Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62515

⸱

28 lipca 2021

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Streszczenie

Płytki krwi są wytwarzane przez megakariocyty, wyspecjalizowane komórki znajdujące się w szpiku kostnym. Możliwość obrazowania megakariocytów w czasie rzeczywistym i ich rodzimego środowiska została opisana ponad 10 lat temu i rzuca nowe światło na proces powstawania płytek krwi. Megakariocyty rozciągają wydłużone wypukłości, zwane płytkami krwi, przez śródbłonek wyściółki naczyń sinusoidalnych. W pracy przedstawiono protokół jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym znakowanych fluorescencyjnie megakariocytów w czaszce, szpiku kostnym i naczyniach sinusoidalnych. Technika ta opiera się na drobnej operacji, która utrzymuje czaszkę w stanie nienaruszonym, aby ograniczyć reakcje zapalne. Głowa myszy jest unieruchomiona za pomocą pierścienia przyklejonego do czaszki, aby zapobiec ruchom podczas oddychania.

Korzystając z mikroskopii dwufotonowej, megakariocyty mogą być wizualizowane przez okres do kilku godzin, umożliwiając obserwację wypukłości komórek i propłytek w procesie wydłużania wewnątrz naczyń sinusoidalnych. Pozwala to na ilościowe określenie kilku parametrów związanych z morfologią występów (szerokość, długość, obecność obszarów zwężenia) i ich zachowaniem wydłużeniowym (prędkość, regularność lub obecność przerw lub faz retrakcji). Technika ta pozwala również na jednoczesną rejestrację krążących płytek krwi w naczyniach sinusoidalnych w celu określenia prędkości płytek krwi i kierunku przepływu krwi. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania roli genów będących przedmiotem zainteresowania w tworzeniu płytek krwi u genetycznie zmodyfikowanych myszy, a także podlega testom farmakologicznym (badanie mechanizmów, ocena leków w leczeniu zaburzeń produkcji płytek krwi). Stała się nieocenionym narzędziem, zwłaszcza uzupełniającym badania in vitro, ponieważ obecnie wiadomo, że tworzenie propłytek krwi in vivo i in vitro opiera się na różnych mechanizmach. Wykazano na przykład, że mikrotubule in vitro są niezbędne do wydłużenia propłytek jako takich. Jednak in vivo służą raczej jako rusztowanie, a wydłużenie jest głównie wspomagane przez siły przepływu krwi.

Wprowadzenie

Płytki krwi są wytwarzane przez wyspecjalizowane komórki megakariocytów znajdujące się w szpiku kostnym. Dokładny sposób, w jaki megakariocyty uwalniają płytki krwi w krążeniu, długo pozostawał niejasny ze względu na wyzwanie techniczne związane z obserwacją zdarzeń w czasie rzeczywistym przez kość. Mikroskopia dwufotonowa pomogła przezwyciężyć to wyzwanie i doprowadziła do znacznych postępów w zrozumieniu procesu powstawania płytek krwi. Pierwsze obserwacje megakariocytów in vivo zostały przeprowadzone przez von Andriana i współpracowników w 2007 roku, z wizualizacją fluorescencyjnych megakariocytów przez skull1. Było to możliwe, ponieważ warstwa kostna w czaszce czołowo-ciemieniowej młodych dorosłych myszy ma grubość kilkudziesięciu mikronów i jest wystarczająco przezroczysta, aby umożliwić wizualizację komórek fluorescencyjnych w leżącym poniżej szpiku kostnym2.

