Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Podsumowanie

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Streszczenie

Pandemia COVID-19 uwypukliła potrzebę szybkich, wysokoprzepustowych metod do czułego i specyficznego wykrywania serologicznego infekcji nowymi patogenami, takimi jak SARS-CoV-2. Multipleksowe testy serologiczne mogą być szczególnie przydatne, ponieważ mogą jednocześnie analizować przeciwciała przeciwko wielu antygenom, co optymalizuje pokrycie patogenów i kontroluje zmienność organizmu i indywidualną odpowiedź gospodarza. Tutaj opisujemy test oparty na mikrosferach fluorescencyjnych SARS-CoV-2 IgG 3-plex, który może wykryć zarówno przeciwciała IgM, jak i IgG przeciwko trzem głównym antygenom SARS-CoV-2 - białku kolca (S), domenie wiążącej receptor (RBD) enzymu konwertującego angiotensynę (ACE2) i nukleokapsydu (Nc). Wykazano, że test ma porównywalną wydajność do testu referencyjnego SARS-CoV-2 na IgG w surowicy uzyskanej po ≥21 dniach od wystąpienia objawów, ale miał wyższą czułość w przypadku próbek pobranych w ≤5 dniu od wystąpienia objawów. Ponadto, stosując rozpuszczalny ACE2 w formacie testu neutralizacji, wykazano hamowanie wiązania przeciwciał dla S i RBD.

Wprowadzenie

Pandemia COVID-19 uwypukliła znaczenie możliwości szybkiego opracowania i wdrożenia szybkich, wysokowydajnych i wydajnych testów serologicznych, które mogą być wykorzystywane do diagnozowania i nadzoru nad nowymi patogenami, takimi jak SARS-CoV-2. Multipleksowe testy serologiczne mogą być niezwykle przydatne w czasie pandemii, ponieważ mogą jednocześnie analizować przeciwciała przeciwko wielu antygenom, co zapewnia szeroki zakres patogenów i kontrolę zmienności organizmu i odpowiedzi gospodarza na infekcję. Niedawno poinformowano o opracowaniu multipleksowego testu fluorescencyjnego opartego na kulkach, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), który może wykrywać przeciwciała przeciwko białku kolca (S), domenie wiążącej receptor (RBD) enzymu konwertującego angiotensynę angiotensynę (ACE2) i nukleokapsydu (Nc) SARS-CoV-2¹. Wykazano, że 3Flex ma porównywalną wydajność do referencyjnego testu IgG SARS-CoV-2 dla surowicy uzyskanej po ≥21 dniach od wystąpienia objawów, ale miał wyższą czułość w przypadku próbek pobranych w ≤5 dniu od wystąpienia objawów. Dodatkowo wykazano hamowanie wiązania przeciwciał dla antygenów S i RBD przy użyciu rozpuszczalnego ACE2 w formacie testu neutralizacji. Technologia oparta na koralikach multipleksowych została szeroko przyjęta jako sprawdzona technologia wielopoziomowych testów serologicznych i ma wyraźne zalety w badaniach przesiewowych na dużą skalę, w tym krótki czas uzyskania wyników, wymagania dotyczące małych próbek i zmniejszony nakład pracy^2,3,4.

Niedawno udostępniono nowe narzędzie do analizy przepływu, które zapewnia taką samą zdolność do obsługi i przepustowości jak system zademonstrowany w poprzedniej pracy¹, ale z dodatkową korzyścią w postaci dwóch kanałów reporterskich. Możliwość pomiaru dwóch fluorescencyjnych sygnałów reporterowych w jednej reakcji pozwala na ocenę dwóch wyników dla każdego analitu dla każdej próbki i jest idealna do zastosowań izotypowych, które zazwyczaj muszą być wykonywane w oddzielnych studniach reakcyjnych⁵. Funkcja podwójnego reportera zapewnia dwukrotnie więcej danych dla każdej próbki w o połowę mniejszej liczbie studzienek reakcyjnych przy połowie wymagań dotyczących objętości próbki, a tym samym ma wyraźną przewagę nad systemami z pojedynczym reporterem. Badanie to szczegółowo opisuje standardowy protokół testu serologicznego i opisuje adaptację do testu neutralizacji. Ponadto w niniejszym raporcie opisano konwersję testu z pojedynczym reporterem na test serologiczny z podwójnym reporterem, a następnie test z podwójną neutralizacją reporterową, w celu jednoczesnego pomiaru przeciwciał neutralizujących zarówno izotypów IgG, jak i IgM przeciwko antygenom SARS-CoV-2 S, RBD i Nc. Wizualny przegląd protokołu testu znajduje się w Rysunek 1.

Protokół

Pozostałe próbki ludzkiej surowicy, wcześniej testowane pod kątem analiz diagnostycznych SARS-CoV-2, zostały wykorzystane w tym badaniu, które zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Rochester.

