Medicine, 3Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Marion Bessin Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątroby jest obecnie trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie, a rak wątrobowokomórkowy (HCC) stanowi 75-90% wszystkich przypadków raka wątroby. Wraz z wprowadzeniem skutecznych metod leczenia i zapobiegania i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu B/C, niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) i bardziej agresywna forma znana jako niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH) szybko stają się głównymi czynnikami ryzyka rozwoju HCC we współczesnych społeczeństwach. Aby lepiej zrozumieć rolę, jaką NASH odgrywa w rozwoju HCC, zaprojektowaliśmy gryberowo związanego z HCC. Przejrzystość optyczna i podatność genetyczna larw danio pręgowanego sprawiają, że są one atrakcyjnym i potężnym modelem do badania mikrośrodowiska wątroby i składu komórek odpornościowych za pomocą nieinwazyjnego obrazowania fluorescencyjnego na żywo. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać model zebry HCC związany z NASH do zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu w mikrośrodowisku wątroby i jej wpływu na skład komórek odpornościowych we wczesnych stadiach choroby. Najpierw karmimy larwy HCC (s704Tg), które wyrażają aktywowaną beta-kateninę specyficzną dla hepatocytów, dietą o 10% wysokiej zawartości cholesterolu przez 8 dni, aby opracować model HCC związany z NASH. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać różne linie transgeniczne do oceny kilku wczesnych cech nowotworu złośliwego w wątrobie za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej, takich jak obszar wątroby, morfologia komórek i jądra (obszar hepatocytów, obszar jądrowy, stosunek jądra do cytoplazmy (stosunek N: C), okrągłość jądrowa, ocena mikrojąder / przepukliny jądrowej) i angiogeneza. Następnie, używając linii transgenicznych ze znakowanymi komórkami odpornościowymi (neutrofile, makrofagi i limfocyty T) pokazujemy, jak analizować skład komórek odpornościowych wątroby u larw HCC związanych z NASH. Opisane techniki są przydatne do oceny mikrośrodowiska wątroby i składu komórek odpornościowych we wczesnych stadiach hepatokarcynogenezy, ale można je również modyfikować w celu badania takich cech w innych modelach chorób wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest agresywnym nowotworem o ograniczonych możliwościach terapeutycznych. Stwierdzono, że ponad 30% wszystkich pacjentów z HCC jest otyłych i ma NASH, agresywną formę NAFLD1,2,3,4. Spożywanie diet bogatych w kalorie drastycznie zwiększa dostępność kwasów tłuszczowych, które powodują miejscowe i ogólnoustrojowe zmiany metaboliczne oraz wywołują stłuszczenie, uszkodzenie hepatocytów, stan zapalny i zwłóknienie - wszystkie kluczowe cechy NASH. Progresja NASH do HCC wiąże się z akumulacją lipidów w wątrobie, co wywołuje stan zapalny i zmienia skład komórek odpornościowych5,6,7. Szczególnie interesujące i ważne jest zrozumienie, w jaki sposób mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych zmieniają się podczas progresji choroby wątroby i jak zmieniają się one pod wpływem pewnych czynników etiologicznych. Aby lepiej określić wpływ, jaki nadmiar cholesterolu ma na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych, opracowaliśmy unikalny model HCC związanego z NASH u danio pręgowanego. Zastosowanie tego modelu pozwoliło nam lepiej zrozumieć wpływ diety i przeżywienia na mikrośrodowisko wątroby i postęp choroby wątroby.

Modele ssaków, takie jak myszy i próbki tkanek ludzkich, były niezbędne do zrozumienia patogenezy stłuszczeniowego zapalenia wątroby i stłuszczenia8. Myszy są preferowanym modelem chorób wątroby i raka, ale brakuje im przejrzystości optycznej na poziomie komórkowym, podczas gdy próbki tkanek ludzkich często nie mają środowiska 3D, które modele zwierzęce są w stanie naśladować. Te przeszkody sprawiły, że danio pręgowany stał się potężnym modelem w społeczności naukowej. Danio pręgowany ma niezwykłe podobieństwa do ludzi, z co najmniej 70% ochroną genów. Utrzymują mikrośrodowisko wątroby, skład komórkowy wątroby, funkcję, sygnalizację i reakcję na urazy9,10. Stosując dietę wysokocholesterolową (HCD) w połączeniu z uznanym transgenicznym modelem HCC danio pręgowanego, opracowaliśmy model HCC związanego z NASH danio pręgowanego.

Tutaj prezentujemy protokół wyjaśniający, jak wygenerować model zebry HCC związany z NASH oraz jak badać mikrośrodowisko wątroby i zajmować się wczesnymi cechami nowotworów in vivo. Korzystając z nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego z fluorescencyjnie znakowaną błoną i jądrem hepatocytów, możemy zająć się wczesnymi cechami nowotworu, analizując morfologię wątroby (obszar, objętość i powierzchnię), morfologię komórek i jądrów (obszar hepatocytów, obszar jądrowy, stosunek N:C, okrągłość jądrowa, punktacja mikrojąder / przepukliny jądrowej) i angiogenezę (gęstość naczyń). Mikrośrodowisko komórek odpornościowych jest również ważną cechą hepatokarcynogenezy11,12,13,14, dlatego pokazujemy również, jak analizować skład komórek odpornościowych wątroby u larw HCC związanych z NASH, przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego z oznaczonymi komórkami odpornościowymi (neutrofile, makrofagi i limfocyty T). Opisane techniki są unikalne dla modelu i niezwykle przydatne do oceny mikrośrodowiska wątroby i składu komórek odpornościowych w progresji choroby wątroby.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania (IACUC) Albert Einstein College of Medicine. Przepisy na i roztwory stosowane w protokole znajdują się w tabeli uzupełniającej 1.

