Artykuł metodologiczny

Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

DOI:

10.3791/62488

⸱

12 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Biotechnology, University of Tehran

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół opisuje procedurę wytwarzania kompleksu białkowego HiBiT wiążącego receptor domeny oraz jego zastosowanie do szybkiego i czułego wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się pandemii COVID-19 zwiększyło zapotrzebowanie na lepsze metody wykrywania serologicznego w celu określenia epidemiologicznego wpływu koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Rosnąca liczba zakażeń SARS-CoV-2 rodzi potrzebę lepszych testów wykrywania przeciwciał. Obecne metody wykrywania przeciwciał obniżają czułość ze względu na szybkość lub są czułe, ale czasochłonne. Duża część przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 jest ukierunkowana na domenę wiążącą receptor (RBD), jeden z głównych przedziałów immunogennych SARS-CoV-2. Niedawno zaprojektowaliśmy i opracowaliśmy wysoce czuły, znakowany bioluminescencyjnie RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2. Poniższy tekst opisuje procedurę wytwarzania kompleksu HiBiT-RBD oraz szybki test do oceny obecności przeciwciał ukierunkowanych na RBD za pomocą tego narzędzia. Ze względu na trwałość produktu białkowego HiBiT-RBD w szerokim zakresie temperatur oraz krótszą procedurę eksperymentalną, którą można zakończyć w ciągu 1 godziny, protokół można uznać za bardziej efektywną alternatywę do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawne pojawienie się nowego koronawirusa, SARS-CoV21, spowodowało ponad 2 800 000 ofiar śmiertelnych i 128 milionów infekcji na dzień 30 marca 2021roku2. Ze względu na brak wiarygodnej i ugruntowanej procedury leczenia klinicznych SARS-CoV-2 podjęto wiele wysiłków w celu ograniczenia dalszej transmisji wirusa, a co ważniejsze, opracowania skutecznego i solidnego leczenia lub szczepionki3. Do tej pory w badaniach zgłoszonych przez Światową Organizację Zdrowia jest ponad 50 kandydatów na szczepionkę przeciwko COVID-19 class<="xref">4. Wykrycie przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2 ma ogromne znaczenie dla określenia długoterminowej stabilności odpowiedzi humoralnej po podaniu szczepionki, a także u ozdrowieńców z COVID-195. Niektóre badania wykazały, że istnieje możliwość, że ozdrowieńcy z SARS-CoV-2 tracą większość przeciwciał wiążących RBD po 1 roku5,6,7,8,9. Konieczne są dalsze badania, aby lepiej zrozumieć trwałą odporność, a bardziej czułe platformy wykrywania przeciwciał mogą pomóc w dalszych pracach. Interesującym i wartym uwagi obszarem badań są również doniesienia o utrzymującej się odporności po łagodnych infekcjach SARS-CoV-2, które sugerują długotrwałą odpowiedź przeciwciał. Szybka i dokładna metoda wykrywania jest niezbędna do monitorowania przeciwciał w surowicach poszczególnych osób, aby uzyskać więcej informacji na temat odporności w populacji.

Podobnie jak inne koronawirusy, SARS-CoV-2 wykorzystuje wystającą glikoproteinę kolca do wiązania się z enzymem konwertującym angiotensynę-2 (ACE2) w celu zainicjowania kaskady zdarzeń, które prowadzą do fuzji błony wirusowej i komórkowej6,7. Kilka badań dowiodło niedawno, że RBD białka Spike odgrywa kluczową rolę w wywoływaniu silnej i swoistej odpowiedzi przeciwciał przeciwko SARS-CoV28,9,10,11. W szczególności korelacje zaobserwowane przez Premkumara i wsp. między mianem przeciwciała wiążącego RBD a siłą neutralizacji SARS-CoV-2 w osoczu pacjentów są zgodne z tym, że RBD jest immunogennym przedziałem struktury wirusa9. Mając to na uwadze, wiele testów diagnostycznych dostępnych do wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2 jest czasochłonnych i kosztownych, wymaga długotrwałej procedury inkubacji i płukania (test immunoenzymatyczny [ELISA]) lub brakuje im czułości i dokładności (test immunologiczny przepływu bocznego [LFIA])12. W związku z tym ilościowa i szybka komplementarna metoda serologiczna wykrywania przeciwciał pochodzących z COVID-19 o wysokiej czułości, szybkiej odpowiedzi i stosunkowo niskich kosztach zaspokoiłaby potrzebę wiarygodnego testu serologicznego do nadzoru epidemiologicznego nad SARS-CoV-2.

