Artykuł metodologiczny

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62487

⸱

6 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Streszczenie

Pandemia COVID-19 uwypukliła potrzebę szybkich, wysokoprzepustowych metod do czułego i specyficznego wykrywania serologicznego infekcji nowymi patogenami, takimi jak SARS-CoV-2. Multipleksowe testy serologiczne mogą być szczególnie przydatne, ponieważ mogą jednocześnie analizować przeciwciała przeciwko wielu antygenom, co optymalizuje pokrycie patogenów i kontroluje zmienność organizmu i indywidualną odpowiedź gospodarza. Tutaj opisujemy test oparty na mikrosferach fluorescencyjnych SARS-CoV-2 IgG 3-plex, który może wykryć zarówno przeciwciała IgM, jak i IgG przeciwko trzem głównym antygenom SARS-CoV-2 - białku kolca (S), domenie wiążącej receptor (RBD) enzymu konwertującego angiotensynę (ACE2) i nukleokapsydu (Nc). Wykazano, że test ma porównywalną wydajność do testu referencyjnego SARS-CoV-2 na IgG w surowicy uzyskanej po ≥21 dniach od wystąpienia objawów, ale miał wyższą czułość w przypadku próbek pobranych w ≤5 dniu od wystąpienia objawów. Ponadto, stosując rozpuszczalny ACE2 w formacie testu neutralizacji, wykazano hamowanie wiązania przeciwciał dla S i RBD.

Wprowadzenie

Pandemia COVID-19 uwypukliła znaczenie możliwości szybkiego opracowania i wdrożenia szybkich, wysokowydajnych i wydajnych testów serologicznych, które mogą być wykorzystywane do diagnozowania i nadzoru nad nowymi patogenami, takimi jak SARS-CoV-2. Multipleksowe testy serologiczne mogą być niezwykle przydatne w czasie pandemii, ponieważ mogą jednocześnie analizować przeciwciała przeciwko wielu antygenom, co zapewnia szeroki zakres patogenów i kontrolę zmienności organizmu i odpowiedzi gospodarza na infekcję. Niedawno poinformowano o opracowaniu multipleksowego testu fluorescencyjnego opartego na kulkach, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), który może wykrywać przeciwciała przeciwko białku kolca (S), domenie wiążącej receptor (RBD) enzymu konwertującego angiotensynę angiotensynę (ACE2) i nukleokapsydu (Nc) SARS-CoV-21. Wykazano, że 3Flex ma porównywalną wydajność do referencyjnego testu IgG SARS-CoV-2 dla surowicy uzyskanej po ≥21 dniach od wystąpienia objawów, ale miał wyższą czułość w przypadku próbek pobranych w ≤5 dniu od wystąpienia objawów. Dodatkowo wykazano hamowanie wiązania przeciwciał dla antygenów S i RBD przy użyciu rozpuszczalnego ACE2 w formacie testu neutralizacji. Technologia oparta na koralikach multipleksowych została szeroko przyjęta jako sprawdzona technologia wielopoziomowych testów serologicznych i ma wyraźne zalety w badaniach przesiewowych na dużą skalę, w tym krótki czas uzyskania wyników, wymagania dotyczące małych próbek i zmniejszony nakład pracy2,3,4.

Niedawno udostępniono nowe narzędzie do analizy przepływu, które zapewnia taką samą zdolność do obsługi i przepustowości jak system zademonstrowany w poprzedniej pracy1, ale z dodatkową korzyścią w postaci dwóch kanałów reporterskich. Możliwość pomiaru dwóch fluorescencyjnych sygnałów reporterowych w jednej reakcji pozwala na ocenę dwóch wyników dla każdego analitu dla każdej próbki i jest idealna do zastosowań izotypowych, które zazwyczaj muszą być wykonywane w oddzielnych studniach reakcyjnych5. Funkcja podwójnego reportera zapewnia dwukrotnie więcej danych dla każdej próbki w o połowę mniejszej liczbie studzienek reakcyjnych przy połowie wymagań dotyczących objętości próbki, a tym samym ma wyraźną przewagę nad systemami z pojedynczym reporterem. Badanie to szczegółowo opisuje standardowy protokół testu serologicznego i opisuje adaptację do testu neutralizacji. Ponadto w niniejszym raporcie opisano konwersję testu z pojedynczym reporterem na test serologiczny z podwójnym reporterem, a następnie test z podwójną neutralizacją reporterową, w celu jednoczesnego pomiaru przeciwciał neutralizujących zarówno izotypów IgG, jak i IgM przeciwko antygenom SARS-CoV-2 S, RBD i Nc. Wizualny przegląd protokołu testu znajduje się w Rysunek 1.

Protokół

Pozostałe próbki ludzkiej surowicy, wcześniej testowane pod kątem analiz diagnostycznych SARS-CoV-2, zostały wykorzystane w tym badaniu, które zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Rochester.

1. Odczynniki i sprzęt

  1. Pozyskiwanie antygenów koronawirusa oraz ludzkich IgG i IgM ze źródeł komercyjnych.
  2. Zaopatrz się w zestawy kulek do kontroli testów (AC) (45 i 220) od dostawcy urządzenia. Zestaw koralików AC 45 monitoruje zbieranie mediany intensywności fluorescencji (MFI) na instrumentach z pojedynczym kanałem reporterowym (RP1). Zestaw koralików AC 220 monitoruje odbiór MFI na drugim kanale reporterowym (RP2).
  3. Uzyskać przeciwciała wykrywające i swoiste dla antygenu surowice królika oraz przeciwciała stosowane do potwierdzenia sprzęgnięcia.
  4. Przeprowadzić detekcję za pomocą przeciwciał znakowanych biotyną ze streptawidyną, koniugatem R-fikoerytryny (SAPE) lub koniugatem streptawidyny fluoroforu Super Bright 436 (SASB; wzbudzenie przy 405 nanometrach (nm) i emisja przy 436 nm).
  5. Uzyskaj ludzkie białko ACE2 (tj. Receptor SARS). Przed użyciem należy ponownie uwodnić liofilizowane białko ACE2 przez rozpuszczenie do stężenia 1 mg/ml w wodzie wolnej od nukleaz (nie poddanej działaniu DEPC, autoklawowanej i sterylnie filtrowanej 0,2 μm) i przechowywanej w temperaturze 4 °C.
  6. Wszystkie reakcje należy przeprowadzić w 96-dołkowych, niewiążących powierzchniowo (NBS) czarnych płytkach o płaskim dnie. Uszczelnij płytki aluminiową taśmą uszczelniającą z 96 dołkami do mikropłytek na etapach inkubacji testu. Użyj magnetycznego separatora płytkowego do etapów mycia testu.

