Artykuł metodologiczny

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

DOI:

10.3791/62492

⸱

10 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrowzorcowanie jest uznaną techniką w społeczności biologii komórki, używaną do badania powiązań między morfologią a funkcją kompartmentów komórkowych przy jednoczesnym omijaniu komplikacji wynikających z naturalnych różnic między komórkami. Aby ustandaryzować kształt komórki, komórki są albo zamykane w formach 3D, albo kontrolowane pod kątem geometrii kleju za pomocą wysp klejowych. Jednak tradycyjne techniki mikrowzoru oparte na fotolitografii i głębokim trawieniu UV w dużym stopniu zależą od pomieszczeń czystych lub specjalistycznego sprzętu. Tutaj prezentujemy technikę mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (mikrofotomodeling) zmodyfikowaną przez Doyle'a i wsp., którą można wygodnie skonfigurować za pomocą dostępnych na rynku systemów obrazowania. W tym protokole używamy systemu obrazowania Nikon A1R MP+ do generowania mikrowzorów z mikronową precyzją za pomocą lasera na podczerwień (IR), który abluje zaprogramowane obszary na szkiełkach nakrywkowych pokrytych alkoholem poliwinylowym. Stosujemy niestandardowy skrypt, aby umożliwić zautomatyzowane wytwarzanie szablonów z wysoką wydajnością i dokładnością w systemach niewyposażonych w sprzętowy autofokus. Pokazujemy, że ten protokół mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (mikrofotomodeling) skutkuje zdefiniowanymi wzorami, do których komórki przyczepiają się wyłącznie i przybierają pożądany kształt. Ponadto dane z dużej liczby komórek można uśrednić ze względu na standaryzację kształtu komórek. Wzorce generowane za pomocą tego protokołu, w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości i analizą ilościową, mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych o stosunkowo wysokiej przepustowości w celu identyfikacji graczy molekularnych pośredniczących w związku między formą a funkcją.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kształt komórki jest kluczowym wyznacznikiem podstawowych procesów biologicznych, takich jak morfogeneza tkanek1, migracja komórek2, proliferacja komórek3, oraz ekspresja genów4. Zmiany w kształcie komórki są napędzane przez skomplikowaną równowagę między dynamicznymi rearanżacjami cytoszkieletu, które deformują błonę plazmatyczną, a czynnikami zewnętrznymi, takimi jak siły zewnętrzne wywierane na komórkę oraz geometria zrostów komórka-komórka i komórka-matryca5. Migrujące komórki mezenchymalne, na przykład, polimeryzują gęstą sieć aktynową na krawędzi natarcia, która popycha błonę plazmatyczną do przodu i tworzy szeroką lamellipodia6, podczas gdy kurczliwość aktomiozyny cofa wąską krawędź spływu komórki, aby oderwać komórkę od jej bieżącej pozycji7,8. Zakłócanie zdarzeń sygnalizacyjnych, które powodują powstawanie takich wyspecjalizowanych struktur cytoszkieletu, zaburza kształt i polaryzację oraz spowalnia migrację komórek9. Ponadto zginanie arkusza nabłonka podczas gastrulacji wymaga zwężenia wierzchołkowego opartego na aktomiozynie, które powoduje, że komórki i ich sąsiedzi stają się klinowate10. Chociaż badania te podkreślają znaczenie kształtu komórki, nieodłączna heterogeniczność kształtu komórki utrudnia wysiłki zmierzające do zidentyfikowania mechanizmów łączących morfologię z funkcjonowaniem.

W tym celu, w ciągu ostatnich trzech dekad opracowano wiele podejść do manipulowania kształtem komórki. Podejścia te osiągają swój cel poprzez ograniczanie komórki za pomocą trójwymiarowej formy lub kontrolowanie geometrii adhezji komórkowej poprzez wzorzyste osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na powierzchni przeciwporostowej, technika określana jako micropatterning11. Tutaj przyjrzymy się kilku technikom, które zyskały popularność na przestrzeni lat.

Pierwotnie zapoczątkowany jako podejście do zastosowań mikroelektronicznych, miękki druk mikrokontaktowy oparty na litografii stał się jednoznacznie kultowym ulubieńcem12. Płytka wzorcowa jest najpierw wytwarzana przez selektywne wystawienie obszarów podłoża krzemowego pokrytego fotorezystem na promieniowanie fotonasłoneczniejące, pozostawiając wzorzystą powierzchnię13. Elastomer, taki jak PDMS, jest następnie wylewany na płytkę wzorcową w celu wygenerowania miękkiego "stempla", który przenosi białka ECM na żądane podłoże11,14. Po wyprodukowaniu, wafel wzorcowy może być użyty do odlania wielu stempli PDMS, które dają początek wysoce powtarzalnym mikrowzorcom12. Jednak wzorów nie można łatwo dostosować ze względu na długotrwały proces fotolitografii. Proces ten wymaga również wysoce specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń czystych, które zwykle nie są dostępne na wydziałach biologii.

