Uogólniona metoda oznaczania składu swobodnie rozpuszczalnych kwasów fenolowych i zdolności przeciwutleniających zbóż i roślin strączkowych

Podsumowanie

Kwasy fenolowe są ważnymi substancjami fitochemicznymi, które są obecne w pełnych ziarnach. Posiadają właściwości bioaktywne, takie jak przeciwutleniające funkcje ochronne. Prace te miały na celu przedstawienie informacji na temat uogólnionej metody identyfikacji HPLC, szacowania całkowitej zawartości fenoli oraz oznaczania zdolności przeciwutleniającej kwasów fenolowych w zbożach i roślinach strączkowych.

Streszczenie

Kwasy fenolowe to klasa związków organicznych, które posiadają zarówno grupę fenolową, jak i karboksylową. Znajdują się w ziarnach i koncentrują się w otrębach zbóż lub okrywie nasiennej roślin strączkowych. Posiadają właściwości przeciwutleniające, które w ostatnich latach wzbudziły duże zainteresowanie badawcze na temat ich potencjalnych przeciwutleniających funkcji ochronnych dla zdrowia. W pracy przedstawiono uogólnioną metodę ekstrakcji wolnych rozpuszczalnych kwasów fenolowych z całych ziaren oraz analizę ich zdolności przeciwutleniających. Wykorzystano pięć próbek pełnego ziarna składających się z dwóch zbóż (pszenicy i żółtej kukurydzy) oraz trzech roślin strączkowych (wspięgi chińskiej, fasoli i soi). Ziarna zmielono na mąkę, a ich wolne rozpuszczalne kwasy fenolowe wyekstrahowano przy użyciu wodnego roztworu metanolu. Związki te zostały następnie zidentyfikowane za pomocą wysokociśnieniowego chromatografu cieczowego (HPLC). Do określenia ich całkowitej zawartości fenoli zastosowano metodę Folin-Ciocalteu, natomiast ich zdolności przeciwutleniające określono za pomocą testów wymiatania rodników DPPH, równoważnej zdolności przeciwutleniającej Trolox (TEAC) i zdolności absorpcji rodników tlenowych (ORAC). Zidentyfikowane kwasy fenolowe obejmowały kwas waniliowy, kawowy, p-kumarowy i ferulowy. Kwas wanilinowy zidentyfikowano tylko w wspięgi chińskiej, podczas gdy kwas kawowy zidentyfikowano tylko w fasoli. Kwas p-kumarowy zidentyfikowano w żółtej kukurydzy, wspiędze chińskiej i soi, natomiast kwas ferulowy zidentyfikowano we wszystkich próbkach. Dominującym zidentyfikowanym kwasem fenolowym był kwas ferulowy. Całkowite stężenie kwasów fenolowych w próbkach zmniejszyło się w następującej kolejności: soja > fasola chińska > żółta kukurydza = fasola > pszenicy. Całkowita zdolność przeciwutleniająca (suma wartości testów DPPH, TEAC i ORAC) zmniejszyła się w następujący sposób: soja > fasola > żółta kukurydza = bąb chiński > pszenicy. W badaniu tym stwierdzono, że analiza HPLC oraz testy DPPH, TEAC i ORAC dostarczają przydatnych informacji na temat składu kwasu fenolowego i właściwości przeciwutleniających całych ziaren.

