Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sonda siły biomembranowej (BFP) pojawiła się ostatnio jako nanonarzędzie do natywnej spektroskopii dynamicznej siły (DFS) na powierzchni komórki lub in situ, które może mierzyć kinetykę wiązania pojedynczych cząsteczek, oceniać właściwości mechaniczne oddziaływań ligand-receptor, wizualizować dynamiczne zmiany konformacyjne białek i bardziej ekscytująco wyjaśniać mechanizmy mechanosensingu komórek za pośrednictwem receptorów. Ostatnio BFP został wykorzystany do pomiaru stałej sprężystości wiązań molekularnych. Protokół ten opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania analizy DFS stałej sprężystości sprężystości molekularnej. W szczególności omówiono dwa tryby pracy BFP, a mianowicie tryby Bead-Cell i Bead-Bead. Protokół ten koncentruje się na wyprowadzeniu stałych sprężystości wiązania molekularnego i komórki na podstawie surowych danych DFS.
Wprowadzenie
Jako technika DFS na żywych komórkach, BFP przekształca ludzką czerwoną krwinkę (erytrocyt; Rycina 1) w ultraczuły i dostosowywalny przetwornik siły o odpowiednim zakresie stałej sprężystości wynoszącym 0,1–3 pN/nm1,2,3. Aby badać interakcję ligand-receptor, BFP umożliwia pomiary DFS z rozdzielczością siły wynoszącą ~1 pN (10-12 N), rozdzielczością przestrzenną ~3 nm (10-9 m) oraz rozdzielczością czasową ~0,5 ms (10-3 s)4,5. Konfiguracja eksperymentalna sk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Uzyskanie zdarzeń DFS nadających się do analizy
- Uruchom eksperyment w oprogramowaniu (np. LabVIEW VI) w celu sterowania BFP i ustawienia parametrów (Rycina S1A).
- Obserwuj powtarzalne kontakty koralika-sondy z koralikiem-celem lub komórką w oprogramowaniu BFP Monitor (Rycina S1B).
- Przetestuj i osiągnij częstotliwość adhezji ≤ 20% w ciągu pierwszych 50 kontaktów poprzez dostrojenie siły uderzenia i czasu kontaktu, co zapewnia, że ≥ 89% zdarzeń adhezji DFS jest zapośredniczonych przez pojedyncze wiązania12,13,14
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy zaprezentowano protokół analizy stałej sprężystości BFP. W trybie analizy Bead-Cell przeanalizowano kmol wiązania molekularnego pomiędzy glikozylowanym białkiem Thy-1 naniesionym na koralik sondy (Probe bead) a integryną α5β1 eksprymowaną na komórce docelowej K562 (Thy-1-integrin α5β1; Rysunek 3A)10. Wartość kcell została również wyznaczona w trybie Bead-Cell (komór.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podsumowując, dostarczyliśmy szczegółowy protokół analizy danych do wstępnego przetwarzania surowych danych DFS i wyprowadzania molekularnych stałych sprężystości w trybach analizy BFP Bead-Bead i Bead-Cell. Przedstawiono modele biomechaniczne i równania niezbędne do wyznaczenia molekularnych i komórkowych stałych sprężystości. Chociaż badane są różne integryny, mol k mierzony w trybie Bead-Bead i Bead-Cell ma znaczne różnice w zakresie (Rysunek 3A w porównaniu z
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.
Podziękowania
Dziękujemy Guillaume'owi Troadecowi za pomocną dyskusję, Zihao Wangowi za konsultacje sprzętowe, oraz Sydney Manufacturing Hub, Greggowi Suaningowi i Simonowi Ringerowi za wsparcie naszego startupu laboratoryjnego. Praca ta była wspierana przez Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) oraz The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and M....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-Mercaptopropylotrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
| Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Przygotowanie buforu fosforanowego |
| Akwizycja danych BFP VI | Kontrola i ustawianie parametrów BFP | LabVIEW | |
| BFP analiza danych surowych BFP | |||
| Biotyna-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Biotynylacja |
| RBCKoraliki ze szkła borokrzemianowego | Distrilab Particle Technology, Holandia | 9002 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand Funkcjonalizacja Kamera |
| VI | LabVIEW | Monitorowanie BFP | |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode' s przygotowanie |
| buforu Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode' s preparat buforowy |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode' s przygotowanie buforowe |
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy; Tyrode" s przygotowanie buforowe |
| Węglan sodu (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode' s preparat buforowy |
| Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4• H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Preparat buforu fosforanowego |
| Streptawidyna-Maleimid | Sigma-Aldrich | S9415 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
Bibliografia
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