Ostatnio doniesiono, że bezpośredni druk przy użyciu głębokiego UV pozwala obejść ograniczenia wynikające z tradycyjnego podejścia opartego na litografii. Głębokie światło UV jest kierowane przez fotomaskę do wybranych obszarów szklanego szkiełka nakrywkowego pokrytego glikolem polietylenowym szczepionym poli-L-lizyną. Grupy chemiczne wystawione na działanie głębokiego UV są fotokonwertowane bez użycia światłoczułych łączników, aby umożliwić wiązanie białek ECM15. Brak światłoczułych łączników sprawia, że wzorzyste szkiełka nakrywkowe pozostają stabilne w temperaturze pokojowej przez ponad siedem miesięcy15. Metoda ta pozwala uniknąć stosowania pomieszczeń czystych i sprzętu do fotolitografii oraz wymaga mniej specjalistycznego szkolenia. Jednak wymóg stosowania fotomasek nadal stanowi istotną przeszkodę dla eksperymentów, które wymagają łatwo dostępnych zmian we wzorcach.

Oprócz metod, które manipulują geometrią komórek poprzez kontrolowane osadzanie białek ECM na powierzchni 2D, inne starają się kontrolować kształt komórek poprzez zamykanie komórek w mikrostrukturach 3D. W wielu badaniach zaadaptowano opisane powyżej podejście oparte na miękkiej litografii do generowania 3D, a nie 2D, komór PDMS w celu zbadania zależnych od kształtu procesów biologicznych w zarodkach, bakteriach, drożdżach i roślinach16,17,18,19. Polimeryzacja dwufotonowa (2PP) również zyskała wiodącą rolę jako technika mikrowytwarzania, która może tworzyć złożone rusztowania hydrożelowe 3D o rozdzielczości nanometrowej20. 2PP opiera się na zasadzie adsorpcji dwufotonowej, gdzie dwa fotony dostarczane w impulsach femtosekundowych są jednocześnie absorbowane przez cząsteczkę - w tym przypadku fotoinicjator - która umożliwia lokalną polimeryzację fotopolimerów21. Technika ta jest intensywnie stosowana do drukowania rusztowań 3D, które naśladują natywne struktury ECM ludzkiej tkanki i wykazano, że indukują niskie uszkodzenia fotochemiczne komórek22.

Debiut mikrofotowzorców 10 lat temu dał naukowcom możliwość wytwarzania mikrowzorów, unikając przy tym niedostępnego i specjalistycznego sprzętu. Mikrofotowzorzec tworzy wzory w skali mikronów poprzez termiczne usuwanie wybranych obszarów alkoholu poliwinylowego (PVA) pokrytych na aktywowanych powierzchniach szklanych za pomocą lasera na podczerwień23,24. Białka ECM, które przyczepiają się tylko do powierzchni szkła znajdującego się pod spodem, a nie PVA, służą następnie jako wskazówki biochemiczne, aby umożliwić kontrolowaną dynamikę rozprzestrzeniania się i kształt komórki. Ta metoda zapewnia również doskonałą elastyczność, ponieważ wzory można łatwo zmieniać w czasie rzeczywistym. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół mikrofotomodelowania przy użyciu komercyjnego systemu obrazowania wielofotonowego. Opisany protokół jest przeznaczony do szybkiego i zautomatyzowanego wytwarzania dużych wzorów. Wykazaliśmy, że te wzorce skutecznie kontrolują kształt komórki poprzez ograniczanie geometrii zrostów komórka-ECM. Na koniec pokazujemy, że opisana technika modelowania moduluje organizację i dynamikę cytoszkieletu aktynowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wstępne przetwarzanie szkiełek nakrywkowych

  1. Przygotuj nieskazitelnie czyste szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w Waterman-Storer, 199825.
  2. Przygotować 1% roztwór (3-aminopropylo)trimetoksysilanu (APTMS) i inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze przez 10 minut, delikatnie mieszając. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe poruszają się swobodnie w roztworze.
  3. Szkiełka nakrywkowe myć dwukrotnie za pomocą dH2O przez 5 minut każde.
  4. Przygotować 0,5% roztwór aldehydu glutarowego (GA) i inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze przez 30 minut na shakerze. Na 25 szkiełek nakrywkowych użyj 50 ml roztworu aldehydu glutarowego. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe poruszają się swobodnie w roztworze.
  5. Szkiełka nakrywkowe umyć trzykrotnie za pomocą dH2O przez 10 minut każde.
  6. Wiruj suche szkiełka nakrywkowe przez 30 s za pomocą specjalnie zaprojektowanego wirnika do szkiełek nakrywkowych. Szczegółowy opis przędzarki nakrywkowej został opublikowany26 i jest dostępny online (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Aktywowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze +4 °C w pudełku z przegrodami, tak aby stały od siebie.