Kolejne badania stosowały tę procedurę do oceny powstawania propłytek krwi w różnych warunkach i do rozszyfrowania mechanizmów leżących u ich podstaw3,4,5,6. Badania te dostarczyły ostatecznych dowodów na to, że megakariocyty dynamicznie wydłużają wypukłości, zwane propłytkami, przez barierę śródbłonkową naczyń sinusoidalnych (Ryc. 1). Te propłytki są następnie uwalniane jako długie fragmenty, które reprezentują objętość kilkuset płytek krwi. Płytki krwi powstaną po przebudowie płytek krwi w mikrokrążeniu narządów znajdujących się w dalszej części narządu, zwłaszcza w płucach7. Do tej pory jednak dokładny proces i mechanizmy molekularne pozostają przedmiotem dyskusji. Na przykład proponowana rola białek cytoszkieletu w wydłużaniu propłytek krwi różni się w warunkach in vitro i in vivo3, a różnice w tworzeniu propłytek krwi wykazano w stanach zapalnych6. Sprawę dodatkowo komplikuje niedawne badanie, w którym zakwestionowano koncepcję propłytek krwi i zaproponowano, że in vivo płytki krwi są zasadniczo tworzone przez mechanizm pączkowania błony na poziomie megakariocytów8.

Ten artykuł przedstawia protokół obserwacji megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym z kości czaszki u żywych myszy, przy użyciu minimalnie inwazyjnej procedury. Podobne podejścia zostały wcześniej opisane w celu wizualizacji innych komórek szpiku, w szczególności hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych9. Nacisk kładziony jest tutaj na obserwację megakariocytów i płytek krwi w celu wyszczególnienia niektórych parametrów, które można zmierzyć, w szczególności morfologii propłytek i prędkości płytek krwi. Protokół ten przedstawia, jak wprowadzić cewnik do żyły szyjnej w celu wstrzyknięcia fluorescencyjnych znaczników i leków oraz obserwacji przez kość czaszki. Kość kości nazębnej jest odsłaniana za pomocą drobnej operacji, tak aby pierścień był przyklejony do kości. Pierścień ten służy do unieruchamiania głowy i zapobiegania ruchom spowodowanym oddychaniem oraz tworzy kubek wypełniony solą fizjologiczną jako medium zanurzeniowe soczewki. Technika ta doskonale nadaje się do: i) obserwacji w czasie rzeczywistym geometrii sinusoidy i megakariocytów oddziałujących ze ścianą naczynia; ii) śledzić megakariocyty w procesie tworzenia, wydłużania i uwalniania propłytków; oraz iii) mierzyć ruchy płytek krwi w celu monitorowania złożonego sinusoidalnego przepływu krwi. Dane uzyskane przy użyciu tego protokołu zostały niedawno opublikowane3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi standardami 2010/63/UE oraz Komisją CREMEAS ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Strasburgu (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, umowa na zwierzętach n°: G67-482-10, umowa projektowa n°: 2018061211274514).

1. Przygotowanie myszy i wprowadzenie cewnika do żyły szyjnej

UWAGA: Tutaj użyto samców lub samic, 5-7-tygodniowych myszy reporterowych mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) skrzyżowanych z myszami Pf4-cre11, co pozwoliło na intensywne znakowanie zieloną fluorescencją w megakariocytach i płytkach krwi12. Przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej komorę grzewczą mikroskopu przez kilka godzin.

