Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.

Streszczenie

Ekspansja in vitro i różnicowanie ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych w megakariocyty zdolne do wydłużania proplatetek i uwalniania płytek krwi pozwala na dogłębne badanie mechanizmów leżących u podstaw biogenezy płytek krwi. Dostępne protokoły hodowli opierają się głównie na krwiotwórczych wskaźnikach progenitorowych pochodzących ze szpiku kostnego lub krwi pępowinowej, co budzi szereg obaw etycznych, technicznych i ekonomicznych. Jeśli istnieją już dostępne protokoły pozyskiwania komórek CD34 z krwi obwodowej, ten manuskrypt proponuje prosty i zoptymalizowany protokół pozyskiwania komórek CD34 + z filtrów leukodeplecyjnych łatwo dostępnych w centrach krwiodawstwa. Komórki te są izolowane z filtrów leukodeplecyjnych stosowanych do przygotowywania produktów do transfuzji krwi, co odpowiada ośmiu pobranym krwiom. Te filtry są przeznaczone do wyrzucenia. Opisano szczegółową procedurę pobierania hematopoetycznych komórek progenitorowych zidentyfikowanych jako komórki CD34+ z tych filtrów. Szczegółowo opisano również metodę uzyskiwania dojrzałych megakariocytów wydłużających propłytki krwi przy jednoczesnym omówieniu ich ewolucji fenotypowej. Wreszcie, w protokole przedstawiono skalibrowaną metodę pipetowania, aby skutecznie uwalniać płytki krwi, które są morfologicznie i funkcjonalnie podobne do natywnych. Protokół ten może służyć jako podstawa do oceny związków farmakologicznych działających na różnych etapach procesu w celu przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw i zbliżenia się do wydajności płytek krwi in vivo.

Wprowadzenie

Płytki krwi pochodzą z wyspecjalizowanych dużych komórek poliploidalnych, megakariocytów (MK), które pochodzą ze stałego i precyzyjnie dostrojonego procesu produkcyjnego znanego jako megakariopoeza (MKP). Na szczycie tego procesu znajdują się hematopoetyczne komórki macierzyste, które w kontakcie ze środowiskiem szpiku kostnego (cytokiny, czynniki transkrypcyjne, nisza krwiotwórcze) będą zdolne do namnażania się i różnicowania w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HP) zdolne do zaangażowania się w szlak megakariocytarny, dając początek niedojrzałym MKs¹. Pod wpływem różnych cytokin, a w szczególności trombopoetyny (TPO), która jest główną cytokiną MKP; MK przejdzie następnie dwa główne etapy dojrzewania: endomitozę i rozwój błon demarkacyjnych (DMS). Ten w pełni dojrzały MK pojawia się następnie w pobliżu naczynia sinusoidalnego, w którym może emitować cytoplazmatyczne rozszerzenia, propłytki, które zostaną uwolnione pod przepływem krwi, a następnie przekształcone w funkcjonalne płytki krwi². Klonowanie TPO w 1994 roku³ przyczyniło się do rozwoju badań nad MKP poprzez przyspieszenie rozwoju technik hodowli in vitro, które umożliwiły różnicowanie HP i dojrzewanie MK.

Istnieje wiele patologii wpływających na płytki krwi, zarówno pod względem liczby płytek krwi (wzrost lub spadek), jak i funkcji^4,5. Możliwość rekapitulacji MKP in vitro z ludzkiego HP może przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw tego procesu, a ostatecznie do leczenia pacjentów.