2. Powłoka PVA

  1. Zmieszaj PVA (98% hydrolizowany PVA, MW 98000) zdH2O, aby uzyskać 5,6% roztwór.
  2. Mieszaninę należy rozpuścić w łaźni wodnej o temperaturze 90 °C i natychmiast przefiltrować przez filtr 0,2 μm w komorze bezpieczeństwa biologicznego, gdy jest gorąca. Ponownie przefiltrować roztwór podstawowy, jeśli się wytrąci. Roztwór PVA można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 3 miesiące.
  3. W probówce o pojemności 15 ml dodaj jedną część HCl do ośmiu części PVA. Ostrożnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.
  4. Wlać 2 ml zmieszanego roztworu do szalki Petriego o średnicy 35 mm i zanurzyć czyste, wstępnie przetworzone szkiełko nakrywkowe w płynie, uważając, aby szkiełka nakrywkowe nie przykleiły się do dna. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na shakerze.
  5. Ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z roztworu. Użyj przędzarki do szkiełek nakrywkowych, aby wirować warstwę przez 40 sekund. W międzyczasie wyczyść pęsetę. Przenieść szkiełko nakrywkowe do pudełka i wysuszyć w temperaturze +4 °C przez noc. Szkiełka nakrywkowe z powłoką PVA można przechowywać w temperaturze +4 °C do dwóch tygodni.

