Kwasy fenolowe są ważnymi substancjami fitochemicznymi, które są obecne w pełnych ziarnach. Posiadają właściwości bioaktywne, takie jak przeciwutleniające funkcje ochronne. Prace te miały na celu przedstawienie informacji na temat uogólnionej metody identyfikacji HPLC, szacowania całkowitej zawartości fenoli oraz oznaczania zdolności przeciwutleniającej kwasów fenolowych w zbożach i roślinach strączkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Uogólniona metoda oznaczania składu swobodnie rozpuszczalnych kwasów fenolowych i zdolności przeciwutleniających zbóż i roślin strączkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kwasy fenolowe to klasa związków organicznych, które posiadają zarówno grupę fenolową, jak i karboksylową. Znajdują się w ziarnach i koncentrują się w otrębach zbóż lub okrywie nasiennej roślin strączkowych. Posiadają właściwości przeciwutleniające, które w ostatnich latach wzbudziły duże zainteresowanie badawcze na temat ich potencjalnych przeciwutleniających funkcji ochronnych dla zdrowia. W pracy przedstawiono uogólnioną metodę ekstrakcji wolnych rozpuszczalnych kwasów fenolowych z całych ziaren oraz analizę ich zdolności przeciwutleniających. Wykorzystano pięć próbek pełnego ziarna składających się z dwóch zbóż (pszenicy i żółtej kukurydzy) oraz trzech roślin strączkowych (wspięgi chińskiej, fasoli i soi). Ziarna zmielono na mąkę, a ich wolne rozpuszczalne kwasy fenolowe wyekstrahowano przy użyciu wodnego roztworu metanolu. Związki te zostały następnie zidentyfikowane za pomocą wysokociśnieniowego chromatografu cieczowego (HPLC). Do określenia ich całkowitej zawartości fenoli zastosowano metodę Folin-Ciocalteu, natomiast ich zdolności przeciwutleniające określono za pomocą testów wymiatania rodników DPPH, równoważnej zdolności przeciwutleniającej Trolox (TEAC) i zdolności absorpcji rodników tlenowych (ORAC). Zidentyfikowane kwasy fenolowe obejmowały kwas waniliowy, kawowy, p-kumarowy i ferulowy. Kwas wanilinowy zidentyfikowano tylko w wspięgi chińskiej, podczas gdy kwas kawowy zidentyfikowano tylko w fasoli. Kwas p-kumarowy zidentyfikowano w żółtej kukurydzy, wspiędze chińskiej i soi, natomiast kwas ferulowy zidentyfikowano we wszystkich próbkach. Dominującym zidentyfikowanym kwasem fenolowym był kwas ferulowy. Całkowite stężenie kwasów fenolowych w próbkach zmniejszyło się w następującej kolejności: soja > fasola chińska > żółta kukurydza = fasola > pszenicy. Całkowita zdolność przeciwutleniająca (suma wartości testów DPPH, TEAC i ORAC) zmniejszyła się w następujący sposób: soja > fasola > żółta kukurydza = bąb chiński > pszenicy. W badaniu tym stwierdzono, że analiza HPLC oraz testy DPPH, TEAC i ORAC dostarczają przydatnych informacji na temat składu kwasu fenolowego i właściwości przeciwutleniających całych ziaren.