1. Odczynniki i sprzęt

1. Pozyskiwanie antygenów koronawirusa oraz ludzkich IgG i IgM ze źródeł komercyjnych.
2. Zaopatrz się w zestawy kulek do kontroli testów (AC) (45 i 220) od dostawcy urządzenia. Zestaw koralików AC 45 monitoruje zbieranie mediany intensywności fluorescencji (MFI) na instrumentach z pojedynczym kanałem reporterowym (RP1). Zestaw koralików AC 220 monitoruje odbiór MFI na drugim kanale reporterowym (RP2).
3. Uzyskać przeciwciała wykrywające i swoiste dla antygenu surowice królika oraz przeciwciała stosowane do potwierdzenia sprzęgnięcia.
4. Przeprowadzić detekcję za pomocą przeciwciał znakowanych biotyną ze streptawidyną, koniugatem R-fikoerytryny (SAPE) lub koniugatem streptawidyny fluoroforu Super Bright 436 (SASB; wzbudzenie przy 405 nanometrach (nm) i emisja przy 436 nm).
5. Uzyskaj ludzkie białko ACE2 (tj. Receptor SARS). Przed użyciem należy ponownie uwodnić liofilizowane białko ACE2 przez rozpuszczenie do stężenia 1 mg/ml w wodzie wolnej od nukleaz (nie poddanej działaniu DEPC, autoklawowanej i sterylnie filtrowanej 0,2 μm) i przechowywanej w temperaturze 4 °C.
6. Wszystkie reakcje należy przeprowadzić w 96-dołkowych, niewiążących powierzchniowo (NBS) czarnych płytkach o płaskim dnie. Uszczelnij płytki aluminiową taśmą uszczelniającą z 96 dołkami do mikropłytek na etapach inkubacji testu. Użyj magnetycznego separatora płytkowego do etapów mycia testu.

2. Przygotowanie koralików kontrolnych sprzężonych z antygenem i przeciwciałami

1. Kowalencyjnie połącz zestawy mikrosfer magnetycznych, polistyrenowych i oznaczonych kolorami (średnica 6,5 μm) z antygenami S, RBD i Nc, jak opisano w Cameron et al.¹. Antygeny koronawirusa są sprzężone w 10 pmol/10⁶ kulek (S) i 100 pmol/10⁶ kulek (RBD i Nc). Koraliki kontrolne sprzężone z ludzką IgG lub IgM są generowane zgodnie z wcześniejszym opisem¹. IgG i IgM są sprzężone przy 5 μg/10⁶ kulkach.
2. Po sprzężeniu określ stężenia kulek i rozcieńcz każdy materiał do 1 x 10⁶ kulek/ml zgodnie z opisanymi procedurami⁶.
3. Wykonaj potwierdzenie sprzężenia antygenu z przeciwciałami specyficznymi dla antygenu od królika lub z dodatnimi surowicami ludzkimi, jak opisano w Cameron et al.¹.
   1. Potwierdź sprzężenie ludzkiej IgG za pomocą biotynylowanych anty-ludzkich odczynników do wykrywania IgG/SAPE w teście, a sprzężenie IgM za pomocą znakowanej fikoerytryną (PE) koziego anty-ludzkiego IgM.
      UWAGA: Potwierdzenie sprzężenia przeprowadza się za pomocą miareczkowania surowicy lub przeciwciała specyficznego dla białka, ponieważ optymalne stężenie do użycia dla tych odczynników nie jest znane. W przypadku surowicy stosuje się seryjne rozcieńczenia krotne, natomiast w przypadku przeciwciał dostarczanych w postaci zapasów mg/ml stosuje się serię seryjnych rozcieńczeń μg/ml.
4. Rozcieńczyć kulki kontrolne (AC), które monitorują zbieranie MFI w dwóch kanałach reporterowych do stężenia 1 x 10⁶ kulek / ml przed użyciem w mieszankach kulek multipleksowych.

3. Przygotowanie świeżej mieszanki koralików multipleksowych

1. Codziennie przygotowuj świeżo mieszane koraliki multipleksowe z pojedynczych sprzężonych koralików i kontroluj zapasy koralików w ilości 1 x 10⁶ kulek / ml.
   UWAGA: Mieszanki kulek Multiplex są przygotowane do dostarczenia 2,500 kulek na każdy region kulek w objętości 50 μl. Obliczenia dotyczące przygotowania mieszanek kulkowych multipleksowych dla dowolnej liczby reakcji opisano na blogu opublikowanym przez Angeloni (2020)⁶.

4. Rozcieńczenie próbki

1. Przygotować próbkę surowicy w stosunku 1:100, mieszając 10 μl surowicy z 990 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,05% Tween 20, 0,02% azydku sodu i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor PBS-TBN).
2. Próbki ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, dodając 20 μl rozcieńczenia 1:100 do 180 μl PBS-TBN.
   UWAGA: Próbki surowicy składają się z ujemnych surowic surowicowych pobranych w 2019 r. przed pandemią COVID-19 oraz dodatnich surowic od pacjentów z dodatnim wynikiem testu PCR na obecność SARS-CoV-2, reprezentujących niskie i wysokie miana przeciwciał. Dodatnie próbki pobierano między ≈3 a >60 dni od wystąpienia objawów (DFSO). Wszystkie próbki surowicy i ujemne surowice kontrolne pozbawione IgG rozcieńcza się w stosunku 1:1000, jak opisano poniżej. W przypadku testów neutralizacji surowice rozcieńcza się w stosunku 1:500, jak opisano w poniższych protokołach neutralizacji (sekcje 6 i 8).