  1. Przenieś mysz do sali obrazowania i przystąp do znieczulenia.
    1. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie roztworu ketaminy (ketamina (100 μg/g) i ksylazyna (10 μg/g) (5 μl/g).
      UWAGA: Wielokrotne podawanie ketaminy/ksylazyny jest tutaj stosowane i działa dobrze, ale wymaga przerwania nagrywania w celu regularnego ponownego wstrzyknięcia. Alternatywnie, jeśli dostępny jest aparat do znieczulenia, indukcja znieczulenia może być przeprowadzona za pomocą ketaminy/ksylazyny, a następnie utrzymywana we wdychaniu gazów (mieszanina izofluranu, powietrza i tlenu).
    2. Umieść zwierzę w klatce, aż osiągnie głębokie znieczulenie. Umieść mysz na rozgrzanej płycie rozgrzanej w temperaturze 37 °C do wszystkich kolejnych manipulacji.
      UWAGA: Podczas gdy zwierzę osiąga głębokie znieczulenie, należy włączyć mikroskop i cały sprzęt (patrz punkt 4.1) i ustawić różne parametry potrzebne (patrz punkt 4.2), aby rozpocząć eksperyment po zakończeniu operacji. W tym przypadku zabieg trwa tylko 3 godziny i jest terminalny. Mysz jest poddawana eutanazji po eksperymencie bez budzenia się. W związku z tym wystarczająca jest dezynfekcja skóry i narzędzi etanolem. Jednak w zależności od wytycznych instytucjonalnych lub jeśli procedura będzie trwała dłużej, należy zastosować bardziej kompleksowe metody dezynfekcji, takie jak trzy naprzemienne peelingi z betadyną/powidonem i alkoholem.
  2. Zainstaluj cewnik w żyle szyjnej.
    UWAGA: Ważne jest, aby w miarę możliwości unikać zanieczyszczenia mikrobiologicznego podczas zabiegu. Należy pamiętać, aby dokładnie zdezynfekować skórę 70% etanolem (EtOH) przed przystąpieniem do zabiegu. Zawsze używaj wysterylizowanych nożyczek i pęsety i regularnie płucz je w 70% EtOH. Pracuj w czystym miejscu i noś maseczkę na twarz. Cewnik "nabiegunowy" o sile 22 g, składający się z igły umieszczonej w plastikowej rurce, służy do wstrzykiwań dożylnych (patrz Tabela materiałów).
    1. Połóż mysz na plecach i przymocuj przednie nogi taśmą chirurgiczną, aby rozciągnąć gardło (Rysunek 2A). Zdezynfekuj gardło 70% etanolem.
      UWAGA: Dla wygody gardło można ogolić przed operacją. Jeśli zabieg trwa dłużej, należy wykonać staranne golenie, aby zapewnić prawidłową technikę aseptyczną.
    2. Wykonaj 0,7-1 cm nacięcie nad prawą lub lewą żyłą szyjną za pomocą sterylnych nożyczek. Rozciągnij sąsiednią tkankę łączną, aby odsłonić zewnętrzną żyłę szyjną i górną część mięśnia piersiowego (Rysunek 2A).
    3. Napełnij cewnik ciepłą, sterylną solą fizjologiczną. Wprowadzić cewnik do żyły po przeniknięciu przez mięsień piersiowy (Rysunek 2B).
      UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz cewnika. Ważne jest, aby wprowadzić cewnik przez mięsień, aby zapobiec krwotokowi, ponieważ mięsień utworzy punkt kompresji. Nawet myszy z wadami hemostazy, takie jak myszy Itgb3-/-, nie krwawią po wprowadzeniu cewnika przy tym podejściu.
    4. Delikatnie wyjmij igłę i, jeśli to konieczne, ostrożnie wsuń cewnik głębiej do żyły. Podłączyć strzykawkę i ustabilizować cewnik, dodając kroplę kleju chirurgicznego (tabela materiałów).
      UWAGA: Możliwe jest wprowadzenie cewnika do żyły ogonowej, chociaż wymaga to pewnej wprawy, ponieważ żyła ma mniejszy kaliber. Jest to szczególnie trudne w przypadku myszy o ciemnych włosach, których żyła ogonowa jest ledwo widoczna. Ze względu na większy kaliber, umieszczenie cewnika wewnątrz żyły szyjnej może pozwolić na bardziej niezawodne wstrzykiwanie większych objętości lub powtarzanych zabiegów. Należy pamiętać, że strzykawka jest napełniana za pierwszym razem ciepłym solem fizjologicznym i nie należy zapominać o wstrzyknięciu martwej objętości przed wstrzyknięciem roztworu leku.
    5. Ostrożnie przywróć mysz do pozycji leżącej (Rysunek 2C). Nałóż żel (tabela materiałów) na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.