Podsumowując, ograniczenia obecnych testów serologicznych skłoniły do zbadania bioluminescencyjnego systemu raportowania jako potencjalnego czynnika diagnostycznego w przyszłych badaniach serologicznych. Bioluminescencja to naturalnie występująca reakcja enzym/substrat, z emisją światła. Lucyferazy Nanoluc jest najmniejszym (19 kDa), ale najjaśniejszym systemem w porównaniu do lucyferazy Renilla i świetlika (odpowiednio 36 kDa i 61 kDa)13,14. Co więcej, Nanoluc ma najwyższy stosunek sygnału do szumu i stabilność spośród wcześniej wymienionych systemów. Wysoka intensywność sygnału Nanoluc wspiera detekcję nawet bardzo małych ilości fuzji reporterowych15. Technologia binarna Nanoluc (NanoBiT) to podzielona wersja systemu Nanoluc, która składa się z dwóch segmentów: małego BiT (11 aminokwasów; SmBiT) i duży BiT (LgBiT) o stosunkowo niskim powinowactwie oddziaływań (KD = 190 μM ), tworząc kompleks luminescencyjny16. NanoBiT jest szeroko stosowany w różnych badaniach obejmujących identyfikację interakcji białko-białko15,17,18,19 i komórkowych szlaków sygnałowych11,20,21.

Niedawno wprowadzono inny mały peptyd o wyraźnie wyższym powinowactwie do LgBiT (KD = 0,7 nM), a mianowicie system HiBiT Nano-Glo, w miejsce SmBiT. Wysokie powinowactwo i silny sygnał testu Nano-Glo "dodaj-wymieszaj-odczyt" sprawia, że HiBiT jest odpowiednim, ilościowym, luminescencyjnym znacznikiem peptydowym. W tym podejściu znacznik HiBiT jest dołączany do białka docelowego poprzez opracowanie konstruktu narzucającego minimalną interferencję strukturalną. Fuzja białka HiBiT aktywnie wiązałaby się z odpowiednikiem LgBiT, wytwarzając wysoce aktywny enzym lucyferazy do generowania wykrywalnej bioluminescencji w obecności odczynników detekcyjnych (Rysunek 1). Podobnie opracowaliśmy system oparty na HiBiT Nano-Glo do łatwego pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy osób ozdrowieńców SARS-CoV-2, a ostatnio opracowaliśmy RBD SARS-CoV-2 znakowany HiBiT. W artykule opisano protokół wytwarzania bioreportera HiBiT-RBD przy użyciu standardowych procedur i sprzętu laboratoryjnego oraz pokazano, w jaki sposób ten bioreporter może być wykorzystany w szybkim i skutecznym teście do wykrywania przeciwciał RBD skierowanych przeciwko SARS-CoV-2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Opisany poniżej protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi etycznymi zgodnie z kodem protokołu 20200371-01H.