2. Przygotowanie koralików kontrolnych sprzężonych z antygenem i przeciwciałami

  1. Kowalencyjnie połącz zestawy mikrosfer magnetycznych, polistyrenowych i oznaczonych kolorami (średnica 6,5 μm) z antygenami S, RBD i Nc, jak opisano w Cameron et al.1. Antygeny koronawirusa są sprzężone w 10 pmol/106 kulek (S) i 100 pmol/106 kulek (RBD i Nc). Koraliki kontrolne sprzężone z ludzką IgG lub IgM są generowane zgodnie z wcześniejszym opisem1. IgG i IgM są sprzężone przy 5 μg/106 kulkach.
  2. Po sprzężeniu określ stężenia kulek i rozcieńcz każdy materiał do 1 x 106 kulek/ml zgodnie z opisanymi procedurami6.
  3. Wykonaj potwierdzenie sprzężenia antygenu z przeciwciałami specyficznymi dla antygenu od królika lub z dodatnimi surowicami ludzkimi, jak opisano w Cameron et al.1.
    1. Potwierdź sprzężenie ludzkiej IgG za pomocą biotynylowanych anty-ludzkich odczynników do wykrywania IgG/SAPE w teście, a sprzężenie IgM za pomocą znakowanej fikoerytryną (PE) koziego anty-ludzkiego IgM.
      UWAGA: Potwierdzenie sprzężenia przeprowadza się za pomocą miareczkowania surowicy lub przeciwciała specyficznego dla białka, ponieważ optymalne stężenie do użycia dla tych odczynników nie jest znane. W przypadku surowicy stosuje się seryjne rozcieńczenia krotne, natomiast w przypadku przeciwciał dostarczanych w postaci zapasów mg/ml stosuje się serię seryjnych rozcieńczeń μg/ml.
  4. Rozcieńczyć kulki kontrolne (AC), które monitorują zbieranie MFI w dwóch kanałach reporterowych do stężenia 1 x 106 kulek / ml przed użyciem w mieszankach kulek multipleksowych.

3. Przygotowanie świeżej mieszanki koralików multipleksowych

  1. Codziennie przygotowuj świeżo mieszane koraliki multipleksowe z pojedynczych sprzężonych koralików i kontroluj zapasy koralików w ilości 1 x 106 kulek / ml.
    UWAGA: Mieszanki kulek Multiplex są przygotowane do dostarczenia 2,500 kulek na każdy region kulek w objętości 50 μl. Obliczenia dotyczące przygotowania mieszanek kulkowych multipleksowych dla dowolnej liczby reakcji opisano na blogu opublikowanym przez Angeloni (2020)6.

4. Rozcieńczenie próbki

  1. Przygotować próbkę surowicy w stosunku 1:100, mieszając 10 μl surowicy z 990 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,05% Tween 20, 0,02% azydku sodu i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor PBS-TBN).
  2. Próbki ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, dodając 20 μl rozcieńczenia 1:100 do 180 μl PBS-TBN.
    UWAGA: Próbki surowicy składają się z ujemnych surowic surowicowych pobranych w 2019 r. przed pandemią COVID-19 oraz dodatnich surowic od pacjentów z dodatnim wynikiem testu PCR na obecność SARS-CoV-2, reprezentujących niskie i wysokie miana przeciwciał. Dodatnie próbki pobierano między ≈3 a >60 dni od wystąpienia objawów (DFSO). Wszystkie próbki surowicy i ujemne surowice kontrolne pozbawione IgG rozcieńcza się w stosunku 1:1000, jak opisano poniżej. W przypadku testów neutralizacji surowice rozcieńcza się w stosunku 1:500, jak opisano w poniższych protokołach neutralizacji (sekcje 6 i 8).

5. Protokół testu serologicznego z pojedynczym reporterem

  1. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
  2. Odmierzyć pipetą 50 μl surowicy w skali 1:1000 lub PBS-TBN do odpowiednich studzienek; końcowe rozcieńczenie surowicy w studzience wynosi 1:2000.
  3. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
  4. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
  5. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
  6. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  7. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze płukanie inkubacyjne po pobraniu próbki).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  8. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (drugie płukanie inkubacyjne po pobraniu próbki).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Zdejmij płytkę z magnesu.
  9. Przygotuj świeżą mieszankę biotyny anty-ludzkiej IgG z SAPE, rozcieńczając przeciwciało do 0,62 μg / ml i SAPE do 1 μg / ml. Dodaj 100 μl do każdego dołka.
  10. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
  11. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
  12. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
  13. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  14. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze płukanie inkubacją przeciwciał po wykryciu).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  15. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (drugie płukanie inkubacyjne przeciwciał po wykryciu).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytek i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Zdejmij płytkę z magnesu.
  16. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
  17. Przykryć folią uszczelniającą i wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
  18. Wyjąć płytkę z wytrząsarki do płyt. Następnie zdejmij uszczelkę foliową i odczytaj 50 μl każdej studzienki na analizatorze przepływu zgodnie z instrukcją obsługi. Krótki opis znajduje się poniżej.
    1. Wybierz menu rozwijane w lewym górnym rogu ekranu i przejdź do opcji Konfiguracja blachy.
    2. Wybierz opcję Uruchom blachę.
    3. Wybierz ikonę Wysuń, aby wysunąć nośnik płyty.
    4. Załaduj tabliczkę na nośnik płyty i wybierz ikonę Wycofaj, aby schować nośnik płyty.
    5. Wybierz ikonę Uruchom, aby uruchomić blachę.

