Method Article

Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej

DOI:

10.3791/62490

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonda siły biomembranowej (BFP) pojawiła się ostatnio jako nanonarzędzie do natywnej spektroskopii dynamicznej siły (DFS) na powierzchni komórki lub in situ, które może mierzyć kinetykę wiązania pojedynczych cząsteczek, oceniać właściwości mechaniczne oddziaływań ligand-receptor, wizualizować dynamiczne zmiany konformacyjne białek i bardziej ekscytująco wyjaśniać mechanizmy mechanosensingu komórek za pośrednictwem receptorów. Ostatnio BFP został wykorzystany do pomiaru stałej sprężystości wiązań molekularnych. Protokół ten opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania analizy DFS stałej sprężystości sprężystości molekularnej. W szczególności omówiono dwa tryby pracy BFP, a mianowicie tryby Bead-Cell i Bead-Bead. Protokół ten koncentruje się na wyprowadzeniu stałych sprężystości wiązania molekularnego i komórki na podstawie surowych danych DFS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako technika DFS z żywymi komórkami, BFP tworzy ludzką czerwoną krwinkę (RBC; Rysunek 1) do ultraczułego i przestrajalnego przetwornika siły o kompatybilnym zakresie stałej sprężystości 0,1-3 pN/nm1,2,3. Aby zbadać interakcję ligand-receptor, BFP umożliwia pomiary DFS przy ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) i ~0,5 ms (10-3 s) w rozdzielczości obowiązującej, przestrzennej i czasowej4,5. Jego eksperymentalna konfiguracja składa się z dwóch przeciwległych mikropipet, a mianowicie sondy i tarczy. Mikropipeta Probe zasysa erytrocyty, a kulka jest przyklejana na jej wierzchołku poprzez interakcję biotyny-streptawidyny. Koralik jest pokryty interesującym go ligandem ( Rysunek 1A). Mikropipeta Target zasysa odpowiednio komórkę lub kulkę z receptorem zainteresowania, odpowiadającym trybom Bead-Cell (Rysunek 1B) i Bead-Bead (Rysunek 1C)5.

Budowa, montaż i eksperymentalne protokoły BFP zostały szczegółowo opisane wcześniej1,6. Krótko mówiąc, cykl dotykowy BFP składa się z 5 etapów: Podejście, Uderzenie, Kontakt, Wycofanie i Dysocjacja (Rysunek 1D). Poziome położenie wierzchołka RBC jest oznaczone jako ΔxRBC. Na początku odkształcenie RBC bez naprężeń (siły zerowej) ΔxRBC wynosi 0 (tabela 1). Cel jest następnie napędzany przez piezotłumacz, aby uderzać i wycofywać się z koralika sondy ( Rysunek 1D). Sonda RBC jest najpierw ściskana przez cel z ujemnym odkształceniem RBC ΔxRBC < 0. W przypadku obligacji etap wycofania przechodzi z fazy ściskania do fazy rozciągania z dodatnim odkształceniem RBC ΔxRBC > 0 (Rysunek 2C i D). Zgodnie z prawem Hooke'a, siła nośna BFP może być mierzona jako F = kRBC × ΔxRBC, gdzie kRBC (tabela 1) jest stałą sprężystości RBC BFP. Po zerwaniu wiązania i zakończeniu jednego cyklu dotykowego, koralik sondy powraca do pozycji zerowej siły z ΔxRBC = 0 (Rysunek 1D).

Aby określić kRBC, mierzymy i rejestrujemy promienie wewnętrznego otworu mikropipety sondy (Rp), RBC (R0) i okrągły obszar styku (Rc) między RBC a koralikiem sondy (Rysunek 1A). Następnie kRBC jest obliczane zgodnie z modelem Evana (równanie 1)7,8 przy użyciu programu LabVIEW, który działa jako wirtualny instrument (VI) do obsługi BFP (Rysunek S1A)8,9.

Równanie równowagi statycznej dla kRBC w dynamice płynów, pokazujące zmienne i składniki logarytmiczne. (Równanie 1)

Po ustaleniu BFP i uzyskaniu surowych danych DFS, niniejszym prezentujemy, jak analizować stałą sprężystości pary ligand-receptor lub komórek. Surowe dane DFS dotyczące interakcji glikozylowanego białka Thy-1 i komórki K562 zawierającej integrynę α5β1 (Thy-1-α5β1; Rysunki 3A i 3B)10 oraz integryna pokryta fibrynogenem i kulkamiα IIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Rysunek 3C)11,12 zostały użyte do zademonstrowania odpowiednio trybów analizy Bead-Cell i Bead-Bead.

Przygotowanie eksperymentalne BFP
Szczegółowe informacje na temat przygotowania i oprzyrządowania eksperymentalnego BFP można znaleźć w wcześniej opublikowanych protokołach3. Krótko mówiąc, ludzkie erytrocyty zostały poddane biotynylacji przy użyciu Biotyny-PEG3500-NHS w buforze węglowo-wodorowęglanowym. Interesujące białka zostały kowalencyjnie sprzężone z kulkami ze szkła borokrzemianowego przy użyciu MAL-PEG3500-NHS w buforze fosforanowym. Aby przyłączyć się do biotynylowanych erytrocytów, koralik sondy jest również pokryty streptawidyną (SA) za pomocą MAL-SA. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów i tabelą 2.