1. Produkcja i ocena bioreportera HiBiT-RBD

  1. Wyprodukowanie wystarczającej ilości bioreportera HiBiT-RBD
    1. Przygotuj się do hodowli komórkowej
      1. Przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny. Następnie ogrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      2. Włącz komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i użyj 70% v/v etanolu do sterylizacji powierzchni szafki.
    2. Hoduj linię komórkową.
      1. Wyjmij linię komórkową z -80 °C lub ciekłego azotu i rozmroź ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Odpowiednia linia komórkowa jest łatwa do utrzymania w hodowli, ma wysoką wydajność transfekcji i nadaje się do produkcji białek egzogennych. Do tego protokołu wykorzystano ludzką nerkę embrionalną, komórki HEK293.
      2. Wymieszać rozmrożone komórki z co najmniej 10 ml kompletnej pożywki, odpipetować zawiesinę komórek na 10 cm szalkę Petriego i zakręcić płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki w naczyniu. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 85-95%.
      3. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aż poziom konfluencji osiągnie 80-90%. Przy dużej konfluencji usuń pożywkę, umyj komórki ciepłym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i dodaj 1 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminowego, aby oderwać komórki od powierzchni.
        UWAGA: Ogniwa HEK293 można dość łatwo odłączyć. Dlatego etap mycia powinien być wykonywany bardzo delikatnie, aby zapobiec przypadkowemu oderwaniu i utracie komórek.
      4. Po około 5 minutach przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem. Jeśli wszystkie komórki unoszą się na wodzie, dodać co najmniej 4 ml pożywki i przenieść zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj 1 × 106 komórek do każdego dołka 6-dołkowej płytki do transfekcji.
        UWAGA: Po 24 godzinach komórki powinny być zlewane w 80% lub więcej.
    3. Transfekcja plazmidu HiBiT-RBD
      1. Użyć 1 μg plazmidu ekspresyjnego HiBiT-RBD z odpowiednim odczynnikiem do transfekcji. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać całkowitą objętość do każdego dołka płytki, kroplami.
        UWAGA: Postępuj zgodnie z protokołem transfekcji producenta. W tym przypadku mieszaninę (określoną ilość) odczynnika do transfekcji z DMEM dodano do rozcieńczonego plazmidu (1 μg) w DMEM (patrz Tabela materiałów). Użyj markera zawierającego plazmid (np. białko zielonej fluorescencji [GFP]) jako kontrolę w celu monitorowania skuteczności transfekcji.
      2. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę zawierającą mieszaninę transfekcji kompletną pożywką. Dokładnie obserwować kontrolę transfekcji 48 godzin po transfekcji.
        UWAGA: Jeśli transfekcja była pozytywna i skuteczna (ponad 80% GFP-dodatnich), komórki powinny być gotowe do pobrania bioreportera HiBiT-RBD. Konstrukt zawiera również His-tag, który może być użyty do uzyskania oczyszczonego białka zamiast całkowitego supernatantu.
      3. Zebrać supernatant w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Dodaj 500 μl 1x pasywnego buforu do lizy (PLB) do komórek; Inkubować i wstrząsać płytką przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek.
        UWAGA: Supernatant i roztwór lizatu można przechowywać w temperaturze -20 °C z niewielką utratą integralności przez co najmniej 6 miesięcy. Według Azad et al.22, reporter jest stabilny w szerokim zakresie pH (4-12) i temperatury (4-42 °C).
  2. Ocena sygnału luminescencyjnego z bioreportera za pomocą testu lucyferazy
    1. Przygotowanie składników reakcji
      1. Użyj supernatantu jako źródła bioreportera.
        UWAGA: Zarówno supernatant, jak i lizat zawierają bioreporter HiBiT-RBD i mogą być używane do testu. Jednakże supernatant jest zalecany jako źródło z przyczyn wyjaśnionych w poniższych uwagach.
      2. Rozcieńczyć LgBiT i substrat do 1x przed użyciem (stężenie wyjściowe wynosi 100x).
        UWAGA: Szczegółowe informacje na temat LgBiT można znaleźć w Tabeli Materiałów.
    2. Test lucyferazy
      1. Przenieść 50 μl supernatantu z każdej studzienki lub probówki do płytki 96-dołkowej i dodać 50 μl 1x LgBiT do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Otwórz oprogramowanie luminometru, dodaj 50 μl 1x substratu (furimazyny) do każdej studzienki, umieść płytkę w luminometrze i uruchom oprogramowanie.
        UWAGA: Dodaj substrat bezpośrednio przed odczytaniem płytki, aby zapobiec zużyciu substratu przez aktywne enzymy przed pomiarem sygnału.