3. Konfiguracja mikroskopu wielofotonowego

UWAGA: Opisany protokół jest dostrojony do tworzenia mikrowzorów adhezyjnych komórek o pożądanym kształcie i rozmiarze w pionowych lub odwróconych systemach obrazowania wielofotonowego, szczególnie tych, które nie są wyposażone w sprzętowy autofokus. W ten sposób dla każdego pola widzenia (FOV) skrypt wzoru abluje niewielki obszar, aby utworzyć znacznik odniesienia na szkiełku nakrywkowym, wykorzystuje programowy autofokus do ustawiania ostrości mikroskopu na powierzchni szkiełka nakrywkowego i abluje żądany wzór. Uruchomienie tego skryptu w pętli dla sąsiednich pól widzenia niezawodnie tworzy duży zestaw mikrowzorców (5 x 5 mm lub większych), które ograniczają kształt komórki i modulują aktywność wewnątrzkomórkowych procesów biologicznych. Opisany protokół został opracowany dla systemu obrazowania Nikon A1R MP+ sterowanego przez oprogramowanie NIS-Elements. Jeśli do tworzenia wzorów używany jest system obrazowania innego dostawcy, konfiguracje optyczne i skrypt tworzenia wzorów należy dostosować zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Włącz oprogramowanie mikroskopu. Upewnij się, że obiektyw "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" jest zamontowany na mikroskopie.
    UWAGA: Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem obiektywu do zanurzenia w wodzie 25x/1,1 NA, ale inne obiektywy mogą być również używane do tworzenia wzorów. Czytelnicy powinni mieć świadomość, że klepanie z obiektywem o dużym powiększeniu (np. 40x i 60x) zajmuje więcej czasu, ponieważ znacznie zmniejsza liczbę wzorców ablowanych w każdym polu widzenia. Obiektywy o małym powiększeniu mogą być używane do modelowania, o ile zapewniają równomierne oświetlenie w całym polu widzenia i moc lasera wystarczającą do ablacji warstwy PVA.
  2. W oknie A1plus MP GUI ustaw linię lasera na 750 nm.
  3. Konfiguracja optyczna "Image"
    UWAGA: NIS-Elements udostępnia użytkownikom kilka narzędzi (interfejs graficzny, narzędzie do tworzenia procesów pozyskiwania danych JOBS, konfiguracje optyczne i makra) do sterowania sprzętem mikroskopu. W tym protokole większość kontroli sprzętowej odbywa się za pomocą różnych konfiguracji optycznych, a także modułów akwizycji ND i stymulacji ND.
    1. Na karcie Kalibracja kliknij opcję New Optical Configuration (Nowa konfiguracja optyczna). Nazwij konfigurację optyczną "Obraz". Jest to podstawowa konfiguracja optyczna, która umożliwia obrazowanie szkiełka nakrywkowego za pomocą współczynnika odbicia. Pozostaw wszystkie inne opcje jako domyślne i wybierz odpowiedni cel.
    2. W oknie A1plus MP GUI kliknij przycisk Ustawienia, aby skonfigurować ustawienia sprzętowe w tej konfiguracji optycznej. Ustaw laser stymulacyjny na bodziec IR, umieść rozdzielacz wiązki (BS 20/80) na ścieżce światła, ustaw jednostkę skanera na Galvano i wybierz odpowiedni detektor descanned.
    3. W oknie A1plus Compact GUI wybierz rozmiar skanowania i czas zatrzymania, który jest wystarczający do uchwycenia małych elementów na szkiełku nakrywkowym (odpowiednio 1,1 ms i 1024 pikseli w naszym systemie). Kliknij przycisk Normalny, aby nie było wykonywane uśrednianie linii ani integrowanie linii. Upewnij się, że pole Użyj lasera IR jest zaznaczone. Skonfiguruj skanowanie jednokierunkowe dla uproszczenia.
      UWAGA: Jeśli szybkość skanowania jest niepewna, można użyć skanowania dwukierunkowego.
    4. W tym samym oknie dostosuj moc lasera i czułość detektora, aby uzyskać jasny, ale nie nasycony obraz powierzchni szkiełka nakrywkowego. Dobrym punktem wyjścia jest ustawienie mocy lasera na 3 - 5% mocy maksymalnej i czułości detektora (suwak "HV") na 15 V.
    5. W oknie Obszar skanowania A1plus ustaw opcję Zoom (Powiększenie) na 1, aby uchwycić całe pole widzenia.
    6. Zapisz konfigurację optyczną.
  4. Ustawianie konfiguracji optycznej "Print_Fudiciary_Marker"
    1. Zduplikuj konfigurację optyczną "Obraz" i zmień jej nazwę na "Print_Fudiciary_Marker".
    2. W oknie A1plus Compact GUI wybierz najmniejszy rozmiar skanowania i czas przebywania (odpowiednio 64 piksele i 80,2 ms w naszym systemie).
    3. Ponieważ na tym etapie nie jest wymagane obrazowanie, ustaw czułość detektora na 0 i zwiększ moc lasera do 30%. Wyższa moc lasera spowoduje termiczne usunięcie warstwy PVA z szkiełka nakrywkowego w pożądanych obszarach.
    4. W oknie Obszar skanowania A1plus ustaw Zoom na maksimum (15,87 dla naszego systemu) i umieść obszar skanowania w środku pola widzenia.
    5. W oknie ND Acquisition (Akwizycja ND) skonfiguruj eksperyment Z-stack. Ustaw ruch w pozycji Z na Względny i wybierz odpowiednie urządzenie Z. Ustaw rozmiar kroku na 2 μm, a głębokość stosu na 10 μm powyżej i poniżej, aby uwzględnić wszelkie nierówności na stoliku mikroskopu lub powierzchni PVA między sąsiednimi polami widzenia.
  5. Ustawianie konfiguracji optycznej "Autofokus"
    1. Zduplikuj konfigurację optyczną "Obraz" i zmień jej nazwę na "Autofokus".
    2. W oknie Obszar skanowania A1plus zmniejsz współczynnik powiększenia, tak aby pole widzenia było nieco większe niż znacznik odniesienia. Gwarantuje to, że inne drobne elementy na szkiełku nakrywkowym nie będą kolidować z autofokusem.
    3. W menu Devices (Urządzenia) wybierz opcję Autofocus Set Up (Konfiguracja autofokusa). Ustaw grubość skanowania na grubość stosu Z w eksperymencie ze stosem Z (patrz krok 3.5.5). Mikroskop przeskanuje ten zakres i znajdzie najlepszą płaszczyznę ogniskową za pomocą znacznika referencyjnego. Pozostaw rozmiar kroku jako domyślny.
  6. Ustawianie konfiguracji optycznej "Load_ROI"
    1. Zduplikuj konfigurację optyczną "Image" i zmień jej nazwę na "Load_ROI".
    2. W oknie A1plus Compact GUI ustaw rozmiar skanowania identyczny z rozmiarem maski ROI. Ta konfiguracja optyczna zostanie użyta do przechwycenia obrazu, na który zostanie załadowana maska ROI. Użyliśmy 2048 pikseli, aby osiągnąć optymalną równowagę między rozdzielczością a szybkością.
      UWAGA: Istotne jest, aby ten przechwycony obraz miał identyczny rozmiar jak maska ROI.
  7. Ustawianie konfiguracji optycznej "Mikrowzorzec"
    1. Zduplikuj konfigurację optyczną "Print_Fiduciary_Marker" i zmień jej nazwę na "Mikrowzorzec".
    2. Ustaw współczynnik powiększenia na jeden.
    3. W oknie graficznego interfejsu użytkownika A1plus MP zwiększ moc lasera stymulacyjnego, aby usunąć PVA i wybierz odpowiednią prędkość skanowania (odpowiednio 40% i 32 s/klatkę w naszych eksperymentach).
    4. W oknie Stymulacja ND skonfiguruj eksperyment ze stymulacją ND. Dodaj kilka faz do harmonogramu czasowego i ustaw każdą z nich jako stymulację. Upewnij się, że obszar i czas trwania stymulacji są prawidłowe.
      UWAGA: Liczbę faz można regulować w zależności od grubości i gładkości warstwy PVA, a także mocy lasera zastosowanej w tej konfiguracji optycznej.
    5. W tym samym oknie włącz funkcję StgMoveMainZ(-1.000,1) przed każdą fazą. To z kolei tłumaczy wszelkie odchylenia w kierunku Z.
      UWAGA: Odległość i kierunek, w którym porusza się obiektyw, można dostosować do grubości i gładkości warstwy PVA.
  8. Ustawianie konfiguracji optycznej "Label_Surface"
    1. Zduplikuj konfigurację optyczną "Print_Fudiciary_Marker" i zmień jej nazwę na "Label_Surface".
    2. W oknie graficznego interfejsu użytkownika A1plus Compact znacznie zwiększ moc lasera i ustaw Zoom na jeden. Zastosowana tutaj wysoka moc lasera fizycznie uszkodzi szklane szkiełko nakrywkowe i stworzy etykietę widoczną gołym okiem. Pomaga to w lokalizowaniu wzorców w dalszych eksperymentach.