6. Protokół testu neutralizacji z pojedynczym reporterem

  1. Przygotuj świeżą mieszankę kulek multipleksowych, jak opisano w sekcji 3 powyżej.
  2. Rozcieńczyć surowicę pacjenta i kontrolną w stosunku 1:500 w następujący sposób.
    1. Rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:100, mieszając 10 μl surowicy z 990 μl PBS-TBN.
    2. Rozcieńczyć surowicę jeszcze 5-krotnie, dodając 40 μl surowicy w skali 1:100 do 160 μl PBS-TBN.
  3. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
  4. Dodać 25 μl rozcieńczenia 2 μg/ml ACE2 do każdej studzienki.
  5. Przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem z mikropłytką i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytek w temperaturze 37 °C przez 2 minuty z wytrząsaniem z prędkością 600 obr./min.
  6. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i usuń uszczelkę foliową.
  7. Dodaj 25 μl surowicy 1:500 lub PBS-TBN do przypisanych studzienek.
  8. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
  9. W pozostałej części procedury oznaczania należy postępować zgodnie z krokami od 5.4 do 5.18.5, jak opisano powyżej.

7. Konwersja do podwójnego testu serologicznego IgG i IgM

  1. Przygotować kulki sprzężone z antygenem, jak opisano w sekcji 2 powyżej.
    UWAGA: W zestawie znajduje się dodatkowy zestaw kulek w połączeniu z ludzką IgM do monitorowania dodania odczynników do wykrywania anty-IgM, a także dodatkowy zestaw kulek AC (220) do monitorowania zbierania MFI dla RP2. Wszystkie zapasy kulek są w rozmiarze 1 x 106 kulek/ml do włączenia do mieszanek kulek multipleksowych, jak opisano poniżej.
  2. Przygotuj świeże mieszanki kulek multipleksowych zgodnie z opisem w sekcji 3 powyżej.
  3. Rozcieńczyć próbki surowicy i ujemne surowice kontrolne pozbawione IgG w stosunku 1:1000, jak opisano w sekcji 4 powyżej.
  4. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
  5. Odpipetować 50 μl surowicy 1:1000 lub PBS-TBN do odpowiednich studzienek. Końcowe rozcieńczenie surowicy w studzience wynosi 1:2000.
  6. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
  7. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
  8. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
  9. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  10. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze płukanie inkubacyjne po pobraniu próbki).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki do płytek i umieść ją na płycie magnetycznej na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  11. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie inkubacyjne po próbce), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 7.10.1-7.10.5.
  12. Zdejmij płytkę z magnesu.
  13. Przygotuj świeży odczynnik do wykrywania zmieszany z wymaganą kombinacją odczynników i dodaj 50 μl lub 100 μl do każdego dołka.
    UWAGA: Mieszaniny odczynników detekcyjnych zawierające anty-ludzką IgG sprzężoną z barwnikiem reporterowym Brilliant Violet 421 (BV; wzbudzenie przy 405 nm i emisja przy 421 nm) stosowano przy 50 μl / dołku ze względu na ograniczone ilości dostępnych odczynników podstawowych. Wszystkie inne mieszaniny odczynników detekcyjnych stosuje się w stężeniu 100 μl/studzienkę.
  14. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
  15. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
  16. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
  17. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  18. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem za pomocą PBS-TBN (pierwsze płukanie po wykryciu inkubacji przeciwciał).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę na magnesie, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  19. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie po wykryciu inkubacji przeciwciał), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 7.17.1-7.17.5.
  20. Zdejmij płytkę z magnesu.
  21. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
  22. Przykryć folią uszczelniającą i wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
  23. Wyjąć płytkę z wytrząsarki do płyt. Następnie zdejmij uszczelkę foliową i odczytaj 50 μl każdej studzienki na analizatorze przepływu, jak opisano powyżej w krokach 5.18.1-5.18-5.

8. Konwersja do testu neutralizacji z podwójnym reporterem

  1. Użyj sprzężonych koralików zgodnie z opisem w kroku 7.1 powyżej.
  2. Przygotuj świeżą mieszankę kulek multipleksowych zgodnie z opisem w kroku 7.2.
  3. Próbki surowicy i ujemne surowice kontrolne pozbawione IgG rozcieńcza się w stosunku 1:500 w następujący sposób.
    1. Przygotować rozcieńczenie w stosunku 1:100, mieszając 10 μl surowicy z 990 μl PBS-TBN.
    2. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:100 jeszcze 5-krotnie, dodając 40 μl rozcieńczeń w stosunku 1:100 do 160 μl PBS-TBN.
  4. Dodać 50 μl mieszanki kulek multipleksowych do każdego przypisanego dołka 96-dołkowej niewiążącej płytki do mikromiareczkowania.
  5. Dodać 25 μl rozcieńczenia 2 μg/ml ACE2 do każdej studzienki.
  6. Przykryć płytkę foliowym uszczelnieniem z mikropłytką i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytek w temperaturze 37 °C przez 2 minuty z wytrząsaniem z prędkością 600 obr./min.
  7. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i usuń uszczelkę foliową.
  8. Dodaj 25 μl surowicy 1:500 lub PBS-TBN do przypisanych studzienek.
  9. Przykryć płytkę uszczelką foliową i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytek w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem z prędkością 600 obr./min.
  10. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
  11. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
  12. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  13. Przemyć studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsze mycie po inkubacji próbki).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  14. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie po inkubacji próbki), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 8.13.1-8.13.5.
  15. Zdejmij płytkę z magnesu.
  16. Przygotuj świeży odczynnik do wykrywania zmieszany z wymaganą kombinacją odczynników i dodaj 50 μl lub 100 μl do każdego dołka.
    UWAGA: Mieszaniny odczynników detekcyjnych zawierające anty-ludzką IgG sprzężoną z barwnikiem reporterowym BV stosowano w dawce 50 μl / dołek ze względu na ograniczone ilości dostępnych odczynników podstawowych (patrz Tabela materiałów). Wszystkie inne mieszaniny odczynników detekcyjnych stosuje się w stężeniu 100 μl/studzienkę.
  17. Przykryć płytkę foliową płytką do mikropłytek i inkubować na rozgrzanej wytrząsarce płytkowej w temperaturze 37 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy prędkości 600 obr./min.
  18. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
  19. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
  20. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  21. Umyj studzienki reakcyjne zgodnie z poniższym opisem (pierwsza nastąpiła po wykryciu inkubacji przeciwciał).
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytowej i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Osusz płytkę na papierze chłonnym, nadal trzymając płytkę na magnesie.
  22. Ponownie przemyć studzienki reakcyjne PBS-TBN (drugie płukanie po wykryciu inkubacji przeciwciał), dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 8.21.1-8.21.5.
    1. Wyjmij płytkę z płyty magnetycznej i dodaj 150 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
    2. Przykryj płytkę świeżą folią uszczelniającą i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 2 minuty przy 600 obr./min.
    3. Wyjmij płytkę z wytrząsarki płytek i umieść ją na magnetycznym separatorze płytkowym na 2 minuty, aby oddzielić kulki od mieszaniny reakcyjnej.
    4. Trzymając płytkę przytwierdzoną do magnesu, zdejmij uszczelkę foliową, ostrożnie odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i delikatnie wytrząśnij supernatant z dołków.
    5. Zdejmij płytkę z magnesu.
  23. Dodaj 100 μl PBS-TBN do każdej studzienki.
  24. Przykryć folią uszczelniającą i wstrząsać przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
  25. Wyjąć płytkę z wytrząsarki do płyt. Następnie zdejmij uszczelkę foliową i odczytaj 50 μl każdej studzienki na analizatorze przepływu, jak opisano powyżej w krokach 5.18.1-5.18-5.

