Artykuł metodologiczny

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

DOI:

10.3791/62510

⸱

17 lipca 2021

 , 
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białko metylotransferazy argininy (PRMT) metylują reszty argininy na szerokiej gamie białek, które odgrywają rolę w wielu procesach komórkowych. PRMT mogą mono- lub dimetylanować grupy guanidynowe argininy symetrycznie lub asymetrycznie. Enzymologia tych białek to złożony i intensywnie badany obszar, który wymaga miligramowych ilości wysokiej jakości rekombinowanego białka. System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) wykorzystujący wirusa wielonukleopolihedronowego Autographa californica (AcMNPV) i komórki owadów Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) został wykorzystany do badania przesiewowego ekspresji i produkcji wielu PRMT, w tym PRMT 1, 2 i 4 do 9. Aby jednocześnie przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem ekspresji wielu konstruktów tych białek, w tym domen i skróconych fragmentów, a także białek o pełnej długości, zastosowaliśmy skalowalne metody wykorzystujące regulowane i programowalne pipety wielokanałowe, połączone z 24- i 96-dołkowymi płytkami i blokami. Ogólnie rzecz biorąc, te dostosowania metody umożliwiły generowanie na dużą skalę bakimidowego DNA, rekombinowanych wirusów i badań przesiewowych ekspresji białek. Wykorzystanie naczyń hodowlanych z dużą objętością zawiesiny komórek Sf9 pomogło przezwyciężyć ograniczenia przestrzenne w procesie produkcyjnym w przypadku produkcji białek na dużą skalę w jednej partii. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły wydajnej i opłacalnej ekspresji funkcjonalnych PRMT do badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białko metylotransferazy argininy (PRMT) metylują reszty argininy w monometylowy lub symetryczny/asymetryczny sposób dimetylowy. Powtarzające się sekwencje RG/RGG/GRG są wysoce preferowane przez większość PRMT i można je znaleźć w szerokiej gamie białek1,2. Białka metylowane argininy, takie jak histony lub czynniki transkrypcyjne i czynniki splicingowe, regulują transkrypcję, splicing i strukturę chromatyny3,4. Rosnąca wiedza na temat różnorodnej regulacji wykorzystania substratów i kofaktorów, obrotu i kinetyki PRMT, a także generowania selektywnych inhibitorów, rzuciły mechanistyczne światło na te enzymy i ich kompleksy5,6. Jednak nie wszyscy członkowie rodziny PRMT są badani w takim samym stopniu; Na przykład dopiero niedawno odkryto, że PRMT9 należy do rodziny PRMT1. Badania struktury i funkcji enzymów tych białek wymagają wystarczających, często miligramowych, ilości rekombinowanego białka, aby były dostępne.

System ekspresji prokariotycznej Escherichia coli (E. coli) jest zazwyczaj pierwszym wyborem do badania przesiewowego ekspresji przy użyciu wielu konstruktów dla danego białka7,8,9. Jednak ekspresja oparta na E. coli nie zawsze prowadzi do wystarczających ilości białek PRMT w ich aktywnych formach, jak zauważyliśmy w szczególności w przypadku PRMT5 i PRMT7 (patrz poniżej). W ten sposób PRMT, które nie uległy ekspresji w E. coli lub musiały być wytwarzane przez eukariotyczną maszynerię ekspresyjną, zostały sklonowane do wektorów odpowiednich do badania przesiewowego ekspresji w alternatywnym systemie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS). Podczas gdy próbki PRMT1, PRMT3 i PRMT8 z ekspresją E. coli są szeroko wykorzystywane do testów in vitro i krystalografii, inne PRMT, takie jak PRMT5, który wymaga partnera wiążącego MEP50 w swojej podwójnej domenie metylotransferazy, oraz PRMT, takie jak PRMT7 i 9, wymagają ekspresji komórek owadów w celu uzyskania wystarczających ilości aktywnego białka. Ogólnie rzecz biorąc, standaryzowane średnioprzepustowe testy metylotransferazy dla PRMT4, 5, 6, 7 i 9 wykorzystywały BEVS w komórkach owadów6. System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to wszechstronna platforma do produkcji rekombinowanych białek wymagających eukariotycznej maszynerii ekspresji, która umożliwia modyfikacje potranslacyjne niezbędne do badań biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych10,11,12. Od czasu pierwszego doniesienia o użyciu bakulowirusów w 1983 roku do ekspresji białek dostępnych jest kilka BEVSów, które są dostępne na rynku13. Większość z tych protokołów wykorzystuje różne strategie przenoszenia plazmidu ekspresyjnego do komórek owadów. Należą do nich Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK itp. Nasz protokół opiera się na najczęściej używanym systemie w BEVS, systemie Bac-to-Bac14, który jest przeznaczony do przenoszenia genu/cDNA kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania (POI, tutaj PRMT) do genomu bakulowirusa utrzymywanego w wyspecjalizowanym szczepie E. coli poprzez transpozycję specyficzną dla miejsca15.

Krótko mówiąc, wektor transferu plazmidu zawierający interesujący nas gen został przekształcony w kompetentne komórki DH10Bac E. coli, aby wytworzyć rekombinowane wirusowe bakimidowe DNA. Adherentne komórki Sf9 zostały następnie przetransfekowane bakcydalnym DNA. Cztery do pięciu dni po transfekcji początkowe rekombinowane bakulowirusy wydzielane do pożywki komórkowej zostały odzyskane i oznaczone jako wirus P1. Stada bakulowirusa P1 wykorzystano następnie do amplifikacji wirusa (tj. generowania stad bakulowirusa P2) i badania przesiewowego ekspresji białka. Na podstawie wyników badań przesiewowych ekspresji zidentyfikowano wirusy P2 w celu uzyskania najlepszego konstruktu ekspresji białka i wykorzystano je do wytworzenia kultur zawiesinowych komórek owadów zakażonych bakulowirusem (SCBIIS) do produkcji białka na dużą skalę. W tym miejscu opisujemy nasze szczegółowe protokoły i opisujemy uzasadnienie naszych wyborów odczynników i naczyń hodowlanych, aby wesprzeć naszą strategię opracowania bardziej efektywnej czasowo, ekonomicznie i skalowalnej metodologii w celu uzyskania wystarczających ilości pożądanych białek rekombinowanych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przegląd kroków protokołu BEVS jest opisany w Rysunek 1.

