Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62459

⸱

29 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Streszczenie

Fagocytoza to zorganizowany proces, który składa się z odrębnych etapów: rozpoznawania, wiązania i internalizacji. Profesjonalne fagocyty wychwytują pasożyty Leishmania poprzez fagocytozę, polegającą na rozpoznawaniu ligandów na powierzchni pasożyta przez wiele receptorów komórek gospodarza. Wiązanie Leishmania z błonami makrofagów zachodzi poprzez receptor dopełniacza typu 1 (CR1) i receptor dopełniacza typu 3 (CR3) oraz receptory rozpoznawania wzorców. Lipofosfoglikan (LPG) i glikoproteina 63 kDa (gp63) są głównymi ligandami zaangażowanymi w interakcje makrofagów-Leishmania. Po wstępnym rozpoznaniu ligandów pasożytów przez receptory komórek gospodarza, pasożyty ulegają internalizacji, przeżywają i namnażają się w wakuolach parazytoforycznych. Proces dojrzewania wakuoli wywołanych Leishmanią obejmuje pozyskiwanie cząsteczek z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych, w tym monomerycznego białka G Rab 5 i Rab 7, lizosomalnego białka błonowego 1 (LAMP-1), lizosomalnego białka błonowego 2 (LAMP-2) i białka związanego z mikrotubulami 1A/1B-łańcuch lekki 3 (LC3).

Tutaj opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń występujących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza za pomocą mikroskopii konfokalnej, w tym (i) wiązanie, (ii) internalizację i (iii) dojrzewanie fagosomu. Poszerzając zasób wiedzy na temat tych czynników warunkujących wynik zakażenia, mamy nadzieję poprawić zrozumienie patogenezy zakażenia Leishmania i wesprzeć ewentualne poszukiwanie nowych celów chemioterapeutycznych.

Wprowadzenie

Leiszmanioza jest zaniedbaną chorobą tropikalną wywoływaną przez pasożytnicze pierwotniaki z rodzaju Leishmania, powodującą szerokie spektrum objawów klinicznych u gospodarza kręgowców, w tym leiszmaniozę skórną, leiszmaniozę śluzówkowo-skórną i leiszmaniozę trzewną1. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że ponad miliard ludzi jest zagrożonych, z ponad milionem nowych przypadków zgłaszanych rocznie2.

Leishmania spp. są obowiązkowymi wewnątrzkomórkowymi pierwotniakami, które przeżywają wewnątrz komórek gospodarza, w tym monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych3. Interakcja Leishmania-makrofag to złożony proces, który obejmuje wiele receptorów komórek gospodarza i ligandów pasożytów poprzez bezpośrednią interakcję lub opsonizację z udziałem receptorów dopełniacza4,5. Klasyczne receptory powierzchniowe, takie jak CR1, CR3, mannoza-fukoza, fibronektyna, receptory toll-podobne i zmiatające, pośredniczą w przyczepianiu się pasożytów do makrofagów6,7,8. Receptory te rozpoznają cząsteczki znajdujące się na powierzchni Leishmania, w tym glikoproteinę 63 kDa (gp63) i glikolipid lipofosfoglikan (LPG)9. Są to najliczniejsze cząsteczki na powierzchni promastigoty i odgrywają istotną rolę w obalaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza, sprzyjając powstaniu infekcji pasożytniczej w komórkach ssaków10. Po tym, jak ligandy powierzchniowe pasożyta wiążą się z receptorami makrofagów, F-aktyna gromadzi się na powierzchni komórek ssaków, otaczając pasożyty podczas ich fagocytozy. Prowadzi to następnie do powstania indukowanego przez pasożyta przedziału zwanego wakuolą parazytoforyczną (PV), który wykazuje cechy fagolizosomalne11. Po dostaniu się do tych fagolizosomów pasożyty przechodzą kilka zmian niezbędnych do przetrwania i rozmnażania3.