4. Generowanie maski ROI i ustawianie makra

  1. Generowanie maski ROI
    1. Użyj programu Adobe Photoshop lub innego dostępnego oprogramowania, aby wygenerować obraz RGB 2048 × 2048. Obraz odpowiada polu widzenia pod mikroskopem (tj. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm na piksel). Obraz powinien mieć czarne (0, 0, 0) tło.
      UWAGA: Do generowania masek ROI do mikrowzorcowania wspomaganego laserowo można użyć wielu komercyjnych i bezpłatnych edytorów obrazów. Chociaż do generowania masek używamy Adobe Photoshop, GIMP i ImageJ/Fiji są również dostępne jako alternatywne bezpłatne opcje.
    2. Narysuj 8 - 12 białych (255,255,255) wzorów na czarnym tle. Rozmiar wzoru różni się w zależności od typu komórki (~200 pikseli średnicy). Pozostaw pusty obszar o rozmiarach od 500 × 500 do środka obrazu w celu automatycznego ustawiania ostrości. Pozostaw wystarczającą przestrzeń między sąsiednimi wzorami (>200 pikseli) i na granicy pola widzenia, aby zapewnić optymalną ablację i przyłączenie komórek. Wzorce przedstawione w tym protokole są dostępne na Githubie (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
  2. Ustawianie makra
    1. Kliknij menu Makro i wybierz Nowe makro.
    2. Zaimportuj kod "Pattern_Stimulation" dostępny w serwisie Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) do okna Nowe makro. Zapisz ten fragment kodu w odpowiednim folderze.
    3. Otwórz kolejne okno Nowe makro i zaimportuj kod "Stage_Movement" dostępny na Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Upewnij się, że katalog roboczy "Stage_Movement" w tym kodzie jest identyczny z katalogiem w kroku 4.2.2. Zapisz kod "Stage_Movement" w tym samym folderze w kroku 4.2.2.