Wprowadzenie

Kwasy fenolowe są jednymi z najważniejszych fitochemikaliów badanych na roślinach ze względu na istotną rolę, jaką odgrywają w obronie roślin przed infekcjami roślinożernymi i grzybiczymi, a także w utrzymaniu wsparcia strukturalnego i integralności tkanek roślinnych1^,2. Są obfite w otręby zbóż i okrywę nasienną roślin strączkowych³. Strukturalnie są one podzielone na dwie grupy: kwasy hydroksybenzoesowe ( Rysunek 1) i kwasy hydroksycynamonowe ( Rysunek 2). Powszechne kwasy hydroksybenzoesowe w zbożach i roślinach strączkowych obejmują kwas galusowy, p-hydroksybenzoesowy, 2,4-dihydroksybenzoesowy, protokatechowy, waniliowy i syryngowy, podczas gdy popularne kwasy hydroksycynamonowe obejmują kwas kawowy, p-kumarowy, ferulowy i synapinowy³. Kwasy fenolowe mają również właściwości przeciwutleniające, ponieważ są w stanie wymiatać wolne rodniki, które powodują jełczenie oksydacyjne tłuszczów oraz inicjować i propagować stres oksydacyjny wywołany rodnikami w układach fizjologicznych^4,5. Ze względu na tę istotną fizjologiczną rolę jako przeciwutleniacze, są one przedmiotem najnowszych badań. Dzieje się tak, ponieważ spożywane jako składniki pokarmów roślinnych mogą wywierać ochronę przeciwutleniającą.

Zboża i produkty zbożowe są głównymi źródłami węglowodanów dla ludzi i zwierząt na całym świecie⁶. Zboża obejmują pszenicę, ryż, kukurydzę, jęczmień, pszenżyto, proso i sorgo. Wśród nich najczęściej wykorzystywana jest kukurydza, której szacowane globalne wykorzystanie wyniosło 1 135,7 mln ton w latach 2019/2020, a następnie pszenica z szacowanym globalnym wykorzystaniem 757,5 mln ton w tym samym okresie⁷. Pokarmy zbożowe są doskonałym źródłem energii dla konsumentów, ponieważ są bogatym źródłem węglowodanów. Dostarczają również trochę białka, tłuszczu, błonnika, witamin i minerałów⁶. Oprócz wartości odżywczej, zboża są dobrym źródłem fitochemicznych przeciwutleniaczy, w szczególności kwasów fenolowych, które mogą chronić układ fizjologiczny przed uszkodzeniami oksydacyjnymi wywołanymi przez rodniki³. Rośliny strączkowe są również dobrym źródłem składników odżywczych i na ogół zawierają więcej białka niż zboża. Zawierają również witaminy i minerały i są używane do przygotowywania różnych potraw⁸. Ponadto rośliny strączkowe są dobrym źródłem różnych fitochemicznych przeciwutleniaczy, w tym kwasów fenolowych, flawonoidów, antocyjanów i proantocyjanidyn^9,10. Różne odmiany zbóż i roślin strączkowych mogą mieć różny skład kwasów fenolowych. W związku z tym istnieje potrzeba zbadania składu kwasów fenolowych zbóż i roślin strączkowych oraz ich odmian, aby poznać ich potencjalne korzyści zdrowotne w odniesieniu do przeciwutleniaczy fenolowych.

Zgłoszono szereg testów do pomiaru ilości kwasów fenolowych w ziarnach zbóż i roślin strączkowych oraz określania ich aktywności przeciwutleniającej. Najpopularniejszymi metodami analizy pełnoziarnistych kwasów fenolowych są spektrofotometria i chromatografia cieczowa¹¹. Celem pracy było zademonstrowanie uogólnionej metody wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej do oznaczania składu wolnych rozpuszczalnych kwasów fenolowych oraz metod spektrofotometrycznych do oznaczania całkowitej zawartości fenoli i zdolności przeciwutleniających niektórych pełnoziarnistych zbóż i roślin strączkowych.

Protokół

1. Rodzaj próbek

1. Do tego badania należy użyć pięciu próbek pełnego ziarna, składających się z dwóch zbóż (np. pszenicy durum i żółtej kukurydzy) oraz trzech roślin strączkowych (np. fasoli krowiej Blackeye, soi i czerwonej fasoli nerkowej).
2. Zmiel 50 g każdego ziarna w trzech porcjach na mąkę za pomocą młynka do kawy i przepuść przez sito 500 μm.
3. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie próbki