Wprowadzenie
Kwasy fenolowe są jednymi z najważniejszych fitochemikaliów badanych na roślinach ze względu na istotną rolę, jaką odgrywają w obronie roślin przed infekcjami roślinożernymi i grzybiczymi, a także w utrzymaniu wsparcia strukturalnego i integralności tkanek roślinnych1,2. Są obfite w otręby zbóż i okrywę nasienną roślin strączkowych3. Strukturalnie są one podzielone na dwie grupy: kwasy hydroksybenzoesowe ( Rysunek 1) i kwasy hydroksycynamonowe ( Rysunek 2). Powszechne kwasy hydroksybenzoesowe w zbożach i roślinach strączkowych obejmują kwas galusowy, p-hydroksybenzoesowy, 2,4-dihydroksybenzoesowy, protokatechowy, waniliowy i syryngowy, podczas gdy popularne kwasy hydroksycynamonowe obejmują kwas kawowy, p-kumarowy, ferulowy i synapinowy3. Kwasy fenolowe mają również właściwości przeciwutleniające, ponieważ są w stanie wymiatać wolne rodniki, które powodują jełczenie oksydacyjne tłuszczów oraz inicjować i propagować stres oksydacyjny wywołany rodnikami w układach fizjologicznych4,5. Ze względu na tę istotną fizjologiczną rolę jako przeciwutleniacze, są one przedmiotem najnowszych badań. Dzieje się tak, ponieważ spożywane jako składniki pokarmów roślinnych mogą wywierać ochronę przeciwutleniającą.
Zboża i produkty zbożowe są głównymi źródłami węglowodanów dla ludzi i zwierząt na całym świecie6. Zboża obejmują pszenicę, ryż, kukurydzę, jęczmień, pszenżyto, proso i sorgo. Wśród nich najczęściej wykorzystywana jest kukurydza, której szacowane globalne wykorzystanie wyniosło 1 135,7 mln ton w latach 2019/2020, a następnie pszenica z szacowanym globalnym wykorzystaniem 757,5 mln ton w tym samym okresie7. Pokarmy zbożowe są doskonałym źródłem energii dla konsumentów, ponieważ są bogatym źródłem węglowodanów. Dostarczają również trochę białka, tłuszczu, błonnika, witamin i minerałów6. Oprócz wartości odżywczej, zboża są dobrym źródłem fitochemicznych przeciwutleniaczy, w szczególności kwasów fenolowych, które mogą chronić układ fizjologiczny przed uszkodzeniami oksydacyjnymi wywołanymi przez rodniki3. Rośliny strączkowe są również dobrym źródłem składników odżywczych i na ogół zawierają więcej białka niż zboża. Zawierają również witaminy i minerały i są używane do przygotowywania różnych potraw8. Ponadto rośliny strączkowe są dobrym źródłem różnych fitochemicznych przeciwutleniaczy, w tym kwasów fenolowych, flawonoidów, antocyjanów i proantocyjanidyn9,10. Różne odmiany zbóż i roślin strączkowych mogą mieć różny skład kwasów fenolowych. W związku z tym istnieje potrzeba zbadania składu kwasów fenolowych zbóż i roślin strączkowych oraz ich odmian, aby poznać ich potencjalne korzyści zdrowotne w odniesieniu do przeciwutleniaczy fenolowych.
Zgłoszono szereg testów do pomiaru ilości kwasów fenolowych w ziarnach zbóż i roślin strączkowych oraz określania ich aktywności przeciwutleniającej. Najpopularniejszymi metodami analizy pełnoziarnistych kwasów fenolowych są spektrofotometria i chromatografia cieczowa11. Celem pracy było zademonstrowanie uogólnionej metody wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej do oznaczania składu wolnych rozpuszczalnych kwasów fenolowych oraz metod spektrofotometrycznych do oznaczania całkowitej zawartości fenoli i zdolności przeciwutleniających niektórych pełnoziarnistych zbóż i roślin strączkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Rodzaj próbek
- Do niniejszego badania wykorzystaj pięć próbek pełnych ziaren, obejmujących dwa zboża (np. pszenicę twardą i kukurydzę żółtą) oraz trzy rośliny strączkowe (np. fasolę vigna unguiculata, soję i czerwoną fasolę zwyczajną).
- Zmiel 50 g każdego ziaren w trzech powtórzeniach na mąkę, używając młynka do kawy, a następnie przesiać je przez sito o oczkach 500 µm.
- Przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie próbek
- Oznaczanie zawartości suchej masy i przeliczenie na suchą masę
UWAGA: Zawartość suchej masy każdej sproszkowanej próbki należy oznaczyć zgodnie z metodą AOAC (2000)12.- Włączyć suszarkę z wymuszoną konwekcją i ustawić temperaturę na 130 °C.
- Osuszyć środek osuszający (żel krzemionkowy) w suszarce przez 30 min do 1 h, a następnie przenieść osuszony żel krzemionkowy do eksykatora.
- Dokładnie odważyć 2 g każdej próbki do czystego, uprzednio osuszonego i zważonego tygielka aluminiowego.
- Suszyć zważone próbki w temperaturze 130 °C przez 1 h w suszarce z wymuszoną konwekcją.
- Przenieść osuszoną próbkę do eksykatora i pozostawić do ochłodzenia do temperatury otoczenia.
- Zważyć osuszoną i ochłodzoną próbkę i zapisać jej masę.
- Obliczyć zawartość suchej masy każdej próbki według następującego wzoru:
- Przeliczyć każdy zmierzony parametr na suchą masę, korzystając z następującego wzoru:
- Ekstrakcja kwasów fenolowych
UWAGA: Rozpuszczalne wolne związki fenolowe w próbkach ziarna należy ekstrahować przy użyciu modyfikacji metody Y. Qiu i wsp.5, która umożliwia ekstrakcję związków fenolowych z miligramowych ilości całych ziaren.- Dokładnie odważyć 100 mg próbki mąki z całych ziaren bezpośrednio do bursztynowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Ciemny kolor probówki pomaga zapobiec wystawieniu mieszaniny na działanie światła.
- Do każdej probówki zawierającej próbki dodać 1 mL 80% wodnego metanolu klasy HPLC.
- Krótko wymieszać roztwór metanolu z próbkami za pomocą wiru (vortex).
- Próbki poddać sonikacji przez 60 min w celu ekstrakcji wolnych rozpuszczalnych związków fenolowych. Na czas sonikacji przykryć próbki w celu zapewnienia dodatkowej ochrony przed światłem.
- Po sonikacji odwirować mieszaninę z prędkością 20 000 × g przez 5 min, aby osadzić pozostałości stałe, pozostawiając nadosad na górze. Wolne związki fenolowe będą obecne w nadosadzie po wirowaniu.
- Przenieść nadosad do czystej probówki do mikrocentryfugi.
UWAGA: Nadosad należy przefiltrować przed wstrzyknięciem do urządzenia HPLC. Aby przefiltrować nadosad, należy wyjąć tłok z 3 mL strzykawki i założyć filtr strzykawkowy. Filtr powinien mieć rozmiar porów nie większy niż 0,22 µm. - Nabrać pipetą około 0,4 mL nadosadu do górnej części strzykawki. Ponownie włożyć tłok i przepchnąć ciecz przez filtr do fiolki HPLC zawierającej wkład.
- Po skonfigurowaniu urządzenia do przeprowadzenia metody analizy HPLC opisanej w manuskrypcie, załadować fiolki do karuzeli zgodnie z listą próbek.
- Uzyskać chromatogramy HPLC przy 320 nm i 280 nm, wykazujące wyraźne piki reprezentujące różne związki fenolowe.
- Korzystając z odpowiednich krzywych wzorcowych, oznaczyć ilość kwasów hydroksycynamowych przy 320 nm, ponieważ wykazują one maksymalną absorbancję przy tej długości fali. Tą samą zasadą należy kierować się przy oznaczaniu kwasów hydroksybenzoenowych przy 280 nm.
- Pozostałe ekstrakty przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
3. Skład fenolowy
- Użyć chromatografu cieczowego wysokosprawnego (Tabela materiałów) w celu identyfikacji i oznaczenia ilościowo wyekstrahowanych związków fenolowych w próbkach, zgodnie z metodą J. Xiang, F. B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M. C. Katundu i T. Beta 4.