Biogeneza PVs to wysoce regulowany proces transportu błonowego, krytyczny dla wewnątrzkomórkowego przetrwania tego patogenu12. Powstawanie tego przedziału wynika z sekwencyjnych zdarzeń fuzji między fagosomami a przedziałami szlaku endocytarnego gospodarza. Klasyczne badania biologii komórki wykazały, że dojrzewanie PV obejmuje nabywanie monomerycznych białek G Rab 5 i Rab 7, które są głównie związane odpowiednio z wczesnym i późnym dojrzewaniem endosomów13. Ponadto przedziały te nabywają białka błonowe związane z lizosomami 1 i 2 (LAMP 1, LAMP 2), główne składniki białkowe błony lizosomalnej i białka związanego z mikrotubulami 1A/1B-łańcuch lekki 3 (LC3), marker autofagosomu 14. Pomimo pozornych podobieństw, kinetyka powstawania PV15,16 i morfologia tych przedziałów różnią się w zależności od gatunku Leishmania. Na przykład infekcja wywołana przez L. mexicana lub L. amazonensis indukuje tworzenie się dużych kompartmentów zawierających dużą liczbę pasożytów17. Natomiast inne gatunki, takie jak L. braziliensis i L. infantum, tworzą mniejsze wakuole, które zwykle zawierają tylko jednego lub dwa pasożyty w każdej wakuoli18.

Pomimo tej wiedzy na temat interakcji między komórką gospodarza a Leishmania, początkowe zdarzenia wywołane kontaktem między receptorami gospodarza a ligandami pasożytów nie zostały w pełni wyjaśnione. Wiadomo, że zdarzenia te są determinantami wyniku zakażenia pasożytami i są zależne od gatunku pasożyta, rodzaju receptorów komórek gospodarza rekrutowanych do rozpoznawania pasożytów oraz aktywacji szlaków sygnałowych makrofagów19,20. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie cząsteczek biorących udział w biogenezie PV wywołanych przez Leishmania oraz określenie roli, jaką odgrywają te cząsteczki w powstawaniu i przebiegu infekcji. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania wczesnych zdarzeń zachodzących podczas fagocytozy Leishmania, w tym wiązania, internalizacji, tworzenia fagosomów i dojrzewania. Prace te mogą pomóc w wyjaśnieniu udziału PLC, Akt, Rab5, Rab7 i LC3 w tworzeniu PV indukowanych przez różne gatunki Leishmania. Co ważne, protokół ten może być wykorzystany do zbadania udziału innych białek biorących udział w dojrzewaniu PV. Przyszłe badania poszerzą wiedzę na temat mechanizmów związanych z interakcją między Leishmanią a komórkami gospodarza i przyczynią się do opracowania nowych strategii chemioterapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komórki zostały pobrane od zdrowych dawców po zatwierdzeniu procedur przez Krajowe Komisje Etyki Badań (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Hodowle komórkowe

  1. Ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów
    UWAGA: Aby uzyskać makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów do różnicowania in vitro w makrofagi, należy pobrać krew od zdrowych dawców i oczyścić komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zgodnie z opisem D. Englisha i B. R. Andersena21.
    1. Po pobraniu krwi obwodowej (50 ml) przelej ją do probówki z heparyną, a następnie rozcieńcz krew w stosunku 1:1 w roztworze buforu fosforanowego (PBS) w temperaturze pokojowej. Delikatnie umieścić rozcieńczoną heparynizowaną krew na wcześniej rozprowadzonym podłożu o gradiencie gęstości.
    2. Odwirować probówki o sile 252 × g przez 30 minut w temperaturze 24 °C, aby uniknąć hemolizy.
      UWAGA: Ustaw odłamanie wirówki, aby uniknąć mieszania warstw gradientu. Po odwirowaniu od dołu do góry tworzą się nieciągłe warstwy gradientowe: erytrocyty, pożywka gradientu gęstości, pierścień PBMC i osocze.
    3. Przenieść pierścień PBMC, znajdujący się między ośrodkiem gradientu gęstości a warstwami plazmy, do nowej probówki i napełnić PBS, aby wypłukać nadmiar ośrodka gradientu gęstości.
    4. Umyć komórki raz i odwirować w temperaturze 190 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża RPMI.
    6. Policz komórki i płytkę 2 × 106 komórek w 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionych 25 mM kwasu N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N′-[2-etanosulfonowego] (HEPES), 2 g/l wodorowęglanu sodu, 2 mM glutaminy, 20 g/ml cyprofloksacyny i 10% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (pełna pożywka RPMI) przez 7 dni w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w 24-dołkowej płytce, aby umożliwić monocytom różnicować się w makrofagi przez adhezję.
  2. Kultury THP-1
    1. Hodować linię komórkową THP-1 w stężeniu 2 × 105 komórek w 10 ml kompletnej pożywki RPMI w kolbie hodowlanej o długości 75 cm2.
    2. Hodowle komórkowe należy utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 7 dni.
    3. Odwirować komory w temperaturze 720 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w pełnym pożywce RPMI.
    4. Policz komórki w komorze Neubauera.
    5. Płytki na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm w stężeniu 2 × 105 komórek na studzienkę w 500 μl kompletnej pożywki RPMI zawierającej 100 nM octan mirystynianu forbolu (PMA) w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w celu umożliwienia różnicowania komórek THP1 w makrofagi.
    6. Po trzech dniach przemyj dwukrotnie komórki 0,9% roztworem NaCl, aby usunąć pożywkę zawierającą PMA.
    7. Inkubować zróżnicowane komórki THP-1 w kompletnej pożywce RPMI wolnej od PMA w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez dodatkowe 2 dni przed rozpoczęciem eksperymentów.