5. Generowanie mikrowzorów za pomocą ablacji zdjęć

  1. Włącz mikroskop i jego akcesoria. Upewnij się, że laser na podczerwień wystarczająco się rozgrzał wcześniej.
  2. Przenieść szkiełko nakrywkowe pokryte PVA na uchwyt. W przypadku mikroskopu pionowego upewnij się, że powierzchnia PVA ma być ablowana stroną do dołu.
  3. Dodaj wodę do rogów, aby ustabilizować szkiełko nakrywkowe i zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu.
  4. Opuść obiektyw i dodaj wodę na szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem obiektywu do zanurzenia w wodzie 25x/1,1 NA. Jeśli używany jest obiektyw do zanurzania na sucho lub w oleju, wodę należy zastąpić odpowiednim medium zanurzeniowym. Gdy obiektyw zanurzeniowy w wodzie jest używany do generowania dużego układu mikrowzorów, parowanie może stać się problemem. W takim przypadku wodę należy zastąpić GenTeal, dostępnym bez recepty lubrykantem do oczu dostępnym w aptekach.
  5. W oprogramowaniu mikroskopu włącz migawkę lasera IR w oknie graficznego interfejsu użytkownika A1plus MP. Kliknij przycisk Automatyczne wyrównanie, aby wyrównać laser przed modelowaniem.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wykonać automatyczne wyrównanie lasera na początku każdej sesji modelowania, ponieważ niewielkie odchylenia w ścieżce lasera znacząco wpłyną na jakość wzorów.
  6. Przełącz się na konfigurację optyczną "Obraz". W oknie graficznego interfejsu użytkownika A1plus Compact kliknij przycisk Skanuj, aby zeskanować pole widzenia, powoli zbliżając obiektyw do szkiełka nakrywkowego.
  7. Uważnie monitoruj obraz. Na początku obraz będzie wyglądał na bardzo przyciemniony. Przesuń obiektyw bliżej szkiełka nakrywkowego, aż jasność obrazu wzrośnie. Jest to powierzchnia szkiełka nakrywkowego, która jest skierowana w stronę obiektywu. Kontynuuj przesuwanie obiektywu, aż jasność zmniejszy się i ponownie zwiększy. Jest to powierzchnia PVA, która ma być wzorowana. Skoncentruj się na każdym małym elemencie (niedoskonałości szkiełka nakrywkowego, kurz itp.) na tej powierzchni i ustaw zero na dysku Z. Zawsze ustawiaj zero po ustawieniu ostrości.
    UWAGA: Chociaż obie powierzchnie szkiełka nakrywkowego są pokryte PVA, właściwości optyczne szkła nie są znacząco zmienione przez powłokę PVA. Rutynowo obrazujemy takie szkiełka nakrywkowe z obiektywami zanurzonymi w suchej, zanurzonej w wodzie i oleju i nie stwierdziliśmy, aby niewzorzysta powierzchnia PVA zakłócała obrazowanie.
  8. Przełącz na konfigurację optyczną "Label_Surface". Kliknij Przechwyć. Wróć do konfiguracji optycznej "obrazowania" i skanuj. Powierzchnia szkła powinna być uszkodzona i sprawiać wrażenie amorficznej. Uszkodzony obszar jest widoczny gołym okiem, co wskazuje na lokalizację wzorców w dalszych eksperymentach.
    UWAGA: Aby zwiększyć rozmiar widocznej etykiety, powtórz krok 5.8 w wielu sąsiednich polach widzenia.
  9. Sprawdź ponownie, czy obiektyw znajduje się mniej więcej na środku szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym jest wystarczająca ilość wody. Przesuń stolik o 1 do 2 pól widzenia, aby uniknąć cząstek szkła i zeskanuj, aby potwierdzić.
  10. W menu Urządzenia otwórz makro Stage_Movement. Sprawdź, czy katalog roboczy Pattern_Stimulation jest poprawny; Jeśli nie, stymulacja nie nastąpi. Ustaw zmienne "PatternLength" i "PatternHeight" na żądaną liczbę FOV, które będą utworzono wzorzec. Zapisz i uruchom makro.
  11. Po zakończeniu tworzenia wzoru przełącz się na konfigurację optyczną "Obrazowanie". Ponownie sprawdź, czy migawka laserowa IR jest otwarta w oknie graficznego interfejsu użytkownika A1plus MP.
  12. Przesuń scenę, aby wyświetlić wzorce. Przejrzyj wzory, aby sprawdzić ich jakość.
  13. Przenieś szkiełko nakrywkowe do pudełka z siatką, wzorami skierowanymi do góry.
  14. Wzorzyste szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze +4 °C do tygodnia przed użyciem.