1. Generowanie rekombinowanego bakmidowego DNA

  1. Przygotowanie selektywnych płytek agarowych LB do przemiany DH10Bac
    1. Przygotuj płytki agarowe LB zawierające: 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 200 μg/ml Bluo-gal i 40 μg/ml IPTG do wyboru dla transformantów DH10Bac.
    2. Odważyć 25 g wstępnie zmieszanego bulionu LB i 13 g agaru Bacto i umieścić w kolbie o pojemności 2 litrów. Doprowadzić objętość do 1 l wodą destylowaną i sterylizować w autoklawie przez 15-30 minut w temperaturze 121 °C.
    3. Ustawić łaźnię wodną na temperaturę 50 °C i schłodzić autoklawowany roztwór agaru w łaźni wodnej przez 40-60 minut, aż schłodzi się do 50-55 °C.
    4. Do schłodzonego roztworu dodać gentamycynę do końcowego stężenia 7 μg/ml, kanamycynę do końcowego stężenia 50 μg/ml, tetracyklinę do końcowego stężenia 10 μg/ml, Bluo-gal do końcowego stężenia 200 μg/ml i IPTG do końcowego stężenia 40 μg/ml.
    5. Zmieszać roztwór agaru i porcję 7-10 ml pożywki na każdą płytkę o średnicy 60 mm za pomocą pipety o pojemności 50 ml. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej (2 godziny) do stwardnienia. Odwrócić, zawinąć i przechowywać w temperaturze 4 °C. Płytki zawierające antybiotyki są stabilne przez okres do 4 tygodni.
  2. Przemiana plazmidu w kompetentne komórki DH10Bac E. coli
    1. Oblicz wymaganą objętość kompetentnych komórek.
    2. Rozmrozić kompetentne komórki na lodzie, delikatnie odwirować i ponownie zawiesić, delikatnie stukając.
    3. Użyj 12-kanałowej pipety, aby dozować 4 μl komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR.
    4. Dodaj ~ 0,3-0,5 μg rekombinowanego plazmidowego DNA do właściwych komórek i delikatnie wymieszaj, stukając. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 10-15 minut.
    5. Szok termiczny mieszaniny w maszynie do PCR w temperaturze 42 °C przez 45 s. Schładzanie na lodzie przez 2 min.
    6. Dozuj 0,5 ml pożywki SOC do każdej studzienki z 96-dołkowych bloków (96-dołkowa głębia 2,4 ml).
    7. Za pomocą 12-kanałowej pipety przenieś przekształconą zawiesinę bakteryjną do odpowiedniego dołka bloku i przykryj go arkuszem powietrznym.
    8. Umieścić blok w inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 37 °C ze średnim mieszaniem (205 obr./min) przez 4-5 godzin.
    9. Równomiernie rozprowadzić 30-50 μl kultury na powierzchni płytki agarowej LB za pomocą sterylnych szklanych kulek. Resztę kultury przechowywać w temperaturze 4 °C.
    10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, aż do momentu, gdy będzie można dostrzec niebiesko-biały kolor kolonii (40-48 godzin). Wyrzuć kulturę, gdy na talerzu pojawi się wystarczająca ilość białych, dużych kolonii.
    11. Aby upewnić się, że białe kolonie zawierają tylko rekombinowane bakimidowe DNA, ponownie nałóż jedną izolowaną białą kolonię na świeże płytki agarowe LB zawierające antybiotyki, bluo-gal i IPTG w celu zweryfikowania fenotypu.
    12. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    13. Wybierz jedną zweryfikowaną białą kolonię z ponownie pokrytej płytką w celu ekstrakcji rekombinowanego DNA bakmidu.
  3. Izolowanie rekombinowanego DNA bakterii
    1. Zaszczepić pojedynczą, izolowaną białą kolonię w 3 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny w blokach 24-dołkowych (bloki 24-dołkowe wokół dna) i przykryć arkuszem powietrznym.
    2. Rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    3. Odwirować bloki 24-dołkowe przy sile 2 100 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant, odwrócić blok i delikatnie postukać w chłonną bibułkę. Dodać 250 μl roztworu 1 (roztwór do ponownego zawieszania komórek) do każdej studzienki.
    4. Uszczelnij bloki podkładkami taśmowymi lub innymi foliami uszczelniającymi i umieść je na platformie wibracyjnej z prędkością 75 obr./min na 5-10 minut. Sprawdź każdą studzienkę, aby zapewnić prawidłową lizę komórek i w razie potrzeby ponownie zawiesij, używając końcówki o pojemności 1 ml.
    5. Dodać 250 μl roztworu 2 (roztwór do lizy komórek) do każdej studzienki, uszczelnić bloki i umieścić na platformie wibracyjnej z prędkością 75 obr./min na 30 s (aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbek, nie odwracać bloków 24-dołkowych) inkubując w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.
    6. Dodać 250 μl roztworu 3 (roztwór neutralizacyjny), uszczelnić bloki i umieścić na platformie wytrząsającej z prędkością 75 obr./min na 30 s. Utworzy się gęsty biały osad białka i genomowego DNA E. coli. Umieść próbkę na lodzie na 10-15 minut.
    7. Wirować przez 60 minut w temperaturze 2 100 x g w temperaturze 4 °C w celu szczelnego osadu białego. Podczas wirowania oznacz nową probówkę do mikrowirówki i dodaj 0,8 ml absolutnego izopropanolu.
    8. Delikatnie przenieść supernatant do probówki zawierającej izopropanol, unikając białego osadu. Wymieszaj, delikatnie odwracając rurkę kilka razy, a następnie umieść na lodzie na 5 do 10 minut. Na tym etapie próbka może być przechowywana przez noc w temperaturze -20 °C.
    9. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 0,5 ml 70% etanolu do każdej probówki. Odwróć rurkę kilka razy, aby umyć granulkę. Wirować przez 5 minut przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej. (Opcjonalnie: powtórzyć pranie)
    10. Umieścić próbki w okapie z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylność preparatu plazmidowego i usunąć jak najwięcej supernatantu.
      UWAGA: Osad może oderwać się od dna probówki, dlatego należy uważnie obserwować osad podczas wyrzucania supernatantu.
    11. Wysuszyć granulkę na powietrzu wewnątrz okapu z przepływem laminarnym przez 15 - 20 minut i rozpuścić DNA w 50 μl przefiltrowanego buforu elucyjnego, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (upewnić się, że granulki nie są przesuszone).
    12. Ponieważ rekombinowany bakmidowy DNA ma rozmiar większy niż 135 kb, aby uniknąć ścinania DNA, rozpuść osad przez delikatne stukanie.
    13. Aby zweryfikować obecność interesującego genu w DNA bakmidu, należy umieścić mieszaninę reakcyjną PCR na 96-dołkowej płytce PCR.
    14. Przygotować mieszaninę PCR w następujący sposób: 1 μl buforu, 0,2 μl (po 10 mM każdy) dNTP, 0,1 μl polimerazy DNA Taq, 0,1 μl (25 μM) starterów do przodu i do tyłu (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μl bakimidowego DNA i 8 μl wody.
    15. Przeprowadzić amplifikację docelowych genów z początkową denaturacją przez 2 minuty w temperaturze 95 °C, a następnie 25 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min/kb.
    16. Przerwać reakcję po ostatecznym przedłużeniu na 7 minut w temperaturze 72 °C.
    17. Przeanalizować 10 μl produktu amplifikacji na 1% (w/v) żelu agarozowym zawierającym roztwór barwiący kwasy nukleinowe metodą elektroforezy.
    18. Przechowywać zweryfikowane DNA bakterii w temperaturze 4 °C.