2. Hodowle pasożytów i czerwone barwienie CellTracker

UWAGA: Aby uwidocznić pasożyty za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wykonaj barwienie za pomocą barwnika fluorescencyjnego CellTracker Red (CMTPX). Alternatywnie, inne markery, w tym karboksyfluoresceina, mogą być stosowane zgodnie z instrukcjami producenta lub promastigoty konstytutywnie wyrażające GFP, RFP lub inne fluorescencyjne geny reporterowe. Pasożyty używane do infekowania komórek to pasożyty w stacjonarnej fazie wzrostu, uzyskane z hodowli aksenicznej promastygoty o nie więcej niż 7 pasażach.

  1. Uprawa Leishmania spp. promastigoty w ilości 1 x 105 pasożytów na 1 000 μl pożywki w kolbie do hodowli komórkowej zawierającej 5 ml pożywki Schneidera uzupełnionej 50 μg/ml gentamycyny i 10% FBS.
  2. Po inkubacji kultur aksenicznych pasożytów w warunkach biochemicznego zapotrzebowania na tlen (B.O.D.) w temperaturze 24 °C, należy przeprowadzić codzienne liczenie w komorze Neubauera. Sprawdzaj formę pasożyta (cienką, wydłużoną) i ruchliwość przez 5 dni. Pasożyty są uważane za znajdujące się w stacjonarnej fazie wzrostu, gdy dwa kolejne zliczenia w odstępie 8 godzin wykazują podobne ilości.
  3. Po osiągnięciu stacjonarnej fazy wzrostu inkubować pasożyty w 4 ml 0,9% roztworu NaCl z 1 μM CMTPX przez 15 minut w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 unikając kontaktu ze światłem.
  4. Dodaj FBS w proporcji 1:1 i inkubuj zawiesinę pasożyta przez dodatkowe 1 minutę.
  5. Przemyć pasożyty trzykrotnie PBS, a następnie odwirować w stężeniu 1 781 × g przez 10 minut.
  6. Zawiesić osad pasożyta w 1 000 μl kompletnego podłoża RPMI.
  7. Policz pasożyty w komorze Neubauera.

3. Ocena wiązania Leishmania z makrofagami

  1. Nasiona 2 × 105 komórek THP-1 lub makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów w 500 μl kompletnej pożywki RPMI na basenik na 24-dołkowej płytce ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 13 mm.
  2. Hodować komórki w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Przemyć komórki dwukrotnie 0,9% roztworem NaCl i inkubować w pełnej pożywce RPMI w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  4. Dodać promastigoty fazy stacjonarnej zgodnie z opisem A. L. Petersena22 w stosunku 10:1 do płytek studzienkowych, a następnie odwirować w temperaturze 720 × g przez 5 minut w temperaturze poniżej 4 °C.
  5. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  6. Umyj komórki dwukrotnie 0,9% roztworem NaCl, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane promastigoty.
  7. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Inkubować szkiełka nakrywkowe z 15 mM NH4Cl przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Przemyć trzykrotnie PBS 0,15% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować z roztworem blokującym (3% BSA w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Przemyć trzykrotnie PBS, a następnie przepuszczać 0,15% PBS-Saponiną przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Dodać falloidynę (rozcieńczoną w stosunku 1:1,200) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
  12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą nośników montażowych.
  13. Uzyskuj obrazy za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 63×/1,4.