1. Przygotowanie diety wzbogaconej o 10% cholesterol na ostry nadmiar cholesterolu.

  1. Zważ 2 x 4 g Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) w dwóch szklanych zlewkach o pojemności 25 ml - jedna dla diety normalnej (ND), a druga dla diety 10% wysokiej zawartości cholesterolu (HCD).
    UWAGA: Można zastosować dowolną komercyjną suchą karmę dla larw danio pręgowanego.
  2. Odważ 0,4 g cholesterolu w szklanej zlewce o pojemności 10 ml. Przykryj zlewkę folią.
  3. Odmierz 5 ml eteru dietylowego za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 20 G. Następnie dodaj eter dietylowy do zlewki ND i natychmiast wymieszaj go z suchą karmą za pomocą szpatułki.
    UWAGA: Eter dietylowy powoduje podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych. Używać tylko w dygestoriach chemicznych.
  4. Odmierzyć ponownie 5 ml eteru dietylowego za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 20 G i dodać do zlewki o pojemności 10 ml z cholesterolem, natychmiast wymieszać, zasysając strzykawką w górę i w dół.
  5. Szybko dodaj roztwór cholesterolu do zlewki HCD i natychmiast wymieszaj go szpatułką, aż roztwór będzie jednolity.
  6. Pozostaw zlewki w okapie na maksymalnie 24 godziny, aby całkowicie odparować eter dietylowy. Następnego dnia zmiel dietę GPAS na drobne cząstki za pomocą tłuczka i moździerza.
    UWAGA: Mielenie diety jest kluczowym krokiem, larwy nie będą w stanie jeść cząstek większych niż 50 nm.
  7. Przenieś każdą dietę do małej, oznakowanej plastikowej torebki lub do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C.

2. Indukcja NASH z krótkotrwałym karmieniem larw dietą wzbogaconą w cholesterol - warunki statyczne.

  1. Ustaw transgeniczne żyłki do ryb w dniu -1 (Tabela 1). Następnego ranka (dzień 0), po tarle ryb, zbierz jaja w sitku o oczkach.
  2. Używając butelki do mycia z wodą z zarodków (E3), dokładnie opłucz jaja i ostrożnie przenieś jaja na 10 cm szalki Petriego z podłożem E3.
  3. Oczyść płytki z wszelkich zanieczyszczeń, które mogły nagromadzić się w pudełkach hodowlanych, w tym martwych lub niezapłodnionych jaj.
    UWAGA: Płukanie jaj i czyszczenie płytek ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć niekontrolowanego rozwoju mikroorganizmów i wynikających z tego wad rozwoju larw.
  4. Jaja podzielić w gęstości 70/80 na 10 cm szalki Petriego (w 25 ml E3). W dniu 1, pod lunetą sekcyjną wyposażoną w bazę do transilluminacji, sprawdzić i oczyścić martwe zarodki lub zarodki z wadami rozwojowymi.
    UWAGA: Użyj trybu ciemnego pola bazy transiluminacji, aby zidentyfikować zarodki z efektami rozwojowymi i sprawdzić, czy nie ma wzrostu mikroorganizmów na płytkach. Różne zakłady mają różną wydajność mikroorganizmów w swoich systemach. W razie potrzeby zmień podłoże E3 i/lub naczynia, aby uniknąć negatywnych skutków.
  5. W dniu 5 połącz larwy ze wszystkich szalek na 15-centymetrowej szalce Petriego, dodaj E3 bez błękitu metylenowego. Następnie podziel larwy w pudełkach do karmienia w następujący sposób (Tabela 2).
    UWAGA: W warunkach kontrolnych, aby wytworzyć zdrowe larwy bez wywoływania ogólnoustrojowego przewlekłego stanu zapalnego, larwy powinny być karmione około 0,1 mg pokarmu na larwę dziennie. Zauważ, że całkowita ilość pokarmu (Tabela 2) jest równo dzielona na dwa karmienia dziennie.
  6. Przechowywać larwy w inkubatorze w temperaturze 28 °C, w cyklu światła ciemnego (np. 14 godzin światła/10 godzin cyklu ciemnego) i karmić larwy dwa razy dziennie od dnia 5. do dnia 12.
  7. Codziennie odsysaj wszelkie resztki jedzenia, a także 90-95% podłoża za pomocą systemu próżniowego podłączonego do końcówki pipety o pojemności 1 ml. Następnie ostrożnie wlej nowy E3 bez błękitu metylenowego do jednego rogu pojemnika do karmienia, aby uniknąć uszkodzenia larw.
    UWAGA: Codzienne czyszczenie karmników ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia niekontrolowanego rozwoju mikroorganizmów.

3. Pobieranie larw z żerowisk po 13 dniach od zapłodnienia.

  1. W dniu 13 przygotuj naczynia do zbierania zgodnie z liczbą warunków eksperymentalnych, które zostały ustawione. Markerem permanentnym narysuj znak na boku naczyń (pokrywka i spód), aby uniknąć zamiany próbek, na przykład jeden pasek dla normalnej diety (ND) i dwa czarne paski dla HCD.
  2. Wlej tyle E3 bez błękitu metylenowego, aby pokryć dno każdego naczynia. Ostrożnie za pomocą systemu próżniowego zasysaj wodę z pojemników do karmienia, staraj się zasysać wszelkie zanieczyszczenia lub martwe larwy z dna, aby uniknąć przenoszenia tych materiałów do naczyń zbiorczych.
  3. Gdy poziom wody zacznie się obniżać, powoli podnieś karmnik, aby larwy podpłynęły do jednego z rogów, a następnie zasysaj w przeciwnym kierunku.
    UWAGA: Użyj pipety o pojemności 1 ml z naciętymi końcówkami, na różnych wysokościach, aby umożliwić różne średnice podczas zasysania wody. Zmieniaj różne rozmiary, zacznij od większej średnicy i zmieniaj na mniejszą, gdy objętość wody zmniejsza się, a gęstość larw wzrasta.
  4. Gdy będzie tylko około 20-30 ml płynu, ostrożnie zdekantuj larwy na szalkę Petriego przygotowaną w Kroku 1. Umieść oznaczoną taśmę z pudełka do karmienia na pokrywie naczynia.
  5. Powtórz kroki 3.2-3.4 dla wszystkich pojemników do karmienia.