1. Oznaczanie zawartości suchej masy i wyrażenie w przeliczeniu na suchą masę
   UWAGA: Określić zawartość suchej masy w każdej sproszkowanej próbce zgodnie z metodą AOAC (2000)¹².
   1. Włącz piec z wymuszonym obiegiem konwekcji i ustaw temperaturę na 130 °C.
   2. Suszyć środek osuszający (żel krzemionkowy) w piecu przez 30 minut do 1 godziny i przenieść wysuszony żel krzemionkowy do eksykatora.
   3. Dokładnie zważ 2 g każdej próbki do czystej, wstępnie wysuszonej i zważonej aluminiowej puszki.
   4. Suszyć zważone próbki w temperaturze 130 °C przez 1 godzinę w piecu z wymuszoną konwekcją.
   5. Przenieść wysuszoną próbkę do eksykatora i pozostawić do ostygnięcia do temperatury otoczenia.
   6. Zważyć wysuszoną, schłodzoną próbkę i zanotować jej masę.
   7. Obliczyć zawartość suchej masy w każdej próbce w następujący sposób:
      
   8. Każdą wartość mierzoną w suchej masie należy wyrazić za pomocą następującego wzoru:
      
2. Ekstrakcja kwasu fenolowego
   UWAGA: Ekstrahować rozpuszczalne wolne związki fenolowe w próbkach ziarna przy użyciu modyfikacji metody Y. Qiu i wsp.⁵, która umożliwia ekstrakcję fenolową z miligramowych ilości pełnych ziaren.
   1. Dokładnie zważyć 100 mg próbki mąki pełnoziarnistej bezpośrednio do bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Ciemny kolor rurki pomaga zapobiegać ekspozycji mieszaniny na światło.
   2. Dodać 1 ml 80% wodnego metanolu klasy HPLC do każdej z probówek zawierających próbki.
   3. Przeprowadzić krótkie wirowanie, aby wymieszać roztwór metanolu i próbki.
   4. Sonikować próbki przez 60 minut w celu ekstrakcji wolnych rozpuszczalnych związków fenolowych. Nałożyć osłonę na próbki na czas sonikacji, aby zapewnić dodatkową ochronę przed światłem.
   5. Po sonikacji odwirować mieszaninę o stężeniu 20 000 × g przez 5 minut, aby rozprowadzić stałe pozostałości, pozostawiając supernatant na wierzchu. Wolne związki fenolowe będą obecne w supernatancie po odwirowaniu.
   6. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Supernatant musi zostać przefiltrowany przed wstrzyknięciem do instrumentu HPLC. Aby przefiltrować supernatant, należy zdjąć tłok strzykawki o pojemności 3 ml i założyć filtr strzykawkowy. Filtr powinien mieć wielkość porów nie większą niż 0,22 μm.
   7. Odpipetować około 0,4 ml supernatantu do górnej części strzykawki. Ponownie włożyć tłok i przepchnąć płyn przez filtr do fiolki HPLC zawierającej wkładkę do fiolki.
   8. Po skonfigurowaniu urządzenia do uruchamiania metody opisanej w manuskrypcie do analizy HPLC, załaduj fiolki do karuzeli, aby odpowiadały liście próbek.
   9. Otrzymać chromatogramy HPLC przy długości fali 320 nm i długości fali 280 nm, wykazujące wyraźne piki reprezentujące różne związki fenolowe.
   10. Stosując odpowiednie krzywe wzorcowe, oznacz ilościowo kwasy hydroksycynamonowe przy 320 nm, ponieważ mają one maksymalną absorbancję przy tej długości fali. Na tej samej zasadzie należy określić ilościowo kwasy hydroksybenzoesowe przy 280 nm.
   11. Pozostałe ekstrakty przechowywać w temperaturze -20 °C do innych analiz.