5. Protokół testu serologicznego z pojedynczym reporterem

1. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
2. Odmierzyć pipetą 50 μl surowicy w skali 1:1000 lub PBS-TBN do odpowiednich studzienek; końcowe rozcieńczenie surowicy w studzience wynosi 1:2000.
3. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
4. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
5. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
6. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
7. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze płukanie inkubacyjne po pobraniu próbki).
   1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
   2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
   3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
   4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
   5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
8. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (drugie płukanie inkubacyjne po pobraniu próbki).
   1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
   2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
   3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
   4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
   5. Zdejmij płytkę z magnesu.
9. Przygotuj świeżą mieszankę biotyny anty-ludzkiej IgG z SAPE, rozcieńczając przeciwciało do 0,62 μg / ml i SAPE do 1 μg / ml. Dodaj 100 μl do każdego dołka.
10. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
11. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
12. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
13. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
14. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze płukanie inkubacją przeciwciał po wykryciu).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
15. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (drugie płukanie inkubacyjne przeciwciał po wykryciu).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytek i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Zdejmij płytkę z magnesu.
16. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
17. Przykryć folią uszczelniającą i wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
18. Wyjąć płytkę z wytrząsarki do płyt. Następnie zdejmij uszczelkę foliową i odczytaj 50 μl każdej studzienki na analizatorze przepływu zgodnie z instrukcją obsługi. Krótki opis znajduje się poniżej.
    1. Wybierz menu rozwijane w lewym górnym rogu ekranu i przejdź do opcji Konfiguracja blachy.
    2. Wybierz opcję Uruchom blachę.
    3. Wybierz ikonę Wysuń, aby wysunąć nośnik płyty.
    4. Załaduj tabliczkę na nośnik płyty i wybierz ikonę Wycofaj, aby schować nośnik płyty.
    5. Wybierz ikonę Uruchom, aby uruchomić blachę.

6. Protokół testu neutralizacji z pojedynczym reporterem

1. Przygotuj świeżą mieszankę kulek multipleksowych, jak opisano w sekcji 3 powyżej.
2. Rozcieńczyć surowicę pacjenta i kontrolną w stosunku 1:500 w następujący sposób.
   1. Rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:100, mieszając 10 μl surowicy z 990 μl PBS-TBN.
   2. Rozcieńczyć surowicę jeszcze 5-krotnie, dodając 40 μl surowicy w skali 1:100 do 160 μl PBS-TBN.
3. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
4. Dodać 25 μl rozcieńczenia 2 μg/ml ACE2 do każdej studzienki.
5. Przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem z mikropłytką i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytek w temperaturze 37 °C przez 2 minuty z wytrząsaniem z prędkością 600 obr./min.
6. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i usuń uszczelkę foliową.
7. Dodaj 25 μl surowicy 1:500 lub PBS-TBN do przypisanych studzienek.
8. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
9. W pozostałej części procedury oznaczania należy postępować zgodnie z krokami od 5.4 do 5.18.5, jak opisano powyżej.

7. Konwersja do podwójnego testu serologicznego IgG i IgM

1. Przygotować kulki sprzężone z antygenem, jak opisano w sekcji 2 powyżej.
   UWAGA: W zestawie znajduje się dodatkowy zestaw kulek w połączeniu z ludzką IgM do monitorowania dodania odczynników do wykrywania anty-IgM, a także dodatkowy zestaw kulek AC (220) do monitorowania zbierania MFI dla RP2. Wszystkie zapasy kulek są w rozmiarze 1 x 10⁶ kulek/ml do włączenia do mieszanek kulek multipleksowych, jak opisano poniżej.
2. Przygotuj świeże mieszanki kulek multipleksowych zgodnie z opisem w sekcji 3 powyżej.
3. Rozcieńczyć próbki surowicy i ujemne surowice kontrolne pozbawione IgG w stosunku 1:1000, jak opisano w sekcji 4 powyżej.
4. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
5. Odpipetować 50 μl surowicy 1:1000 lub PBS-TBN do odpowiednich studzienek. Końcowe rozcieńczenie surowicy w studzience wynosi 1:2000.
6. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
7. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
8. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
9. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
10. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze płukanie inkubacyjne po pobraniu próbki).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
11. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie inkubacyjne po próbce), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 7.10.1-7.10.5.
12. Zdejmij płytkę z magnesu.
13. Przygotuj świeży odczynnik do wykrywania zmieszany z wymaganą kombinacją odczynników i dodaj 50 μl lub 100 μl do każdego dołka.
    UWAGA: Mieszaniny odczynników detekcyjnych zawierające anty-ludzką IgG sprzężoną z barwnikiem reporterowym Brilliant Violet 421 (BV; wzbudzenie przy 405 nm i emisja przy 421 nm) stosowano przy 50 μl / dołku ze względu na ograniczone ilości dostępnych odczynników podstawowych. Wszystkie inne mieszaniny odczynników detekcyjnych stosuje się w stężeniu 100 μl/studzienkę.
14. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
15. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
16. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
17. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
18. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem za pomocą PBS-TBN (pierwsze płukanie po wykryciu inkubacji przeciwciał).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
19. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie po wykryciu inkubacji przeciwciał), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 7.17.1-7.17.5.
20. Zdejmij płytkę z magnesu.
21. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
22. Przykryć folią uszczelniającą i wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
23. Wyjąć płytkę z wytrząsarki do płyt. Następnie zdejmij uszczelkę foliową i odczytaj 50 μl każdej studzienki na analizatorze przepływu, jak opisano powyżej w krokach 5.18.1-5.18-5.