- Przygotować standardy kwasów fenolowych (kwas wanilinowy, kwas kawowy, kwas p-kumarynowy, kwas ferulowy i kwas sinapowy) w celu identyfikacji i oznaczenia ilościowo składowych związków fenolowych w ekstraktach.
- W tym celu odważyć 1 mg każdego standardu i rozpuścić w 1 mL 50% wodnego roztworu metanolu, aby uzyskać stężenie 1 000 µg/mL dla każdego standardu.
- Zmieszać równe objętości wszystkich pięciu standardów w 2 mL bursztynowej probówce wirówkowej, aby przygotować koktajl standardów, w którym każdy związek ma stężenie 200 µg/mL.
- Przygotować rozcieńczenia szeregowe koktajlu standardów, przenosząc określoną objętość do nowej probówki i rozcieńczając ją równą objętością rozpuszczalnika w postaci wodnego metanolu.
- Powtarzać rozcieńczenia szeregowe aż do uzyskania stężenia 3,125 µg/mL.
- Oddzielnie rozcieńczyć każdy standard 40-krotnie rozpuszczalnikiem, aby uzyskać stężenie 25 µg/mL dla każdego standardu.
- Ustawić temperaturę kolumny na 35 °C, a temperaturę autosamplera na 15 °C.
- Aby przygotować fazę ruchomą A (0,1% wodny kwas mrówkowy), przenieść 1 mL kwasu mrówkowego do kolby miarowej o pojemności 1 L i dopełnić wodą klasy HPLC do kreski 1 L. Wstrząsnąć w celu wymieszania.
- Aby przygotować fazę ruchomą B (0,1% kwas mrówkowy w metanolu), przenieść 1 mL kwasu mrówkowego do kolby miarowej o pojemności 1 L i dopełnić metanolem klasy HPLC do kreski 1 L. Wstrząsnąć w celu wymieszania.
- W razie potrzeby skorygować objętości do kreski 1 L.
- Przefiltrować obie fazy ruchome przez hydrofilowy papier filtrujący 0,45 µm.
- Do analizy wstrzyknąć 10 µL każdego ekstraktu lub standardu (standardy 25 µg/mL oraz koktajle standardów) na kolumnę w fazie odwróconej.
- Eluować fazami ruchomymi zgodnie z programem gradientu liniowego dla 25-minutowego przebiegu w następujący sposób: 0-3,81 min, 9%-14% B; 3,81-4,85 min, 14%-15% B; 4,85-5,89 min, 15%-15% B, 5,89-8,32 min, 15%-17% B; 8,32-9,71 min, 17%-19% B; 9,71-10,40 min, 19%-19% B; 10,40-12,48 min, 19%-26% B; 12,48-13,17 min, 16%-28% B; 13,17-14,21 min, 28%-35% B; 14,21-15,95 min, 35%-40% B; 15,95-16,64 min, 40%-48% B; 16,64-18,37 min, 48%-53% B; 18,37-22,53 min, 53%-70% B; 22,53-22,88 min, 70%-90% B; 22,88-25,00 min, 90% B.
- Porównać czasy retencji pików chromatograficznych uzyskanych dla autentycznych standardów o stężeniu 25 µg/mL przy 280 nm i 320 nm z czasami retencji ekstraktów, aby zidentyfikować składowe związki fenolowe w próbkach.
- Wykreślić krzywe kalibracyjne dla koktajli standardów kwasów fenolowych, przyjmując stężenie standardów na osi poziomej, a pole powierzchni piku na osi pionowej.
- Wykorzystać krzywe kalibracyjne do oszacowania stężeń zidentyfikowanych związków fenolowych poprzez porównanie pól powierzchni pików na wykresie z polami powierzchni zidentyfikowanych związków przy 280 nm i 320 nm, jak wspomniano w poprzedniej sekcji.
4. Całkowita zawartość związków fenolowych
UWAGA: Całkowitą zawartość związków fenolowych w ekstraktach należy oznaczyć metodą Folina-Ciocalteu opisaną przez F. B. Apea-Bah i wsp.13.