3. Skład fenolowy

1. Użyj wysokociśnieniowego chromatografu cieczowego (tabela materiałów), aby zidentyfikować i określić ilościowo ekstrahowane związki fenolowe w próbkach, w oparciu o metodę J. Xianga, F. B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M. C. Katundu i T. Beta ⁴.
2. Przygotować wzorce kwasu fenolowego (kwas wanilinowy, kwas kawowy, kwas p-kumarowy, kwas ferulowy i kwas synapinowy) w celu identyfikacji i ilościowego określenia składowych związków fenolowych w ekstraktach.
3. W tym celu należy zważyć 1 mg każdego wzorca i rozpuścić w 1 ml 50% wodnego roztworu metanolu, aby uzyskać 1000 μg/ml każdego wzorca.
4. Wymieszaj równe objętości wszystkich pięciu wzorców w bursztynowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml, aby uzyskać koktajl wzorców, z których każdy ma stężenie 200 μg/ml.
5. Przygotować seryjne rozcieńczenia wzorcowego koktajlu, pobierając objętość do nowej probówki i rozcieńczając równą objętością wodnego rozpuszczalnika metanolowego.
6. Powtórzyć seryjne rozcieńczenia do stężenia 3,125 μg/ml.
7. Należy również oddzielnie rozcieńczyć każdy wzorzec 40 razy rozpuszczalnikiem, aby uzyskać stężenie 25 μg/ml każdego wzorca.
8. Ustawić temperaturę kolumny na 35 °C, a temperaturę pieca do pobierania próbek na 15 °C.
9. Aby przygotować ruchomą fazę A (0,1% wodny roztwór kwasu mrówkowego), przenieść 1 ml kwasu mrówkowego do kolby miarowej o pojemności 1 l i dodać wodę do klasy HPLC do oznaczenia 1 l. Dobrze wstrząśnij, aby wymieszać.
10. Aby przygotować ruchomą fazę B (0,1% kwas mrówkowy w metanolu), przenieść 1 ml kwasu mrówkowego do kolby miarowej o pojemności 1 l i dodać metanol klasy HPLC do oznaczenia 1 l. Dobrze wstrząśnij, aby wymieszać.
11. W razie potrzeby dostosuj głośność do oznaczenia 1 L.
12. Przefiltruj obie fazy ruchome przez hydrofilową bibułę filtracyjną o grubości 0,45 μm.
13. W celu analizy wstrzyknąć 10 μl każdego ekstraktu lub wzorca (wzorce 25 μg/ml i koktajle wzorcowe) do kolumny z odwróconymi fazami.
14. Elute z fazami ruchomymi zgodnie z programem gradientu liniowego przez 25 minut przebieg w następujący sposób: 0-3,81 min, 9%-14% B; 3,81-4,85 min, 14%-15% B; 4,85-5,89 min, 15%-15% B, 5,89-8,32 min, 15%-17% B; 8,32-9,71 min, 17%-19% B; 9,71-10,40 min, 19%-19% B; 10,40-12,48 min, 19%-26% B; 12,48-13,17 min, 16%-28% B; 13,17-14,21 min, 28%-35% B; 14.21-15.95 min, 35%-40% B; 15,95-16,64 min, 40%-48% B; 16,64-18,37 min, 48%-53% B; 18.37-22.53 min, 53%-70% B; 22.53-22.88 min, 70%-90% B; 22.88-25.00 min, 90% B.
15. Porównać czasy retencji pików chromatograficznych otrzymanych dla autentycznych wzorców stężeń 25 μg/ml przy 280 nm i 320 nm z czasami retencji ekstraktów, w celu zidentyfikowania składowych związków fenolowych w próbkach.
16. Wykreślić krzywe kalibracyjne dla wzorcowych koktajli kwasu fenolowego, ze stężeniem wzorców na osi poziomej i powierzchnią piku na osi pionowej
17. Wykorzystuje się krzywe kalibracyjne do oszacowania stężeń zidentyfikowanych związków fenolowych, porównując powierzchnie pików na powierzchni z powierzchnią zidentyfikowanych związków przy 280 nm i 320 nm, jak wspomniano we wcześniejszej sekcji.

4. Całkowita zawartość fenoli

UWAGA: Określ całkowitą zawartość fenoli w ekstraktach za pomocą metody Folin-Ciocalteu opisanej przez F. B. Apea-Bah et al.¹³.