Wyniki

Optymalizacja serologicznego testu z pojedynczym reporterem.
Strategia sprzęgania dla wszystkich antygenów SARS-CoV-2 została opisana w pracy Cameron, et al., 20201 oraz w kroku 2.1 powyżej. Strategia potwierdzenia sprzęgania została opisana w kroku 2.3 powyżej. W przypadku efektywnego sprzęgania wartości mediany intensywności fluorescencji (MFI) powinny być znacznie wyższe niż w przypadku reakcji kontrolnych ujemnych bez surowicy/przeciwciał oraz powinny wykazywać odpowiedź dawkową w postaci spadku sygnału MFI wraz ze zmniejszaniem ilości odczynnika detekcyjnego. Wartości MFI wynoszące około 1 000 jednostek MFI lub więcej powyżej tła MFI zazwyczaj wskazują na efektywne sprzęganie białek i są zależne od stężenia oraz swoistości zastosowanego odczynnika detekcyjnego. Przy użyciu tej metody przetestowano potwierdzenie sprzęgania antygenów S, RBD i Nc dla dwóch partii kulek (Rysunek 2). Sygnały MFI dla wszystkich antygenów były znacznie wyższe niż MFI tła i wykazywały odpowiedź dawkową przy miareczkowaniu odczynników detekcyjnych. Dane wykazały również dobrą powtarzalność poziomów MFI pomiędzy dwiema różnymi partiami sprzęganych kulek.

Optymalizację testu z pojedynczym reporterem przeprowadzono zgodnie z opisem w Cameron, et al., 20201. Każdy antygen testowano przy różnych stężeniach sprzęgania z różnymi rozcieńczeniami kilku próbek surowicy reprezentujących próbki o wysokim, średnim, niskim i ujemnym poziomie. Dodatkowo, ponieważ test mierzy miana IgG, jako dodatkową próbkę ujemną wykorzystano surowicę pozbawioną IgG. Wyniki reprezentatywnej serii rozcieńczeń próbek przy różnych poziomach sprzęgania antygenu przedstawiono na Rysunku 3. Tę wstępną serię rozcieńczeń przetestowano przy stałym stężeniu odczynników detekcyjnych, aby uzyskać potencjalny zakres reprezentatywnych poziomów MFI dla antygenów swoistych oraz tła. Na podstawie tych danych określono dodatkowe zakresy rozcieńczeń próbek i poziomy sprzęgania antygenów, które następnie przetestowano na dodatkowych próbkach (dane nie pokazano).

Następnie zoptymalizowano stężenie odczynnika detekcyjnego do zastosowania przy różnych rozcieńczeniach surowicy i poziomach sprzęgania antygenu. Reprezentatywne dane z wykorzystaniem 6 próbek dodatnich i 2 ujemnych przedstawiono na Rysunku 4. Po dodatkowych testach z wykorzystaniem kilkuset ujemnych próbek surowicy pobranych przed pandemią COVID-19, wybrano końcowe optymalne poziomy sprzęgania antygenu oraz stężenia odczynnika detekcyjnego dla finalnego protokołu analizy, jak opisano w sekcji 5.

Konwersja na test neutralizacji z pojedynczym reporterem
Konwersję serologicznego testu z pojedynczym reporterem na test neutralizacji osiągnięto poprzez dodanie etapu inkubacji z wykorzystaniem ACE2 (jako odczynnika konkurującego) z kuleczkami przed dodaniem próbki surowicy. Poprzez miareczkowanie ilości dodanego ACE2 zaobserwowano inhibicję wiązania IgG do antygenów S i RBD, co przedstawiono na Rysunku 5. Mimo że surowice 11 pacjentów miały różne miana IgG, w każdej z nich odnotowano znaczący spadek sygnału MFI wraz ze wzrostem stężenia ACE2. Zgodnie z oczekiwaniami, ACE2 wpływa wyłącznie na sygnały MFI dla S i RBD, ale nie dla antygenu Nc.

Procentowy pozostały sygnał MFI w stosunku do 0 µg/mL ACE2 dla wszystkich próbek przedstawiono na Rysunku 6. W przypadku większości próbek zaobserwowano spadek sygnału >30% dla S oraz RBD wraz ze wzrostem stężenia ACE2. Zgodnie z oczekiwaniami, ACE2 nie wpłynęło na sygnał Nc.