8. Konwersja do testu neutralizacji z podwójnym reporterem

1. Użyj sprzężonych koralików zgodnie z opisem w kroku 7.1 powyżej.
2. Przygotuj świeżą mieszankę kulek multipleksowych zgodnie z opisem w kroku 7.2.
3. Próbki surowicy i ujemne surowice kontrolne pozbawione IgG rozcieńcza się w stosunku 1:500 w następujący sposób.
   1. Przygotować rozcieńczenie w stosunku 1:100, mieszając 10 μl surowicy z 990 μl PBS-TBN.
   2. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:100 jeszcze 5-krotnie, dodając 40 μl rozcieńczeń w stosunku 1:100 do 160 μl PBS-TBN.
4. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
5. Dodać 25 μl rozcieńczenia 2 μg/ml ACE2 do każdej studzienki.
6. Przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem z mikropłytką i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytek w temperaturze 37 °C przez 2 minuty z wytrząsaniem z prędkością 600 obr./min.
7. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i usuń uszczelkę foliową.
8. Dodaj 25 μl surowicy 1:500 lub PBS-TBN do przypisanych studzienek.
9. Przykryć płytkę uszczelką foliową i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytek w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem z prędkością 600 obr./min.
10. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
11. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
12. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
13. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze mycie po inkubacji próbki).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
14. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie po inkubacji próbki), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 8.13.1-8.13.5.
15. Zdejmij płytkę z magnesu.
16. Przygotuj świeży odczynnik do wykrywania zmieszany z wymaganą kombinacją odczynników i dodaj 50 μl lub 100 μl do każdego dołka.
    UWAGA: Mieszaniny odczynników detekcyjnych zawierające anty-ludzką IgG sprzężoną z barwnikiem reporterowym BV stosowano w dawce 50 μl / dołek ze względu na ograniczone ilości dostępnych odczynników podstawowych (patrz Tabela materiałów). Wszystkie inne mieszaniny odczynników detekcyjnych stosuje się w stężeniu 100 μl/studzienkę.
17. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
18. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
19. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
20. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
21. Umyj studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsza nastąpiła po wykryciu inkubacji przeciwciał).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
22. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie po wykryciu inkubacji przeciwciał), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 8.21.1-8.21.5.
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytek i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Zdejmij płytkę z magnesu.
23. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
24. Przykryć folią uszczelniającą i wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
25. Wyjąć płytkę z wytrząsarki do płyt. Następnie zdejmij uszczelkę foliową i odczytaj 50 μl każdej studzienki na analizatorze przepływu, jak opisano powyżej w krokach 5.18.1-5.18-5.

Wyniki

Optymalizacja testu serologicznego z pojedynczym reporterem.
Strategia sprzęgania dla wszystkich antygenów SARS-CoV-2 została opisana w Cameron, et al., 2020¹ oraz w kroku 2.1 powyżej. Strategia potwierdzania sprzężenia została opisana w kroku 2.3 powyżej. Aby zapewnić skuteczne sprzężenie, średnie wartości intensywności fluorescencji (MFI) powinny być znacznie wyższe niż reakcja(-e) kontroli ujemnej bez surowicy/bez przeciwciała i powinny wykazywać odpowiedź na dawkę malejącego sygnału MFI przy zmniejszających się ilościach odczynnika wykrywającego. MIF o wielkości około 1 000 lub więcej jednostek MIF w stosunku do MIF tła na ogół wskazują na efektywne sprzężenie białek i są zależne od stężenia i swoistości zastosowanego odczynnika wykrywającego. Za pomocą tej metody przetestowano potwierdzenie sprzężenia antygenu S, RBD i Nc dla dwóch partii koralików (Rysunek 2). Sygnały MFI dla wszystkich antygenów były znacznie wyższe niż sygnały tła MFI i wykazywały odpowiedź na dawkę z miareczkowaniem odczynników wykrywających. Dane wykazały również dobrą odtwarzalność poziomów MIF między dwiema różnymi partiami sprzężonych koralików.

Optymalizacja testu pojedynczego reportera została przeprowadzona zgodnie z opisem w Cameron, et al., 2020¹. Każdy antygen testowano w różnych stężeniach sprzęgania z różnymi rozcieńczeniami kilku próbek surowicy reprezentujących próbki wysokie, średnie, niskie i ujemne. Ponadto, ponieważ test mierzy miana IgG, surowicę pozbawioną IgG użyto jako dodatkowej próbki ujemnej. Wyniki reprezentatywnej serii rozcieńczeń próbki z różnymi poziomami sprzęgania antygenu przedstawiono na Rysunek 3. Ta początkowa seria rozcieńczeń została przetestowana ze stałym stężeniem odczynników wykrywających, aby uzyskać potencjalny zakres reprezentatywnych poziomów MFI specyficznych dla antygenu i tła. Na podstawie tych danych określono dodatkowe zakresy rozcieńczenia próbki i poziomy sprzężenia antygenu, a następnie przetestowano je z dodatkowymi próbkami (dane nie pokazano).

Następnie, stężenie odczynnika do wykrywania zostało zoptymalizowane do użycia z różnymi rozcieńczeniami surowicy i poziomami sprzężenia antygenu. Reprezentatywne dane z 6 próbek dodatnich i 2 ujemnych przedstawiono na rysunku Rysunek 4. Po przeprowadzeniu dodatkowych testów z kilkuset ujemnymi próbkami surowicy sprzed COVID-19 do końcowego protokołu testu wybrano ostateczne optymalne poziomy sprzężenia antygenów i wykrywalne stężenia regentów, jak opisano w sekcji 5.

Konwersja na pojedynczy test neutralizacji reporterowej
Konwersję testu serologicznego z pojedynczym reporterem na test neutralizacji osiągnięto poprzez dodanie etapu inkubacji przy użyciu ACE2 (jako konkurencyjnego odczynnika) z kulkami przed dodaniem próbki surowicy. Poprzez miareczkowanie ilości dodanego ACE2 zaobserwowano hamowanie wiązania IgG z antygenami S i RBD, jak pokazano na Figura 5. Podczas gdy 11 surowic pacjenta miało różne miana IgG, każda z nich wykazywała znaczny spadek sygnału MFI wraz ze wzrostem stężenia ACE2. Zgodnie z oczekiwaniami, ACE2 wpływa tylko na sygnały MFI S i RBD, ale nie na antygen Nc.