Różne źródła ludzkiego HP są odpowiednie: krew pępowinowa, szpik kostny i krew obwodowa^6,7,8. Pobieranie HP z krwi obwodowej stwarza mniej problemów logistycznych i etycznych niż ich odzyskiwanie z krwi pępowinowej lub szpiku kostnego. HP można odzyskać z leukaferezy lub kożuchy koralowej, ale te źródła są drogie i nie zawsze dostępne w centrach krwiodawstwa. Inne protokoły, tańsze i łatwiejsze do wykonania, umożliwiają bezpośrednie odzyskiwanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) bez konieczności uprzedniej izolacji sterowanej CD34^4,8. Jednak czystość megakariocytów nie jest zadowalająca w przypadku tej metody i zaleca się wybór komórek CD34 + z PBMC w celu optymalnego różnicowania do MK. To skłoniło nas do wdrożenia oczyszczania HP z filtrów leukoredukcyjnych (LRF), rutynowo stosowanych w bankach krwi w celu usunięcia białych krwinek, a tym samym uniknięcia niepożądanych reakcji immunologicznych⁹. Rzeczywiście, od 1998 roku koncentraty płytek krwi są we Francji automatycznie leukodonezowane. Pod koniec tego procesu LRF są odrzucane, a wszystkie komórki zatrzymane w LRF są niszczone. Ogniwa w LRF są zatem łatwo dostępne bez dodatkowych kosztów. LRF mają zawartość komórkową zbliżoną do tej uzyskanej przez leukaferezę lub w kożuchach, zwłaszcza w składzie CD34+ HP, co czyni je niezwykle atrakcyjnym źródłem¹⁰. Wykazano już, że LRF jako ludzkie źródło HP zapewnia komórkom nienaruszone zdolności funkcjonalne¹¹. To źródło ma tę zaletę, że jest obfite i niedrogie do badań laboratoryjnych. W tym kontekście w artykule opisano kolejno: i) ekstrakcję i selekcję CD34⁺ HP z LRF; ii) dwufazowa zoptymalizowana hodowla, która podsumowuje zaangażowanie HP w szlak megakariocytarny i dojrzewanie MK zdolnego do wydzielania propłytków; iii) metodę skutecznego uwalniania płytek krwi z tych MK; oraz iv) procedurę fenotypowania MK i hodowanych płytek krwi.

Protokół

Kontrolne próbki ludzkie pobrano od ochotniczych dawców krwi, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę, zrekrutowanych przez centrum transfuzji krwi, w którym przeprowadzono badania (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Wszystkie procedury zostały zarejestrowane i zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych i zarejestrowane pod numerem AC_2015_2371. Dawcy wyrazili zgodę w formularzu zgody CODHECO o numerze AC-2008 - 562, w celu wykorzystania próbek do celów badawczych. Badania na ludziach przeprowadzono zgodnie z deklaracją helsińską.

1. Ekstrakcja i selekcja komórek CD34+ (HP) z LRF

1. Przygotowanie odczynnika (dla jednego LRF)
   1. Przygotować 25 ml przefiltrowanego buforu elucyjnego: 21,25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 2,5 ml roztworu kwasu cytrynianu i dekstrozy (ACD) i 1,25 ml odkomplementowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przefiltrować na 0,22 μm i umieścić w temperaturze 37 °C.
   2. Przygotować 500 ml PBS z 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
   3. Wyrzuć 25 ml pożywki o gradiencie gęstości (DGM) (1.077 g/ml) do dwóch probówek o pojemności 50 ml.
2. Metody płukania wstecznego LRF (Rysunek 1)
   UWAGA: Ten krok wymaga sterylnej spawarki do rur, umożliwiającej sterylne połączenie rurki termoplastycznej.
   1. Najpierw podłącz LRF do pustego worka transferowego o pojemności 600 ml, a LRF do zestawu przewodów (Rysunek 1A). Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego wstrzyknąć całkowitą objętość przefiltrowanego i przygotowanego buforu elucyjnego odpowiadającą liczbie obsługiwanych LRF (xLRF x 25 ml) do pustego worka. Następnie, za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml, delikatnie zassać całą zawartość worka przez LRF, przepłukać wstecznie i przenieść komórki do nowej probówki o pojemności 50 ml (Rysunek 1B).
   2. Do sedymentacji czerwonych krwinek rozcieńczyć zawiesinę komórek o połowę dekstranem 2% i dobrze wymieszać, aby zebrać czerwone krwinki. Odczekaj 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).