4. Ocena fagocytozy Leishmania przez makrofagi

  1. Nasiona 2 × 105 komórek THP-1 lub makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów w 500 μl kompletnej pożywki RPMI na basenik na 24-dołkowej płytce ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 13 mm.
  2. Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
  3. Przemyć komórki dwukrotnie w 0,9% roztworze NaCl i inkubować w pełnym pożywce RPMI na 24-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  4. Dodać Leishmania spp. w fazie stacjonarnej, jak opisano przez A. L. Petersena22 w stosunku 10:1 (pasożyt do komórki gospodarza), a następnie odwirować w temperaturze 720 × g przez 10 minut w temperaturze poniżej 4 °C.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  6. Umyj komórki dwukrotnie 0,9% roztworem NaCl, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane promastigoty.
  7. Inkubować komórki w pożywce z dodatkiem RPMI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut.
  9. Zamontuj szkiełka nakrywkowe przy użyciu preferowanych mediów montażowych.
  10. Policz nie mniej niż 400 komórek w losowych polach pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą obiektywu 100×/1,4.

5. Ocena dojrzewania wakuoli wywołanego przez Leishmania

UWAGA: Transfekcja komórek THP-1 powinna być przeprowadzona zgodnie z opisem M. B. Maess, B. Wittig i S. Lorkowski 23. Tutaj podsumowujemy ten protokół, z minimalnymi modyfikacjami. Nukleofekcja to specyficzna metoda transfekcji, która wymaga nukleofektora. Alternatywną metodą jest transfekcja komórek za pomocą lipofektaminy24 i transdukcji lentiwirusa25.

  1. Aby zbadać biogenezę PV wywołanego przez Leishmania, transfekuj komórki THP1 za pomocą PLC26,27, Akt26,27, Rab 528,29,30 lub Rab 728,29,31 plazmidów.
    UWAGA: Ta metodologia może być stosowana do transfekcji komórek THP-1 z innymi genami niż wymienione powyżej.
  2. Nasiona komórek THP-1 w kolbach do hodowli tkankowych 1,5 x 10 7 w 75 cm² zawierających 10 ml kompletnej pożywki RPMI uzupełnionej 100 ng / ml PMA i 50 μM 2-merkaptoetanolu przez 48 godzin.
  3. Umyj komórki raz w 0,9% roztworze NaCl.
  4. Odłączyć komórki za pomocą nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek i wirować (250 × g) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Ponownie zawiesić komórki THP-1 w 1 ml pożywki RPMI i przeprowadzić liczenie w komorze Neubauera.
  6. Ponownie odwirować komórki THP-1 przy 250 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  7. Ponownie zawiesić 2 × 106 komórek w 100 μl roztworu nukleofektora i inkubować z 0,5 μg plazmidu kodującego interesujące białko, oznaczone białkiem fluorescencyjnym.
  8. Przenieś zawiesinę zawierającą komórki THP-1 i kwas nukleinowy do kuwety Nucleofectora.
  9. Transfekcja komórek THP1 za pomocą programu Nucleofector Y-001.
  10. Odzyskać transfekowane komórki (2x106) i wysiać w pożywce 500 μl RPMI na 24-dołkowych płytkach ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 13 mm (4 dołki/transfekcja).
  11. Inkubować komórki THP-1 w kompletnym pożywce RPMI w temperaturze 37 °C przez 0,5, 2, 4, 6, 12 i 24 godziny.
  12. Powtórz kroki 3.13 i 3.13.

6. Ocena rekrutacji LC3 do Leishmania spp. PVs

UWAGA: Autofagiczny marker błonowy LC3 może być użyty do zbadania, czy fagosomy wykazują cechy autofagiczne. Rekrutacja LC3 do PV indukowanych przez Leishmanię może być oceniana podczas infekcji poprzez immunoznakowanie komórek przeciwciałem anty-LC3, jak wcześniej opisano przez C. Matte32 i B. R. S. Dias33.