Procentowy resztkowy sygnał MFI w stosunku do 0 μg/mL ACE2 dla wszystkich próbek jest pokazany w Rysunek 6. Dla większości próbek zaobserwowano utratę sygnału >30% dla S i RBD wraz ze wzrostem stężenia ACE2. Zgodnie z oczekiwaniami nie stwierdzono wpływu ACE2 na sygnał Nc.

Konwersja do testu serologicznego IgG i IgM z podwójnym reporterem
W przypadku testu z podwójnym reporterem IgG i IgM zastosowano standardowe warunki testu z pojedynczym reporterem do przetestowania różnych kombinacji przeciwciał i reporterów dla dwóch kanałów reporterowych. Kanał RP1 jest podobny do poprzednich przyrządów do analizy przepływu z detekcją "pomarańczowej" fluorescencji dla barwników reporterowych, takich jak PE. Drugi kanał, RP2, wykorzystuje fioletowy laser wzbudzający, który może być używany do wykrywania "niebieskiej" fluorescencji barwników wzbudzonych przy 402 nm z pikami widm emisyjnych w zakresie 421-441 nm.

Kilka różnych kombinacji przeciwciał anty-ludzkich IgG i IgM zostało przetestowanych w różnych stężeniach przy standardowych 2000-krotnych warunkach rozcieńczenia próbki i inkubacji opisanych w sekcji 6. Wstępny test anty-IgM sprzężonego z barwnikiem reporterowym DyLight 405 (DL 405; wzbudzenie przy 400 nm i emisja przy 420 nm) dla kanału RP2 przeprowadzono przy użyciu zestawu 11 próbek PCR-dodatnich z DFSO w zakresie od 5 do >60 dni oraz próbki surowicy pozbawionej IgG. Ten odczynnik detekcyjny nie wytwarzał wysokiego sygnału w kanale RP2, jak pokazano na Rysunek 7A,B,C. W przypadku próbek o wysokim IgM RP2 MFI najwyższe sygnały zaobserwowano dla RBD i Nc (Rysunek 7B,C). Podczas gdy miana IgM powinny być w tym czasie podwyższone w niektórych próbkach, obserwowane poziomy MFI nie przekraczały 140 jednostek MFI z odczynnikiem do wykrywania IgM. Co więcej, kulka kontrolna dla IgM nie miała znaczącego zakresu dynamiki dla MFI przy użyciu DL 405 sprzężonego z anty-IgM w porównaniu z reporterem anty-IgM RP1 znakowanym PE stosowanym w tych samych stężeniach (Figura 7D).

Ponieważ nie był dostępny odpowiedni odczynnik do wykrywania IgM znakowany reporterem RP2, przetestowano oryginalny anty-IgG biotyny z SASB do użycia w kanale RP2. Sygnał dla IgG w kanale RP2 z SASB nie miał takiego samego zakresu dynamiki jak w przypadku SAPE, ale nadal miał odpowiedni zakres do pomiaru miana IgG dla S, RBD i Nc (Rysunek 8). Dane te doprowadziły do przetestowania różnych kombinacji odczynników do wykrywania RP1 IgM i RP2 IgG, jak opisano poniżej.

Konwersja do testu neutralizacji z podwójnym reporterem
Test serologiczny z podwójnym reporterem przekształcono w test neutralizacji poprzez dodanie etapu inkubacji z ACE2 i kulkami, przed dodaniem próbki surowicy. Zastosowano 2-krotną serię rozcieńczeń ACE2, zaczynając od 16 μg/ml, a następnie przetestowano je z zestawami 11 próbek i surowicami pozbawionymi surowicy, jak opisano powyżej. Ponadto przetestowano 3 różne kombinacje mieszanin przeciwciał wykrywających RP1 IgM i RP2 IgG na zestawie 11 próbek i okrojonych kontrolnych surowicy. Końcowe kombinacje i stężenia odczynników, które uznano za optymalne, przedstawiono w tabeli 1.

Do wykrywania IgG, anty-ludzka IgG/SASB biotyna użyta w oryginalnym teście pojedynczego reportera została przetestowana wraz z innym anty-IgG sprzężonym z barwnikiem reporterowym BV. Podczas gdy koniugat BV miał wysokie sygnały MFI RP2, intensywność sygnału MFI dla miana IgG różniła się w zależności od miareczkowania ACE2 (Rysunek 9A,C,E). Kombinacja biotyny anty-ludzkiej IgG / SASB miała bardziej konsekwentne zmniejszanie sygnału MFI w całym miareczkowaniu ACE2 w porównaniu z koniugatem BV, wykazując odpowiedź na dawkę, chociaż poziomy MFI były niższe. Fluktuacja sygnału przez koniugat BV w stężeniach ACE2 zakłócała również określanie procentowego hamowania przez ACE2 w całym zakresie mian IgG w porównaniu z kombinacją anty-ludzkiej IgG / SASB biotyny (Figura 9B, D, F). Próbki o niskich sygnałach MFI, takie jak próbka DFSO 3, nie mają wystarczająco wysokich mian, aby ocenić działanie tych odczynników lub zmierzyć zdolność neutralizacji IgG.

W celu określenia miana IgM w kanale RP1, anty-IgM sprzężone z PE porównano z anty-ludzkim IgM sprzężonym z barwnikiem reporterowym DyLight 549 (DL 549; wzbudzenie przy 562 nm i emisja przy 576 nm) przy stężeniach wymienionych w Tabeli 1. Spośród tych dwóch odczynników, anty-IgM PE wykazywały wyższe MFI niż te generowane przez DL 549 anty-ludzkie IgM dla badanych próbek (Rysunek 9A, C, E). Kulka kontrolna IgM mierząca dodanie tych odczynników miała różne średnie MFI wynoszące ≈17 000 dla anty-IgM PE i 2 723 dla koniugatu DL 549. Nawet przy tych różnicach wpływ różnych stężeń ACE2 na MIF można było zmierzyć za pomocą koniugatu DL 549. W celu określenia procentowego hamowania wiązania IgM przez ACE2 wystąpiła niewielka, ale nieistotna różnica między dwoma odczynnikami do wykrywania IgM (Rysunek 9B, D, F).

pkt. pkt.