4. Test kontrolny na stłuszczenie wątroby wywołane dietą - barwienie, obrazowanie i punktacja Oil Red O (ORO).

  1. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś 15-20 larw do probówki z okrągłym dnem o pojemności 2 ml i umieść na lodzie na około 15-30 minut. Usuń większość pożywki z probówki.
  2. Dodać 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w celu utrwalenia larw i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Następnego ranka usuń 4% roztwór PFA i umyj larwy trzy razy 2 ml 1x PBS.
  4. Przygotuj płytkę 12-dołkową (Rysunek 2A) na warunek z jedną wkładką do studzienki siatkowej.
  5. Za pomocą szklanej pipety przenieść larwy z probówki o pojemności 2 ml do wkładki uprzednio umieszczonej w studzience, dodać 5 ml 1x PBS. Zachowaj probówki o pojemności 2 ml do przechowywania próbki po barwieniu.
    UWAGA: Larwy są na tym etapie bardzo lepkie, nie używaj plastikowych pipet.
  6. Przenieś wkładkę z larwami do innej studzienki z 5 ml 60% roztworu izopropanolu. Wysiadywać larwy przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  7. W międzyczasie przygotuj 0,3% olej czerwony O w 60% roztworze izopropanolu. Przefiltrować dwukrotnie 0,3% roztwór czerwieni olejowej za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
    UWAGA: Przygotuj 5 ml roztworu na studzienkę, mieszając 3 ml 0,5% czerwonego oleju O w izopropanolu z 2 ml wody destylowanej. 0,3% Oil Red O w 60% roztworze izopropanolu musi być świeżo przygotowany.
  8. Następnie przenieś wkładkę siatkową z larwami do innej studzienki z 5 ml świeżo przygotowanego 0,3% czerwonego oleju O w 60% roztworze izopropanolu. Wysiadywane larwy przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
  9. Po barwieniu ORO spłucz larwy, przenosząc wkładkę do innej studzienki z 60% izopropanolem. Płucz larwy dwukrotnie w 60% izopropanolu przez 30 minut za każdym razem, przenosząc wkładkę sekwencyjnie do studzienek z 60% izopropanolem.
  10. Umyj larwy trzy razy przez 5 minut w 1x PBS-0,1% Tween przenosząc wkładkę sekwencyjnie do studzienek z 1x PBS-0,1% Tween.
  11. Przenieść larwy do probówek o pojemności 2 ml. Usuń PBST, dodaj 1 ml 80% glicerolu i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.
  12. Aby uzyskać lepsze obrazowanie, przenieś larwy do 1x PBS-0,1% Tween i pod lunetą preparacyjną wypreparuj wątrobę, ostrożnie ciągnąc tkanki za pomocą dwóch kleszczy #55.
    UWAGA: W przypadku korzystania z Casper obrazowanie tła można przeprowadzić przy użyciu całych larw.
  13. Za pomocą szklanej pipety ostrożnie przenieś wątroby do dołka z porcelanową płytką punktową z 50% glicerolem. Ustaw wątroby za pomocą małego narzędzia do manipulowania larwami (np. narzędzie do rzęs - Rysunek 2B). Obraz wątroby w stereomikroskopie wyposażonym w kolorową kamerę.
  14. Ocena stłuszczenia wątroby (brak barwienia ORO = brak; jasnoczerwone barwienie ORO = łagodne; czerwono-ciemnoczerwone barwienie ORO = umiarkowane/ciężkie).

5. Nieinwazyjne obrazowanie konfokalne przy użyciu urządzenia do zraniania i uwięzienia danio pręgowanego do wzrostu i obrazowania (zWEDGI).