  1. Nasiona 2 × 105 komórek THP-1 lub makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów w 500 μl kompletnej pożywki RPMI na 24-dołkowej płytce ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 13 mm.
  2. Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
  3. Umyj komórki dwukrotnie w 0,9% roztworze NaCl i inkubuj w pełnym pożywce RPMI.
  4. Dodać promastigoty Leishmania spp. w fazie stacjonarnej, zgodnie z opisem A. L. Petersena22 w stosunku 10:1 (pasożyt: komórki gospodarza) i odwirować komórki w temperaturze 720 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut lub 4 godziny. Następnie umyj dwukrotnie i utrwal komórki, aby ocenić rekrutację LC3 do błon PV wywołanych przez Leishmania we wczesnych stadiach infekcji.
    1. Alternatywnie, aby ocenić rekrutację LC3 do błon PV w późniejszych stadiach infekcji, należy dwukrotnie przemyć inną grupę makrofagów po 4 godzinach infekcji, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane promastigoty. Inkubuj zainfekowane komórki w kompletnej pożywce RPMI przez dodatkowe 12 godzin i 24 godziny, aby na koniec umyć dwukrotnie i naprawić.
      UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w PBS lub 0,9% roztworze NaCl w temperaturze 4 °C do momentu etykietowania.
  6. Jednocześnie blokuj i przepuszczaln utrwalone komórki w 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normalnej koziej surowicy, 6% odtłuszczonym mleku w proszku i 50% FBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Inkubować komórki z przeciwciałem anty-LC3 (1:200) rozcieńczonym w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jako negatywną kontrolę barwienia immunologicznego, grupa komórek powinna być inkubowana z immunoglobuliną G (IgG) od zwierzęcia pochodzenia przeciwciał pierwotnych w stężeniu równoważnym stężeniu zastosowanym dla przeciwciała pierwszorzędowego.
  8. Umyj komórki trzykrotnie 0,9% roztworem NaCl o temperaturze pokojowej.
  9. Inkubować komórki z kozimi przeciwciałami anty-króliczymi IgG (1:500) sprzężonymi z AlexaFluor 488 lub preferowanymi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Umyj komórki trzykrotnie 0,9% roztworem NaCl o temperaturze pokojowej.
  11. Zamontuj szkiełka nakrywkowe przy użyciu preferowanych mediów montażowych.
  12. Uzyskuj obrazy za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 63x/1,4.

7. Akwizycja mikroskopii konfokalnej i kwantyfikacja Fidżi

UWAGA: Pozyskiwanie obrazów immunofluorescencyjnych powinno odbywać się za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Aby osiągnąć lepszą rozdzielczość, użyj soczewki obiektywowej 63x z olejkiem.

  1. Szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 13 mm należy pozostawić w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem co najmniej 30 minut przed pobraniem.
  2. Wyczyść szkiełka nakrywkowe chusteczką chłonną.
  3. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do celu i dodaj szkiełko.
  4. Przesuń obiektyw w górę, aż olej dotknie suwaka.
  5. Obserwuj i dostosuj ostrość w mikroskopie i wybierz opcję obiektywu 63x z olejem.
  6. Otwórz program Leica i dostosuj lasery w długościach fal 488, 552 i 405.
  7. Wybierz rozdzielczość obrazu 1,024 x 1,024.
  8. Kliknij przycisk Na żywo, ustaw stos Z i naciśnij opcję Rozpocząć. Następnie zrób to ponownie i naciśnij przycisk End. Zalecamy 20 μm dla grubości warstwy, aby uzyskać obrazy konfokalne o dobrej rozdzielczości.
  9. Poczekaj na pozyskanie obrazu, a następnie wybierz opcję "Maksymalna projekcja" w narzędziach Leica.
  10. Zapisz eksperyment.
  11. Wyeksportuj obrazy w formacie lif lub tiff do komputera i otwórz program FIJI.
  12. Otwórz eksperyment i ustaw stos widoku z hiperstosem. Następnie wybierz otwarte pliki pojedynczo i zszyj płytki.
  13. Wybierz narzędzie wolnych rąk na pasku narzędzi Fidżi i ostrożnie prześledź komórkę ręcznie.
  14. Naciśnij przycisk Analizuj i zmierz, aby wyświetlić intensywność fluorescencji.
  15. Powtórz ten proces dla każdej komórki w grupie.
  16. Zapisz pomiary i wyeksportuj je do edytora arkuszy kalkulacyjnych.
  17. Dodaj te dane do programu do analizy statystycznej i przeprowadź analizę statystyczną.