Rysunek 1: Sposoby płukania wstecznego LRF. (A) Reprezentatywny schemat (i) sterylnego połączenia worka transferowego z LRF i (ii) zestawu przewodów z LRF. (B) Reprezentatywny schemat podłączenia strzykawek do pobierania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Kolekcja PBMC
   1. Po sedymentacji czerwonych krwinek usunąć i przenieść supernatant do probówki o pojemności 50 ml i napełnić ją PBS-EDTA 2 mM. Delikatnie nałożyć supernatant na wyżej przygotowany DGM. Pozwól supernatantowi płynąć łagodnie, nie naruszając płaszczyzny powierzchni gradientu gęstości. Wirować przy 400 x g przy RT przez 30 minut w trybie hamowania.
   2. Zebrać warstwę PBMC za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Przenieś komórki z każdej probówki DGM do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Napełnij każdą probówkę PBS-EDTA 2 mM i umyj dwukrotnie w 50 ml PBS-EDTA 2 mM przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w trybie hamowania.
   3. Odpipetować i połączyć osad z komórkami za pomocą 50 mL PBS-EDTA 2 mM.
      UWAGA: Istnieje możliwość przerwania zabiegu poprzez utrzymywanie pobranych komórek w mieszaniu w temperaturze 4 °C w nocy. Następnie przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka komórkowego o wielkości 40 μm, aby usunąć powstałe agregaty.
4. Wybór komórek CD34+
   1. Określić liczbę komórek i odwirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut z włączoną przerwami.
   2. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości PBS-EDTA 2 mM, szczegółowo opisanej przez producenta zestawu selekcyjnego CD34 (300 μl PBS-EDTA na 10,⁸ komórek). Dodaj odczynnik blokujący FcR i mikrogranulki CD34 w odpowiednim stężeniu (50 μL na 10⁸ komórek).
   3. Po 30 minutach w temperaturze 4 °C przemyć zawiesinę komórek i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości PBS-EDTA 2 mM, wyszczególnionej przez producenta zestawu selekcyjnego CD34 (500 μL na 10⁸ komórek).
      UWAGA: Wyboru dokonuje się na kolumnach sortujących dla przejścia maksymalnie 2 x 10⁹ komórek na kolumnę.
   4. Przełóż próbkę przez mokrą kolumnę magnesu. Przemyć dwukrotnie 3 ml PBS-EDTA 2 mM i wymyć komórki 5 ml PBS-EDTA 2 mM. Drugi przebieg na nowej kolumnie zgodnie z tą samą procedurą jest konieczny w celu poprawy czystości próbki.
      UWAGA: Oczekiwana liczba 6,1 x 10⁵ komórek/LRF (Rysunek 2A). W przypadku wyższych liczb LRF należy odpowiednio zwiększyć skalę odczynników i metod.
5. Ocena czystości komórek CD34+
   1. Do podwielokrotności 100 μl zawiesiny otrzymanej po selekcji CD34⁺ dodać 2 μl ludzkiego przeciwciała CD34-PE lub 2 μl IgG - PE (kontrola). Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Przemyć komórki, dodając 2 ml PBS i odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zamieszać w 200 μl PBS.
   3. Analizuj czystość za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano w Rysunek 2A oraz w Dyskusji.
      UWAGA: Oczekuje się czystości komórek CD34+ powyżej 90% (Rysunek 2Bii).
   4. Użyj ogniw CD34+ bezpośrednio lub zamroź do dalszego użycia.
6. Zamrażanie komórek CD34+
   UWAGA: Zamrażanie komórek CD34 + odbywa się przy gęstości 10⁶ komórek na ml.
   1. Po oznaczeniu liczby komórek CD34+ przygotować następujące podłoża do kriokonserwacji: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) i pozostawić do schłodzenia w temperaturze 4 °C.
   2. Odwirować komórki CD34+ przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w zimnym roztworze 1, a następnie natychmiast dodać do zimnego roztworu 2 (v/v).
   3. Umieść krioprobówki natychmiast w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 24 godziny, a następnie przenieś krioprobówki do zbiornika z ciekłym azotem.

2. Hodowla i różnicowanie komórek CD34+ w celu wytworzenia dojrzałych megakariocytów zawierających propłytki

UWAGA: Protokół hodowli komórkowej (Rysunek 3A), reprezentatywny schemat procedury hodowli komórkowej są szczegółowo opisane w tej sekcji.

