Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrowzorcowanie jest uznaną techniką w społeczności biologii komórki, używaną do badania powiązań między morfologią a funkcją kompartmentów komórkowych przy jednoczesnym omijaniu komplikacji wynikających z naturalnych różnic między komórkami. Aby ustandaryzować kształt komórki, komórki są albo zamykane w formach 3D, albo kontrolowane pod kątem geometrii kleju za pomocą wysp klejowych. Jednak tradycyjne techniki mikrowzoru oparte na fotolitografii i głębokim trawieniu UV w dużym stopniu zależą od pomieszczeń czystych lub specjalistycznego sprzętu. Tutaj prezentujemy technikę mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (mikrofotomodeling) zmodyfikowaną przez Doyle'a i wsp., którą można wygodnie skonfigurować za pomocą dostępnych na rynku systemów obrazowania. W tym protokole używamy systemu obrazowania Nikon A1R MP+ do generowania mikrowzorów z mikronową precyzją za pomocą lasera na podczerwień (IR), który abluje zaprogramowane obszary na szkiełkach nakrywkowych pokrytych alkoholem poliwinylowym. Stosujemy niestandardowy skrypt, aby umożliwić zautomatyzowane wytwarzanie szablonów z wysoką wydajnością i dokładnością w systemach niewyposażonych w sprzętowy autofokus. Pokazujemy, że ten protokół mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni (mikrofotomodeling) skutkuje zdefiniowanymi wzorami, do których komórki przyczepiają się wyłącznie i przybierają pożądany kształt. Ponadto dane z dużej liczby komórek można uśrednić ze względu na standaryzację kształtu komórek. Wzorce generowane za pomocą tego protokołu, w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości i analizą ilościową, mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych o stosunkowo wysokiej przepustowości w celu identyfikacji graczy molekularnych pośredniczących w związku między formą a funkcją.
Wprowadzenie
Kształt komórki jest kluczowym wyznacznikiem podstawowych procesów biologicznych, takich jak morfogeneza tkanek1, migracja komórek2, proliferacja komórek3, oraz ekspresja genów4. Zmiany w kształcie komórki są napędzane przez skomplikowaną równowagę między dynamicznymi rearanżacjami cytoszkieletu, które deformują błonę plazmatyczną, a czynnikami zewnętrznymi, takimi jak siły zewnętrzne wywierane na komórkę oraz geometria zrostów komórka-komórka i komórka-matryca5. Migrujące komórki mezenchymalne, na przykład, polimeryzują gęstą sieć aktynową na krawęd....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wstępne przetwarzanie szkiełek nakrywkowych
- Przygotuj nieskazitelnie czyste szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w Waterman-Storer, 199825.
- Przygotować 1% roztwór (3-aminopropylo)trimetoksysilanu (APTMS) i inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze przez 10 minut, delikatnie mieszając. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe poruszają się swobodnie w roztworze.
- Szkiełka nakrywkowe myć dwukrotnie za pomocą dH2O przez 5 minut każde.
- Przygotować 0,5% roztwór aldehydu glutarowego (GA) i inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze przez 30 minut na shakerze. Na 25 szkiełek nakrywkowych użyj 50 ml rozt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jakość danych doświadczalnych uzyskanych za pomocą mikrowzorowania w dużej mierze zależy od jakości samych wzorów. Aby ocenić jakość wzorów generowanych powyższą metodą, zastosowano najpierw mikroskopię odbiciową w celu analizy kształtu i rozmiaru obszarów usuniętych metodą ablacji laserowej z krawędzi szkiełka podstawowego. Stwierdzono, że każdy pojedynczy wzór był bardzo podobny do maski ablacyjnej, posiadał wyraźne krawędzie oraz powierzchnię odbijającą światło w sposób jednorodny (Rycina 2B
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Powyższe wyniki pokazują, że opisany protokół mikrowzorcowania wspomaganego laserem IR (mikrofotowzorcowanie) zapewnia powtarzalne przylegające wzory o różnych kształtach, co umożliwia manipulowanie kształtem komórki i architekturą cytoszkieletu. Chociaż zarówno przed, jak i po debiucie mikrofotomodelowania opracowano wiele metod mikromodelowania, metoda ta ma kilka zalet. Po pierwsze, nie wymaga specjalistycznego sprzętu i pomieszczeń czystych, które zwykle znajdują się tylko w działach inżynieryjnych. W rzeczywistości,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Connaught Fund New Investigator Award dla S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (granty RGPIN-2015-05114 i RGPIN-2020-05881), University of Manchester i University of Toronto Joint Research Fund, oraz University of Toronto XSeed Program. C.T. był wspierany przez stypendium NSERC USRA.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| (3-Aminopropylo)trimetoksysilan | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Naczynie do hodowli komórkowych | VWR | 10062-880 | Polistyren, z powłoką TC, wentylowane |
| Obiektyw do zanurzania w wodzie 25X Apo LWD | Nikon | MRD77225 | |
| 3,5 cm Naczynie do hodowli komórkowych | VWR | 10861-586 | Polistyren, poddany obróbce TC, wentylowany |
| 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/ml roztwór dichlorowodorku |
| Albumina seryny bydlęcej | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Sulbecco's Salan-buffered Solanek | Żubr | 311-425-CL | |
| Etanoloamina | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronektyna | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/ml w pH 7,5 bufor |
| Przeciwciało fibronektyny | Mysz BD | 610077 | |
| Fiji | ImageJ | Wersja 1.53c | |
| Fluorescencyjny falloidyna | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Szklane szkiełko nakrywkowe | VWR | 16004-302 | 22 i 22 mm |
| Aldehyd glutarowy | Mikroskopia elektronowa Sciences | 16220 | 25% roztwór wodny |
| Kwas solny | Caledon | 6025-1-29 | 37% roztwór wodny |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium & | Gibco | 12561-056 | |
| Medium montażowe | Sigma | F4680 | |
| Mysz Wtórna | technologia sygnalizacji komórek | 4408S | Koza, |
| mikroskop wielofotonowy | Nikon | A1R MP+ | |
| Myozyna Łańcuch lekki | Technologia sygnalizacji komórek | 3672S | Elementy |
| NIS | królika Nikon | Wersja 5.21.03 | |
| Kwas azotowy | Caledon | 7525-1-29 | 70% roztwór wodny |
| Photoshop | Adobe | Wersja 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Proszek |
| Poli(alchohol winylowy) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolizowana |
| technologia sygnalizacji komórek | przeciwciał wtórnych królika | 4412S | Koza, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Znany również jako wahacz analogowy |
| Borowodorek sodu | Aldrich | 452882 | w proszku |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma | S5136 | w proszku |
| Monobasic | Sigma | S5011 | w proszku |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsyna | Żubr | 325-042-CL | 0,05% roztwór wodny z 0,53mM EDTA |
Bibliografia
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape deter....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Podczerwone mikrowzorowanie laserowekontrola geometrii komórektechnika mikrowzorowaniaszkiełka zakrywkowe z alkoholu poliwinylowegoobrazowanie wielofotonowezautomatyzowany wytwarzanie wzorówanaliza morfologii komórekobrazowanie o wysokiej rozdzielczościaktynowe włókna stresoweobrazowanie immunofluorescencyjne