  1. Przygotuj 10 cm szalkę Petriego z 15-20 ml 1x Tricaine-E3, tylko tyle, aby pokryć dno.
    UWAGA: 1x roztwór roboczy Trikaina-E3 (0,16 mg / ml) można otrzymać przez rozcieńczenie 2 ml 25 x roztworu podstawowego trikainy (4 mg / ml) w 48 ml E3. Stężenie trikainy nie może przekraczać 0,16 mg/ml, ponieważ larwy są niezwykle wrażliwe na znieczulenie na tym etapie rozwoju.
  2. Przenieś 15-20 larw plastikową pipetą Pasteura na szalkę Petriego zawierającą 1x Trikaina-E3 i znieczulaj larwy przez 5 minut.
  3. Przygotuj płytkę 6-dołkową z 2-3 ml E3 bez błękitu metylenowego na dołek.
  4. Na fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym przebadaj znieczulone larwy pod kątem pożądanych markerów fluorescencyjnych (Tabela 1). Przesiane larwy przenieść w minimalnej ilości trikainy w E3 i pozwolić im dojść do siebie na płytce 6-dołkowej, aż nadejdzie czas na obrazowanie.
    UWAGA: Badania przesiewowe podwójnych, potrójnych i poczwórnych larw transgenicznych wymagają czasu, umieszczania larw w E3 i częstej zmiany pożywki z płytki 6-dołkowej, aby zmniejszyć niepotrzebne narażenie na Trikainę. Ponadto larwy na tym etapie rozwoju unoszą się na wodzie, więc użyj narzędzia do rzęs, aby ustawić larwy do badania przesiewowego bez powodowania uszkodzenia tkanek.
  5. Po przesianiu przygotuj 10 cm szalkę Petriego z 25 ml 1x Tricaine-E3. Przenieś 15-20 larw plastikową pipetą Pasteura na szalkę Petriego zawierającą 1x Trikaina-E3 i znieczulaj larwy przez 5 minut.
  6. W międzyczasie, pod mikroskopem stereoskopowym, dodaj 1x Tricaine-E3 do komór urządzenia do ranienia i uwięzienia (np. zWEDGI)15,16. Usunąć pęcherzyki powietrza z komór i tunelu ograniczającego za pomocą mikropipety P200. Usuń cały nadmiar 1x Tricaine-E3, pozostawiając tylko tyle objętości, aby wypełnić komory.
  7. Przenieś znieczuloną larwę do komory załadowczej zWEDGI i umieść ją za pomocą narzędzia do rzęs pod mikroskopem stereoskopowym. Delikatnie postukaj w głowę larwy i popchnij ją tak, aby ogon wszedł do tunelu ograniczającego. Ponadto za pomocą mikropipety usuń 1x Tricaine-E3 z komory zranienia, aby pomóc larwie dostać się do tunelu. Upewnij się, że larwa jest odpowiednio ustawiona do obrazowania lewego płata - Mikroskop odwrócony: lewa strona skierowana w dół; Mikroskop pionowy: lewa strona skierowana do góry.
    UWAGA: Jeśli zWEDGI nie jest dostępny, ryby można zamontować i umieścić w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w 1x Tricaine-E3, jednak zanurzenie w agarozie może być użyte tylko do szybkiego obrazowania (do 15 min).
  8. W celu analizy morfologii hepatocytów i jądra należy zobrazować wątrobę za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu 40-krotnego obiektywu pneumatycznego i stosów z o przekroju optycznym 2 μm. W przypadku morfologii wątroby, angiogenezy i rekrutacji komórek odpornościowych obrazy wątroby przy użyciu 20-krotnego obiektywu powietrznego i stosów z o przekrojach optycznych 5 μm. W przypadku larw z dużymi wątrobami należy wykonać obrazy 2 x 2 kafelki, aby zapewnić obrazowanie całej wątroby i jej otoczenia o wielkości 75 μm.
  9. Po obrazowaniu użyj plastikowej pipety Pasteura z 1x Tricaine-E3, aby wyciągnąć larwy z tunelu ograniczającego i przenieść na szalkę Petriego z E3 bez błękitu metylenowego.

6. Analiza zmian morfologicznych wątroby.

UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane dla ilościowego oznaczania powierzchni wątroby i objętości:

  1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Dodaj folder zawierający pliki obrazów do analizy do Areny, wybierając ikonę folderu Obserwuj. Następnie, klikając prawym przyciskiem myszy miniatury, wybierz Konwertuj na natywny format pliku Imaris, aby przekonwertować pliki do formatu (.ims).
  2. W podmenu Surpass dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału. Następnie utwórz powierzchnię z wątroby, klikając niebieski przycisk Dodaj nowe powierzchnie.
  3. Następnie w panelu tworzenia powierzchni wybierz opcję Podziel na segmenty tylko obszar zainteresowania, aby ręcznie utworzyć powierzchnię wątroby.
  4. Kliknij Pomiń automatyczne tworzenie | Opcja Edytuj ręcznie. Wybierz Kontur i odznacz opcję "Głośność" w panelu sceny.
    UWAGA: Opcja widoku głośności musi być odznaczona, w przeciwnym razie wybór obszaru zainteresowania w różnych stosach z nie będzie możliwy.
  5. Poruszaj się po stosach z i rysuj obszar zainteresowania na każdej płaszczyźnie, wybierając Tryb, wybierz preferowany tryb rysowania. Aby rozpocząć rysowanie, zmień wskaźnik na tryb wyboru, a nie nawigację, a następnie kliknij Rysuj i zacznij przeciągać wskaźnik przez wątrobę, aby narysować ROI.
  6. Po wybraniu ROI w różnych płaszczyznach ogniskowych wybierz opcję Utwórz powierzchnię, aby scalić wszystkie wybrane ROI i utworzyć powierzchnię wątroby.
  7. Następnie, korzystając z nowo utworzonej powierzchni, stwórz maskę sygnału hepatocytów. Kliknij powierzchnię i na karcie Edytuj (ołówek) wybierz opcję Maskuj wszystko. W wyświetlonym oknie wybierz kanał, który chcesz zamaskować, który będzie używany do ilościowego określania objętości i powierzchni wątroby. Następnie wybierz ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 0 i zaznacz opcję Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski.
  8. Do analizy należy użyć wartości powierzchni wątroby i objętości wątroby z menu analizy statystycznej.

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w celu ilościowego określenia obszaru wątroby.

  1. Otwórz oprogramowanie Fiji. W menu Wtyczki wybierz Bio-formaty, a następnie Importer Bio-formatów, zaznacz opcję Podziel kanały, aby otworzyć plik obrazu.
  2. W menu Obraz wybierz opcję Właściwości, aby sprawdzić, czy obraz ma prawidłowy rozmiar piksela i głębokość woksela, jeśli nie są to prawidłowe wartości. Następnie przejdź do menu Obrazy, kliknij Dostosuj, a następnie Jasność i Kontrast, dostosuj jasność i kontrast obrazu.
  3. Następnie, za pomocą kanału hepatocytów, stwórz projekcję maksymalnej intensywności wątroby. Przejdź do menu Obrazy, kliknij Stosy, a następnie Z Project. Wybierz opcję Projekcja maksymalnej intensywności.
  4. Korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, ręcznie utwórz obszar zainteresowania (ROI) otaczający wątrobę larwy. Następnie w menu Analizuj kliknij Zmierz, aby uzyskać obszar wątroby. Zapisz wyniki jako arkusz kalkulacyjny do dalszej analizy.