1. Przygotować wzorce kwasu ferulowego i kwasu galusowego w zakresie stężeń od 0,025 do 0,150 mg/ml w celu wykreślenia krzywych kalibracyjnych dla porównania, w celu oszacowania całkowitej zawartości fenoli.
2. W tym celu należy dokładnie zważyć po 1 mg każdego z wzorców kwasu ferulowego i kwasu galusowego w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml.
3. Dodaj 1 ml 50% wodnego metanolu do każdego wzorca i wiruj do rozpuszczenia, tworząc 1 mg / ml zapasu każdego wzorca.
4. Przygotować serię rozcieńczeń z każdego roztworu podstawowego w sumie 500 μl.
5. Odpipetować 18,2 μl każdego ekstraktu lub wzorca do oddzielnego dołka na 96-dołkowej mikropłytce.
6. Dodać 36,4 μl 10% (v/v) wodnego odczynnika Folin-Ciocalteu do każdego ekstraktu lub wzorca.
7. Następnie do każdej mieszaniny reakcyjnej dodać 145,4 μl 700 mM węglanu sodu.
8. Mieszaniny reakcyjne inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 2 godziny.
9. Odczytać absorbancję na czytniku mikropłytek przy długości fali 750 nm.
10. Wykreślić krzywe kalibracyjne zmiany absorbancji w zależności od stężenia wzorców kwasu fenolowego i wykorzystać je do oszacowania całkowitej zawartości fenoli.
11. Wyniki należy wyrazić w miligramach ekwiwalentu kwasu ferulowego na gram zmielonej próbki (mg GTAK/g) i w miligramach ekwiwalentu kwasu galusowego na gram zmielonej próbki (mg GAE/g) w przeliczeniu na suchą masę.

5. Testy antyoksydacyjne

UWAGA: Określ zdolność przeciwutleniającą ekstraktów zbożowych za pomocą następujących trzech testów: zdolność do wymiatania rodników przez 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (DPPH); zdolność wymiatania rodników kwasu 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolin-6-sulfonowego (ABTS), która jest również nazywana równoważną zdolnością antyoksydacyjną Trolox (TEAC); i zdolność absorpcji rodników tlenowych (ORAC).