- Przygotować standardy kwasu ferulowego i kwasu galowego w zakresie stężeń od 0,025 do 0,150 mg/mL w celu wykreślenia krzywych kalibracyjnych do porównania, na potrzeby oznaczania całkowitej zawartości związków fenolowych.
- W tym celu odważyć dokładnie po 1 mg standardów kwasu ferulowego i kwasu galowego do probówek wirówkowych o pojemności 2 mL.
- Do każdego standardu dodać 1 mL 50% wodnego roztworu metanolu i wymieszać w wortexie do rozpuszczenia, otrzymując roztwory stokowe każdego standardu o stężeniu 1 mg/mL.
- Przygotować serię rozcieńczeń z każdego roztworu stokowego o całkowitej objętości 500 µL.
- Nanieść pipetą 18,2 µL każdego ekstraktu lub standardu do osobnych dołków na mikropłytce 96-dołkowej.
- Do każdego ekstraktu lub standardu dodać 36,4 µL 10% (v/v) wodnego odczynnika Folina-Ciocalteu.
- Następnie do każdej mieszaniny reakcyjnej dodać 145,4 µL 700 mM węglanu sodu.
- Inkubować mieszaniny reakcyjne w ciemności w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 2 h.
- Odczytać absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 750 nm.
- Wykreślić krzywe kalibracyjne zmiany absorbancji w funkcji stężenia standardów kwasów fenolowych i wykorzystać je do oszacowania całkowitej zawartości związków fenolowych.
- Wyniki wyrazić jako miligramy ekwiwalentu kwasu ferulowego na gram zmielonej próbki (mg FAE/g) oraz miligramy ekwiwalentu kwasu galowego na gram zmielonej próbki (mg GAE/g) w przeliczeniu na suchą masę.
5. Testy przeciwutleniające
UWAGA: Wyznacz potencjał przeciwutleniający ekstraktów z ziarna, wykorzystując następujące trzy testy: zdolność do wymiatania wolnych rodników 2,2-difenilo-1-pikrylohydrazylu (DPPH); zdolność do wymiatania wolnych rodników 2,2'-azino-bis(3-etylbenzotiazolino-6-sulfonowego kwasu) (ABTS), nazywaną również przeciwutleniającą zdolnością równoważną Trolox (TEAC); oraz zdolność absorbancji rodników tlenowych (ORAC).
- Przygotowanie standardów Trolox do krzywych wzorcowych
- Użyj Trolox, rozpuszczalnego w wodzie analogu witaminy E, jako standardu do oszacowania potencjału przeciwutleniającego in vitro ekstraktów z pełnego ziarna.
- Odważ dokładnie 1 mg Trolox do probówki o pojemności 15 mL. Rozpuść w 4 mL 50% wodnego roztworu metanolu. Wymieszaj w wortexie do rozpuszczenia, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 1 mM (1000 µM).
- Przygotuj sześć stężeń Trolox, tj. 50, 100, 200, 400, 600 i 800 µM, aby wykreślić krzywe wzorcowe do oszacowania zdolności neutralizacji rodników DPPH oraz przeciwutleniającej zdolności równoważnej Trolox (TEAC). Podobnie przygotuj stężenia Trolox 6,25, 12,5, 25 i 50 µM do oszacowania zdolności pochłaniania rodników tlenowych (ORAC). Doprowadź całkowitą objętość każdego stężenia do 500 µL, zgodnie z treścią Tabeli 1.
- Rozcieńczenie ekstraktów z próbek
- Rozcieńcz ekstrakty z próbek metanolem przed analizą. W tym przypadku ekstrakty z żółtej kukurydzy i fasoli grochowej rozcieńczono dwukrotnie, z pszenicy i fasoli zwyczajnej pięciokrotnie, natomiast ekstrakt z soi rozcieńczono 10-krotnie metanolem.