2. Chirurgia i instalacja pierścienia czaszkowego

UWAGA: Pełne wsparcie dla instalacji myszy składa się z 4 elementów, bloku i płytki, pierścienia do przytrzymania głowicy myszy oraz do przymocowania pierścienia do bloku (Rysunek 3A). Wszystkie elementy podpory zostały pozyskane z i.materialise.com metodą druku 3D. Płyta wykonana jest z polimeru akrylonitryl-butadien-styren (ABS), blok i śruba ze stali nierdzewnej, a pierścień z wysokogatunkowej stali nierdzewnej (wysokoszczegółowej stali nierdzewnej) (patrz rysunek uzupełniający S1 dla wymiarów i materiałów uzupełniających dla plików do druku 3D). Blok mocowany jest na stałe do wspornika, przykręcany lub klejony. Po zamocowaniu pierścienia na czaszce myszy należy go przykręcić do uchwytu bloku (Rysunek 3A).

  1. Zwilż włosy na skórze głowy ręcznikiem papierowym zwilżonym 70% etanolem do dezynfekcji. Usuń wszystkie luźne włosy mokrym ręcznikiem papierowym.
    UWAGA: Dla wygody skóra głowy może zostać ogolona przed zabiegiem.
  2. Naciąć skórę głowy, formując literę T w linii środkowej do 1 cm i między uszami, aby odsłonić kalwarię, używając sterylnych cienkich nożyczek i pęsety.
    UWAGA: Pierścień zostanie umieszczony tak, aby zachodził na kość czołową i ciemieniową (Rysunek 3B).
  3. Użyj sterylnej pęsety, aby odsłonić czaszkę. Ostrożnie usuń okostną nożyczkami i pęsetą. Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby usunąć całą okostną i wszelkie zanieczyszczenia lub włosy, które mogą zmienić obrazowanie.
    UWAGA: Aby ograniczyć reakcje zapalne, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić kości.
  4. Usuń wszelkie ślady krwi, spłukując solą fizjologiczną i szybko osusz kość suchym bawełnianym wacikiem. Nałóż klej w żelu na pierścień, umieść go na odsłoniętej kości i utrzymuj przez kilka sekund, aby pierścień był mocno przymocowany do czaszki.
    UWAGA: Klej nie może dostać się do pola obserwacji, ponieważ może to prowadzić do niepożądanej autofluorescencji.
  5. Lekko zwilż czaszkę bawełnianym wacikiem zanurzonym w soli fizjologicznej.
  6. Przygotuj silikonową pastę dentystyczną, dokładnie mieszając niebieskie i żółte składniki w stosunku 1:1. Nałóż pastę dentystyczną na całym pierścieniu, aby uszczelnić, aby zapobiec wyciekom podczas obrazowania. Ostrożnie usuń pastę dentystyczną lub klej, które mogły dostać się do pierścienia.
  7. Napełnij pierścień solą fizjologiczną i sprawdź, czy nie ma wycieków.
    UWAGA: Sól fizjologiczna służy jako medium zanurzeniowe dla obiektywu mikroskopu. Krwawienie może być bardziej krytyczne w przypadku myszy z wadami związanymi z hemostazą. Istotne jest, aby zapobiec przedostawaniu się krwi do pierścienia, ponieważ może to spowodować rozmycie dalszego obrazowania.
  8. Umieść mysz na wsporniku i przykręć pierścień do uchwytu bloku (Rysunek 3C). Pod głową zwierzęcia należy umieścić złożone kompresy, aby podnieść głowę i zapobiec oderwaniu się pierścienia od czaszki.
    UWAGA: Głowica jest bezpośrednio zamocowana, dzięki czemu zapobiega ruchom obrazu spowodowanym oddychaniem.
  9. Umieść wspornik i zespół myszy w podgrzewanej komorze mikroskopu (Rysunek 3D).
    UWAGA: Należy uważać, aby w żadnym momencie nie usunąć wprowadzonego cewnika.