Kombinacja	Reporter	Końcowe stężenie w studzience (μg/mL)
		Zobacz materiał RP1	Zobacz materiał RP2
1	PE anty-IgM	cyfra arabska	-
	Biotyna-Ig	-	0,62
	SASB (Polskie Linie Handlowe)	-	4
2	DyLight 549 Anty-Human IgM	1	-
	Fioletowy brylantowy 421 Anty-ludzka IgG	-	1
3	DyLight 549 Anty-Human IgM	1	-
	Biotyna-Ig	-	0,62
	SASB (Polskie Linie Handlowe)	-	4

Tabela 1: Lista testowanych kombinacji barwników reporterowych RP1 i RP2. Oceniono kilka różnych barwników reporterowych RP1 i RP2 pod kątem pomiaru miana IgG i IgM. Trzy przedstawione powyżej kombinacje zostały przetestowane w różnych trybach wykrywania RP1 oraz w celu optymalizacji testu neutralizacji. W przypadku kombinacji RP2 przy użyciu SASB pokazano stężenia przeciwciała wykrywającego biotynylowane i SASB. *Stężenie końcowe reprezentuje końcowe stężenie w studzience reakcyjnej.

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający główne kroki protokołu testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Potwierdzenie sprzężenia antygenów. Antygeny sprzężono przy 100, 10 i 1 pmol/10⁶ kulkach. W przypadku antygenów S i RBD zastosowano królicze surowice anty-S i wykryto je za pomocą PE anty-króliczej IgG. W przypadku Nc zastosowano poliklonalny anty-Nc z królika oczyszczonego z białka G. Przedstawiono krzywe miareczkowania dla kulek sprzężonych z 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) i 100 pmol Nc (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Optymalizacja rozcieńczenia surowicy przy różnych poziomach sprzężenia antygenu. Próbki surowicy reprezentujące próbki wysokie, średnie, niskie i ujemne badano z różnymi sprzęgami antygenu pmol / 10⁶ kulek. Czterokrotne miareczkowanie surowicy testowano z multipleksową mieszanką kulek sprzężonych z antygenem przy użyciu protokołu testu opisanego w sekcji 5. Przedstawiono wartości MIF krzywych miareczkowania dla S (A), RBD (B) i Nc (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Określenie optymalnego rozcieńczenia surowicy i stężenia odczynnika do wykrywania. Osiem próbek surowicy, w tym pacjentów z ujemnym wynikiem (2 próbki) oraz z wynikiem od niskiego do bardzo dodatniego (6 próbek), przetestowano w dodatkowych rozcieńczeniach surowicy z trzema różnymi stężeniami odczynników wykrywających. Wyniki MIF przedstawiono dla S (A), RBD (B) i Nc (C). Na podstawie tych i innych danych (nie pokazanych) wybrano rozcieńczenie próbki 1:2 000 i stężenie przeciwciał wykrywających biotynę 0,62 μg/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Optymalizacja testu neutralizacji pojedynczego reportera. Modyfikacja testu serologicznego z pojedynczym reporterem na test wykrywania przeciwciał neutralizujących została przeprowadzona przez dodanie etapu inkubacji z ACE2 jako konkurentem, jak opisano w sekcji 6. Zestaw 11 próbek, od surowic mianowych o niskim do wysokiego dodatniego mianie, oraz próbkę surowicy z paskami IgG przetestowano z serią dwukrotnych rozcieńczeń ACE2, zaczynając od 4 μg/ml, przy użyciu standardowych warunków testu. W tym zakresie stężeń ACE2 można zaobserwować spadek MFI przy zwiększonym ACE2 dla S (A) i RBD (B), ale nie dla Nc (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Procentowe hamowanie sygnału za pomocą ACE2. Pokazano procentowe sygnały resztkowe dla zestawu 11 próbek (z Rysunek 4). Dla każdej próbki, niezależnie od jej miana IgG, osiągnięto maksymalny spadek sygnału MFI o ≥30% dla S (A) i RBD (B) przy najwyższym stężeniu ACE2. Dla antygenu Nc (C) nie stwierdzono istotnego hamowania sygnału przy jakiejkolwiek badanej ilości ACE2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Test anty-IgM DyLight 405 jako odczynnika do wykrywania IgM RP2. Zestaw 11 próbek i surowice pozbawione IgG użyto do przetestowania anty-IgM sprzężonego z DL 405 jako odczynnika do wykrywania RP2. Pokazane są sygnały MFI RP2 IgM dla S (A), RBD (B) i Nc (C). Najwyższy sygnał MFI dla dowolnego antygenu z dowolną próbką wynosił około 140 jednostek MFI dla RBD z próbką H (B). Nawet sygnał na zestawie kulek kontrolnych IgM był mniejszy niż 1,000 MFI w kanale RP2 w całym zakresie miana przeciwciał i nie wykazywał zwiększonego zakresu dynamiki obserwowanego w przypadku przeciwciała wykrywającego anty-IgM PE w kanale RP1 (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Optymalizacja SASB jako reportera RP2 z anty-IgG biotyny. Zestaw 11 próbek i surowice z paskami IgG użyto do przetestowania serii rozcieńczeń SASB za pomocą standardowego anty-IgG biotyny 0,62 μg/ml. Pokazane są wynikowe IgG MIF w kanale RP2 dla S (A), RBD (B) i Nc (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Porównanie trzech różnych kombinacji mieszanin detekcyjnych RP1 IgM i RP1 IgG. Na 11 próbkach przetestowano trzy mieszaniny przeciwciał o różnym wykrywaniu, a surowice pozbawione IgG zostały usunięte. Zastosowane kombinacje i stężenia końcowe opisano w tabeli 1. Wszystkie próbki badano z 2-krotnymi rozcieńczeniami ACE2, zaczynając od 16 μg/ml. Pokazano dane dla próbek w DFSO z 3, 12 i 30 dni. Sygnały MFI dla RP1 IgM (pomarańczowy) i RP2 IgG (niebieski) są pokazane w A (DFSO 3), C (DFSO 12) i E (DFSO 30). Procentowy udział rezydualnych MIF w ACE2 przedstawiono w kategoriach B (DFSO 3), D (DFSO 12) i F (DFSO 30). Sygnały reprezentujące spadek o >30% w porównaniu do kontroli Brak ACE2 są podświetlone na jasnozielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Badanie to rozszerzyło funkcjonalność multipleksowego testu mikrosfery fluorescencyjnej 3Flex, który jakościowo ocenia odpowiedź IgG na zakażenie SARS-CoV-2¹. Podczas gdy wiele testów serologicznych na COVID-19 wykrywa pojedynczy antygen, ten test jednocześnie ocenia antygeny S, RBD i Nc oraz obejmuje wewnętrzną kontrolę izotypu^{przeciwciał 7}. Ponadto ACE2 jest używany jako wskaźnik do wykrywania miana przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2.