2. Generowanie rekombinowanych zapasów bakulowirusów

UWAGA: Używaj wykładniczo rosnących komórek Sf9 o żywotności 95% lub większej na dowolnym etapie protokołu ekspresji bakulowirusa, w tym transfekcji komórek do generowania bakulowirusa, amplifikacji objętości bakulowirusa, badania przesiewowego ekspresji białka i produkcji białka.

  1. Transfekcja komórek Sf9 za pomocą DNA Bacmid i odczynników do transfekcji (TR), takich jak JetPrime lub X-tremeGENE 9.
    UWAGA: Barwienie błękitem trypanowym i hemocytometr mogą być używane do określenia liczby żywotnych komórek i % żywotności komórek. Komórki niezdolne do życia przyjmują barwnik i wydają się niebieskie pod mikroskopem, podczas gdy żywe komórki pozostają niewybarwione. Aby obliczyć % żywotności komórek, uzyskuje się całkowitą liczbę komórek (niebarwionych i barwionych), a liczbę komórek zdolnych do życia dzieli się przez całkowitą liczbę komórek i mnoży przez 100.
    1. Rozcieńczyć wykładniczo rosnące komórki Sf9 do końcowej gęstości komórek 4 x 105 komórek/ml w pożywce dla owadów wolnych od surowicy i wlać do sterylnego zbiornika odczynnika.
    2. Użyj programowalnej pipety wielokanałowej, aby wysiać 0,5 ml rozcieńczonych komórek Sf9 do każdego dołka na 24-dołkowej płytce.
    3. Oznacz jedną studzienkę płytki jako kontrolną (nietransfekowaną) i użyj jej jako kontroli do porównania transfekowanych i nietransfekowanych komórek w celu oceny potencjalnych objawów infekcji.
    4. Po wysianiu komórek na płytkach, delikatnie kołysz płytkami kilka razy w przód iw tył, aby zapewnić równą monowarstwę komórek. Nie obracaj płytek, ponieważ komórki skupią się w środku studzienki.
    5. Inkubować płytki w temperaturze 27 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie komórek do płytek hodowlanych.
    6. Dobrze wymieszać fiolkę z odczynnikiem do transfekcji. Do każdej transfekcji dodać 2 μl odczynnika do transfekcji do 100 μl buforu do transfekcji. Można również użyć dowolnego innego niesuplementowanego podłoża dla owadów. Umieść rozcieńczony odczynnik do transfekcji w sterylnym zbiorniku odczynnika i delikatnie mieszaj przez 10 sekund.
    7. Za pomocą pipety 12-kanałowej przenieś 102 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji na sterylną płytkę 96-dołkową.
    8. Przenieść 10 μl 0,2 μg/μl roztworu rekombinowanego bakmidowego DNA do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki mikrodołkowej i wymieszać, delikatnie potrząsając (stukając) płytką z boków.
    9. Inkubować mieszaninę transfekcji przez 15-20 minut, aby umożliwić tworzenie kompleksów.
    10. Za pomocą regulowanej pipety 6-kanałowej przeznaczonej do przenoszenia między płytkami 96- i 24-dołkowymi, dodaj mieszaninę do transfekcji na komórki kroplami do odpowiednich dołków płytek transfekcyjnych i inkubuj przez 4-5 godzin w temperaturze 27 °C.
    11. Delikatnie kołysz płytkami w przód i w tył kilka razy w czasie inkubacji, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie mieszaniny transfekcji na monowarstwie komórki.
    12. 4-5 godzin po transfekcji dodać 1,5 ml pożywki bez surowicy owadów uzupełnionej 10% (v/v) końcowej inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyko-przeciwgrzybiczą do 1% (v/v) końcowej objętości (100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B).
    13. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 27 °C przez 72-96 godzin. Jeśli to możliwe, delikatnie kołysać płytkami transfekcyjnymi raz dziennie.
    14. Szukaj oznak infekcji (SOI), widocznych w transfekowanych komórkach po 72-96 godzinach od transfekcji (Ryc. 2). Należy pamiętać, że transfekowane komórki zaczną wytwarzać wirusa i dalej infekować kulturę; Dlatego szukaj oznak infekcji.
      UWAGA: Objawami infekcji są zmiany strukturalne w komórkach owadów, takie jak 25-50% wzrost średnicy komórki, powiększenie jąder komórkowych, jednolicie zaokrąglony kształt, utrata proliferacji i przylegania do powierzchni szalki hodowlanej, a także spadek żywotności komórek (Rysunek 2. Bakulowirus Zakażone i niezakażone komórki Sf9).