Konwersja do podwójnego testu serologicznego z reporterami dla IgG i IgM
W przypadku testu z podwójnym reporterem dla IgG i IgM zastosowano standardowe warunki testu z pojedynczym reporterem, aby przetestować różne kombinacje przeciwciał i reporterów dla dwóch kanałów reporterowych. Kanał RP1 jest podobny do poprzednich instrumentów do analizy przepływowej z detekcją fluorescencji „pomarańczowej” dla barwników reporterowych, takich jak PE. Drugi kanał, RP2, wykorzystuje laser wzbudzający w zakresie fioletowym, który może być użyty do detekcji fluorescencji „niebieskiej” barwników wzbudzanych przy 402 nm z szczytami widma emisji w zakresie 421-441 nm.

Przetestowano kilka różnych kombinacji przeciwciał przeciwko ludzkim IgG i IgM w różnych stężeniach, przy standardowym 2000-krotnym rozcieńczeniu próbek i warunkach inkubacji opisanych w sekcji 6. Wstępny test przeciwciał przeciw-IgM sprzężonych z barwnikiem raportującym DyLight 405 (DL 405; wzbudzenie przy 400 nm i emisja przy 420 nm) dla kanału RP2 przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu 11 próbek PCR-dodatnich z DFSO w zakresie od 5 do >60 dni oraz próbki surowicy pozbawionej IgG. Odczynnik detekcyjny ten nie wygenerował wysokiego sygnału w kanale RP2, co przedstawiono na Rysunku 7A,B,C. W przypadku próbek z wysoką wartością MFI dla IgM w kanale RP2, najwyższe sygnały zaobserwowano dla RBD i Nc (Rysunek 7B,C). Choć miana IgM powinny być w tym czasie podwyższone w niektórych próbkach, zaobserwowane poziomy MFI nie przekroczyły 140 jednostek MFI przy użyciu odczynnika detekcyjnego IgM. Co więcej, kulek kontrolnych dla IgM brakowało znaczącego zakresu dynamicznego dla MFI przy zastosowaniu DL 405 sprzężonego z przeciwciałem przeciw-IgM w porównaniu do raportera przeciw-IgM RP1 znakowanego PE, użytego w tych samych stężeniach (Rysunek 7D).

Ponieważ nie było dostępnego odpowiedniego odczynnika detekcyjnego do IgM znakowanego reporterem RP2, przetestowano oryginalny biotynowany przeciwciało anty-IgG z SASB do zastosowania w kanale RP2. Sygnał dla IgG w kanale RP2 z użyciem SASB nie posiadał takiego samego zakresu dynamicznego jak w przypadku SAPE, ale nadal wykazywał zakres odpowiedni do pomiaru mian IgG dla S, RBD oraz Nc (Rysunek 8). Dane te doprowadziły do przetestowania różnych kombinacji odczynników detekcyjnych RP1 IgM i RP2 IgG, zgodnie z opisem poniżej.

Konwersja na test neutralizacji z podwójnym reporterem
Serologiczny test z podwójnym reporterem przekształcono w test neutralizacji poprzez dodanie etapu inkubacji z ACE2 i kuleczkami przed dodaniem próbki surowicy. Zastosowano szereg rozcieńczeń ACE2 2-krotnych, zaczynając od 16 µg/ml, a następnie przetestowano go na zestawach 11 próbek i surowic oczyszczonych, zgodnie z powyższym opisem. Dodatkowo, na zestawie 11 próbek i kontrolach z surowicy oczyszczonej przetestowano 3 różne kombinacje mieszanin przeciwciał detekcyjnych RP1 IgM i RP2 IgG. Końcowe kombinacje oraz stężenia odczynników uznane za optymalne szczegółowo opisano w Tabeli 1.

W celu wykrycia IgG przetestowano biotynowane przeciwciało anty-ludzkie IgG/SASB, stosowane w pierwotnym teście z pojedynczym reporterem, wraz z innym przeciwciałem anty-IgG sprzężonym z barwnikiem reporterowym BV. Chociaż koniugat BV dawał wysokie sygnały RP2 MFI, intensywność sygnału MFI dla miana IgG różniła się w zależności od mianowania ACE2 (Rycina 9A,C,E). Kombinacja biotynowanego przeciwciała anty-ludzkiego IgG/SASB wykazała bardziej spójny spadek sygnału MFI w mianowaniu ACE2 w porównaniu z koniugatem BV, wykazując odpowiedź zależną od dawki, mimo że poziomy MFI były niższe. Fluktuacje sygnału koniugatu BV przy różnych stężeniach ACE2 utrudniały również określenie procentowego zahamowania przez ACE2 w pełnym zakresie mian IgG w porównaniu z kombinacją biotynowanego przeciwciała anty-ludzkiego IgG/SASB (Rycina 9B,D,F). Próbki z niskimi sygnałami MFI, takie jak próbka DFSO 3, nie posiadają wystarczająco wysokich mian, aby ocenić wydajność tych odczynników lub zmierzyć neutralizacyjną zdolność IgG.

W celu oznaczenia mian IgM w kanale RP1, przeciwciało anty-IgM sprzężone z PE porównano z przeciwciałem anty-ludzkim IgM sprzężonym z barwnikiem raportującym DyLight 549 (DL 549; wzbudzenie przy 562 nm i emisja przy 576 nm) w stężeniach wymienionych w Tabeli 1. Z tych dwóch odczynników, anty-IgM z PE wykazało wyższe wartości MFI niż te uzyskane dla anty-ludzkiego IgM z DL 549 w badanych próbkach (Rysunek 9A,C,E). Kulek kontrolnych IgM służących do pomiaru dodania tych odczynników cechowały się różnymi średnimi wartościami MFI, wynoszącymi odpowiednio ≈17 000 dla anty-IgM z PE oraz 2 723 dla koniugatu DL 549. Pomimo tych różnic, wpływ różnych stężeń ACE2 na MFI był mierzalny przy użyciu koniugatu DL 549. W przypadku określania procentowego hamowania wiązania IgM przez ACE2, między dwoma odczynnikami do detekcji IgM wystąpiła niewielka, lecz nieistotna różnica (Rysunek 9B,D,F).