Testy wieloantygenowe mogą być szczególnie przydatne w przyszłości do rozróżniania odpowiedzi immunologicznych między osobami zakażonymi i zaszczepionymi. W przypadku SARS-CoV-2, jeśli oceniane są tylko przeciwciała S i RBD, niemożliwe byłoby określenie, czy było to spowodowane przebytą infekcją, czy odpowiedzią przeciwciał poszczepiennych. Żadna z obecnie stosowanych szczepionek nie jest ukierunkowana na antygen Nc, więc oceniając antygeny S/RBD i Nc, możliwe jest odróżnienie przebytej infekcji wirusowej (Nc- i S/RBD-dodatniej) od odpowiedzi na szczepienie (tylko S/RBD-dodatnia; Nc-ujemne).

W obecnym badaniu testy serologiczne i neutralizacyjne 3Flex (sekcje 5 i 6) przeniesiono do nowego przyrządu do podwójnej analizy przepływu reporterowego (sekcje 7 i 8). Typowe protokoły testów immunologicznych dla testów multipleksowych opartych na kulkach są podobne do standardowych protokołów ELISA, po zastosowaniu porównywalnych etapów inkubacji próbki, inkubacji przeciwciał/reportera wykrywania i analizy wyników⁸. Wcześniejsze badania wykazały również, w jaki sposób standardowe testy ELISA można przenieść na platformę multipleksowania opartą na koralikach⁹.

Protokoły testowe można było bezproblemowo przenieść z poprzedniego przyrządu z pojedynczym reporterem do nowego systemu z podwójnym reporterem, jak pokazują wyniki uzyskane dla próbek testowych i kontroli (Rysunek 4 i Rysunek 5). W teście serologicznym wszystkie dodatnie próbki surowicy wykazywały charakterystyczny spadek sygnału reagujący na dawkę, odpowiadający zarówno większemu rozcieńczeniu próbki, jak i niższemu stężeniu przeciwciał wykrywających, podczas gdy sygnały dla próbek ujemnych pozostały na poziomach tła. Podobnie, w teście neutralizacji, malejące sygnały dla S i RBD, ale nie Nc, odpowiadały rosnącym stężeniom konkurenta ACE2, podczas gdy surowica pozbawiona IgG była znacznie mniej dotknięta dodatkiem ACE2. Wstępna inkubacja kulek z ACE2 przez 2 minuty przed dodaniem próbki surowicy (jak opisano w punktach 6 i 8) porównano również z łączeniem kulek z ACE2 i surowicą w tym samym czasie i dała niewielką różnicę w wynikach (dane nie pokazane). Ponieważ jednak wyniki uzyskane za pomocą kulek i etapu wstępnej inkubacji ACE2 były bardziej spójne, była to ostateczna procedura przyjęta do protokołu testu neutralizacji (sekcje 6 i 8).

Ponieważ system podwójnego reportera zawiera drugi fluorescencyjny kanał reporterowy, oba testy zostały przekształcone w testy izotypiczne, aby jednocześnie mierzyć odpowiedzi IgG i IgM. Funkcja podwójnego reportera analizatora przepływu umożliwia zbieranie sygnałów fluorescencyjnych z dwóch odczynników do wykrywania reporterów dla każdego analitu w multipleksie dla każdej próbki, skutecznie podwajając dane generowane dla próbki w teście. W celu opracowania i optymalizacji protokołów podwójnego testu reporterowego, kilka dostępnych na rynku barwników reporterowych i przeciwciał wykrywających oceniono dla nowego kanału RP2 (Figura 7 i Figura 8) w celu określenia najlepszej dostępnej opcji (opcji). Przeciwciało anty-IgM sprzężone z barwnikiem reporterowym DL 405 nie działało dobrze w kanale RP2 (Figura 7), więc anty-IgG biotyny z SASB oceniano następnie pod kątem wykrycia w kanale RP2 (Figura 8). Trzy kombinacje odczynników detekcyjnych RP1 i RP2 porównano w teście podwójnej neutralizacji reporterowej (tabela 1 i ryc. 9) w celu określenia najlepszych kombinacji do jednoczesnego wykrywania przeciwciał neutralizujących IgG i IgM. Chociaż wystąpiły istotne różnice w intensywności sygnału między kanałem RP1 wykorzystującym PE-anty IgM a kanałem RP2 wykorzystującym anty-IgM DL 549, nie było istotnej różnicy w pomiarze procentowego hamowania wiązania przez ACE2.