1. Przygotowanie wzorców Trolox dla krzywych standardowych
   1. Użyj Trolox, rozpuszczalnego w wodzie analogu witaminy E, jako standardu do oszacowania zdolności przeciwutleniającej ekstraktów z pełnego ziarna in vitro.
   2. Dokładnie odważyć 1 mg leku Trolox w probówce o pojemności 15 ml. Rozpuścić w 4 ml 50% wodnego roztworu metanolu. Wirować do rozpuszczenia w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 1 mM (1000 μM).
   3. Przygotować sześć stężeń Trolox, tj. 50, 100, 200, 400, 600 i 800 μM, aby wykreślić krzywe wzorcowe w celu oszacowania zdolności wymiatania rodników DPPH i równoważnej zdolności przeciwutleniającej Trolox (TEAC). Podobnie należy przygotować stężenia Trolox 6,25, 12,5, 25 i 50 μM w celu oszacowania zdolności absorpcji rodników tlenowych (ORAC). Uzupełnić całkowitą objętość każdego stężenia do 500 μl, jak pokazano w tabeli 1.
2. Rozcieńczanie ekstraktów próbek
   1. Rozcieńczyć ekstrakty próbki metanolem przed analizą. Tutaj ekstrakty z żółtej kukurydzy i wspięgi chińskiej rozcieńczono dwukrotnie, pszenicę i fasolę pięciokrotnie, a ekstrakt z soi rozcieńczono 10 razy metanolem.
3. Test równoważnej zdolności antyoksydacyjnej Trolox (TEAC)
   1. Zmierz równoważną zdolność antyoksydacyjną Trolox (TEAC) próbek, stosując metodę opisaną wcześniej przez F. B. Apea-Bah et al.¹⁴.
   2. Odważyć 8,23 mg ABTS w czystej, bursztynowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
   3. Następnie odważyć 1,62 mg nadsiarczanu potasu do innej czystej bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
   4. Dodaj 1 ml wody destylowanej do każdego z nich i wiruj, aby je rozpuścić.
      UWAGA: W ten sposób otrzymuje się 16 mM roztwór podstawowy ABTS z 6 mM wodnym roztworem nadsiarczanu potasu.
   5. Przygotować roztwór podstawowy ABTS, mieszając roztwory ABTS i nadsiarczanu potasu w równych objętościach. Roztwór natychmiast zmieni kolor na ciemny.
   6. Mieszaninę odczynników inkubować w ciemności przez 12-16 godzin.
   7. Rozcieńczyć roztwór podstawowy ABTS 30 razy roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o stężeniu 200 mM w celu uzyskania roztworu roboczego ABTS. W tym celu należy dodać 58 ml 200 mM PBS do 2 ml roztworu podstawowego ABTS. Roztwór roboczy będzie zawierał 0,27 mM ABTS i 0,1 mM nadsiarczanu potasu.
   8. Do analizy należy umieścić 10 μl każdego rozcieńczonego ekstraktu lub leku Trolox w 96-dołkowej mikropłytce.
   9. Dodać 190 μl roztworu roboczego ABTS do każdego dołka i inkubować mieszaniny reakcyjne przez 60 minut.
   10. Zmierzyć absorbancję mieszanin reakcyjnych przy długości fali 750 nm w czytniku mikropłytek.
   11. Roztwory wzorcowe Trolox należy stosować w stężeniu od 100 do 800 μmol/l, aby wykreślić krzywą kalibracyjną.
   12. Oszacuj zdolność ABTS do wymiatania rodników na podstawie krzywej kalibracyjnej.
   13. Wyniki należy wyrazić w mikromolowych ekwiwalentach Troloxu na gram (μmol TE/g) próbki w przeliczeniu na suchą masę.
4. Test DPPH
   UWAGA: Określ zdolność DPPH do wymiatania rodników w próbkach za pomocą metody opisanej wcześniej przez F. B. Apea-Bah i wsp.¹³. Test przeciwutleniający DPPH wymaga związku generującego rodniki, DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl).
   1. Dokładnie odważyć 1,2 mg DPPH do pustej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić DPPH w 30 ml metanolu, aby otrzymać roztwór metanolowy o stężeniu 60 μmol/l.
      UWAGA: Test DPPH testuje zdolność ekstraktów próbki do wymiatania wolnych rodników wytwarzanych przez DPPH.
   2. Do analizy dodać 5 μl ekstraktów próbki lub roztworu Trolox do studzienek z mikropłytkami.
   3. Następnie dodać 195 μl roztworu metanolowego o stężeniu 60 μmol/l DPPH i inkubować przez 60 minut.