KombinacjaReporterstężenie końcowe w dołku (µg/mL)
RP1RP2
1anty-IgM znakowane PE2-
Biotyna-Ig-0.62
SASB-4
2DyLight 549 przeciwciało anty-ludzkie IgM1-
Brilliant Violet 421 przeciw ludzkiemu IgG-1
3DyLight 549 przeciwciało anty-IgM ludzkie1-
Biotyna-Ig-0.62
SASB-4

Tabela 1: Lista przetestowanych kombinacji barwników reporterowych RP1 i RP2. W celu pomiaru mian IgG i IgM oceniono kilka różnych barwników reporterowych RP1 i RP2. Trzy powyższe kombinacje zostały przetestowane przy różnych trybach detekcji RP1 oraz w celu optymalizacji testu neutralizacji. Dla kombinacji RP2 z użyciem SASB podano stężenia biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego oraz SASB. *Stężenie końcowe oznacza stężenie końcowe w dołku reakcyjnym.

Schemat blokowy procesu testu serologicznego i neutralizacji przedstawiający etapy i przygotowanie próbek.
Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający główne etapy protokołu testu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe potwierdzające sprzęganie S, RBD i Nc; analiza oddziakiwań białkowych; wyniki rozcieńczenia w stosunku do MFI.
Rycina 2: Potwierdzenie sprzęgania antygenów. Antygeny sprzęgano w ilościach 100, 10 i 1 pmol/106 kulek. W przypadku antygenów S i RBD zastosowano króliki przeciw-S, a detekcję przeprowadzono za pomocą PE przeciw-króliczych IgG. Dla Nc zastosowano oczyszczone za pomocą białka G króliki poliklonalne przeciw-Nc. Przedstawiono krzywe miareczkowania dla kulek sprzęganych z 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) i 100 pmol Nc (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe optymalizacji sprzęgania; rozcieńczenie vs. MFI; wysokie/średnie/niskie poziomy surowicy; wyniki eksperymentalne.
Rycina 3: Optymalizacja rozcieńczenia surowicy przy różnych poziomach sprzęgania antygenu. Próbki surowicy reprezentujące poziomy wysoki, średni, niski oraz próbki negatywne zostały przetestowane przy różnych poziomach sprzęgania pmol antygenu/106 kulek. 4-krotne miareczkowanie surowicy przeprowadzono z użyciem multipleksowej mieszaniny kulek sprzęganych z antygenem, zgodnie z protokołem analizy opisanym w sekcji 5. Przedstawiono wartości MFI krzywych miareczkowania dla S (A), RBD (B) oraz Nc (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy optymalizacji próbek/odczynników detekcyjnych; poziomy przeciwciał detekcyjnych w μg/mL.
Rysunek 4: Wyznaczenie optymalnego rozcieńczenia surowicy i stężenia odczynnika detekcyjnego. Osiem próbek surowicy, w tym od pacjentów negatywnych (2 próbki) oraz od pacjentów z niskim do wysokiego stopnia pozytywnych (6 próbek), przetestowano przy dodatkowych rozcieńczeniach surowicy z trzema różnymi stężeniami odczynnika detekcyjnego. Wyniki MFI przedstawiono dla S (A), RBD (B) i Nc (C). Na podstawie tych i innych danych (nie pokazano) wybrano rozcieńczenie próbki 1:2,000 oraz stężenie biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego 0.62 µg/mL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy optymalizacji neutralizacji; porównanie surowicy z wiązaniem ACE2; wykres wyników eksperymentalnych.
Rycina 5: Optymalizacja testu neutralizacji z pojedynczym reporterem. Modyfikację serologicznego testu z pojedynczym reporterem do testu wykrywania przeciwciał neutralizujących przeprowadzono poprzez dodanie etapu inkubacji z ACE2 jako konkurentem, zgodnie z opisem w Sekcji 6. Zestaw 11 próbek, obejmujący surowice o mianach od niskich do wysokich dodatnich, oraz próbkę surowicy pozbawionej IgG, przetestowano z dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń ACE2 rozpoczynającym się od 4 µg/mL, stosując standardowe warunki testu. W tym zakresie stężeń ACE2 widoczny jest spadek MFI wraz ze wzrostem stężenia ACE2 dla S (A) i RBD (B), ale nie dla Nc (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący sygnały hamowania zapośredniczone przez ACE2 dla S, RBD, Nc w analizie surowicy.
Rycina 6: Procentowe hamowanie sygnału przez ACE2. Przedstawiono procent pozostałych sygnałów dla zestawu 11 próbek (z Ryciny 4). Dla każdej próbki, niezależnie od miana IgG, przy najwyższym stężeniu ACE2 osiągnięto maksymalny spadek sygnału MFI wynoszący ≥30% dla S (A) i RBD (B). W przypadku antygenu Nc (C) nie zaobserwowano istotnego hamowania sygnału przy żadnej z testowanych ilości ACE2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki ELISA dla detekcji IgM; wykresy słupkowe przedstawiające dane sygnału w różnych warunkach i kontrolach.
Rycina 7: Test przeciwciała anty-IgM DyLight 405 jako odczynnika do detekcji IgM w RP2. Zestaw 11 próbek oraz surowic pozbawionych IgG wykorzystano do przetestowania anty-IgM sprzężonego z DL 405 jako odczynnika detekcyjnego w RP2. Przedstawiono sygnały MFI dla IgM w RP2 dla S (A), RBD (B) oraz Nc (C). Najwyższy sygnał MFI dla dowolnego antygenu w dowolnej próbce wyniósł około 140 jednostek MFI dla RBD w próbce H (B). Nawet sygnał na zestawie kulek kontrolnych IgM był mniejszy niż 1 000 MFI w kanale RP2 w całym zakresie miana przeciwciał i nie wykazał zwiększonego zakresu dynamicznego obserwowanego przy użyciu przeciwciała detekcyjnego PE anty-IgM w kanale RP1 (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy porównujące sygnały S IgG, RBD IgG i Nc IgG w próbkach surowicy; μg/mL SASB; RP2 MFI
Rysunek 8: Optymalizacja SASB jako reportera RP2 z biotynowanym przeciwciałem anty-IgG. Do przetestowania serii rozcieńczeń SASB ze standardową dawką 0,62 µg/mL biotynowanego przeciwciała anty-IgG wykorzystano zestaw 11 próbek oraz surowice pozbawione IgG. Przedstawiono wynikowe wartości MFI dla IgG w kanale RP2 dla S (A), RBD (B) oraz Nc (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy danych, porównanie arkuszy kalkulacyjnych z wynikami zakodowanymi kolorystycznie w sześciu panelach, analiza badawcza.
Rycina 9: Porównanie trzech różnych kombinacji mieszanin detekcyjnych dla RP1 IgM i RP1 IgG. Przetestowano trzy różne mieszaniny przeciwciał detekcyjnych na 11 próbkach oraz w osoczach pozbawionych IgG. Kombinacje i końcowe stężenia zostały opisane w Tabeli 1. Wszystkie próbki badano przy 2-krotnych rozcieńczeniach ACE2, zaczynając od 16 µg/mL. Przedstawiono dane dla próbek w DFSO 3, 12 i 30 dni. Sygnały MFI dla RP1 IgM (pomarańczowy) i RP2 IgG (niebieski) pokazano w panelach A (DFSO 3), C (DFSO 12) oraz E (DFSO 30). Procentowe pozostałe wartości MFI dla ACE2 przedstawiono w panelach B (DFSO 3), D (DFSO 12) oraz F (DFSO 30). Sygnały reprezentujące spadek o >30% w porównaniu do kontroli bez ACE2 zostały wyróżnione jasnozielonym kolorem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Badanie to rozszerzyło funkcjonalność multipleksowego testu mikrosfery fluorescencyjnej 3Flex, który jakościowo ocenia odpowiedź IgG na zakażenie SARS-CoV-21. Podczas gdy wiele testów serologicznych na COVID-19 wykrywa pojedynczy antygen, ten test jednocześnie ocenia antygeny S, RBD i Nc oraz obejmuje wewnętrzną kontrolę izotypuprzeciwciał 7. Ponadto ACE2 jest używany jako wskaźnik do wykrywania miana przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2.