7. Hepatocyty i jądrowa analiza morfologiczna.

  1. Otwórz oprogramowanie Fiji. W menu Wtyczki wybierz Bio-formaty, a następnie Importer Bio-formatów zaznacz opcję Podziel kanały, aby otworzyć plik obrazu.
  2. W menu Obraz wybierz opcję Właściwości, aby sprawdzić, czy obraz ma prawidłowy rozmiar piksela i głębokość woksela, jeśli nie są to prawidłowe wartości. Następnie przejdź do menu Obrazy, kliknij Dostosuj, a następnie Jasność i Kontrast, dostosuj jasność i kontrast obrazu.
  3. W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary, zaznacz wszystkie parametry, które chcesz przeanalizować (np. deskryptory powierzchni, obwodu i kształtu). Wybierz kanał fluorescencyjny błony hepatocytów. Poruszając się po Z, użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby narysować idealny zwrot z inwestycji wokół jednego hepatocytu. Następnie w menu Analizuj kliknij Zmierz, aby obliczyć powierzchnię hepatocytów.
  4. Powtórz krok 7.3 dla 15-30 hepatocytów. Zapisz wyniki jako arkusz kalkulacyjny do dalszej analizy.
  5. Następnie wybierz kanał fluorescencyjny jądra. Poruszając się po Z, użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby narysować idealny zwrot z inwestycji wokół jądra hepatocytów. Następnie w menu Analizuj kliknij Zmierz, aby obliczyć powierzchnię jądrową i kołowość.
  6. Powtórz krok 7.5 dla 15-30 hepatocytów. Zapisz wyniki jako arkusz kalkulacyjny do dalszej analizy, w tym ilościowego określenia stosunku jądra do cytoplazmy.
  7. Oceniać próbki pod kątem obecności mikrojąder i przepukliny w następujący sposób (tabela 3).

8. Analiza angiogenezy.

  1. Ręcznie utworzyć powierzchnię wątroby, jak opisano w sekcji 6 niniejszego protokołu. Nazwij tę powierzchnię jako "Powierzchnia wątroby".
  2. Stwórz maskę dla sygnału komórek śródbłonka wewnątrz wątroby. Kliknij powierzchnię i pod zakładką edycji (ołówek) wybierz Maskuj wszystko. W wyświetlonym oknie wybierz kanał komórek śródbłonka, aby wyizolować sygnały naczyń krwionośnych tylko z wątroby. Wybierz ustaw woksele na zewnątrz powierzchni na 0 i zaznacz opcję Duplikuj kanał przed zastosowaniem maski.
  3. Zmień nazwę nowego kanału zamaskowanego komórek śródbłonka na Unaczynienie wątroby.
  4. Aby zmierzyć objętość i powierzchnię naczynia, utwórz drugą powierzchnię. Kliknij niebieski przycisk Dodaj nowe powierzchnie. W pierwszym kroku tworzenia powierzchni upewnij się, że wszystkie opcje nie są zaznaczone, aby automatycznie utworzyć powierzchnię.
  5. W drugim kroku wybierz kanał naczyniowy wątroby, aby utworzyć powierzchnię. Usuń zaznaczenie opcji wygładzania, aby wykryć jak najwięcej szczegółów z naczyń i włączyć odejmowanie tła w opcji progowania.
  6. Dostosuj progowanie, upewniając się, że wykryta powierzchnia kolokalizuje się z sygnałem naczyniowym wątroby. Użyj wartości pola powierzchni i objętości z menu analizy statystycznej. Oblicz wskaźnik gęstości naczynia, korzystając z następujących równań:
    Wskaźnik gęstości naczyń (według wątroby μm2) = (Powierzchnia naczynia (μm2)) / (Powierzchnia wątroby (μm2))
    Wskaźnik gęstości naczyń (według wątroby μm3) = (objętość naczynia (μm3)) / (objętość wątroby (μm3))

9. Analiza rekrutacji komórek odpornościowych.

  1. Otwórz oprogramowanie Fiji. W menu Wtyczki wybierz Bio-formaty, a następnie Importer Bio-formatów zaznacz opcję Podziel kanały, aby otworzyć plik obrazu.
  2. W menu Obraz wybierz opcję Właściwości, aby sprawdzić, czy obraz ma prawidłowy rozmiar piksela i głębokość woksela, jeśli nie są to prawidłowe wartości. Następnie przejdź do menu Obrazy, kliknij Dostosuj, a następnie Jasność i Kontrast, dostosuj jasność i kontrast obrazu (np. makrofagi - mCherry lub dTomato; neutrofile - BFP; Limfocyty T - EGFP; hepatocyty - EGFP lub mCherry).
  3. Następnie utwórz projekcje maksymalnej intensywności dla każdego kanału.
  4. Jak opisano w sekcji 6 (kroki 6.9-6.12), utwórz ROI otaczający wątrobę larwy i zmierz obszar wątroby. Utwórz drugi zwrot z inwestycji, w tym obszar wątroby i obszar otoczenia o długości 75 μm ("Obszar rekrutacji").
  5. Następnie w menu Edycja wybierz opcję Zaznaczenie, a następnie Dodaj do menedżera. Wybierając projekcję maksymalnej intensywności kanału komórek odpornościowych wrodzonej, kliknij zwrot z inwestycji w wątrobę w oknie Menedżera zwrotu z inwestycji, aby ustawić obszar Rekrutacja.
  6. W menu Wtyczki wybierz opcję Analizuj, a następnie Licznik komórek i policz komórki odpornościowe w obszarze Rekrutacja. Rekordowa liczba zrekrutowanych komórek odpornościowych w obszarze wątroby w arkuszu kalkulacyjnym.
  7. Oblicz gęstość neutrofili, makrofagów i limfocytów T, normalizując liczbę komórek odpornościowych na obszar wątroby.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzając krótkoterminową dietę wysokocholesterolową do modelu zebrywanego z rakiem wątrobowokomórkowym (HCC), który wykazuje nadekspresję specyficznej dla hepatocytów konstytutywnie aktywnej formy beta-kateniny (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, jesteśmy w stanie stworzyć model HCC związany z NASH u kręgowców innych niż ssaki. Postęp choroby wątroby można monitorować wcześnie, mierząc stłuszczenie wątroby, wielkość wątroby, hepatocyty, morfologię jądra, angiogenezę i infiltrację komórek odpornościowych (Rysunek 1).