- Oznaczenie przeciwutleniającej zdolności równoważnej Trolox (TEAC)
- Zmierz przeciwutleniającą zdolność równoważną Trolox (TEAC) próbek metodą opisaną wcześniej przez F. B. Apea-Bah i współpracowników14.
- Odważ 8,23 mg ABTS do czystej bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 mL.
- Następnie odważ 1,62 mg nadtlenanu potasu do drugiej czystej bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 mL.
- Dodaj 1 mL wody destylowanej do każdej z nich i wymieszaj w wortexie do rozpuszczenia.
UWAGA: W wyniku tego powstanie 16 mM roztwór stokowy ABTS z 6 mM wodnym roztworem nadtlenanu potasu. - Przygotuj roztwór stokowy ABTS, mieszając roztwory ABTS i nadtlenanu potasu w równych objętościach. Roztwór natychmiast zmieni barwę na ciemną.
- Inkubuj mieszaninę odczynników w ciemności przez 12-16 h.
- Rozcieńcz roztwór stokowy ABTS 30-krotnie za pomocą 200 mM fosforanowego buforu soli fizjologicznej (PBS), aby utworzyć roztwór roboczy ABTS. Aby to zrobić, dodaj 58 mL 200 mM PBS do 2 mL roztworu stokowego ABTS. Roztwór roboczy będzie zawierał 0,27 mM ABTS i 0,1 mM nadtlenanu potasu.
- Do analizy nanieś 10 µL każdego rozcieńczonego ekstraktu lub standardu Trolox na mikropłytkę 96-dołkową.
- Dodaj 190 µL roztworu roboczego ABTS do każdego dołka i inkubuj mieszaniny reakcyjne przez 60 min.
- Zmierz absorbancję mieszanin reakcyjnych przy 750 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
- Użyj standardów Trolox w stężeniu od 100 do 800 µmol/L do wykreślenia krzywej kalibracyjnej.
- Oszacuj zdolność neutralizacji rodników ABTS na podstawie krzywej kalibracyjnej.
- Wyraź wyniki jako mikromole równoważników Trolox na gram (µmol TE/g) próbki w przeliczeniu na suchą masę.
- Oznaczenie DPPH
UWAGA: Określ zdolność neutralizacji rodników DPPH próbek metodą opisaną wcześniej przez F. B. Apea-Bah i współpracowników13. Test przeciwutleniający DPPH wymaga związku generującego rodniki, DPPH (2,2-difenilo-1-pikrylhydrazylu).- Odważ dokładnie 1,2 mg DPPH do pustej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Rozpuść DPPH w 30 mL metanolu, aby przygotować 60 µmol/L roztwór metanolowy.
UWAGA: Test DPPH sprawdza zdolność ekstraktów z próbek do neutralizacji wolnych rodników generowanych przez DPPH. - Do analizy dodaj 5 µL ekstraktów z próbek lub roztworu Trolox do dołków mikropłytki.
- Następnie dodaj 195 µL 60 µmol/L metanolowego roztworu DPPH i inkubuj przez 60 min.
- Zmierz absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy 515 nm.
- Użyj standardów Trolox (50-800 µmol/L) do wykreślenia krzywej kalibracyjnej, gdzie zmiana absorbancji znajduje się na osi pionowej, a stężenia Trolox na osi poziomej.
- Oszacuj zdolność neutralizacji DPPH na podstawie krzywej kalibracyjnej.
- Wyraź wyniki jako mikromole równoważników Trolox na gram (µmol TE/g) próbki w przeliczeniu na suchą masę.
- Odważ dokładnie 1,2 mg DPPH do pustej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Rozpuść DPPH w 30 mL metanolu, aby przygotować 60 µmol/L roztwór metanolowy.
- Zdolność pochłaniania rodników tlenowych
- Określ zdolność pochłaniania rodników tlenowych (ORAC) próbek na podstawie metody F. B. Apea-Bah i współpracowników13.
- Na początek przygotuj standardy Trolox o stężeniach 6,25, 12,5, 25 i 50 µM z 1000 µM roztworu stokowego standardu Trolox w 75 mM buforze fosforanowym potasu (K2HPO4/KH2PO4).
