Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sonda siły biomembranowej (BFP) pojawiła się ostatnio jako nanonarzędzie do natywnej spektroskopii dynamicznej siły (DFS) na powierzchni komórki lub in situ, które może mierzyć kinetykę wiązania pojedynczych cząsteczek, oceniać właściwości mechaniczne oddziaływań ligand-receptor, wizualizować dynamiczne zmiany konformacyjne białek i bardziej ekscytująco wyjaśniać mechanizmy mechanosensingu komórek za pośrednictwem receptorów. Ostatnio BFP został wykorzystany do pomiaru stałej sprężystości wiązań molekularnych. Protokół ten opisuje krok po kroku procedurę przeprowadzania analizy DFS stałej sprężystości sprężystości molekularnej. W szczególności omówiono dwa tryby pracy BFP, a mianowicie tryby Bead-Cell i Bead-Bead. Protokół ten koncentruje się na wyprowadzeniu stałych sprężystości wiązania molekularnego i komórki na podstawie surowych danych DFS.
Wprowadzenie
Jako technika DFS na żywych komórkach, BFP przekształca ludzką czerwoną krwinkę (erytrocyt; Rycina 1) w ultraczuły i dostosowywalny przetwornik siły o odpowiednim zakresie stałej sprężystości wynoszącym 0,1–3 pN/nm1,2,3. Aby badać interakcję ligand-receptor, BFP umożliwia pomiary DFS z rozdzielczością siły wynoszącą ~1 pN (10-12 N), rozdzielczością przestrzenną ~3 nm (10-9 m) oraz rozdzielczością czasową ~0,5 ms (10-3 s)4,5. Konfiguracja eksperymentalna składa się z dwóch przeciwnie ustawionych mikropipet, nazywanych odpowiednio Sondującym i Celowym. Mikropipeta Sondująca aspiruje czerwoną krwinkę, a na jej wierzchołku przyklejona jest kulka za pomocą interakcji biotyna-streptawidyna. Kula pokryta jest ligandem, który jest przedmiotem zainteresowania (Rycina 1A). Mikropipeta Celowa aspiruje albo komórkę, albo kulkę niosącą receptor będący przedmiotem zainteresowania, co odpowiada odpowiednio trybom Kulka-Komórka (Rycina 1B) i Kulka-Kulka (Rycina 1C)5.
Konstrukcję BFP, jego montaż oraz protokoły eksperymentalne DFS szczegółowo opisano wcześniej1,6. Krótko mówiąc, cykl dotyku BFP składa się z 5 etapów: Podejście, Uderzenie, Kontakt, Odsunięcie i Dysocjacja (Rycina 1D). Poziomą pozycję wierzchołka czerwonej krwinki oznacza się jako ΔxRBC. Na początku odkształcenie czerwonej krwinki (przy zerowej sile) ΔxRBC wynosi 0 (Tabela 1). Następnie Cel jest przesuwany za pomocą piezoprzetwornika, aby uderzyć w kulę sondy i się od niej odsunąć (Rycina 1D). Sonda czerwonej krwinki jest najpierw ściskana przez Cel, powodując ujemne odkształcenie czerwonej krwinki ΔxRBC < 0. W przypadku zdarzenia wiązania, etap Odsunięcia przechodzi od fazy ściskania do fazy rozciągania, z dodatnim odkształceniem czerwonej krwinki ΔxRBC > 0 (Rycina 2C i D). Zgodnie z prawem Hooke’a, siłę nośną BFP można zmierzyć jako F = kRBC × ΔxRBC, gdzie kRBC (Tabela 1) to stała sprężystości czerwonej krwinki w BFP. Po zerwaniu wiązania i zakończeniu jednego cyklu dotyku, kulka sondy wraca do pozycji zerowej siły, przy czym ΔxRBC = 0 (Rycina 1D).
Aby wyznaczyć kRBC, mierzymy i rejestrujemy promienie wewnętrznego otworu mikropipety sondy (Rp), erytrocytu (R0) oraz kołowego obszaru kontaktu (Rc) między erytrocytem a kulką sondy (Rycina 1A). Następnie wartość kRBC oblicza się zgodnie z modelem Evansa (równanie 1)7,8 za pomocą programu LabVIEW działającego jako wirtualny instrument (VI) do obsługi BFP (Rycina S1A)8,9.
(równ. 1)
Po ustaleniu BFP i uzyskaniu surowych danych DFS, przedstawiamy sposób analizy stałej sprężystości pary ligand-receptor lub komórek. Surowe dane DFS dotyczące oddziaływania glikozylowanego białka Thy-1 i komórek K562 wyrażających integrinę α5β1 (Thy-1-α5β1; Rysunki 3A i 3B)10 oraz oddziaływania fibrynogenu i powlekanych integriną αIIbβ3 kulek (FGN-αIIbβ3; Rysunek 3C)11,12 zostały wykorzystane odpowiednio do zademonstrowania trybów analizy Bead-Cell i Bead-Bead.