2. Wykrywanie przeciwciał anty-RBD za pomocą szybkiego i czułego testu

  1. Test wykrywania przeciwciał HiBiT-RBD
    1. Przygotować bioreporter HiBiT-RBD zgodnie z opisem w sekcji 1.1 protokołu.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie supernatantu do następującego testu, ponieważ jest on łatwiejszy do zebrania i zawiera dojrzałą glikozylowaną wersję białka. Co więcej, lizat zawiera kilka innych białek, które mogą zakłócać interakcję HiBiT-RBD-przeciwciało.
    2. Połączyć 50 μl supernatantu zawierającego HiBiT-RBD z 1 μg komercyjnego przeciwciała SARS-CoV-2-RBD w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Do roztworu dodać 20 μl białka wiążącego immunoglobuliny (białka G). Zwiększyć całkowitą objętość do 300 μl, dodając PBS.
      UWAGA: Całkowitą objętość mieszaniny można zmniejszyć do 150 μL. Nie zaleca się zmniejszania objętości całkowitych, ponieważ może to spowodować nieodpowiednie wymieszanie przeciwciał z bioreporterem.
    3. Inkubować probówkę (probówki) na wytrząsarce probówkowej lub rotatorze przez 30 minut. Wirować przy 12 000 × g przez 30 s, odrzucić supernatant i przemyć PBS. Powtórz proces trzy razy, aby usunąć wolny HiBiT-RBD. Zawiesić ponownie w 50 μl PBS i przenieść na płytkę 96-dołkową.
    4. Dodaj 50 μL 1x LgBiT i odczekaj 5 minut. Następnie dodaj 50 μl 1x substratu NanoLuc. Natychmiast odczytaj sygnał luminescencyjny za pomocą luminometru.