   4. Zmierzyć absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy długości fali 515 nm.
   5. Za pomocą wzorców Trolox (50-800 μmol/L) należy wykreślić krzywą kalibracyjną ze zmianą absorbancji na osi pionowej i stężeniami Trolox na osi poziomej.
   6. Oszacuj zdolność oczyszczania DPPH na podstawie krzywej kalibracyjnej.
   7. Wyniki należy wyrazić w mikromolowych ekwiwalentach Troloxu na gram (μmol TE/g) próbki w przeliczeniu na suchą masę.
5. Zdolność absorpcji rodników tlenowych
   1. Określić zdolność absorpcji rodników tlenowych (ORAC) próbek w oparciu o metodę F. B. Apea-Bah i wsp.¹³.
   2. Na początek należy przygotować wzorce Trolox o stężeniach 6,25, 12,5, 25 i 50 μM z 1,000 μM wzorcowego roztworu podstawowego Trolox w buforze 75 mM fosforanu potasu (_K2HPO₄/KH₂PO₄).
   3. W tym celu należy odważyć 1 mg proszku Trolox i rozpuścić w 4 ml roztworu buforowego poddanego sonikacji, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 000 μM.
   4. Następnie pobrać 50 μl roztworu podstawowego do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml i rozcieńczyć 950 μl roztworu buforowego, aby uzyskać 1 000 μl 50 μM roztworu Trolox.
   5. Pobrać pipetą 500 μl roztworu o stężeniu 50 μM do nowej probówki i rozcieńczyć równą objętością buforu, aby otrzymać 25 μM roztwór Trolox.
   6. Powtórzyć seryjne rozcieńczenie 25 μM, aby uzyskać 12,5 μM, a następnie podobnie powtórzyć rozcieńczenie 12,5 μM, aby uzyskać 6,25 μM.
   7. Przygotować odpowiednie roztwory ekstraktów próbek.
   8. Rozcieńczyć ekstrakty z żółtej kukurydzy i wspięgi chińskiej 20 razy, ekstrakty z pszenicy i fasoli 50 razy, a ekstrakt z soi 100 razy roztworem buforowym.
   9. Przenieść 200 μl każdej próbki lub wzorca Trolox do dołków czarnej 96-dołkowej mikropłytki w celu automatycznego pipetowania.
   10. Następnie napełnij trzy zbiorniki odczynników dostarczone ze sprzętem ORAC następującymi środkami: (1) roztworem buforowym; (2) 0,816 nM fluoresceiny w buforze; oraz (3) 153 mM dichlorowodorku 2,2′-azobis(2-amidynopropanu) (AAPH) w buforze.
   11. Umieść je w pojemnikach w celu automatycznego pipetowania.
   12. Skonfiguruj urządzenie ORAC i automatyczny system pipetowania do analizy, w oparciu o standardową procedurę operacyjną.
   13. Na potrzeby analizy należy skonfigurować zautomatyzowany system pipetowania w taki sposób, aby transfer 25 μl każdego rozcieńczonego ekstraktu lub wzorca do dołków przezroczystej, czarnej 96-dołkowej mikropłytki.
   14. Następnie automatycznie dodaj 150 μl fluoresceiny 0,816 nM do bufora.
   15. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w maszynie ORAC.
   16. Następnie automatycznie dodaj 25 μl AAPH do każdej mieszaniny reakcyjnej.
   17. Inkubować je w temperaturze 37 °C przez 50 minut w maszynie ORAC.
   18. Ustawić maszynę ORAC do pomiaru rozpadu fluorescencji w okresie inkubacji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 nm i 520 nm.
   19. Po pomiarach należy wykreślić krzywą wzorcową Troloxa, z Troloxem (6,25-50 μM) na osi poziomej i zanikiem fluorescencji na osi pionowej.
   20. Oszacować zdolność absorpcji rodników tlenowych ekstraktów z krzywej wzorcowej Troloxa.
   21. Wyniki należy wyrazić jako μmol TE/g próbki w przeliczeniu na suchą masę.
6. analiza statystyczna
   1. Przedstawić wszystkie wyniki jako średnie ± odchyleniu standardowym co najmniej trzykrotnie.
   2. Wykonaj analizę wariancji (ANOVA), aby określić wpływ rodzaju ziarna na zmienne odpowiedzi.
   3. Tam, gdzie istnieją znaczące różnice na poziomie p < 0,05, należy użyć najmniej znaczącej różnicy (LSD) do porównania średnich.
   4. Wykonaj analizę korelacji Pearsona, aby oszacować związek między zawartością fenoli a zdolnościami przeciwutleniającymi.