Larwy HCC karmione normalną dietą nie wykazują łagodnego stłuszczenia wątroby, mierzonego barwieniem Oil Red O. Jednak larwy HCC karmione dietą o wysokiej zawartości cholesterolu wykazują znaczny wzrost stłuszczenia wątroby (Ryc. 2).

Dobrze znanym markerem choroby wątroby jest hepatomegalia17. Aby ocenić wielkość wątroby, larwy HCC można krzyżować z linią transgeniczną specyficznie wyrażającą marker fluorescencyjny na hepatocytach, taki jak Tg (fabp10a:H2BmCherry). Aby ocenić powiększenie wątroby, przeprowadza się ocenę obszaru wątroby (2D), pola powierzchni wątroby i objętości wątroby (3D). Po 8 dniach ekspozycji na nadmiar cholesterolu zaobserwowano powiększenie wątroby u larw HCC (Ryc. 3).

Korzystając z nieinwazyjnego obrazowania na żywo, transgeniczne linie ryb wyrażające białka fluorescencyjne w błonach hepatocytów (takie jak Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) i w jądrach hepatocytów (takie jak Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) mogą być używane do oceny zmian morfologii komórkowej i jądrowej związanych z nowotworem złośliwym w hepatocytach. Obszar hepatocytów został zwiększony w HCC związanym z NASH (Rysunek 4A, B, D), a także w obszarze jądrowym ( Rysunek 4C, E) i stosunku jądrowo-cytoplazmatycznego (Rysunek 4F). Znaczący spadek cyrkularności jądrowej zaobserwowano również w grupie HCD+HCC (Rysunek 4G). Lipotoksyczność wyzwala uszkodzenie DNA, cechę kancerogenezy w obecności mikrojąder. Korzystając z markera H2B-mCherry zaobserwowaliśmy większą częstość występowania mikrojąder u larw HCC karmionych dietą o wysokiej zawartości cholesterolu (Ryc. 4H).

Unaczynienie wątroby można łatwo ocenić w modelach danio pręgowanego za pomocą transgenicznej linii oznaczonej, takiej jak Tg (kdrl:mCherry lub Tg(fli:EGFP), które oznaczają unaczynienie. Istotny wzrost gęstości naczyń zaobserwowano u larw HCC+HCD (Ryc. 5).

Aby zaobserwować reakcję zapalną wywołaną wcześnie w HCC związanym z NASH, transgeniczna linia ryb wyrażająca białka fluorescencyjne w makrofagach i neutrofilach, takich jak Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP), została skrzyżowana z linią transgeniczną HCC. Naciekanie neutrofili i makrofagów występuje zarówno w HCC, jak i HCC karmionych HCD, co oceniano za pomocą kwantyfikacji liczby i gęstości neutrofili/makrofagów w wątrobie i okolicy (obszar otaczający do 75 μm) (Rysunek 6A-H). Niemniej jednak, HCC+HCD wykazywał znaczny wzrost liczby i gęstości neutrofili (Ryciny 6F-H). Po 13 dniach od zapłodnienia adaptacyjny układ odpornościowy jest już sprawny. Wykorzystanie transgenicznej linii ryb eksprymującej białko fluorescencyjne w limfocytach T, takich jak Tg(lck:EGFP), oraz w połączeniu z linią transgeniczną HCC; oceniliśmy wpływ nadwyżki cholesterolu na rekrutację limfocytów T do wątroby. Znaczny spadek gęstości limfocytów T i ogólnej liczby zaobserwowano u larw HCC karmionych HCD (Ryc. 6I-K).

Transgeniczne linie danio pręgowanegoOdniesienie do ZFINTest
CasperRoyA9; MitfaW2Steat wątroby
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Wenus / fabp10a:H2B-mWiśnia)s704Tg / uwm41TgMorfologia wątroby
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Wenus; fabp10a:H2B-mWiśnia; fabp10a:LIFEACT-EGFP)s704Tg / uwm41Tg / uwm42TgHepatocyty i morfologia jądrowa
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Wenus; fli:EGFP)s704Tg / y1TgAngiogenezy
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Wenus; mfap4:Pomidor-CAAX; lyzC:BFP)s704Tg / xt6Tg / zf2171TgRekrutacja makrofagów i neutrofili
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Wenus; lck:EGFP)s704Tg / cz1TgRekrutacja limfocytów T

Tabela 1: Transgeniczne linie danio pręgowanego do wykorzystania w różnych testach.

szt. Rozdział szt. szt. szt.
Liczba larwRozmiar pudełka do karmieniaIlość jedzenia na dzień (mg)Objętość E3 (ml)
30-40Małe pudełko hodowlane3-4200
60-80Małe/duże pudełko hodowlane6-8400
100-150Duże pudełko hodowlane10-15500

Tabela 2: Ustaw warunki karmników.