- Aby to zrobić, odważ 1 mg proszku Trolox i rozpuść w 4 mL roztworu buforowego podczas sonikacji, aby przygotować roztwór stokowy 1000 µM.
- Następnie pobierz 50 µL roztworu stokowego do probówki wirówkowej o pojemności 2 mL i rozcieńcz 950 µL roztworem buforowym, aby uzyskać 1000 µL roztworu Trolox 50 µM.
- Pipetuj 500 µL roztworu 50 µM do nowej probówki i rozcieńcz równą objętością buforu, aby uzyskać roztwór Trolox 25 µM.
- Powtórz rozcieńczanie seryjne roztworu 25 µM, aby uzyskać 12,5 µM, a następnie analogicznie powtórz rozcieńczanie 12,5 µM, aby uzyskać 6,25 µM.
- Przygotuj odpowiednie rozcieńczenia ekstraktów z próbek.
- Rozcieńcz ekstrakty z żółtej kukurydzy i fasoli grochowej 20-krotnie, ekstrakty z pszenicy i fasoli zwyczajnej 50-krotnie, a ekstrakt z soi 100-krotnie roztworem buforowym.
- Przenieś 200 µL każdej próbki lub standardu Trolox do dołków czarnej mikropłytki 96-dołkowej w celu automatycznego pipetowania.
- Następnie napełnij trzy zbiorniki na odczynniki dostarczone z urządzeniem ORAC w następujący sposób: (1) roztwór buforowy; (2) 0,816 nM fluoresceiny w buforze; oraz (3) 153 mM 2,2′-azobis(2-amidinopropanu) dihydrochlorku (AAPH) w buforze.
- Umieść je w ich gniazdach do automatycznego pipetowania.
- Skonfiguruj urządzenie ORAC i system automatycznego pipetowania do analizy zgodnie ze standardową procedurą operacyjną.
- Do analizy ustaw system automatycznego pipetowania tak, aby przeniósł 25 µL każdego rozcieńczonego ekstraktu lub standardu do dołków czarnej mikropłytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem.
- Następnie automatycznie dodaj 150 µL 0,816 nM fluoresceiny w buforze.
- Inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 15 min w urządzeniu ORAC.
- Następnie automatycznie dodaj 25 µL AAPH do każdej mieszaniny reakcyjnej.
- Inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 50 min w urządzeniu ORAC.
- Ustaw urządzenie ORAC tak, aby mierzyło zanik fluorescencji w okresie inkubacji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 nm i 520 nm.
- Po pomiarach wykreśl krzywą wzorcową Trolox, z Trolox (6,25-50 µM) na osi poziomej i zanikiem fluorescencji na osi pionowej.
- Oszacuj zdolność pochłaniania rodników tlenowych ekstraktów z krzywej wzorcowej Trolox.
- Wyraź wyniki jako µmol TE/g próbki w przeliczeniu na suchą masę.
- Analiza statystyczna
- Przedstaw wszystkie wyniki jako średnie ± odchylenie standardowe z co najmniej trzech powtórzeń.
- Przeprowadź analizę wariancji (ANOVA), aby określić wpływ rodzaju ziarna na zmienne odpowiedzi.
- W przypadku wystąpienia istotnych różnic przy p < 0,05, użyj najmniejszej istotnej różnicy (LSD) do porównania średnich.