Wyniki

Tabela 2 pokazuje kwasy fenolowe, które zostały zidentyfikowane w ziarnach zbóż i roślin strączkowych. Na podstawie dostępnych autentycznych wzorców w próbkach zidentyfikowano cztery kwasy fenolowe, a są to: kwas waniliowy, kawowy, p-kumarowy i ferulowy. Kwas wanilinowy jest kwasem hydroksybenzoesowym, podczas gdy pozostałe trzy to kwasy hydroksycynamonowe. Kwas wanilinowy zidentyfikowano tylko w fasoli cowpea Blackeye, podczas gdy kwas kawowy zidentyfikowano tylko w fasoli nerkowej. Kw...

Dyskusja

Produkty pełnoziarniste zostały wybrane jako reprezentatywne ziarna zbóż i roślin strączkowych, które znajdują szerokie zastosowanie w żywności na całym świecie. Chociaż mogą występować różnice między odmianami każdego ziarna, celem tego badania było zademonstrowanie uogólnionej metody ekstrakcji i analizy wolnego kwasu fenolowego dla całych ziaren. Metoda ekstrakcji została zmodyfikowana poprzez znaczne zmniejszenie ilości próbek i rozpuszczalników, w celu zmniejszenia ilości substancji chemicznych, które zostałyby uwol...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml stożkowe probówki wirówkowe Falcon	Fisher Scientific	05-527-90
2 ml fiolka ze szkła bursztynowego ID Surestop	Thermo Scientific	C5000-2W
2 mL Bursztynowe probówki do mikrowirówek	VWR	20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropan) dichlorowodorek (AAPH)	Sigma-Aldrich	440914-100G
Kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥ 98%,	Sigma Aldrich	A1888-2G
2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)		Kwas
(Trolox) (C14H18O4), ≥ 98%	Fluka Chemika	56510
9 mm Autosampler Nasadki gwintowane na fiolki	Thermo Scientific	60180-670
96-dołkowe płaskie płytki	denne Fisher Scientific	12565501
Czytnik mikropłytek Agilent BioTek ELx800	Fisher Scientific	BT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automatyczny system pipetowania mikropłytek	Fisher Scientific	N/A
Czytnik fluorescencji mikropłytek Agilent BioTek FLx800	Fisher Scientific	N/A
Waga analityczna SI-114	Denver Instrument	SI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus
BD 3 mL Luer-Lok Tip	309657
Myjka ultradźwiękowa Branson, Branson 5510	Millipore Sigma	Z245143
Corning LSE Vortex Mixer	Corning	6775
Filtr Durapore (0,45 &mikro; m Membrana PVDF)	Merck Millipore Ltd	HVLP04700
Filtry membranowe Durapore (0,45 &mikro; m HV)	Merck Millipore Ltd	HVHP04700
Eppendorf Research  plus, 0,5-10 i mikro; L	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research  plus 0,5-5 ml	Eppendorf	3123000071
Eppendorf Research  plus, 100-1000 i mikro; L	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research  plus, 10-100 i mikro; L	Eppendorf	3123000047
Octan etylu, klasa HPLC	Fisher Chemical	E195-4
Wzorzec kwasu ferulowego	Sigma Aldrich	128708-5G
Fluoresceina	Fisher Scientific	AC119245000
Folin & Odczynnik fenolowy Ciocalteu	Sigma Aldrich	F9252
Kwas mrówkowy, 99%	Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3A	27048-0010
Wzorzec kwasu galusowego	Sigma	G7384
Wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC), Wody 2695	Wody	960402
Metanol, klasa HPLC	Fisher Chemical	A452-4
Końcówki do mikropipet, 0,5-10 i mikro; L	Fisherbrand	21-197-2F
Mikrowirówka Sorvall Legend Micro 21 Wirówka	Thermo Scientific	75002435
Mikropipeta wielokanałowa, Proline Plus, 30-300 i mikro; L	Sartorius	728240
Detektor matrycowy fotodiodowy, Waters 2996	Waters	720000350EN
Końcówki do pipet, 1000 µ L	VWR	83007-382
Końcówki do pipet, 1-5 ml	VWR	82018-840
Nadsiarczan potasu (K2S2O8), ≥ 99,0%	Sigma Aldrich	216224-100G
Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodny (K2HPO4)	Fisher Scientific	P288-500
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
PYREX 250 mL Kolba do gotowania z krótką szyjką, Okrągłe dno	Corning	4321-250
Kolumna analityczna C18 z odwróconą fazą (100 x 3 mm) Parownik Roto Accucore aQ	Thermo Scientific	17326-103030
IKA RV 10	IKA&	nbsp;
Węglan sodu (NaCO3) bezwodny	Fisher Chemical	S263-1
Chlorek sodu (NaCl)	Mallinckrodt AR®	7581
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-500
Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny (NaH2PO4)	Bioodczynniki Fisher	BP329-500
Standaryzacja końcówek do pipet 0-200 i mikro; L	Fisherbrand	02-681-134
Jednostka filtrująca napędzana strzykawką (0,22 i mikro; m)	Millex®-GV	SLGVR04NL
Wkładka do fiolki z mikrosertami Target (400 µ L)	Thermo Scientific	C4011-631
Ultraczysta woda (system Direct Q-3 UV z pompą)	Millipore	ZRQSVP030