8. Analiza statystyczna

UWAGA: Do analizy danych i grafiki użyj programu do analizy statystycznej.

  1. Otwórz program.
  2. Wstaw uzyskane dane i przetestuj parametry normalności.
  3. W przypadku danych z rozkładem normalnym należy użyć testu t-Studenta, a w przypadku testów nieparametrycznych testu Manna-Whitneya.
  4. Rozważ dane ze statystycznie istotną różnicą, gdy wartość p jest mniejsza niż 0,05.
  5. Przygotuj grafikę przedstawiającą dane, z miarami tendencji centralnej (średnia lub mediana) i miarami zmienności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego raportu jest ocena wczesnych zdarzeń występujących podczas fagocytozy *L. braziliensis* wyizolowane od pacjentów wykazujących *L. braziliensis*-LCL lub *L. braziliensis*postać DL CL. Wykorzystując mikroskopię konfokalną, zbadaliśmy główne zdarzenia związane z fagocytozą pasożytów: wiązanie, internalizację oraz dojrzewanie fagosomu. W pierwszej kolejności oceniliśmy L. braziliensis-LCL lub *L. braziliensis*Wiązanie -DL i fagocytoza przez makrofagi pochodzące z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Interakcja leiszmanio-makrofagów jest złożonym procesem i obejmuje kilka etapów, które mogą wpływać na rozwój choroby5. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy związane z interakcją nieopsonizowanej Leishmanii i komórek gospodarza, opisaliśmy protokół, który wykorzystuje konfokalną mikroskopię fluorescencyjną do oceny fagocytozy od wczesnych do późnych stadiów infekcji Leishmania. Zastosowanie technik fluorescencyjnych obejmujących dwa lub więcej fluoroforów do badania mechanizm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu lub analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brazylia oraz wydziałowi mikroskopii za pomoc. Prace te były wspierane przez INOVA-FIOCRUZ numer 79700287000, P.S.T.V. posiada grant na produktywność w badaniach od CNPq (305235/2019-2). Plazmidy zostały udostępnione dzięki uprzejmości Mauricio Terebicznika z University of Toronto w Kalifornii. Autorzy pragną podziękować Andrisowi K. Walterowi za korektę języka angielskiego i pomoc w redakcji manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolThermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488-sprzężony kozioł anty-królik IgGThermo Fisher ScientificTem varios przeciwciało
Novus BiologicalsNB600-1384
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Czerwony (CMTPX) BarwnikThermo Fisher ScientificC34552
Centrí fugaThermo Fisher Scientific Inkubator
CO2 CiprofloksacynaIsofarmaX
Termo Fisher ScientificX
Konfokalny mikroskop fluorescencyjny (Leica SP8)Leica Leica SP8
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10270106
(Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
GentamycynaGibco15750045
GlutaminaThermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etano-sulfonowy)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
Normalna surowica koziaSigmaNS02L
Urządzenie Nucleofector 2b LonzaAAB-1001
Roztwór nukleofektoraLonzaVPA-1007
ParaformaldehydSigma158127
PhalloidinInvitrogenA12379
Octan mirystynianu forbolu (PMA)SigmaP1585
Roztwór buforowy fosforanu (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Zestaw przeciwblaknięciaLife TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średniGibco11875-093
SaponinThermo Fisher ScientificX
Pożywka dla owadówSchneidera SigmaS0146
Wodorowęglan soduSigmaS5761
Pirogronian soduSigmaS8636
Triton X-100SigmaX
anty-LC3 bez miejsca Mikroskop fluorescencyjny

Bibliografia

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496(2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960(2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690(2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890(2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795(2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646(2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Fagocytoza Leishmaniainterakcja z makrofagamidojrzewanie fagosomukomórki THP-1rekrutacja LC3Rab5-GFPRab7-GFPinternalizacja pasożytatransfekcja białek
Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.