- Przeprowadź analizę korelacji Persona, aby oszacować związek między zawartością związków fenolowych a potencjałem przeciwutleniającym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tabela 2 przedstawia kwasy fenolowe zidentyfikowane w ziarnach zbóż i roślin strączkowych. Na podstawie dostępnych wzorców autentycznych w próbkach zidentyfikowano cztery kwasy fenolowe: kwas wanilinowy, kwas kofeinowy, kwas p-kumarowy oraz kwas ferulowy. Kwas wanilinowy jest kwasem hydroksybenzoesowym, natomiast pozostałe trzy to kwasy hydroksycynamowe. Kwas wanilinowy zidentyfikowano wyłącznie w fasoli Blackeye, natomiast kwas kofeinowy wyłącznie w fasoli czerwonej. Kwas p-kumarowy zi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Produkty pełnoziarniste zostały wybrane jako reprezentatywne ziarna zbóż i roślin strączkowych, które znajdują szerokie zastosowanie w żywności na całym świecie. Chociaż mogą występować różnice między odmianami każdego ziarna, celem tego badania było zademonstrowanie uogólnionej metody ekstrakcji i analizy wolnego kwasu fenolowego dla całych ziaren. Metoda ekstrakcji została zmodyfikowana poprzez znaczne zmniejszenie ilości próbek i rozpuszczalników, w celu zmniejszenia ilości substancji chemicznych, które zostałyby uwol...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie techniczne Pani Alison Ser i Pani Hannah Oduro-Obeng, a także wsparcie w edycji wideo przez Panią Janice Fajardo i Pana Miguela del Rosario.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 ml stożkowe probówki wirówkowe Falcon | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 ml fiolka ze szkła bursztynowego ID Surestop | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Bursztynowe probówki do mikrowirówek | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropan) dichlorowodorek (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| Kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥ 98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Kwas | ||
| (Trolox) (C14H18O4), ≥ 98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Nasadki gwintowane na fiolki | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96-dołkowe płaskie płytki | denne Fisher Scientific | 12565501 | |
| Czytnik mikropłytek Agilent BioTek ELx800 | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automatyczny system pipetowania mikropłytek | Fisher Scientific | N/A | |
| Czytnik fluorescencji mikropłytek Agilent BioTek FLx800 | Fisher Scientific | N/A | |
| Waga analityczna SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | |||
| BD 3 mL Luer-Lok Tip | 309657 | ||
| Myjka ultradźwiękowa Branson, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Filtr Durapore (0,45 &mikro; m Membrana PVDF) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Filtry membranowe Durapore (0,45 &mikro; m HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0,5-10 i mikro; L | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus 0,5-5 ml | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 i mikro; L | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 i mikro; L | Eppendorf | 3123000047 | |
| Octan etylu, klasa HPLC | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Wzorzec kwasu ferulowego | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluoresceina | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Odczynnik fenolowy Ciocalteu | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Kwas mrówkowy, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3A | 27048-0010 | |
| Wzorzec kwasu galusowego | Sigma | G7384 | |
| Wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC), Wody 2695 | Wody | 960402 | |
| Metanol, klasa HPLC | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Końcówki do mikropipet, 0,5-10 i mikro; L | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Mikrowirówka Sorvall Legend Micro 21 Wirówka | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Mikropipeta wielokanałowa, Proline Plus, 30-300 i mikro; L | Sartorius | 728240 | |
| Detektor matrycowy fotodiodowy, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Końcówki do pipet, 1000 µ L | VWR | 83007-382 | |
| Końcówki do pipet, 1-5 ml | VWR | 82018-840 | |
| Nadsiarczan potasu (K2S2O8), ≥ 99,0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodny (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Kolba do gotowania z krótką szyjką, Okrągłe dno | Corning | 4321-250 | |
| Kolumna analityczna C18 z odwróconą fazą (100 x 3 mm) Parownik Roto Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| IKA RV 10 | IKA& | nbsp; | |
| Węglan sodu (NaCO3) bezwodny | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny (NaH2PO4) | Bioodczynniki Fisher | BP329-500 | |
| Standaryzacja końcówek do pipet 0-200 i mikro; L | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Jednostka filtrująca napędzana strzykawką (0,22 i mikro; m) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Wkładka do fiolki z mikrosertami Target (400 µ L) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultraczysta woda (system Direct Q-3 UV z pompą) | Millipore | ZRQSVP030 |
Bibliografia
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478(2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27(2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158(2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