3. Badania przesiewowe ekspresji białek na małą skalę i amplifikacja wirusa

  1. Zakażenie komórek Sf9 zapasami bakkulowirusa P1.
    UWAGA: 4-5 dni po transfekcji objawy infekcji powinny być widoczne w transfekowanych komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi (nietransfekowanymi) pod odwróconym mikroskopem. Początkowe rekombinowane bakulowirusy wydzielane do pożywki do hodowli komórkowej powinny być gotowe do pobrania.
    1. Wysiew 2 x 105 wykładniczo rosnących komórek Sf9 w pożywce dla owadów wolnych od surowicy do każdej studzienki 24-dołkowych płytek o łącznej objętości 2 ml w celu zakażenia wirusami P1 w celu zwiększenia objętości wirusa (co skutkuje powstaniem wirusów P2).
    2. Po odpipetowaniu komórek do płytek, delikatnie kołysz płytkami, wykonując ruchy w przód i w tył, aby zapewnić równą monowarstwę. Nie obracaj płytek, ponieważ komórki skupią się w środku studzienki.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 27 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić przyleganie komórek do płytki.
    4. Dozuj 4 ml komórek Sf9 o gęstości 3,5-4 x 106 w pożywce wolnej od surowicy owadów do każdej studzienki z 24-dołkowymi blokami, aby zainfekować wirusami P1 w celu badania przesiewowego ekspresji białka.
      UWAGA: Oznacz jedną studzienkę z 24-dołkowych płytek i 24-dołkowych bloków jako kontrolną i użyj jako niezakażonej kontroli do porównania zakażonych i niezakażonych komórek podczas poszukiwania SOI.
    5. Stosować programowalny elektroniczny wielokanałowość, aby umożliwić jednoczesne zbieranie wirusów P1 (krok 2.1.13), zakażenie świeżo posianych komórek Sf9 (krok 3.1.1) i zakażenie komórek zawiesinowych w blokach 24-dołkowych (krok 3.1.4) 150 μl wirusów P1.
    6. Resztę zebranych zapasów wirusa P1 należy odkręcać przez 15 minut w temperaturze 17 970 x g, przenieść do probówek do mikrowirówek i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    7. Delikatnie kołysać 24-dołkowymi płytkami (krok 3.1.1) na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie dodanych wirusów P1 na monowarstwie komórki; powtórzyć to kilka razy w czasie inkubacji.
    8. Przykryj bloki 24-dołkowe kulturą zawiesinową zakażonych komórek Sf9 (krok 3.1.4) arkuszem powietrznym.
    9. Inkubować bloki 24-dołkowe w temperaturze 27 °C, wytrząsając z prędkością 245 obr./min przez 72–96 godzin.
    10. Poszukaj SOI w ciągu 72-96 godzin po czasie infekcji na 24-dołkowych płytkach z wirusami P2 (krok 3.1.1) i w 24-dołkowych blokach (krok 3.1.4) z zakażonymi komórkami w celu przeprowadzenia badania przesiewowego ekspresji.
      UWAGA: 4-5 dni po zakażeniu komórek Sf9 wirusami P1, SOI powinien być widoczny w zakażonych komórkach w porównaniu z niezakażonymi komórkami kontrolnymi pod odwróconym mikroskopem.
    11. Pobrać wirusy P2 z płytek 24-dołkowych, wirować przez 15 minut przy 17 970 x g, przenieść je do probówek do mikrowirówek i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
    12. Po 72-96 godzinach od infekcji spryskaj 24-dołkowe bloki 70% etanolem, wprowadź do okapu z przepływem laminarnym i sprawdź gęstość i żywotność komórek w kilku studzienkach za pomocą barwienia Trypan Blue.
    13. Przystąp do oczyszczania białek, jeśli komórki mają oznaki infekcji, a żywotność jest bliska 70-75%, jak oceniono za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
    14. Osadzać komórki przez odwirowanie bloków 24-dołkowych przy 525 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant i dokładnie zawiesić granulki w 1 ml buforu do lizy zawierającego 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazolu, 5% glicerolu (v/v) i 1x koktajl inhibitorów proteazy (100 x koktajl inhibitorów proteazy zawiera aprotyninę 0,25 mg / ml, leupeptyna 0,25 mg/ml, pepstatyna A 0,25 mg/ml; E-64 0,25 mg/ml).
    15. Zawiesinę komórek przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego oczyszczania testowego (patrz ppkt 3.2.2).
  2. Oczyszczanie białek z zamrożonej zawiesiny komórkowej w 24-dołkowych blokach testowo-ekspresyjnych.
    1. Montaż bloku wiążącego (Rysunek 3).
      1. Umieść 3 nakładające się na siebie warstwy parafilmu na wierzchu bloku studzienki o głębokości 96 (studzienka o głębokości 96 ml 2,4 ml).
      2. Umieść 96-dołkową płytkę filtracyjną (mikropłytka filtracyjna, 96-dołkowa, polipropylenowa z membraną polietylenową o ultrawysokiej masie cząsteczkowej 25 μm) na górze bloku studzienki o głębokości 96.
      3. Wciśnij płytę filtracyjną, aby zamocować końcówki w parafilmie, aby uszczelnić płytę filtracyjną od bloku o głębokości 96 dołków.
      4. Przenieść 50 μl wstępnie zbalansowanej 50% zawiesiny żywicy Ni-NTA do każdej studzienki płyty filtracyjnej.
    2. Procedura wyrażenia testowego
      1. Zawiesinę zamrożonych komórek (etap 3.1.15) znajdującą się w 24-dołkowych blokach umieścić w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut, a następnie wstrząsać z prędkością 450 obr./min przez 20 minut.
      2. Odwirować bloki 24-dołkowe przy 3,275 x g przez 15 minut.
      3. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść oczyszczone lizaty na płytkę filtracyjną zawierającą 50 μl wstępnie zbalansowanej 50% zawiesiny żywicy Ni-NTA (krok 3.2.1.4) i uszczelnić płytkę filtracyjną 96-dołkową matą nasadkową (96-dołkowa mata nasadkowa, do stosowania z studzienką kwadratową, 2 ml).
        UWAGA: Użyj kilku gumek, aby utrzymać blok wiążący razem podczas etapów inkubacji i wirowania.
      4. Umieść zabezpieczony blok wiążący na 45-60 minut w rotatorze w chłodnym pomieszczeniu w celu inkubacji oczyszczonych lizatów z żywicą Ni-NTA.
      5. Po inkubacji ostrożnie podnieść płytę filtracyjną i usunąć warstwę parafilmu z powierzchni bloku studni o głębokości 96 (krok 3.2.1.1).
      6. Umieść z powrotem płytkę filtracyjną na górze bloku studzienki o głębokości 96 i odwiruj zabezpieczony blok wiążący przez 2 minuty przy 235 x g.
      7. Żywica Ni-NTA Wash bond 2x z 2 ml buforu myjącego zawierającego 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu i 15 mM imidazolu.
      8. Obracać blok z buforem myjącym za każdym razem przez 5 minut przy 235 x g, aby zapewnić całkowite usunięcie resztek płynu.
      9. Przenieś płytkę filtracyjną na wierzch 96-dołkowej płytki do PCR zawierającej 10 μl 4-krotnego barwnika ładującego.
      10. Dodać 40 μl buforu elucyjnego (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolu, 500 mM imidazolu) do każdej studzienki płytki filtracyjnej i inkubować przez 5 minut.
      11. Odwiruj blok, aby wymyć białka do 96-dołkowej płytki PCR przy 235 x g przez 10 minut.
      12. Uszczelnić 96-dołkową płytkę do PCR odporną na wysokie temperatury podkładką kranową i podgrzewać w temperaturze 98 °C przez 3 minuty.
      13. Załaduj 15 μl eluowanych próbek białka do standardowego buforu Laemmli na 4-20% żelu SDS-PAGE obok drabinki białkowej i uruchom żel ze standardowym buforem biegnącym zawierającym SDS.
      14. Zabarwić żel kolorem Coomassie blue i odplamić wodą. Analizowanie wyników wyrażeń testowych w celu zidentyfikowania najlepszych konstrukcji wyrażających dla produkcji na dużą skalę.

4. Przygotowanie komórek owadów zakażonych bakulowirusem (SCBIIC) do produkcji białka

  1. Na 4 dni przed planowanym czasem produkcji podziel wykładniczo rosnące komórki Sf9 na końcową gęstość komórek 2 x 106 komórek/ml na 125 ml / 250 ml / 500 ml szklanych kolb do wytrząsania Erlenmeyera z przegrodami w 50 ml / 100 ml / 200 ml pożywki bez surowicy owadziej zawierającej 1% (v/v) końcowego antybiotyku-antybiotyku.
  2. Dodać 0,150 ml / 0,300 ml / 0,6 ml odpowiednich wirusów P2, inkubować zakażone komórki z prędkością 165 obr./min na wytrząsarce orbitalnej z jednocalowym skokiem i w niższej temperaturze 25 °C, aby spowolnić podział komórek.
  3. Po 4 dniach od zakażenia sprawdź komórki pod mikroskopem pod kątem SOI i przystąp do produkcji, jeśli żywotność komórek zweryfikowana za pomocą barwienia błękitem trypanowym jest bliska 70-75%.