Aby złożyć BFP (Rysunek 1, po lewej), trzecia mikropipeta o nazwie 'Helper' zostanie użyta do dostarczenia koralika sondy i przyklejenia jej do apex1,3. Oddziaływanie kowalencyjne między koralikiem sondy pokrytym SA a biotynylowanymi RBC jest znacznie silniejsze niż interesujące nas wiązanie ligand-receptor. Tak więc etap dysocjacji może być interpretowany jako zerwanie wiązania ligand-receptor, a nie oderwanie koralika sondy od RBC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uzyskiwanie analizowanych zdarzeń DFS

  1. Rozpocznij eksperyment w oprogramowaniu (np. LabVIEW VI) dla sterowania BFP i ustawiania parametrów (Rysunek S1A).
  2. Obserwuj powtarzające się dotknięcia koralika/komórki koralika sondy / celu w oprogramowaniu monitora BFP (rysunek S1B).
  3. Przetestuj i osiągnij częstotliwość adhezji ≤ 20% w ciągu pierwszych 50 dotknięć, dostrajając siłę uderzenia i czas kontaktu, dzięki czemu zapewnia, że ≥ 89% zdarzeń adhezji DFS jest zapośredniczonych przez pojedyncze wiązania12,13,14.
    UWAGA: Dla każdej pary Bead-Cell/Bead wykonujemy 200 powtarzających się cykli dotykowych. Aby uzyskać jakość danych nadających się do publikacji, zwykle wykonujemy n ≥ 3 par Koralik-Koralik lub Koralik-Komórka.
    1. Zapisz dane, w postaci siły w funkcji czasu, w folderze wskazanym przez użytkownika na końcu każdej pary, po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie do sterowania BFP i ustawiania parametrów.
  4. Zbierz surowe dane dotyczące siły w funkcji czasu dotyczące zdarzeń związanych z obligacjami, jak pokazano na rysunku Rysunek 2A, przy użyciu platformy akwizycji BFP (Rysunek S1C).
    1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych BFP. Kliknij żółtą ikonę folderu i wybierz odpowiedni plik danych surowych, klikając je dwukrotnie.
  5. Uruchom program, a następnie kliknij przycisk w górę i w dół, aby przełączać się między zdarzeniami. Użyj kryteriów wykluczania wartości odstających (Rysunek S2), aby odfiltrować nieprawidłowe zdarzenia. Wybierz typ danych eksportu jako format Siła w funkcji czasu i kliknij przycisk Eksportuj dane wykresów.

2. Zamień krzywą siły w czasie na krzywą siły w zależności od przemieszczenia

  1. Wyeksportuj segment danych odpowiadający etapowi Wycofanie do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2A, kwadratowa markiza), który jest istotny dla analizy stałej sprężystości.
  2. Wykreśl krzywą siły w funkcji czasu za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Aby uzyskać krzywą siły w funkcji przemieszczenia, przelicz wartości czasu (Rysunek 2A, oś x) na całkowite wartości przemieszczenia (Δxtot), mnożąc wartości czasu przez prędkość ruchu piezoelektrycznego (tj. 4,000 nm/s według ustawień wstępnych).
  3. Wyzeruj pierwszy punkt danych, odejmując najmniejszą wartość przemieszczenia od każdej uzyskanej wartości przemieszczenia. Ta transformacja pozioma nie ma wpływu na wznoszące się nachylenia etapu cofania ani na późniejsze obliczenia stałej sprężystości.
  4. Warto zauważyć, że BFP jest uważany za szeregowy system sprężynowy, w którym Δxtot (tabela 1) sumuje deformacje RBC, ΔxRBC (tabela 1), wiązanie molekularne, Δxmol (tabela 1) i komórkę docelową, komórkę Δx (tabela 1), jako równanie 2:
    Równanie równowagi statycznej Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, wzór matematyczny. (Równanie 2)
  5. Wykreśl krzywą siły (F) w funkcji przemieszczenia (Δxtot), jak pokazano na rysunku Rysunek 2B.