Testy wieloantygenowe mogą być szczególnie przydatne w przyszłości do rozróżniania odpowiedzi immunologicznych między osobami zakażonymi i zaszczepionymi. W przypadku SARS-CoV-2, jeśli oceniane są tylko przeciwciała S i RBD, niemożliwe byłoby określenie, czy było to spowodowane przebytą infekcją, czy odpowiedzią przeciwciał poszczepiennych. Żadna z obecnie stosowanych szczepionek nie jest ukierunkowana na antygen Nc, więc oceniając antygeny S/RBD i Nc, możliwe jest odróżnienie przebytej infekcji wirusowej (Nc- i S/RBD-dodatniej) od odpowiedzi na szczepienie (tylko S/RBD-dodatnia; Nc-ujemne).

W obecnym badaniu testy serologiczne i neutralizacyjne 3Flex (sekcje 5 i 6) przeniesiono do nowego przyrządu do podwójnej analizy przepływu reporterowego (sekcje 7 i 8). Typowe protokoły testów immunologicznych dla testów multipleksowych opartych na kulkach są podobne do standardowych protokołów ELISA, po zastosowaniu porównywalnych etapów inkubacji próbki, inkubacji przeciwciał/reportera wykrywania i analizy wyników8. Wcześniejsze badania wykazały również, w jaki sposób standardowe testy ELISA można przenieść na platformę multipleksowania opartą na koralikach9.

Protokoły testowe można było bezproblemowo przenieść z poprzedniego przyrządu z pojedynczym reporterem do nowego systemu z podwójnym reporterem, jak pokazują wyniki uzyskane dla próbek testowych i kontroli (Rysunek 4 i Rysunek 5). W teście serologicznym wszystkie dodatnie próbki surowicy wykazywały charakterystyczny spadek sygnału reagujący na dawkę, odpowiadający zarówno większemu rozcieńczeniu próbki, jak i niższemu stężeniu przeciwciał wykrywających, podczas gdy sygnały dla próbek ujemnych pozostały na poziomach tła. Podobnie, w teście neutralizacji, malejące sygnały dla S i RBD, ale nie Nc, odpowiadały rosnącym stężeniom konkurenta ACE2, podczas gdy surowica pozbawiona IgG była znacznie mniej dotknięta dodatkiem ACE2. Wstępna inkubacja kulek z ACE2 przez 2 minuty przed dodaniem próbki surowicy (jak opisano w punktach 6 i 8) porównano również z łączeniem kulek z ACE2 i surowicą w tym samym czasie i dała niewielką różnicę w wynikach (dane nie pokazane). Ponieważ jednak wyniki uzyskane za pomocą kulek i etapu wstępnej inkubacji ACE2 były bardziej spójne, była to ostateczna procedura przyjęta do protokołu testu neutralizacji (sekcje 6 i 8).

Ponieważ system podwójnego reportera zawiera drugi fluorescencyjny kanał reporterowy, oba testy zostały przekształcone w testy izotypiczne, aby jednocześnie mierzyć odpowiedzi IgG i IgM. Funkcja podwójnego reportera analizatora przepływu umożliwia zbieranie sygnałów fluorescencyjnych z dwóch odczynników do wykrywania reporterów dla każdego analitu w multipleksie dla każdej próbki, skutecznie podwajając dane generowane dla próbki w teście. W celu opracowania i optymalizacji protokołów podwójnego testu reporterowego, kilka dostępnych na rynku barwników reporterowych i przeciwciał wykrywających oceniono dla nowego kanału RP2 (Figura 7 i Figura 8) w celu określenia najlepszej dostępnej opcji (opcji). Przeciwciało anty-IgM sprzężone z barwnikiem reporterowym DL 405 nie działało dobrze w kanale RP2 (Figura 7), więc anty-IgG biotyny z SASB oceniano następnie pod kątem wykrycia w kanale RP2 (Figura 8). Trzy kombinacje odczynników detekcyjnych RP1 i RP2 porównano w teście podwójnej neutralizacji reporterowej (tabela 1 i ryc. 9) w celu określenia najlepszych kombinacji do jednoczesnego wykrywania przeciwciał neutralizujących IgG i IgM. Chociaż wystąpiły istotne różnice w intensywności sygnału między kanałem RP1 wykorzystującym PE-anty IgM a kanałem RP2 wykorzystującym anty-IgM DL 549, nie było istotnej różnicy w pomiarze procentowego hamowania wiązania przez ACE2.