5. Preparaty komórkowe Sf9 do produkcji białek na dużą skalę

  1. Na 4 dni przed planowanym czasem produkcji oblicz wymaganą objętość komórek Sf9 do produkcji białka na dużą skalę.
  2. Wysiew 2 l wykładniczo rosnących komórek Sf9 w podłożu bez surowicy owadów do gęstości komórek 1 x 106 komórek / ml w 2,8 l kolbach do wytrząsania Fernbach.
  3. Inkubować kolby w temperaturze 27 °C z wytrząsaniem ustawionym na 150 obr./min.
    UWAGA: Aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu w hodowli komórek Sf9, należy użyć gentamycyny do końcowego stężenia 10 μg/ml lub penicyliny/streptomycyny odpowiednio do 50 U/ml i 50 μg/ml.

6. Zakażenie komórek Sf9 SCBIIS w celu produkcji białka na dużą skalę

  1. Rozdrobnij 2 l lub 4 l wykładniczo rosnących komórek Sf9 w podłożu bez surowicy owadów do końcowej gęstości komórek 4 x 106 komórek/ml w 2,5 l kolbach do wstrząsania Tunair lub 5 litrowych butelkach z odczynnikami.
  2. Dodać 10-12 ml/l kultury zawiesinowej komórek owadów zakażonych bakulowirusem (SCBIIC).
  3. Inkubować zakażoną kulturę komórek Sf9 na wytrząsarce z prędkością 145 obr./min w niższej temperaturze 25 °C (w celu spowolnienia podziału komórek) przez 72-96 godzin.
  4. Po 72 godzinach od zakażenia sprawdź komórki pod mikroskopem pod kątem SOI i oceń ich żywotność.
  5. Zwykle po około 72 godzinach od infekcji żywotność komórek Sf9 spada do 70%-75% (mierzona za pomocą barwienia błękitem trypanowym). Pobrać zakażone komórki Sf9 do 1 litrowej butelki polipropylenowej przez odwirowanie w temperaturze 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zawiesić osad komórkowy zebrany z 1 l produkcyjnej hodowli komórkowej z 20-25 ml 1x PBS, delikatnie obracając i przenosząc do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  7. Odkręcać zawiesinę komórek o sile 900 x g przez 15 minut i wyrzucić roztwór PBS.
  8. Zawiesić przemyte osady komórkowe w 20-25 ml buforu zawiesiny (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% glicerolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy) i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie; przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczenia.
    UWAGA: Procedury oczyszczania dla PRMT zostały szczegółowo opisane w artykule opublikowanym przez SGC6.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd protokołu BEVS jest opisany w Rysunek 1. W Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) wygenerowano wiele konstruktów ekspresyjnych PRMT, w tym pełnowymiarowe, domeny i obcięte fragmenty, zgodnie z wewnętrznymi strategiami, z próbą zwiększenia wskaźnika sukcesu w identyfikacji rozpuszczalnych i stabilnych białek o stosunkowo wysokim poziomie ekspresji7,9. Zainteresowanych czytelników zachęca się do zapoznania się z definicjami i metodologią SGC dotyczącą projektowania "fragmentu" jako segmentu sekwencji genu włączonego do klonu ekspresji, "domeny" jako domeny strukturalnej z adnotacjami PFAM i "konstruktu" jako fragmentu sklonowanego w wektorze ekspresji, z których wszystkie zostały szczegółowo opisane we wcześniejszej publikacji7. Konstrukty ekspresyjne PRMT przedstawione w tym protokole służą do produkcji białek znakowanych polihistydyną sklonowanych do wektora pFBOH-MHL, który jest pochodną wektora pFastBac1. W Rysunek 4, prezentujemy analizę SDS-PAGE rozpuszczalnych konstruktów PRMT1, 2, 4-9 oznaczonych przez Hisa oczyszczonych z granulek zebranych po 4 ml produkcji w komórkach Sf9 (krok 3.1.4). Pełnowymiarowe (FL) PRMT1 i PRMT9 nie są przedstawione w tym żelu, ponieważ FL PRMT1 został wyprodukowany z E. coli, a FL PRMT9 wyprodukowany z BEVS został oczyszczony przez Flag-tag6. Skrócone konstrukty PRMT1, FL PRMT4 i wszystkie konstrukty PRMT8 wykazują stosunkowo wysoką wydajność, ale eluaty białkowe zawierają frakcje współoczyszczonych zanieczyszczeń. Konstrukty te wymagają dalszej optymalizacji protokołów oczyszczania. W związku z tym konieczne są dodatkowe podejścia w celu poprawy czystości tych białek pochodzących z produkcji na dużą skalę, takie jak zmniejszenie ilości kulek niklu na etapie inkubacji z klarowanym lizatem; wzrost stężeń imidazolu w do mycia; rozszczepienie znacznika His za pomocą proteazy TEV, a następnie nałożenie na żywicę o powinowactwie do Ni; oraz dodatkowe etapy oczyszczania, takie jak wykluczanie według wielkości i chromatografia jonowymienna. Konstrukty PRMT2 wykazują znacznie niższą wydajność w porównaniu z innymi białkami i pełnowymiarowym białkiem PRMT2, któremu towarzyszy silne pasmo zanieczyszczeń. Zwiększenie skali produkcji i dwa etapy oczyszczania, takie jak IMAC i wykluczanie wielkości, potwierdziły niski poziom ekspresji tego konstruktu wraz z utrzymującą się obecnością zanieczyszczenia współoczyszczającego białko FL. Dla kompleksu PRMT5 uzyskano czyste białka, które zostały wyprodukowane i oczyszczone z jego obligatoryjnym partnerem wiążącym, MEP50. Okrojony konstrukt PRMT9 ma prawie dwu- lub trzykrotnie niższy poziom ekspresji, bliski 1,5 mg/l, w porównaniu z innymi PRMT. Niemniej jednak, rekombinowane stada wirusów tego konstruktu zostały wykorzystane do produkcji na dużą skalę, uzyskano kryształy dyfrakcyjne, a struktura została rozwiązana dla tego białka wraz z PRMT4, 6 i 7 (Figura 5).