6. Adsorpcja fibronektyny

  1. Przygotuj świeży roztwór 1 M NaBH4 w 1 M NaOH. Dodać w stosunku 1:100 do buforu fosforanowego o pH 8,0 zawierającego 0,2 M etanoloaminy.
  2. Przenieść wzorzyste szkiełka nakrywkowe do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm. Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z 1 ml powyższego roztworu przez 8 minut, aby ugasić autofluorescencję, a następnie spłukać 3 razy PBS.
  3. Rozcieńczyć fibronektynę (FN) w PBS do końcowego stężenia 10 μg/ml. Inkubować szkiełko nakrywkowe w FN przez 1 godzinę w temperaturze +37 °C.
    UWAGA: Jeśli zaobserwuje się znaczne niespecyficzne wiązanie białka ECM z substratem, FN można rozcieńczyć w PBS zawierającym 0,1% Pluronic F-12724.
  4. Umyj szkiełko nakrywkowe 2 razy za pomocą PBS. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyty, przechowywać w PBS w temperaturze +4 °C przez noc.

7. Przywiązanie do komórki

UWAGA: Poniższy protokół jest zoptymalizowany dla pierwotnych ludzkich fibroblastów dziąseł.

  1. Hoduj 10 cm naczynie komórek do 70% zbieżności.
  2. Podgrzej pożywkę do hodowli komórkowych, PBS i 0,05% trypsyny w łaźni wodnej o temperaturze +37 °C.
    UWAGA: W przypadku komórek, które słabo przylegają do substratu, nieproteolityczna dysocjacja z versenem (0,48 mM EDTA) lub zastrzeżonym buforem bezenzymatycznym może zwiększyć przywiązanie komórek do wzorców i należy je rozważyć.
  3. Przed wysiewem komórek przenieś wzorzyste szkiełko nakrywkowe do czystego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającego 1 ml ciepłego PBS.
  4. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowych i przemyć raz PBS.
  5. Dodać 700 μl 0,05% trypsyny/EDTA do naczynia i inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze +37 °C, 5% CO2 przez 1 minutę.
  6. W międzyczasie odessać PBS pokrywający wzorzyste szkiełko nakrywkowe i dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  7. Upewnij się, że komórki zostały odłączone. Następnie ponownie zamieszaj trypsynizowane komórki z 10 ml pożywki do hodowli komórkowych i dodaj 1 ml do wzorzystego szkiełka nakrywkowego.
  8. Hoduj komórki w inkubatorze przez 2 - 3 godziny i sprawdź, czy wystarczająca liczba komórek przyczepiła się do wzorów. Jeśli tak, zmień nośnik raz, aby usunąć niedołączone komórki. Minimalizuje to prawdopodobieństwo, że wiele komórek wyląduje na tym samym wzorcu.
    UWAGA: Czas mocowania może się różnić w zależności od typu ogniwa.
  9. Po kolejnych 3-4 godzinach, lub gdy wystarczająca liczba komórek rozprzestrzeni się na wzory, komórki są gotowe do dalszych eksperymentów. Nie czekaj zbyt długo, aby uniknąć podziału komórek.

8. Akwizycja danych

  1. Utrwal komórki z 4% PFA w buforze cytoszkieletu27 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Postępuj zgodnie z protokołami immunofluorescencji ustalonymi dla interesujących białek. Szkiełka nakrywkowe powlekane PVA dobrze sprawdzają się w każdym protokole immunofluorescencji.
  3. Pozyskaj obrazy komórek za pomocą odpowiedniego mikroskopu. W zależności od celu eksperymentu, zobrazuj jedną lub wiele komórek na pole widzenia.

9. Analiza obrazu

UWAGA: Poniższy protokół pozwala użytkownikom uzyskać średni sygnał fluorescencyjny interesującego białka na dużej liczbie komórek z Z-stosów obrazów mikroskopowych.