Przygotowanie eksperymentu z wykorzystaniem BFP
Aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące przygotowania eksperymentu BFP i sprzętu, prosimy o zapoznanie się z wcześniej opublikowanymi protokołami3. W skrócie, ludzkie krwinki czerwone zostały biotynylowane za pomocą Biotyn-PEG3500-NHS w buforze węglanowo-biwęglanowym. Badane białka zostały kowalencyjnie sprzężone z kuleczkami z borokrzemianu sodu za pomocą MAL-PEG3500-NHS w buforze fosforanowym. Aby przyłączyć do biotynylowanych krwinek czerwonych, kuleczka sondy jest również pokrywana streptawidyną (SA) przy użyciu MAL-SA. Zobacz Tabelę materiałów oraz Tabelę 2.
Aby złożyć BFP (Rycina 1, lewa strona), trzecią mikropipetę zwaną „Helper” wykorzystuje się do dostarczenia kulki sondy i przyłączenia jej do wierzchołka erytrocytu1,3. Oddziaływanie kowalencyjne między pokrytą SA kulką sondy a biotynylowanym erytrocytem jest znacznie silniejsze niż badane wiązanie ligand-receptor. W związku z tym etap dysocjacji można interpretować jako zerwanie wiązania ligand-receptor, a nie odłączenie kulki sondy od erytrocytu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Uzyskanie zdarzeń DFS nadających się do analizy
- Uruchom eksperyment w oprogramowaniu (np. LabVIEW VI) w celu sterowania BFP i ustawienia parametrów (Rycina S1A).
- Obserwuj powtarzalne kontakty koralika-sondy z koralikiem-celem lub komórką w oprogramowaniu BFP Monitor (Rycina S1B).
- Przetestuj i osiągnij częstotliwość adhezji ≤ 20% w ciągu pierwszych 50 kontaktów poprzez dostrojenie siły uderzenia i czasu kontaktu, co zapewnia, że ≥ 89% zdarzeń adhezji DFS jest zapośredniczonych przez pojedyncze wiązania12,13,14.
UWAGA: Dla każdej pary koralik-komórka/koralik wykonujemy 200 powtórnych cykli kontaktu. Aby uzyskać dane o jakości nadającej się do publikacji, zazwyczaj analizujemy n ≥ 3 par koralik-koralik lub koralik-komórka.- Zapisz dane w formie siły w funkcji czasu (Force vs. Time) w folderze wskazanym przez użytkownika po zakończeniu każdej pary, zgodnie z poleceniem oprogramowania do sterowania BFP i ustawiania parametrów.
- Zbierz surowe dane siły w funkcji czasu dla zdarzeń wiązania, jak pokazano na Rycini 2A, korzystając z platformy akwizycyjnej BFP (Rycina S1C).
- Otwórz oprogramowanie do analizy danych BFP. Kliknij żółtą ikonę folderu i wybierz odpowiedni plik z surowymi danymi, klikając go dwukrotnie.
- Uruchom program, a następnie klikaj przyciski góra i dół, aby przełączać się między zdarzeniami. Użyj kryteriów wykluczania wartości odstających (Rycina S2), aby odrzucić nieprawidłowe zdarzenia. Wybierz format eksportu danych jako Force vs. Time i kliknij przycisk Export Plots Data.
2. Przekształcenie krzywej siły w funkcji czasu w krzywą siły w funkcji przemieszczenia
- Wyeksportuj segment danych odpowiadający etapowi cofania (Retract) do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2A, prostokątne zaznaczenie), który jest istotny dla analizy stałej sprężystości.
- Wykreśl krzywą zależności siły od czasu za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych. Aby uzyskać krzywą zależności siły od przemieszczenia, przekształć wartości czasu (Rysunek 2A, oś x) w wartości całkowitego przemieszczenia (Δxtot), mnożąc wartości czasu przez prędkość ruchu piezoelektryka (tj. 4,000 nm/s zgodnie z ustawieniami).
- Wyzeruj pierwszy punkt danych, odejmując najmniejszą wartość przemieszczenia od każdej uzyskanej wartości przemieszczenia. Ta transformacja pozioma nie wpływa na nachylenia wstępujące etapu cofania ani na późniejsze obliczenie stałej sprężystości.
- Należy zauważyć, że BFP jest traktowany jako szeregowy układ sprężyn, w którym Δxtot (Tabela 1) jest sumą odkształceń RBC, ΔxRBC (Tabela 1), wiązania molekularnego, Δxmol (Tabela 1) oraz komórki docelowej, Δxcell (Tabela 1), zgodnie z Równaniem 2:
(Eq. 2) - Wykreśl krzywą zależności siły (F) od przemieszczenia (Δxtot), jak pokazano na Rysunku 2B.
3. Analiza stałej sprężystości w trybie koralik-komórka
- Na krzywej siły w funkcji przemieszczenia (Force vs. Displacement) można zidentyfikować dwa odrębne nachylenia, z których każde może reprezentować fazę ściskania i fazę rozciągania. Dopasuj linię regresji do każdej grupy danych (Rycina 2B), gdzie większe nachylenie dopasowania liniowego reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie ściskania (Rycina 2B, kolor czerwony), oznaczoną jako k1 (Tabela 1); natomiast mniejsze nachylenie dopasowania liniowego reprezentuje całkowitą stałą sprężystości w fazie rozciągania (Rycina 2B, kolor niebieski), oznaczoną jako k2 (Tabela 1).