Dla produkcji zwiększającej skalę, odpowiednie wirusy P2 zostały użyte do zainfekowania hodowli zawiesinowej komórek owadów Sf9. Ten etap generuje 50/100/200 ml komórek zakażonych bakulowirusem zawierających zakażone komórki i wirusy P3 w supernatancie. W celu produkcji białka na dużą skalę, 2 l komórek Sf9 hodowano w każdej z 2,8 l kolb Fernbacha przy 150 obr./min, 27 °C (Ryc. 6). W dniu produkcji 2 l komórek Sf9 (żywotność komórek > 97%) w 2,5 l kolbach do wstrząsów Tunair lub 4 l w 5 litrowych butelkach z odczynnikiem rozcieńczono do gęstości komórek 4 x 106/ml. Komórki te zakażono bezpośrednio 10-12 ml/l hodowli zawiesinowej komórek owadów zakażonych bakulowirusem i inkubowano w obniżonej temperaturze 25 °C, przy 145 obr./min. Zakażenie partii produkcyjnej bezpośrednio hodowlą zawiesinową komórek owadów zakażonych bakulowirusem znacznie ograniczyło pracochłonne i czasochłonne etapy zwiększania objętości wirusa, wykluczając dodatkowe obchodzenie się z zakażonymi komórkami, oraz pozwoliło uniknąć zmniejszenia miana i degradacji wirusa. Utrzymanie hodowli komórkowych SF9 i produkcja na dużą skalę zostały przeprowadzone w naczyniach hodowlanych o dużej objętości napełnienia, aby przyjąć produkcję białka na dużą skalę w jednej partii (Rysunek 6).

Pełnowymiarowe białka PRMT 4, 5 (w kompleksie z MEP50), 6, 7 i 9 wyprodukowane z platformy produkcyjnej za pośrednictwem Baculovirus zostały użyte do charakterystyki kinetycznej i badań przesiewowych związków inhibitorowych w klasie SGC6. Struktury krystaliczne rozpuszczono i zdeponowano w Banku Danych Białkowych (PDB) dla pełnowymiarowych lub skróconych form białek PRMT 4, 6, 7 i 9 za pomocą różnych sond chemicznych i inhibitorów. Plazmidy ekspresyjne dla tych PRMT zostały zdeponowane w repozytorium plazmidów Addgene (Addgene jest partnerem dystrybucyjnym SGC, https://www.addgene.org/) i są dostępne dla społeczności naukowej (Rysunek 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd etapów procesu ekspresji bakulowirusa Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Bakulowirus Zainfekowane i niezainfekowane komórki Sf9. Objawami infekcji są zmiany strukturalne w komórkach owadów, takie jak wzrost średnicy komórki o 25-50%, powiększenie jąder komórkowych, jednolicie zaokrąglony kształt, utrata proliferacji i przyleganie do powierzchni szalki hodowlanej, a także spadek żywotności komórek. Biała skala 200 μm. Przedstawione tutaj objawy infekcji są takie same dla komórek transfekowanych przy użyciu obu odczynników do transfekcji, JetPrime i X-tremeGene 9. Konkretny pokazany przykład dotyczy odczynnika do transfekcji JetPrime. (A) Niezakażone komórki Sf9 jako kontrola. (B) Komórki Sf9 zakażone bakulowirusem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Zespół płytki wiążącej do szybkiego oczyszczania białek ekspresji testowej. Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście, krokach 3.2.1-2 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wyniki badań przesiewowych ekspresji białek. Wyniki badań przesiewowych ekspresji białek w produkcji białek za pośrednictwem bakulowirusa w 4 ml kultury zawiesiny Sf9 zakażonej odpowiednimi rekombinowanymi wirusami P1 dla różnych PRMT i kompleksu PRMT5-MEP50. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Podsumowanie konstrukcji ekspresji dla PRMT4, 6, 7 i 9 używanych do badań struktury krystalicznej w Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Struktury krystaliczne rozpuszczono i zdeponowano w Banku Danych o Białkach (PDB) dla pełnej długości lub skróconych form białek PRMT 4, 6, 7 i 9 za pomocą różnych sond chemicznych i inhibitorów. Plazmidy ekspresyjne dla tych PRMT zostały zdeponowane w repozytorium plazmidów Addgene i są dostępne dla społeczności naukowej (Addgene jest partnerem dystrybucyjnym SGC, https://www.addgene.org/). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Utrzymanie komórek owadów Sf9 i produkcja białka w różnych naczyniach hodowlanych: (A) Kolba Fernbacha o pojemności 2,8 l do utrzymania komórek i produkcji białka. Zastosowanie 72% objętości napełniania zwiększa przepustowość 2,5-krotnie w jednej platformie wytrząsającej. (B) Kolby do wytrząsania Tunair (tylko 9 z 10 kolb jest pokazanych na tym zdjęciu) i butelki z odczynnikami o objętości 80% napełnienia drastycznie zwiększają zdolność produkcyjną platformy wiadukcyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedna z zalet BEVS w komórkach owadów koncentruje się na zdolności maszynerii modyfikacji potranslacyjnej do umożliwienia bardziej złożonych modyfikacji, takich jak fosforylacja, mirystoylacja i glikozylacja. Wraz z wysoce wydajnym fałdowaniem białek ssaków, modyfikacje te ułatwiają uzyskanie dużych ilości zmodyfikowanych i pofałdowanych białek, odpowiednich do fizjologicznie istotnych dalszych eksperymentów16.

W tym miejscu opisaliśmy szczegółowe protokoły BEVS, kładąc nacisk na kluczowe elementy dla skutecznego badania przesiewowego ekspresji wielu konstruktów białek PRMT i produkcji białek PRMT na dużą skalę na platformie ekspresji bakulowirusa: 1) Zastosowanie regularnych, regulowanych i programowalnych pipet wielokanałowych do przenoszenia materiału biologicznego między 24- a 96-dołkowymi płytkami i blokami do hodowli komórkowych na etapach generowania DNA bakimida i wirusa; zbiór rekombinowanych wirusów, amplifikacja objętości rekombinowanych wirusów i przygotowanie bloków przesiewowych ekspresji białek. 2) Wysokowydajne i ekonomiczne odczynniki do transfekcji do wytwarzania rekombinowanych wirusów. 3) Hodowla zawiesinowa komórek owadów zakażonych bakulowirusem (SCBIIC) do produkcji białka na dużą skalę. 4) Wykorzystanie kolb do wstrząsów Fernbach o dużej objętości 2,8 l w celu utrzymania kultury zawiesiny Sf9 oraz kolb do wstrząsania Tunair o pojemności 2,5 l i butelek z odczynnikami o pojemności 5 l do produkcji białka na dużą skalę.