FenotypMetoda punktacji
żadenNormalne jądra, brak mikrojąder lub przepukliny
ŁagodnyMała liczba mikrojąder (mniej niż 5 na pole widzenia) i/lub przepuklina
Umiarkowany/CiężkiUmiarkowana lub duża liczba mikrojąder (więcej niż 5 na pole widzenia) i/lub przepuklina

Tabela 3: Punktacja mikrojąder i przepuklin jądrowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram protokołu podsumowujący główne etapy eksperymentalne i podejście do analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test kontrolny dla stłuszczenia wątroby - barwienie OR. Larwy HCC karmiono dietą o normalnej lub wysokiej zawartości cholesterolu i przeprowadzono barwienie czerwienią olejową (ORO) w celu oceny stłuszczenia wątroby. (A) Schemat płytki 12-dołkowej do wykonywania sekwencyjnego barwienia ORO przy użyciu wkładek do studzienek siatkowych. (B) Obraz narzędzia do rzęs używanego do manipulowania larwami. (C) Reprezentatywne obrazy wątroby zabarwionej czerwienią olejową; Larwy HCC i HCC+HCD. (D) Wykres chi-kwadrat przedstawiający odsetek larw z różną punktacją stłuszczenia wątroby. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy z rozmiaru wątroby. Transgeniczne larwy HCC wykazujące ekspresję markera wątrobowego (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) zostały zobrazowane na żywo i nieinwazyjnie, na mikroskopie konfokalnym z odwróconym dyskiem wirującym przy użyciu zWEDGI. (A) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (B-D) Wykres przedstawiający zmiany morfologiczne wątroby, w tym obszar wątroby (B), obszar wątroby (C) i objętość wątroby (D) u larw HCC i HCC+HCD. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy z morfologii hepatocytów i jąder. Zobrazowano transgeniczne linie HCC wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w błonach hepatocytów (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) oraz w jądrach hepatocytów (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)". (A-C) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D jąder F-aktyny i hepatocytów larw HCC i HCC+HCD. Otwarte groty strzał pokazują powiększone jądra; białe groty strzał pokazują jądro o zmienionym kształcie; a czerwone strzałki pokazują mikrojądra i przepuklinę jądrową. (D-G) Wykresy przedstawiające średnie parametry komórkowe i jądrowe u 13-dniowych larw HCC i HCC+HCD. (D) Obszar hepatocytów. e) Obszar jądrowy. (F) Stosunek jądra do cytoplazmy. (G) Obieg jądrowy. Każda kropka reprezentuje średnie na larwę. Wykresy kropkowe pokazują średnie ±SEM (H) Wykresy chi-kwadrat pokazujące procent larw z różnymi punktacjami mikrojąder i przepuklin jądrowych. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy z układu naczyniowego wątroby. Transgeniczne linie HCC eksprymujące białka fluorescencyjne w jądrach hepatocytów (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) oraz w komórkach śródbłonka (Tg)fli:EGFP)). (A) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D unaczynienia wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (B-C) Wykres przedstawiający wskaźnik gęstości naczyń w zależności od powierzchni wątroby (B) objętości (C) u larw HCC i HCC+HFCD. Wykresy punktowe pokazują średnią ±SEM. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy z krajobrazu komórek odpornościowych wątroby. Transgeniczna linia HCC wykazująca ekspresję białek fluorescencyjnych w makrofagach i neutrofilach (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) lub w limfocytach T (Tg(lck-EGFP). (A,C,F) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D wątroby i rekrutacji leukocytów do obszaru wątroby u 13-dniowych larw HCC i HCC+HCD. (B) Schemat obrazowanego obszaru wątroby. (D-E) Wykres przedstawiający gęstość (D) i liczbę makrofagów (E) w obszarze wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (G-H) Wykres przedstawiający gęstość (G) i liczbę neutrofili (H) w obszarze wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (G) Reprezentatywne rekonstrukcje 3D rekrutacji limfocytów T do obszaru wątroby u larw HCC i HCC+HCD. (H-I) Wykres przedstawiający gęstość i liczbę limfocytów T (H) w obszarze wątroby u larw HCC i HCC+HCD. Wykresy punktowe pokazują średnią ±SEM. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela i roztworów Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz ze zwiększoną częstością występowania HCC, w szczególności HCC indukowanego przez NASH, ogromne znaczenie ma posiadanie bardziej wydajnych modeli do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych zaangażowanych w HCC związane z NASH. Dekonwolucja interakcji komórka-komórka w wątrobie ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia progresji choroby wątroby i hepatokarcynogenezy. Podejście opisane w tym protokole oferuje unikalny sposób analizy progresji choroby wątroby in vivo i nieinwazyjnie.

Przygotowanie diety ma kluczowe znaczenie dla powodzenia w ustanowieniu modelu HCC związanego z NASH. Ważne jest, aby eter dietylowy całkowicie odparował wewnątrz dygestorium, aby uniknąć szkodliwych skutków podczas przygotowywania diety dla danio pręgowanego. Aby stosować te diety z larwami (5-12 dni po zapłodnieniu), niezwykle ważne jest zmielenie diety na drobne cząstki, aby zapewnić pobieranie pokarmu przez larwy. Zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie analogów kwasów tłuszczowych można wykorzystać do oceny spożycia pokarmu przez larwy.

Przed umieszczeniem larw w skrzynkach hodowlanych i rozpoczęciem procedury karmienia ważne jest, aby upewnić się, że pobieranie próbek doświadczalnych jest ujednolicone poprzez zmieszanie larw z różnych płytek. Ten krok jest ważny, ponieważ różne mikrośrodowiska, począwszy od dnia 0, są promowane w każdej z płytek i mogą wpływać na odpowiedź zapalną.