Uznaje się kilka ograniczeń obecnej metody i niniejszego badania. Po pierwsze, próbki testowane i wykorzystywane do opracowywania i optymalizacji metody ograniczały się do zestawów 8-11 próbek. Więcej próbek zostanie przetestowanych w rozszerzonych badaniach, aby sprawdzić, czy metoda jest w pełni zoptymalizowana. Po drugie, przetestowano ograniczoną liczbę fluoroforów reporterowych i par reporterowych. Dalsze testy wszystkich dostępnych reporterów we wszystkich możliwych kombinacjach określą, które odczynniki mogą być z powodzeniem stosowane w tej metodzie. Przeciwciało anty-IgG sprzężone z biotyną różniło się od przeciwciała anty-IgG sprzężonego z reporterem BV 421. Tak więc, chociaż istniała zmienność intensywności sygnału dla anty-IgG BV 421, mogła ona wynikać ze specyficzności przeciwciała i nie była związana z barwnikiem reporterowym. Testowanie innych dostępnych przeciwciał sprzężonych z BV 421 może zidentyfikować inne przeciwciało, które dobrze działałoby w kanale RP2. Przyszłe badania będą również oceniać połączenie PE anty-IgM z anty-ludzką IgG BV 421 w celu wykrywania odpowiednio w RP1 i RP2. Wreszcie, nawet przy możliwości podwójnego reporterowania instrumentu, testy są ograniczone do dwóch izotypów (dwóch parametrów) na reakcję. Jeśli mają być mierzone dodatkowe izotypy lub pożądane jest pełne izotypowanie, wówczas dodatkowe reakcje przy użyciu tych samych dwóch kanałów reporterowych musiałyby być prowadzone w oddzielnych studzienkach.

Technologia multipleksowania oparta na kulkach pozwala na szybkie i elastyczne projektowanie testów z łatwą implementacją do rutynowych procesów laboratoryjnych 3,4,10. Badanie to wykazało łatwość przeniesienia wcześniej opisanych testów serologicznych i neutralizacyjnych 3Flex dla SARS-CoV-2 do systemu analizy przepływu do pomiaru IgG za pomocą jednego reportera lub z niewielką modyfikacją, jednocześnie mierząc zarówno odpowiedzi IgG, jak i IgM za pomocą dwóch reporterów. Opcja podwójnego reportera ma wyraźną przewagę nad platformami z pojedynczym reporterem, ponieważ może dostarczyć dwa razy więcej danych na próbkę, wykorzystując połowę objętości próbki i połowę liczby studzienek reakcyjnych. Dzięki odpowiednim barwnikom reporterowym i przeciwciałom detekcyjnym, testy izotypowania można łatwo opracować i przeprowadzić na urządzeniu do analizy przepływu z podwójnym reporterem.

Oświadczenia

Stephen Angeloni i Sherry Dunbar są pracownikami firmy Luminex Corporation, która produkuje niektóre z odczynników i przyrządów użytych w tym badaniu. Publikacja tego artykułu w otwartym dostępie była sponsorowana przez Luminex Corporation

Podziękowania

Ten raport został sfinansowany przez Luminex Corporation (Austin, TX). Autorzy dziękują dr Matthew Silvermanowi (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, Floryda) za pomoc w redakcji naukowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ACE2 (człowiek) (rec.)AdipoGen Life SciencesAG-40B-0192-3050
Biotin-SP (długi dystans) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specyficzny dla fragmentuJackson ImmunoResearch Laboratories109-065-098
Albumina surowicy bydlęcejMilliporeSigmaA7888Sigma-Aldrich
Branson 1800 Środek czyszczący/dźwiękowy do kąpieli wodnejRóżne
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystiren NBS MicroplateCorning3650
Corning 96-well Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca, niesterylnaCorning6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ   specyficzny fragmentJackson ImmunoResearch Laboratories109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Kozia anty-ludzka IgM Fc5μ specyficznaJackson ImmunoResearch Laboratories109-506-129Wycofane, ale dostępne u wielu dostawców
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 SprzężonyThermoFisher Scientific62-4317-82
Wytrząsarka do mikropłytek inkubacyjnych FisherbrandThermoFisher Scientific02-217-757Fisher Scientific
Kozioł anty-króliczą IgG (H+L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, PEThermoFisher ScientificP-2771MP
Luminex Magnetyczny separator płytowyLuminex CorporationCN-0269-01
Koraliki MagPlexLuminex CorporationMC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Koza Anty-Ludzka IgM Fc5μ specyficzneJackson ImmunoResearch Laboratories109-116-129
Miliporysoli fizjologicznej buforowanej fosforanemSigmaP3813Przeciwciało
białkowe nukleokapsydu Sigma-Aldrich SARSNovos BiologicalsNB100-56683Niesprzężone, królik, poliklonalne, białko G oczyszczone
przeciwciało białkowe nukleokapsydu SARSNovos BiologicalsNB100-56049Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko A oczyszczone
Przeciwciało przeciwko białku kolca SARSNovos BiologicalsNB100-56047Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko G oczyszczone
Przeciwciało przeciwko białku kolca SARSNovos BiologicalsNB100-56048Niesprzężone, królik, poliklonalne, Białko G oczyszczone Przeciwciało
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1, Królik MAbSinoBiological40150-R007
Miliporekazydku soduSigmaS2002Sigma-Aldrich
Streptawidyna, koniugat R-fikoerytryny (SAPE)ThermoFisher ScientificS21388najwyższej jakości
rewolwer / rotatorThermoFisher Scientific88881001
TWEEN 20MilliporeSigmaP9416Sigma-Aldrich
xMAP Zestawdo badania przeciwciałLuminex Corporation40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SELuminex CorporationINTELLIFLEX-DRSE-RUO

Bibliografia

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).
  2. Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
  3. Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza wielokrotna z użyciem kulekwykrywanie IgG i IgMcytometria przepływowapodwójny test reporterowyprzeciwciała przeciw białku kolcawiązanie z receptorem ACE2antygen nukleokapsydutesty serologiczneinhibicja przeciwciał
Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.