Uznaje się kilka ograniczeń obecnej metody i niniejszego badania. Po pierwsze, próbki testowane i wykorzystywane do opracowywania i optymalizacji metody ograniczały się do zestawów 8-11 próbek. Więcej próbek zostanie przetestowanych w rozszerzonych badaniach, aby sprawdzić, czy metoda jest w pełni zoptymalizowana. Po drugie, przetestowano ograniczoną liczbę fluoroforów reporterowych i par reporterowych. Dalsze testy wszystkich dostępnych reporterów we wszystkich możliwych kombinacjach określą, które odczynniki mogą być z powodzeniem stosowane w tej metodzie. Przeciwciało anty-IgG sprzężone z biotyną różniło się od przeciwciała anty-IgG sprzężonego z reporterem BV 421. Tak więc, chociaż istniała zmienność intensywności sygnału dla anty-IgG BV 421, mogła ona wynikać ze specyficzności przeciwciała i nie była związana z barwnikiem reporterowym. Testowanie innych dostępnych przeciwciał sprzężonych z BV 421 może zidentyfikować inne przeciwciało, które dobrze działałoby w kanale RP2. Przyszłe badania będą również oceniać połączenie PE anty-IgM z anty-ludzką IgG BV 421 w celu wykrywania odpowiednio w RP1 i RP2. Wreszcie, nawet przy możliwości podwójnego reporterowania instrumentu, testy są ograniczone do dwóch izotypów (dwóch parametrów) na reakcję. Jeśli mają być mierzone dodatkowe izotypy lub pożądane jest pełne izotypowanie, wówczas dodatkowe reakcje przy użyciu tych samych dwóch kanałów reporterowych musiałyby być prowadzone w oddzielnych studzienkach.

Technologia multipleksowania oparta na kulkach pozwala na szybkie i elastyczne projektowanie testów z łatwą implementacją do rutynowych procesów laboratoryjnych ^3,4,10. Badanie to wykazało łatwość przeniesienia wcześniej opisanych testów serologicznych i neutralizacyjnych 3Flex dla SARS-CoV-2 do systemu analizy przepływu do pomiaru IgG za pomocą jednego reportera lub z niewielką modyfikacją, jednocześnie mierząc zarówno odpowiedzi IgG, jak i IgM za pomocą dwóch reporterów. Opcja podwójnego reportera ma wyraźną przewagę nad platformami z pojedynczym reporterem, ponieważ może dostarczyć dwa razy więcej danych na próbkę, wykorzystując połowę objętości próbki i połowę liczby studzienek reakcyjnych. Dzięki odpowiednim barwnikom reporterowym i przeciwciałom detekcyjnym, testy izotypowania można łatwo opracować i przeprowadzić na urządzeniu do analizy przepływu z podwójnym reporterem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ACE2 (człowiek) (rec.)	AdipoGen Life Sciences	AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (długi dystans) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specyficzny dla fragmentu	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-065-098
Albumina surowicy bydlęcej	MilliporeSigma	A7888	Sigma-Aldrich
Branson 1800 Środek czyszczący/dźwiękowy do kąpieli wodnej	Różne
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystiren NBS Microplate	Corning	3650
Corning 96-well Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca, niesterylna	Corning	6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ   specyficzny fragment	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Kozia anty-ludzka IgM Fc5μ specyficzna	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-506-129	Wycofane, ale dostępne u wielu dostawców
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Sprzężony	ThermoFisher Scientific	62-4317-82
Wytrząsarka do mikropłytek inkubacyjnych Fisherbrand	ThermoFisher Scientific	02-217-757	Fisher Scientific
Kozioł anty-króliczą IgG (H+L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, PE	ThermoFisher Scientific	P-2771MP
Luminex Magnetyczny separator płytowy	Luminex Corporation	CN-0269-01
Koraliki MagPlex	Luminex Corporation	MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Koza Anty-Ludzka IgM Fc5μ specyficzne	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-116-129
Milipory	soli fizjologicznej buforowanej fosforanemSigma	P3813	Przeciwciało
białkowe nukleokapsydu Sigma-Aldrich SARS	Novos Biologicals	NB100-56683	Niesprzężone, królik, poliklonalne, białko G oczyszczone
przeciwciało białkowe nukleokapsydu SARS	Novos Biologicals	NB100-56049	Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko A oczyszczone
Przeciwciało przeciwko białku kolca SARS	Novos Biologicals	NB100-56047	Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko G oczyszczone
Przeciwciało przeciwko białku kolca SARS	Novos Biologicals	NB100-56048	Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko G oczyszczone Przeciwciało
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1, Królik MAb	SinoBiological	40150-R007
Miliporek	azydku soduSigma	S2002	Sigma-Aldrich
Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE)	ThermoFisher Scientific	S21388	najwyższej jakości
rewolwer / rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
TWEEN 20	MilliporeSigma	P9416	Sigma-Aldrich
xMAP Zestaw	do badania przeciwciałLuminex Corporation	40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE	Luminex Corporation	INTELLIFLEX-DRSE-RUO