Kolejnym ważnym krokiem jest policzenie larw, aby dowiedzieć się, ile pokarmu jest potrzebne do każdego pudełka do karmienia. Jeśli ilość pokarmu nie jest odpowiednia do liczby larw obecnych w każdym pudełku, wystąpi jeden z dwóch scenariuszy: 1) larwy będą niedożywione; 2) Larwy będą przekarmione. Niedokładne karmienie doprowadzi do niezdrowych warunków związanych z niedożywieniem lub przeżywieniem, takich jak stany zapalne, które drastycznie wpłyną na mikrośrodowisko wątroby. Jeśli dojdzie do niedokładnego karmienia, larwy będą wykazywać problemy z ruchem. Na tym etapie rozwoju larwy powinny intensywnie pływać, dlatego w przypadku zauważenia problemów z poruszaniem się larwy były wychowywane w niezdrowych warunkach (niedożywienie lub narażenie na toksyczne dawki cholesterolu z powodu przekarmienia). Z tego powodu procedury żywieniowe muszą być ściśle kontrolowane zarówno dla diet normalnych, jak i wzbogaconych w cholesterol. Niektóre testy można wykonać, aby szybko określić dokładność żerowania i zdrowia larw, w tym obecność powiększenia wątroby (wielkość wątroby) oraz zapalenie tkanek i narządów, zwłaszcza wątroby i jelit (widoczny zwiększony naciekanie neutrofili i makrofagów).

Codzienne czyszczenie i wymiana 95% E3 ma kluczowe znaczenie dla ograniczenia rozwoju mikroorganizmów w karmnikach oraz poprawy zdrowia i przeżywalności larw. Alternatywnie, larwy można umieścić w samodzielnym systemie stojaków. Aby uzyskać najlepsze wyniki, umieść 60-80 larw w 3-litrowym zbiorniku. Utrzymuj przepływ wody na minimalnym poziomie, dostosowując przepływ do trybu szybkiego kapania i karmiąc larwy 3-4 mg dwa razy dziennie (rano i po południu). Przepływ wody powinien być regularnie sprawdzany, aby zapewnić prawidłowy przepływ w każdym zbiorniku. W naszym laboratorium metoda ta daje nam 95-100% przeżycia przy krótkotrwałym karmieniu 10% HCD. Ponadto metoda ta znacznie zmniejszyła nakład pracy związany z codziennym czyszczeniem i wymianą wody niezbędną w opisanym protokole żywienia statycznego.

Podczas gdy zastosowaliśmy dietę wzbogaconą w 10% cholesterolem, aby wywołać NASH w krótkotrwałej ekspozycji (5 dni wystarczy, aby wywołać stłuszczeniowe zapalenie wątroby), zmiany w diecie mogą być przeprowadzone i rozszerzone o użycie fruktozy 18, kwasów tłuszczowych (takich jak kwas palmitynowy)19 lub protokołów żywieniowych, które można rozszerzyć za pomocą diety wzbogaconej w 4% cholesterol20. Obecnie istnieje niewiele skutecznych celów terapeutycznych dla HCC i żaden dla NASH. Wykorzystanie modeli danio pręgowanego to wyjątkowa okazja do poszerzenia naszej wiedzy na temat hepatokarcynogenezy, ale także nieporównywalnego systemu kręgowców do wykonywania wielkoprzepustowych badań przesiewowych leków. Techniki opisane w tym protokole ułatwią przyszłe odkrycia i cele terapeutyczne w chorobach wątroby i hepatokarcynogenezie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor chciałby podziękować technikom z Albert Einstein College of Medicine, Clintonowi DePaolo i Spartakowi Kalininowi za pomoc i konserwację naszych linii do danio pręgowanego. FJMN jest wspierany przez Instytut Badań nad Rakiem oraz Fundację Raka Fibrolamellar.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CholesterolSigmaC8667-25GŁatwo ulega degradacji. Przechowywać -20°C.
Zestaw nośny Corning Netwells 15 mmFisher07-200-223
Wkładki Corning NetwellsFisher07-200-212
Eter dietylowyFisher60-046-380Bardzo lotny.
Kleszcze Dumont #55 dumostarFisherNC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipety 5,75 calaFisher22-183624
4% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauka15710
Dieta Złotej Perły 5– 50 nm Active SpheresSolanka Shrimp Direct-Można użyć dowolnego komercyjnego suchego proszku dla larw.
Pipety z podziałkąFisher22-170-404
IsopropanolFisherBP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 sztukCrystalgen221-1422-10
Szalki Petriego 100X20MMFisher08-747D
TricaineSigmaA-5040
Tween 20FisherBP337-500
Czerwony olej roztwór O 0,5% izopropanolSigmaO1391-500ML
TricaineSigmaA-5040
Tween 20FisherBP337-500
VactrapVWR76207-630System próżniowy do zbierania larw
mikroskopy
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaM205 FCA THUNDER Imager Model Organism Duży
mikroskop konfokalny z wirującym dyskiemNikonNikon CSU-W1
StereomikroskopLeicaS9i z transpodświetlaną bazą
Software
FijiOpen-source program do przetwarzania obrazów Java.
Imaris 9.6Płaszczyzna bitowa; Instrumenty Oksfordzkie.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
  2. El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
  3. Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
  4. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  5. Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177(2014).
  6. Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).
  7. Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
  8. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  9. Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
  10. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
  11. Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509(2019).
  12. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  13. Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204(2013).
  14. de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
  15. Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).
  16. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  17. Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  18. Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
  19. Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
  20. Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Liver MicroenvironmentNon Alcoholic Fatty LiverHepatocellular CarcinomaZebrafish ModelImmune Cell CompositionConfocal MicroscopyHigh Cholesterol DietHepatic SteatosisTransgenic ZebrafishSingle Cell RNA

Powiązane artykuły