1. Rozmrażanie komórek CD34+ (w razie potrzeby)
   1. Przygotować roztwór do rozmrażania: 13 ml PBS-20% FBS i umieścić w temperaturze 37 °C na 15 minut. Szybko przenieś krioprobówki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż powstanie tylko jeden mały kryształek lodu. Pod szafką do hodowli biologicznej odpipetować całą zawartość i powoli przenieść do 13 ml podgrzanego roztworu do rozmrażania.
   2. Określ liczbę komórek i żywotność komórek.
2. Protokół hodowli, krok 1: od dnia 0 do dnia 7
   UWAGA: Zwykle hodowle wykonuje się na 24-dołkowych płytkach z 1 ml pożywki na studzienkę o gęstości 40 000 żywych komórek/ml, co odpowiada 20 000 żywotnych komórek/cm². Bardzo ważne jest, aby przestrzegać tej gęstości, jeśli planowane jest jakiekolwiek zwiększenie skali.
   1. Przygotowanie pożywki wzrostowej: W pożywce do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy (uprzednio podgrzanej do 37 °C) dodać penicylinę-streptomycynę-glutaminę (PSG) 1x, ludzką lipoproteinę o niskiej gęstości (hLDL) w stężeniu 20 μg/ml, koktajl cytokin ekspansji megakariocytów 1x i stemregeninę 1 (SR1) w stężeniu 1 μM.
   2. Wysiew komórek: Odwirować rozmrożone komórki CD34+ w temperaturze 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dokładnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej i przeprowadzić numerację komórek i żywotność w celu określenia odpowiedniej objętości do wysiewu komórek.
   3. Odwirować komórki 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości ciepłej pożywki wzrostowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 7 dni.
3. Protokół hodowli, krok 2: od dnia 7 do dnia 13 (Rysunek 3B, reprezentatywne obrazy w dniu 13)
   UWAGA: Zwykle hodowle wykonuje się na 24-dołkowych płytkach z 1 ml pożywki na dołek o gęstości 50 000 żywotnych komórek/ml, co odpowiada 25 000 żywotnych komórek/cm². Bardzo ważne jest, aby przestrzegać tej gęstości, jeśli planowane jest jakiekolwiek zwiększenie skali.
   1. Przygotowanie pożywki do dojrzewania: W pożywce do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy (uprzednio podgrzanej do 37 °C) dodać PSG 1x, hLDL w stężeniu 20 μg/ml, TPO w stężeniu 50 ng/ml i SR1 w stężeniu 1 μM.
   2. Zbadaj komórki pod mikroskopem. W 7 dniu komórki wykazują okrągły i jednorodny wygląd, wypełniając studzienki lub kolby bez zbytniego zlewania się.
   3. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego delikatnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienki za pomocą PBS. Następnie określ liczbę komórek i ich żywotność, aby obliczyć odpowiednią objętość do zasiewu komórek.
   4. Odwirować komórki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości ciepłej pożywki, obliczonej w poprzednim kroku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 6 dni.
4. Uwalnianie kulturowych płytek krwi w 13 dniu
   1. Dodać 0,5 μM prostaglandyny I₂ (PGI₂₎ i 0,02 U/ml apyrazy do kultury i wykonać kolejno pipetowanie pięć razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Płytki krwi są teraz uwalniane do pożywki.

3. Analiza cytometrii przepływowej (fenotypowanie MK i liczba kultur płytek krwi)

UWAGA: Ten protokół może być zastosowany do fenotypowania komórek w wybranych dniach hodowli. Pozwala również na określenie liczby uwalnianych płytek krwi w hodowli (Rysunek 4A,B).

1. Przygotowanie do analizy MK
   1. Oznacz cztery zestawy probówek do mikrowirówek w następujący sposób: Nieznakowane komórki jako kontrolne, komórki + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Komórki + 5 μL CD34 - PECy7, Komórki + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Użyj minimum 1,10⁵ komórek na probówkę, nie przekraczaj 1,10⁶ komórek na probówkę. Dodać do 100 μl zawiesiny komórkowej na probówkę cytometryczną i różne przeciwciała. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Następnie dodać 2 ml PBS-EDTA 2 mM na probówkę i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Podczas wirowania należy przygotować roztwór PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycin-D (7AAD) (1/100), pozostawić 300 μl roztworu na probówkę.
   3. Usunąć supernatant i umieścić osad w 300 μl PBS-EDTA 2 mM z 7AAD. Przepuścić próbki przez cytometr przepływowy w ciągu 30 minut
      UWAGA: Strategia analizy cytometrii przepływowej jest pokazana w Rysunek 3C oraz w dyskusji.
2. Przygotowanie probówki do analizy kultur płytek krwi
   1. Oznacz cztery zestawy probówek do mikrowirówek w następujący sposób: Nieznakowane komórki jako kontrolne, Komórki + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Komórki + 20 μL CD42a - PE, Komórki + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Po pięciu kolejnych pipetowaniach w dołku hodowlanym, przenieść 300 μl zawiesiny do probówki do cytometrii zawierającej skalibrowaną liczbę kulek fluorescencyjnych.
   2. Dodać przeciwciała i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   3. Przepuść próbki przez cytometr przepływowy w ciągu 30 minut i ustaw akwizycję na przejście 5 000 kulek.
      UWAGA: Strategia analizy cytometrii przepływowej jest pokazana w Rysunek 4B oraz w dyskusji.