  1. Otwórz uzyskane obrazy w NIS Elements i przytnij je. Upewnij się, że każdy obraz zawiera tylko jedną dobrze rozsianą komórkę. Szczegółową instrukcję dotyczącą przetwarzania obrazu można znaleźć w poniższym skrypcie.
  2. Zainstaluj Anacondę i uruchom Spyder za pomocą Anaconda Navigator.
    UWAGA: Skrypty .py mogą być uruchamiane w dowolnym środowisku z odpowiednimi pakietami zidentyfikowanymi w requirements.txt. Zalecamy Anacondę, ponieważ zawiera większość wymaganych pakietów dla poniższych kodów.
  3. Pobierz skrypt z Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) i otwórz w Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" lub "Pattern_Averaging_4Channels.py" dla obrazów z odpowiednio 3 kanałami lub 4 kanałami).
  4. Ustaw parametry na podstawie uzyskanych obrazów. Zobacz skrypt, aby uzyskać szczegółowe opisy.
  5. Naciśnij F5, aby uruchomić skrypt. Postęp można śledzić w panelu Konsola.
  6. Pobierz pliki wyjściowe zapisane w tym samym folderze. Obrazy wyjściowe są średnią z każdego kanału dla wszystkich próbek. Arkusz Excela pokazuje średnią intensywność każdego kanału w komórce próbki, co umożliwia dalszą analizę ilościową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość danych eksperymentalnych uzyskanych za pomocą mikrowzorów jest w dużej mierze zależna od jakości wzorców. Aby określić jakość wzorów wygenerowanych powyższą metodą, najpierw użyliśmy mikroskopii refleksyjnej, aby ocenić kształt i rozmiar obszarów szkiełka nakrywkowego poddanych ablacji ze zdjęcia. Odkryliśmy, że każdy indywidualny wzór wyglądał bardzo podobnie do maski ablacyjnej i wyświetlał wyraźne krawędzie oraz powierzchnię, która równomiernie odbijała światło (Rysunek 2B). W zależności od ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższe wyniki pokazują, że opisany protokół mikrowzorcowania wspomaganego laserem IR (mikrofotowzorcowanie) zapewnia powtarzalne przylegające wzory o różnych kształtach, co umożliwia manipulowanie kształtem komórki i architekturą cytoszkieletu. Chociaż zarówno przed, jak i po debiucie mikrofotomodelowania opracowano wiele metod mikromodelowania, metoda ta ma kilka zalet. Po pierwsze, nie wymaga specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń czystych, które zwykle znajdują się tylko w działach inżynieryjnych. W rzeczywistości,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Connaught Fund New Investigator Award dla S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (granty RGPIN-2015-05114 i RGPIN-2020-05881), University of Manchester i University of Toronto Joint Research Fund, oraz University of Toronto XSeed Program. C.T. był wspierany przez stypendium NSERC USRA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropylo)trimetoksysilanAldrich281778
10 cm Naczynie do hodowli komórkowychVWR10062-880Polistyren, z powłoką TC, wentylowane
Obiektyw do zanurzania w wodzie 25X Apo LWDNikonMRD77225
3,5 cm Naczynie do hodowli komórkowychVWR10861-586Polistyren, poddany obróbce TC, wentylowany
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)Thermo622481mg/ml roztwór dichlorowodorku
Albumina seryny bydlęcejBioShopALB005
Dulbecco's Sulbecco's Salan-buffered SolanekŻubr311-425-CL
EtanoloaminaSigma-AldrichE9508
FibronektynaSigma-AldrichFC0101mg/ml w pH 7,5 bufor
Przeciwciało fibronektynyMysz BD610077
FijiImageJWersja 1.53c
Fluorescencyjny falloidynaInvitrogenA12380568nm
Szklane szkiełko nakrywkoweVWR16004-30222 i 22 mm
Aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Sciences1622025% roztwór wodny
Kwas solnyCaledon6025-1-2937% roztwór wodny
IR LaserCoherentChameleon Vision
Minimal Essential Medium &Gibco12561-056
Medium montażoweSigmaF4680
Mysz Wtórnatechnologia sygnalizacji komórek4408SKoza,
mikroskop wielofotonowyNikonA1R MP+
Myozyna Łańcuch lekkiTechnologia sygnalizacji komórek3672SElementy
NISkrólika NikonWersja 5.21.03
Kwas azotowyCaledon7525-1-2970% roztwór wodny
PhotoshopAdobeWersja 21.2.1
Pluronic F-127SigmaP2443Proszek
Poli(alchohol winylowy)Aldrich341584MW 89000-98000, 98% hydrolizowana
technologia sygnalizacji komórekprzeciwciał wtórnych królika4412SKoza, 488nm
ShakerVWR10127-876Znany również jako wahacz analogowy
Borowodorek soduAldrich452882w proszku
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045
Fosforan sodu dwuzasadowySigmaS5136w proszku
MonobasicSigmaS5011w proszku
SpyderAnaconda4.1.4
TrypsynaŻubr325-042-CL0,05% roztwór wodny z 0,53mM EDTA
przeciwciał 488nm przeciwciała

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
  3. Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
  4. Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
  5. Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
  6. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
  9. Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
  10. Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  11. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  12. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  13. Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
  14. Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
  15. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
  16. Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
  17. Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
  18. Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
  19. Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
  20. Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
  21. Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217(2020).
  22. Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
  23. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  24. Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
  25. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
  26. Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
  27. Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
  28. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  29. Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491(2017).
  30. Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Infrared Laser MicropatterningCell Geometry ControlMicropatterning TechniquePolyvinyl Alcohol CoverslipsMultiphoton ImagingAutomated Pattern FabricationCell Morphology AnalysisHigh Resolution ImagingActin Stress FibersImmunofluorescence Imaging

Powiązane artykuły