Szczególne względy i uzasadnienie dla etapów transformacji i transfekcji.
Chociaż komercyjny protokół zaleca użycie 100 μl kompetentnych komórek do jednej transformacji14, wydajność transformacji komercyjnych komórek kompetentnych DH10Bac E. coli wynosi aż 1 x 108 jtk/ μg DNA, więc używamy tylko 4 μl. To wystarczy, aby każdy transformant otrzymał izolowane białe rekombinowane kolonie do izolacji bakmidowego DNA. Przylegające komórki Sf9 w 24-dołkowej płytce transfekcyjnej wysiewano z gęstością komórek 2 x 105 / ml w 0,5 ml pożywki dla owadów bez surowicy. Ta objętość wystarczy, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni roboczej studni. Jednocześnie nie rozcieńcza zbytnio mieszanki transfekcyjnej, co zwiększa wydajność transfekcji. Odczynniki do transfekcji są nietoksyczne dla komórek Sf9, a wymiana pożywki nie jest konieczna. Zamiast zmiany pożywki, dodatkowe 1,5 ml pożywki zawierającej 10% (v/v) FBS jest dodawane do płytki transfekcyjnej w ciągu 4-5 godzin po transfekcji, aby ułatwić wzrost komórek. Skuteczność transfekcji obu odczynników do transfekcji jest wysoka. Mimo to, w przypadku X-tremeGene 9, oznaki infekcji w transfekowanych komórkach (Figura 2) pojawiają się 10-12 godzin wcześniej niż w przypadku odczynnika JetPrime, więc wybieramy między tymi odczynnikami w zależności od harmonogramu pracy kolejnych kroków w protokołach, co zapewnia pewną elastyczność w całym procesie.

Badanie przesiewowe ekspresji białka można przeprowadzić z wirusami P2, jeśli ilość początkowych rekombinowanych wirusów, pobranych z płytki transfekcyjnej i oznaczonych jako P1, jest czynnikiem ograniczającym, który można wykorzystać do badania przesiewowego ekspresji białka.

Zagadnienia dotyczące przechodzenia z małych do dużych ilości kultur.
Historycznie uważano, że optymalny wzrost komórek wymaga dużej przestrzeni powietrznej w kulturze zawiesinowej w utrzymaniu komórek Sf9 i zwiększaniu produkcji. Jednak w 2014 r. doniesiono, że duża przestrzeń powietrzna w naczyniach hodowlanych jest mniej krytyczna, niż wcześniej sądzono17. Naczynie hodowlane ustawione przy użyciu odpowiednio dostosowanej prędkości wytrząsania do wyrzutu orbitalnego platformy wytrząsającej zapewni wystarczający transfer tlenu nawet w kulturze zawiesinowej o dużej objętości poprzez tworzenie i utrzymywanie małych pęcherzyków powietrza przez dłuższy czas. Dzięki takiemu podejściu, dostępne na rynku komórki owadów mogą być hodowane z większą prędkością wytrząsania w normalnym zakresie czasu podwajania komórek bez poświęcania wysokiej żywotności komórek.

Tak więc 6 lat temu zaczęliśmy zwiększać objętość kultury zawiesinowej w kolbie do wytrząsania podczas konserwacji komórek i wprowadziliśmy inny typ naczynia hodowlanego do produkcji białek, jednocześnie dostosowując i monitorując warunki wytrząsania (ryc. 6). Aby ustalić optymalne warunki w tych naczyniach hodowlanych, monitorowaliśmy parametry hodowli komórek Sf9, takie jak czas podwajania komórek wraz z żywotnością komórek, rozmiarem i kształtem, stanem agregacji i podatnością na infekcję komórek.

Na przykład, w celu utrzymania komórek Sf9, w kolbach do wytrząsania Fernbacha o pojemności 2,8 l, hodujemy 2 l zamiast 0,8 l komórek zawiesinowych Sf9 wytrząsając z prędkością 150 obr./min w temperaturze 27 °C, a żywotność komórek w większości przypadków jest bliska 99%, z równomiernie ukształtowanymi zdrowymi dzielącymi się komórkami. W celu zwiększenia skali produkcji infekujemy 4 l komórek w 5-litrowych butelkach z odczynnikami, wstrząsając z dużą prędkością do 145 obr./min w obniżonej temperaturze 25 °C. Najczęściej używane inkubatory z wbudowaną platformą wytrząsającą mogą pomieścić 6 x 2,8 l kolby do wytrząsania lub 6 x 5 l butelki z odczynnikiem lub 10 x 2,5 l kolby do wytrząsania Tunair. Tak więc pojemność jednej platformy wytrząsającej, jeśli napełnimy kolby i butelki z odczynnikami Fernbacha do 1/3 w porównaniu z dużą objętością napełnienia naczyń wynosi 4,8 l w porównaniu z 12 litrami przy użyciu 2,8 l kolb Fernbacha i 10 l w porównaniu z 24 litrami przy użyciu 5 litrowych butelek z odczynnikami (rysunek 6). Utrzymanie hodowli w komórkach zawiesinowych i zwiększenie skali produkcji w naczyniach hodowlanych o dużej objętości napełnienia pomogły nam przezwyciężyć ograniczenia wielkości produkcji i przyjąć platformę na dużą skalę. W związku z tym jest to bardzo przydatne dla laboratoriów, które nie mają dostępu do bioreaktorów i/lub mają ograniczoną przestrzeń w rurociągach produkcyjnych.

Protokół ten można łatwo dostosować do produkcji i oczyszczania konstruktów białkowych o różnych znacznikach powinowactwa poprzez wykorzystanie odpowiednich żywic i modyfikację oczyszczających, jak opisano w artykule opublikowanym przez SGC6 dla białek o pełnej długości znakowanych flagą PRMT4, 7, 9 oraz kompleksu PRMT5-MEP50 znakowanego Hisem i PRMT6. Chociaż opisujemy protokół BEVS dla rodziny białek PRMT, to samo podejście można zastosować do każdej innej rodziny białek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Dalii Barsyte-Lovejoy za poświęcenie czasu na dostarczenie cennych informacji zwrotnych i krytycznych komentarzy na temat manuskryptu oraz wszystkim naszym kolegom z SGC, którzy pracowali nad rodziną białek PRMT wyrażonych przez System Wektorów Ekspresyjnych Bakulowirusa.