3. Analiza sprężynowa trybu Bead- Cell

  1. Na krzywej siły w funkcji przemieszczenia można zidentyfikować dwa wyraźne nachylenie, z których każde może reprezentować fazę ściskania i fazę rozciągania. Dopasuj linię regresji do każdej grupy danych ( Rysunek 2B), gdzie większe liniowe nachylenie dopasowania reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie ściskania ( Rysunek 2B, czerwony), oznaczoną jako k1 (Tabela 1); a mniejsze nachylenie dopasowania liniowego reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie rozciągania (Rysunek 2B, niebieski), oznaczoną jako k2 (Tabela 1).
  2. W przypadku sprężyn połączonych szeregowo zgodnie z opisem kroku 2.2 należy wyrazić odwrotność całkowitej stałej sprężystości, ktot (tabela 1), jako sumę odwrotności stałej sprężystości RBC, kRBC (tabela 1), wiązania molekularnego, kmol (tabela 1) i komórki docelowej, komórki k (tabela 1). Podczas fazy kompresji w trybie Bead-Cell wiązanie molekularne nie jest rozciągane, dlatego kmol nie jest brany pod uwagę. Odwrotność ktot w tym scenariuszu (1/k1) jest wyrażona jako
    Równanie reprezentujące kinetykę komórki w biologii; wykres stałych kinetycznych: k1, kRBC, kcell. (Równanie 3).
    W przykładowych danych kRBC jest wstępnie określone (domyślnie 0,25 pN/nm). Komórka k może być wyprowadzona z równania 3 z nabytym k1 i k RBC (Rysunek 3B).
  3. Podczas fazy rozciągania powstaje adhezja między parą ligand-receptor. Przeciwstawność ktot w tym scenariuszu (1/k2) należy wyrazić jako
    Równanie oporu szeregowego, pokazujące 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell, stosowane w badaniach kinetycznych. (Równanie 4)
    gdzie k2 (tabela 1) oznacza całkowitą stałą sprężystości w fazie rozciągania.
  4. Wyprowadź kmol z odjęcia 1/k1 od 1/k2 (porównaj równanie 3 i równanie 4).

4. Analiza stałej sprężystości koralików - tryb koralików

  1. Dopasuj linię regresji do danych fazy ściskania, aby uzyskać k1 (podobnie jak w przypadku Rysunek 2B, czerwony). Warto zauważyć, że w trybie Bead-Bead komórka docelowa jest zastępowana szklanym koralikiem pokrytym receptorem zainteresowania (Rysunek 1C). Ponieważ deformacja kulki jest znikoma, człon komórki 1/k można odpowiednio usunąć z równania 3 i równania 4. Odwrotność ktot fazy ściskającej (1/k1) może być wyrażona jako:
    Równanie przedstawiające zależność: 1/k1 = 1/kRBC; Klucz do kinetycznych, stałych szybkościowych w analizie biochemicznej. (Równanie 5)
  2. Dopasuj linię regresji do danych fazy rozciągania, aby uzyskać k2 (podobnie jak w Rysunek 2B, niebieski). Odwrotność ktot fazy rozciągania (1/k2) może być wyrażona jako:
    Równanie szybkości reakcji, wykres odwrotnych stałych szybkości; Terminy k2, kRBC, kmol dla analizy kinetycznej. (Równanie 6)
  3. Wyprowadź kmol z odjęcia 1/k1 od 1/k2 (porównaj równanie 5 i równanie 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy pokazaliśmy protokół analizy stałej sprężystości BFP. W trybie analizy Bead-Cell przeanalizowaliśmy kmol wiązania molekularnego między glikozylowanym białkiem Thy-1 pokrytym koralikiem sondy a integryną α5β1 wyrażoną na docelowej komórce K562 (Thy-1-integryna α5β1; Rysunek 3A)10. Komórka k jest również pochodząca z trybu Bead-Cell (K562 Cell; Rysunek 3B). W trybie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, dostarczyliśmy szczegółowy protokół analizy danych do wstępnego przetwarzania surowych danych DFS i wyprowadzania molekularnych stałych sprężystości w trybach analizy BFP Bead-Bead i Bead-Cell. Przedstawiono modele biomechaniczne i równania niezbędne do wyznaczenia molekularnych i komórkowych stałych sprężystości. Chociaż badane są różne integryny, mol k mierzony w trybie Bead-Bead i Bead-Cell ma znaczne różnice w zakresie (Rysunek 3A w porównaniu z

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Guillaume'owi Troadecowi za pomocną dyskusję, Zihao Wangowi za konsultacje sprzętowe, oraz Sydney Manufacturing Hub, Greggowi Suaningowi i Simonowi Ringerowi za wsparcie naszego startupu laboratoryjnego. Praca ta była wspierana przez Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) oraz The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Arnold Ju jest członkiem DECRA Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DE190100609).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Mercaptopropylotrimethoxysilane (MPTMS)Uct, Specialties, llc4420-74-0Funkcjonalizacja kulek szklanych
Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Przygotowanie buforu fosforanowego
Akwizycja danych BFP VIKontrola i ustawianie parametrów BFPLabVIEW
BFP analiza danych surowych BFP
Biotyna-PEG3500-NHSJenKemA5026-1Biotynylacja
RBCKoraliki ze szkła borokrzemianowegoDistrilab Particle Technology, Holandia9002Funkcjonalizacja kulek szklanych
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA0336Ligand Funkcjonalizacja Kamera
VILabVIEWMonitorowanie BFP
D-glukozaSigma-AldrichG7021Tyrode' s przygotowanie
buforu HepesSigma-AldrichH3375Tyrode' s preparat buforowy
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Funkcjonalizacja kulek szklanych
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode' s przygotowanie buforowe
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy; Tyrode" s przygotowanie buforowe
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode' s preparat buforowy
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4• H2O)Sigma-AldrichS9638Preparat buforu fosforanowego
Streptawidyna-MaleimidSigma-AldrichS9415Funkcjonalizacja kulek szklanych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
  15. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

Related Articles