- Dla sprężyn połączonych szeregowo zgodnie z opisem w kroku 2.2, wyraź odwrotność całkowitej stałej sprężystości, ktot (Tabela 1), jako sumę odwrotności stałych sprężystości RBC, kRBC (Tabela 1), wiązania molekularnego, kmol (Tabela 1) oraz komórki docelowej, kcell (Tabela 1). Podczas fazy ściskania w trybie Bead-Cell wiązanie molekularne nie jest rozciągane, w związku z czym nie uwzględnia się kmol. Odwrotność ktot w tym scenariuszu (1/k1) jest wyrażona jako
(Równ. 3).
W danych przykładu wartość kRBC jest określona wcześniej (domyślnie 0.25 pN/nm). Wartość kcell można wyprowadzić z Równ. 3, wykorzystując otrzymane wartości k1 oraz kRBC (Rycina 3B). - Podczas fazy rozciągania powstaje adhezja między parą ligand-receptor. Wyraź odwrotność ktot w tym scenariuszu (1/k2) jako
(Równ. 4)
gdzie k2 (Tabela 1) reprezentuje całkowitą stałą sprężystości podczas fazy rozciągania. - Wyprowadź wartość kmol poprzez odjęcie 1/k1 od 1/k2 (porównaj Równ. 3 i Równ. 4).
4. Analiza stałej sprężystości w trybie koralik-koralik
- Dopasuj linię regresji do danych z fazy ściskania, aby wyznaczyć k1 (podobnie jak na Rysunku 2B, kolor czerwony). Należy zauważyć, że w trybie Bead-Bead komórka docelowa zostaje zastąpiona szklaną kuleczką pokrytą interesującym nas receptorem (Rysunek 1C). Ponieważ odkształcenie kuleczki jest pomijalne, składnik 1/kcell może zostać odpowiednio usunięty z równania 3 oraz równania 4. Odwrotność ktot dla fazy ściskania (1/k1) może być wyrażona jako:
(Równ. 5) - Dopasuj linię regresji do danych z fazy rozciągania, aby wyznaczyć k2 (podobnie jak na Rysunku 2B, kolor niebieski). Odwrotność ktot dla fazy rozciągania (1/k2) może być wyrażona jako:
(Równ. 6) - Wyznacz kmol poprzez odjęcie 1/k1 od 1/k2 (porównaj Równ. 5 i Równ. 6).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy zaprezentowano protokół analizy stałej sprężystości BFP. W trybie analizy Bead-Cell przeanalizowano kmol wiązania molekularnego pomiędzy glikozylowanym białkiem Thy-1 naniesionym na koralik sondy (Probe bead) a integryną α5β1 eksprymowaną na komórce docelowej K562 (Thy-1-integrin α5β1; Rysunek 3A)10. Wartość kcell została również wyznaczona w trybie Bead-Cell (komór...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podsumowując, dostarczyliśmy szczegółowy protokół analizy danych do wstępnego przetwarzania surowych danych DFS i wyprowadzania molekularnych stałych sprężystości w trybach analizy BFP Bead-Bead i Bead-Cell. Przedstawiono modele biomechaniczne i równania niezbędne do wyznaczenia molekularnych i komórkowych stałych sprężystości. Chociaż badane są różne integryny, mol k mierzony w trybie Bead-Bead i Bead-Cell ma znaczne różnice w zakresie (Rysunek 3A w porównaniu z
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów do zgłoszenia w odniesieniu do niniejszego badania.
Podziękowania
Dziękujemy Guillaume'owi Troadecowi za pomocną dyskusję, Zihao Wangowi za konsultacje sprzętowe, oraz Sydney Manufacturing Hub, Greggowi Suaningowi i Simonowi Ringerowi za wsparcie naszego startupu laboratoryjnego. Praca ta była wspierana przez Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) oraz The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Arnold Ju jest członkiem DECRA Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DE190100609).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-Mercaptopropylotrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
| Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Przygotowanie buforu fosforanowego |
| Akwizycja danych BFP VI | Kontrola i ustawianie parametrów BFP | LabVIEW | |
| BFP analiza danych surowych BFP | |||
| Biotyna-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Biotynylacja |
| RBCKoraliki ze szkła borokrzemianowego | Distrilab Particle Technology, Holandia | 9002 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand Funkcjonalizacja Kamera |
| VI | LabVIEW | Monitorowanie BFP | |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode' s przygotowanie |
| buforu Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode' s preparat buforowy |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode' s przygotowanie buforowe |
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy; Tyrode" s przygotowanie buforowe |
| Węglan sodu (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode' s preparat buforowy |
| Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4• H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Preparat buforu fosforanowego |
| Streptawidyna-Maleimid | Sigma-Aldrich | S9415 | Funkcjonalizacja kulek szklanych |
Bibliografia
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
- Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