3. Wysokoprzepustowe wykrywanie przeciwciał specyficznych dla SARS-CoV-2 w próbkach surowicy pacjenta

  1. Przygotować większe ilości bioreportera HiBiT-RBD do testu wysokoprzepustowego, postępując zgodnie z sekcją 1.1 protokołu.
  2. Połączyć 20 μl białka magnetycznego G z 50 μl supernatantu HiBiT-RBD w studzience z 96-dołkową płytką dla każdej próbki. Dodać 10 μl próbki surowicy do każdego dołka i zwiększyć całkowitą objętość do 150 μl, dodając PBS.
    UWAGA: Należy stosować zarówno nieswoiste przeciwciała IgG (kontrola ujemna), jak i neutralizujące przeciwciało SARS-CoV-2 (kontrola pozytywna) przy stężeniu 1 μg/ml, jak opisano w kroku 2.1.2. Co więcej, próbki surowicy od zaszczepionych myszy można również ocenić pod kątem przeciwciał. W tym teście próbki surowicy zostały pobrane z Ottawa Hospital General Campus zgodnie z zatwierdzoną procedurą i za świadomą zgodą osób.
  3. Inkubować przez 30 minut na shakerze w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę na podkładce magnetycznej, aby wytrącić kompleks przeciwciał białkowych.
    UWAGA: Specyficzna struktura myjki magnetycznej spowoduje wytrącenie kompleksu na bocznych ściankach każdej studzienki.
  4. Wylej roztwór w środkowej części każdej studzienki i dodaj PBS do mycia. Powtórz krok prania co najmniej trzy razy, aby usunąć nadmiar HiBiT-RBD. Dodać 50 μl 1x PBS i 50 μL 1x LgBiT. Inkubować przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj oprogramowanie luminometru, a następnie dodaj 50 μl 1x podłoża. Umieść płytkę w maszynie, uruchom oprogramowanie i nagraj sygnały. Porównaj sygnały z próbek surowicy, próbek kontrolnych i tła (puste studzienki).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnały zarówno z lizatu komórkowego zawierającego HiBit-RBD, jak i supernatantu transfekowanych komórek zostały zarejestrowane (Rysunek 2) w celu oceny odpowiedniego źródła białka. HiBiT-RBD i LgBit były oddzielnie używane jako kontrole, a dane wykazały niskie tło w porównaniu z silnym sygnałem, gdy obie części były połączone. W związku z tym interakcja HiBiT-RBD z LgBiT jest niezbędna do wytworzenia aktywnego enzymu do trawienia substratu i aktywności bioluminescencyjnej (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnąca liczba osób zakażonych wirusem SARS-CoV-2 oraz nieustanne wysiłki na rzecz globalnych szczepień wymagają czułych i szybkich testów serologicznych, które można wykorzystać w badaniach serologicznych na dużą skalę. Ostatnie badania pokazują, że do opracowania takich testów można wykorzystać rozszczepione bioreportery oparte na nanolucyferazie. Niedawno opracowaliśmy HiBiT-RBD bioreporter, aby zaprojektować test, który można wykorzystać do szybkiego i niezawodnego wykrywania przeciwciał specyficznych dla SARS-CoV-2 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy i dziękujemy za pomoc techniczną Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin i Christiano Tanese De Souza. Dziękujemy również Minie Ghahremani za projekt graficzny. Chcielibyśmy również podziękować wszystkim osobom, które wzięły udział i oddały swoje próbki krwi do tego badania. DWC jest częściowo wspierany przez Wydział i Wydział Medycyny Uniwersytetu w Ottawie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5x Pasywny bufor do lizyPromegaE194A30 ml
Bio-Plex Ręczna myjka magnetycznaBio-Rad171020100
DMEMSigmaD6429-500ml
System testowy lucyferazy Dual-GloPromegaE2940100 ml
Surowica bydlęca płodu (FBS)SigmaF1051
Plazmid HiBiT-RBDgacggatcgggagatcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgttgg aggtcgctgggtggcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgcttcgcgatgccagatatacgc gttgacattgattattgactagatgactagttatagt aatcaattacggggtcatgccatgccatcaa atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatgctattaccatggtgatgcggtt ggcagtacatcaatgggcgt ggcagtacatcaatgggcgtgggtg actcacggatttccaagtctccaccccatg acgtcaatggggaccaatc aacgggactttccaatgtcgtccatcac ctaactagagaacccactgcttactggctctcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTCTCTCTCTCTCTCTCTC TGGTGACtctggct agcggcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAGGACC ACGACGGTGACTACAGGACCA CGACATCGACTACAGGACACAGGACAC GACGACAAGggcagcggctctccca gcagcggaggcgggcacaaatctgtg cccatcggcggcaaatctgtg cccattcgggggaggtaacgccaccagac ttgccagcgtgtatgcctggaaccaagaga atctctaattgcgtgggactatagcgtgctgcttgt gctatggcgtgtccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtacggccgactttttgt gatcaggggggatgaggcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcccctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggac cggctgtacagaaattccatcatsc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtgctgtgctg cacgacctgcaaccgtggacc gaggggggccacatgctgctgcatc atcaccatcatcatcaccgatag cggccgctcaccaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagagccatctgttgtccgtg ccttgacctctcacccac tgtcctcctaaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgggg ggtggggtgg ggattggggggaccgaaggaa agaaccaggggggctctctagggggtatcccca cgcgccctctagcggcattaagcgcggcg ggtgtggtgctacgcgcctac acttgccagcgctagcgcctcctttcg ctttcttcgccacgtgccccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctctt tccccctcta gggttccgattgggcttha gggttccgatttagtgctttacggcaccgaccgacc ccaaaaaacttgattagggt gtgggccatcgccatgcccgtgtct cttgt cttgtctctcgtt***TcratrattGCTTTTTTGGtrattGCTCTCT atttaacatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtggaaagtccccc caggctccccagcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggcccaggggcaggcaagg atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccccccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccccc ccctaactccgcccagttccccattctcccc ccatgggactatttatgcagaggc cgaggcccttttatgcagaggc cgagggcctctgccatgcaggacgagggtc. cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccgggcttgggcttggctattcgtctatgcatccatgct gatgccgccgttccgtgcagggg cgcccggttgtcaagaccgacctgtccgggg tgccctgaatgaactgcaggacgaggggcg cggctatcgtggacgacggggcgtgt tgcgcagctgtgccatggctggcgtggcgtg. cggccatgctgcaatggcaatgaactgcatgccatggcggcg cggctatcgtgcgtgc tgcccatccatggccatgccatgcgccggcgcggg cgggcatggcatgcgcg agcgagcacgtactcggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccgaactgttcgccaaccgccagggcccgg ggctcaaggcgcgcatgcgcggggagg atctcgtcgtgacccatgcatggcctgcttg ccgaatatcatggtggaatgggctttt ctggattcatcgactgtgggt ggcgggt ggcgggctatcaggacatagcgttggctgctgaagggctctgcgcgggcgcggcgcgtgc ttctatcgccttcgtgackackcgackcggackcggackackggcackcggccgaatgggcctggctgg. tccaccgccccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccggggggcggggatga tcctccagcgcggggaggcggagggggaggggagt tcttcccccaccaccaccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaaagcaatagcatcacaa atttcaaataaagcatttcactgcatt ctagttgtggtccaactcatgtatgtataccatcatgtataccatgtcgacccgaccttctc ctgtgtgaaatcatggtcatagctctc ctgtgtgaaattgtccaaattccac aacatacgagccggaagcataa gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcgggcgtgctcactgactgactc gctgcgcctcggtcggcggcggt atcagctcactcaaaggtggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaggaaagaa catgtgagcaaggggagagcaaggggag gaaccgtagggggcgtgcgttt tccataggctccgcctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaaaatcgaccatcacaaatcgaccatcaaaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctctcgtgcctgccgcctctgcccgt tttctcccttcgggaagcggcgctcat agctcacgctctgtaggtatcagtggtggtgtagtag: gtcgttcgctccaagctgggctgtgcacgaaa ccccccgtgcgggaccgcacgaa ccccccgtgccgtcttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcaggccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagtgtggtgtaact acggctacactagaagggtggggtaact acggctacactagaagaagaacagattttatc tgcgctgaagaccagttcgga aagagttggtggcaaaca ccaccgctgggggtgca ctcaagatcctttgattttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaggatct tcacctagatccttttaaatgaaatgaagtt ttaaatcaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacacagttactaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccgtcgtgtagataactac gatacggctccccagtg ctgcaatgatgatggccatcccagtg ctgcaatgataccgcaccacc ggctccagatttattatcaataaaccaggggagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattttt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgccatggtggtgg cttcattcagagctcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaag cggttagctccttcgtgtggatcgttgtccagaagtaagttgggcagtccaagtaagttgggcagtgttatccatgtt tatggcagcactcatcatgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgctctcgcgtgackacka gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttttcaccaggcgtcttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatcttcctttttcaat attattgaagcatcatcttcctttttcaat attattgaagcattattattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaagggcgca catttccccgaagtgccacctggtc
LgBiTPromegaN3030
penicylina StreptomycynaThermo Fisher Scientific
Pierce Protein G Kulki magnetyczneThermo Fisher Scientific88848
PolyJet Odczynnik do transfekcji DNA in vitroSignagenSL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało neutralizujące kolce, mysz MabSinoBiological40592-MM57
Synergy Mx Microplate ReaderBioTek96-dołkowy czytnik płytek
Trypsyna-EDTAThermo Fisher Scientific25200560,25%
Zestaw 15140122

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
  2. Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
  3. Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514(2020).
  4. World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
  5. Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
  6. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  7. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  8. Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
  9. Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
  10. Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
  11. Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
  12. Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516(2020).
  13. Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
  14. Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
  15. Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
  16. Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).
  17. Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596(2019).
  18. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  19. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  20. Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
  21. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  22. Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeciwcia o przeciw SARS CoV 2bioreporter HiBiTtest wykrywania przeciwciareporter bioluminescencyjnywytr canie za pomoc bia ka Gtest lucyferazowyanaliza pr bek surowicytest wysokoprzepustowysubstrat NanoLuc

Powiązane artykuły