SGC jest zarejestrowaną organizacją charytatywną (numer 1097737), która otrzymuje fundusze od AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada za pośrednictwem Ontario Genomics Institute [OGI-196], UE i EFPIA poprzez Wspólne Przedsięwzięcie Inicjatywy Leków Innowacyjnych 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (aka EMD w Kanadzie i USA), Pfizer, Takeda i Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2.8L Nalgene  Kolba hodowlana Fernbach, poliwęglan,Nalgene29171-854Do konserwacji na dużą skalę kultury zawiesinowej komórek Sf9
24-dołkowe bloki RBQiagen19583Do inkubacji  4ml zawiesiny  Ogniwa Sf9  dla białka  badanie przesiewowe ekspresji
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ulBiorad5671095Do analizy SDS-PAGe oczyszczonych białek
50ml Zbiornik odczynnikaCelltreat Scientific Products229290  Zbiornik używany do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji  i zawiesina komórek Sf9
96-dołkowa mata nasadkowa, do stosowania z studzienką kwadratową, 2 mlGreiner Bio-One381080Służy do pokrycia 96-dołkowej płytki
PCR blokowej 96-dołkowejEppendorf30129300
Agar BactoBD214010Do palet selekcyjnych LB-agar
Arkusze taśmy Airpore Qiagen19571Do pokrycia 24 bloków dołków do badania przesiewowego
ekspresji białekWirówka Allega X-15RBeckman Coulter392932
antybiotykowy antybiotyk przeciwgrzybiczy (100x)Gibco15240112
Bacmid DNAwewnętrznapozycja poza katalogiemBacmid DNA do produkcji bakulowirusa
Bluo-Gal, 1gThermo Fisher15519028
Beckman JLA 8.1000
Płytki do hodowli komórkowych, 24-dołkowe, z pokrywka, płaskie dno, sterylneEppendorf30722116Tissue  płytka poddana hodowli
Roztwór do ponownego zawieszania komórek 0,5  LMillipore SigmaLSKCRS500do ekstrakcji DNA Bacmid
Komórka  Roztwór do lizy 0,5  LMillipore SigmaLSKCLS500do ekstrakcji DNA Bacmid
CELLSTAR  Płytki do hodowli tkankowych, 96-dołkoweGreiner Bio-One655180Do mieszanki transfekcyjnej
ClipTip 1250, ponowne ładowanie filtra, sterylneThermoFisher Scientific94420818Końcówki do  programowalnych i regulowanych pipet wielokanałowych
dNTP Mix (25 mM każda)Thermo Fisher ScientificR1121
E1-ClipTip  Elektronicznie regulowana rozstaw końcówek Wielokanałowa pipeta korektora, 15 do 1250 μ LThermoFisher Scientific4672090BTProgramowalna i regulowana pipeta wielokanałowa
E4  Pipeta 6-kanałowa XLS o regulowanym rozstawie kół, 20-300 μ LRaninLTS EA6-300XLSRegulowana pipeta wielokanałowa Ranin
Mikropłytka filtracyjna, 96-dołkowa, polipropylenowa, z 25 &mikro; m membrana polietylenowa o ultra wysokiej masie cząsteczkowejAgilent201005-100Do oczyszczania białek w badaniach przesiewowych ekspresji
Zestaw kolb z pełną przegrodą Tunair, 2.5LIBI ScientificSS-6003CDo produkcji białek na dużą skalę w hodowli zawiesinowej komórek SF9
Gentamycyna 10x10mlBioShop15750078
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaBiocenter080-450
I-Max Pożywka dla owadów z L-glutaminą, 1 lBisent Biocenter301-045-LLPożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy
InstantBlue, Ultrafast Protein StainExpedeon Protein SolutionsISB1L-1LDo barwienia żelu białkowego (SDS-PAGE)
Iptg, Ultra Pure, Bez dioksanu, Min 99.5%BioShopIPT001.100
Odczynnik do transfekcji JetPRIME  Dostarczane z  jetPRIME bufferPOLYPLUS TRANSFECTION Inc114-01Do transfekcji komórek Sf9 w celu wytworzenia
monosiarczanu kanamycynyBioShopKAN201.100
Lb Rosół (Lennox), proszek mikrobiologiczny Gro&SigmaL3022-1KG
Masterblock 96 studnia głębinowa 2,4 mlGreiner Bio-One780285-FDStosowany w procedurach przesiewowych transformacji i ekspresji
Maksymalna wydajność Kompetentne komórki DH10Bac, 0,5 mlThermo Fisher10361012Kompetentne komórki do generowania bakcydowego DNA
Pipeta 12-kanałowa mLINE, regulowana 30 - 300 uLSartoriusSartorius 72524012-kanałowa
Roztwór do neutralizacji pipet, 0,5  LMillipore SigmaLSKNS0500Do ekstrakcji DNA bakimidów
Nowy Brunszwik  Innova 44R, 120V, orbita 2,5 cm (1 in)EppendorfM1282-0004Inkubator z wytrząsarką do inkubacji zawiesiny komórek Sf9
Ni-NTA AgarozaQiagen30250Do oczyszczania białek
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)GibcoLS15140122
PYREX  Delong Shaker Kolba Erlenmeyera z przegrodami, Corning  500mlPyrex4444-500Do  hodowli zawiesinowej komórek Sf9
PYREX Delong Shaker Kolba Erlenmeyera z przegrodami, Corning  125mlPyrex4444-125Do hodowli zawiesinowej komórek Sf9
PYREX Delong Shaker Kolba Erlenmeyera z przegrodami, Corning  250mlPyrex4444-250Do hodowli zawiesinowej komórek
Sf9Czerwony  Nukleinowy  Kwas  Barwienie  RoztwórFroggabio21141
RNaza A, 0,9  mLMillipore SigmaLSKPMRN30Do buforu zawiesinowego do ekstrakcji DNA bakimidów
Roll & Kuliste szklane koraliki do uprawyMP Biomedicals115000550dla  rozprzestrzeniania komórek bakteryjnych na powierzchni płytki agarowej.
RT-LTS-A-300μ L-768/8 (końcówki)Ranin30389253Końcówki do pipety wielokanałowej ranin
S.O.C. MediumThermo Fisher Scientific15544034
surowica, hodowla komórkowa, płodowa surowica bydlęca (fbs), hyklon, scharakteryzowany kanadyjskicytivalifesciencesSH3039602Oprócz surowicy wolny medim dla  transfekowanych komórek
Komórki Sf9Thermo Fisher12659017Owad komórki
Sfx-Insect Cell Culture MediaCytiva (dawniej GE Healthcare Life Sciences)SH3027802Pożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy
Podkładka taśmowaQiagen19570Podkładka taśmowa
Polimeraza DNA Taq z buforem ThermoPol - 2,000 jednostekNew England BiolabsM0267L
Tetracyklina HclBioShopTET701.10
Błękit trypanowy 0,4% RozwiązanieGibco15250061dla  ocena żywotności komórek
VITLAB  Butelki z odczynnikami, PP z nakrętkami, PP, BrandTech, 5LVITLABV100889Do produkcji białek na dużą skalę w hodowli zawiesinowej komórek Sf9
VWR  Cyfrowy mini inkubatorVWR10055-006Inkubator do przylegających komórek Sf9
VWR  Wytrząsarka do mikropłytek inkubacyjnychVWR97043-606Inkubator do hodowli zawiesinowej komórek Sf9 w blokach 24-dołkowych
VWR Szalki Petriego VWRCA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Odczynnik do transfekcji  1,0 MRoche6365787001do transfekcji komórek Sf9 w celu wytworzenia rekombinowanego bakulowirusa
bakulowirusa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  2. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  3. Lorton, B. M., Shechter, D. Cellular consequences of arginine methylation. Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).
  4. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
  5. Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
  6. Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
  7. Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
  8. Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5, 135(2008).
  10. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
  11. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  12. Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
  13. Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
  14. Invitrogen Life Technologies. Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , Invitrogen Life Technologies. Carlsbad. (2010).
  15. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
  16. Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
  17. Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PRMT ProteinsBaculovirus ExpressionRecombinant Protein ProductionSf9 Insect CellsProtein Expression ScreeningBacmid DNASuspension CultureMultichannel PipetteLarge Scale Protein ProductionProtein Arginine Methyltransferases

Powiązane artykuły