Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ekspansja in vitro i różnicowanie ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych w megakariocyty zdolne do wydłużania proplatetek i uwalniania płytek krwi pozwala na dogłębne badanie mechanizmów leżących u podstaw biogenezy płytek krwi. Dostępne protokoły hodowli opierają się głównie na krwiotwórczych wskaźnikach progenitorowych pochodzących ze szpiku kostnego lub krwi pępowinowej, co budzi szereg obaw etycznych, technicznych i ekonomicznych. Jeśli istnieją już dostępne protokoły pozyskiwania komórek CD34 z krwi obwodowej, ten manuskrypt proponuje prosty i zoptymalizowany protokół pozyskiwania komórek CD34 + z filtrów leukodeplecyjnych łatwo dostępnych w centrach krwiodawstwa. Komórki te są izolowane z filtrów leukodeplecyjnych stosowanych do przygotowywania produktów do transfuzji krwi, co odpowiada ośmiu pobranym krwiom. Te filtry są przeznaczone do wyrzucenia. Opisano szczegółową procedurę pobierania hematopoetycznych komórek progenitorowych zidentyfikowanych jako komórki CD34+ z tych filtrów. Szczegółowo opisano również metodę uzyskiwania dojrzałych megakariocytów wydłużających propłytki krwi przy jednoczesnym omówieniu ich ewolucji fenotypowej. Wreszcie, w protokole przedstawiono skalibrowaną metodę pipetowania, aby skutecznie uwalniać płytki krwi, które są morfologicznie i funkcjonalnie podobne do natywnych. Protokół ten może służyć jako podstawa do oceny związków farmakologicznych działających na różnych etapach procesu w celu przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw i zbliżenia się do wydajności płytek krwi in vivo.
Wprowadzenie
Płytki krwi pochodzą z wyspecjalizowanych dużych komórek poliploidalnych, megakariocytów (MK), które pochodzą ze stałego i precyzyjnie dostrojonego procesu produkcyjnego znanego jako megakariopoeza (MKP). Na szczycie tego procesu znajdują się hematopoetyczne komórki macierzyste, które w kontakcie ze środowiskiem szpiku kostnego (cytokiny, czynniki transkrypcyjne, nisza krwiotwórcze) będą zdolne do namnażania się i różnicowania w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HP) zdolne do zaangażowania się w szlak megakariocytarny, dając początek niedojrzałym MKs1. Pod wpływem różnych cytokin, a w szczególności trombopoetyny (TPO), która jest główną cy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Kontrolne próbki ludzkie pobrano od ochotniczych dawców krwi, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę i zostali zrekrutowani przez centrum transfuzjologii, w którym przeprowadzono badania (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Wszystkie procedury zostały zarejestrowane i zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (French Ministry of Higher Education and Research) pod numerem AC_2015_2371. Dawcy wyrazili zgodę w formularzu CODHECO nr AC- 2008 - 562 na wykorzystanie próbek do celów badawczych. Badania z udziałem ludzi przeprowadzono zgodnie z deklaracją helsińską.
1. Izolacja i selekcja komórek CD34+ (HP) z LRF<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Izolacja i selekcja komórek CD34+ z LRF
Niniejsza metoda, opracowana na podstawie pracy Peytour i wsp.9, opisuje izolację i selekcję komórek CD34+ z odrzuconych LRF dostępnych w bankach krwi po leukoredukcji. Po procedurze przepłukiwania wstecznego zwykle odzyskuje się 1,03 x 109 ± 2,45 x 108 komórek/LRF (średnia±SEM; n = 155) przy żywotności 94,88 ± 0,10% (Rysunek 2A i). Po pozytywnej selekcji CD3.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę wytwarzania MK zdolnego do wydzielania propłytek krwi z HP pochodzącego z krwi i uwalniania płytek krwi z pożywki. HP są otrzymywane z LRF, produktu ubocznego banków krwi, używanego do usuwania zanieczyszczających leukocytów z komórkowych produktów krwiopochodnych i unikania działań niepożądanych. Chociaż ta metoda jest stosunkowo prosta, na szczególną uwagę zasługuje kilka punktów.
Osadzanie zawiesiny komórek na pożywce o gradiencie gęstości (etap 1.3.1) musi być p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anty-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anty-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anty-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anty-CD42a-PE | 559919Apyrase | ||
| EFS-Alsace | NA | ||
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, człowiek | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Wirówka | Heraeus | Megafuge 1.OR | Lub równoważny materiał |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Lub równoważny materiał |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Lub równoważny materiał |
| Dekstran z leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Lub równoważny materiał |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0,5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Lub równoważny materiał |
| Jednostka filtracyjna Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Cytometr przepływowy | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDYNA 0,1 mg/1 ml | Bayer | MA038EX | |
| Wkłady | Fenwal | R4R1401 | Lub równoważny materiał |
| Okap z przepływem laminarnym | Holten | NA | Produkt archiwalny |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamina (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Lub równoważny materiał |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Filtry wstępnej separacji Macopharma | VSE4001XA | |
| (30µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Technologie komórek macierzystych | #72344 | |
| Suplement rozszerzający StemSpan (100x) | Technologie komórek macierzystych | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Technologie komórek macierzystych | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µ m PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclon | Termos naukowy | SH3007103 | |
| Strzykawki 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Lub równoważny materiał |
| Filtry strzykawkowe Millex 0,22µ M PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Technologie komórek macierzystych | #02822 | |
| Probówki 50 ml | Sarstedt | 62.548.004 PP | Lub równoważny materiał |
| Probówki 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Lub równoważny materiał |
| Kanaliki | B Braun | 4055137 | Lub równoważny materiał |
Bibliografia
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Natu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