Wyniki

Ekstrakcja i selekcja komórek CD34+ z LRFs
W tym przypadku metoda, wywodząca się z Peytour et al.⁹, opisuje ekstrakcję i selekcję ^komórek CD34+ z odrzuconych LRF dostępnych w bankach krwi po usunięciu leukocytów. Po procedurze płukania wstecznego zwykle odzyskuje się 1,03 x 10⁹ ± 2,45 x 10⁸ komórek/LRF (średnia±SEM; n = 155) z żywotnością 94,88 ± 0,10% (Rysunek 2A i). Po pozytywnej selekcji CD34 uzyskuje się...

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę wytwarzania MK zdolnego do wydzielania propłytek krwi z HP pochodzącego z krwi i uwalniania płytek krwi z pożywki. HP są otrzymywane z LRF, produktu ubocznego banków krwi, używanego do usuwania zanieczyszczających leukocytów z komórkowych produktów krwiopochodnych i unikania działań niepożądanych. Chociaż ta metoda jest stosunkowo prosta, na szczególną uwagę zasługuje kilka punktów.

Osadzanie zawiesiny komórek na pożywce o gradiencie gęstości (etap 1.3.1) musi być p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
7-AAD	Biolegend	558819
ACD	EFS-Alsace	NA
Anty-CD34-PE	Miltenyi biotec	130-081-002
Anty-CD34-PECy7	eBioscience	25-0349-42
Anty-CD41-Alexa Fluor 488	Biolegend	303724
Anty-CD42a-PE		559919Apyrase
	EFS-Alsace	NA
BD Trucount Tubes	BD Bioscience	340334
CD34 MicroBead Kit UltraPure, człowiek	Miltenyi biotec	130-100-453
Wirówka	Heraeus	Megafuge 1.OR	Lub równoważny materiał
Compteur ADAM	DiagitalBio	NA	Lub równoważny materiał
Cryotubes	Dutscher	55002	Lub równoważny materiał
Dekstran z leuconostoc spp	Sigma	31392-50g	Lub równoważny materiał
DMSO Hybri-max	Sigma	D2650
EDTA 0,5 M	Gibco	15575-039
Eppendorf 1,5 mL	Dutscher	616201	Lub równoważny materiał
Jednostka filtracyjna Steriflip PVDF	Merck Millipore Ltd	SE1M179M6
Cytometr przepływowy	BD Bioscience	Fortessa
Human LDL	Stemcell technologies	#02698
ILOMEDYNA 0,1 mg/1 ml	Bayer	MA038EX
Wkłady	Fenwal	R4R1401	Lub równoważny materiał
Okap z przepływem laminarnym	Holten	NA	Produkt archiwalny
LS Columms	Miltenyi Biotec	130-042-401
Lymphoprep	Stemcell	7861
Pen Strep Glutamina (100x)	Gibco	10378-016
PBS (-)	Life Technologies	14190-169	Lub równoważny materiał
PGi2	Sigma	P6188
Poches de transferts 600ml	Filtry wstępnej separacji Macopharma	VSE4001XA
(30µ m)	Miltenyi Biotec	130-041-407
StemRegenin 1 (SR1)	Technologie komórek macierzystych	#72344
Suplement rozszerzający StemSpan (100x)	Technologie komórek macierzystych	#02696
StemSpan-SFEM	Technologie komórek macierzystych	#09650
Stericup Durapore 0,22µ m PVDF	Merck Millipore Ltd	SCGVU05RE
SVF Hyclon	Termos naukowy	SH3007103
Strzykawki 30 mL	Terumo	SS*30ESE1	Lub równoważny materiał
Filtry strzykawkowe Millex 0,22µ M PVDF	Merck Millipore Ltd	SLGV033RB
TPO	Technologie komórek macierzystych	#02822
Probówki 50 ml	Sarstedt	62.548.004 PP	Lub równoważny materiał
Probówki 15 mL	Sarstedt	62.554.001 PP	Lub równoważny materiał
Kanaliki	B Braun	4055137	Lub równoważny materiał