3. Obserwacja znieczulonych myszy do końca eksperymentu

UWAGA: Znieczulenie jest ponownie wywoływane co 35 minut poprzez naprzemienne podskórne (s.c.) wstrzyknięcia ketaminy (25 μg/g) w objętości 5 μL/g masy ciała oraz mieszaniny ketaminy (50 μg/g) i ksylazyny (5 μg/g) (1,2 μL/g). Ponieważ nie jest możliwe otwarcie podgrzewanej komory mikroskopu podczas akwizycji, Monitorowanie znieczulenia wykonuje się przed i po ponownym podaniu środka znieczulającego poprzez uszczypnięcie palca u nogi. Podobnie szczypanie palców u nóg jest wykonywane przed rozpoczęciem każdego nowego nagrania wideo.

  1. W razie potrzeby należy przerwać pobieranie i ponownie wprowadzić znieczulenie przez wstrzyknięcie domięśniowe.
    1. Uważając, aby nie poruszać głową myszy, ściśnij skórę pleców między kciukiem a palcem wskazującym lewej ręki. Podskórnie wstrzyknąć środek znieczulający w fałd skóry pleców prawą ręką (lub odwrotnie w przypadku osób leworęcznych).
  2. Sprawdź, czy w pierścieniu nie ma soli fizjologicznej i, jeśli to konieczne, napełnij świeżą solą fizjologiczną. Kontynuuj nagrywanie przez następne 35 minut i postępuj podobnie przez czas trwania nagrywania.
  3. Pod koniec eksperymentu poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, zanim się obudzi.
    UWAGA: Mysz jest znieczulana przez maksymalny czas 3 godzin, w porozumieniu z lokalną komisją ds. etyki i dobrostanu zwierząt.

4. Obrazowanie dwufotonowe

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat mikroskopu i związanego z nim sprzętu. Obrazy rejestrowano za pomocą skanera rezonansowego (12 lub 8 kHz). Tryb dwukierunkowy został skonfigurowany w celu zwiększenia szybkości akwizycji, ponieważ piksele są rejestrowane w obu kierunkach; W związku z tym wszelkie niezgodności w fazie muszą być korygowane za pomocą panelu sterowania "Korekcja fazy". Na koniec ustalono dostosowane uśrednianie jako kompromis między szybkością akwizycji a stosunkiem sygnału do szumu.

  1. Włącz mikroskop dwufotonowy, w tym skaner laserowy i rezonansowy (moc wyjściowa lasera zwykle ~1,8-2,5 W w zależności od lasera).
  2. Ustaw odpowiednią długość fali lasera dla wybranych fluoroforów. Ustaw odpowiednią długość fali do odzyskiwania emitowanych świateł.
    UWAGA: W tym przypadku do jednoczesnego wzbudzenia i wykrycia AlexaFluor-488 i Qtracker-655 zastosowano detektory hybrydowe o długości fali 913 nm i detektory hybrydowe (500-550 nm i 575-625 nm).
  3. Za pomocą cewnika doszyjkowego wstrzyknij znacznik fluorescencyjny, aby oznaczyć naczynia krwionośne (Qtracker-655; Tabela materiałów). Wstrzyknąć 50 μl/mysz roztworu o stężeniu 0,2 μM, odnawiać raz na godzinę, aby uzyskać maksymalnie 150 μl/eksperyment.
    UWAGA: Można stosować inne znaczniki, takie jak dekstran o dużej masie cząsteczkowej1. W takim przypadku należy wziąć pod uwagę, że lepkość krwi może być zmieniona przez dekstran i zmodyfikować niektóre parametry hemoreologiczne.
  4. Umieść stolik mikroskopu z podporą i myszą pod obiektywem mikroskopu. Sprawdź, czy pierścień jest zawsze wypełniony solą fizjologiczną i zanurz obiektyw. Użyj epifluorescencji, aby zlokalizować naczynia szpiku kostnego (kolor czerwony) i obecność megakariocytów (zielony) ustawionych wzdłuż naczyń sinusoidalnych.
    UWAGA: Kość czaszki ma grubość mniejszą niż 100μm2. Szpik znajduje się pod kością i jest łatwo rozpoznawalny przez fluorescencyjne zielone megakariocyty i gęste, czerwone, zespolone naczynia sinusoidalne oznaczone przez Qtracker-655.
  5. Długie akwizycje (megakariocyty, propłytki)
    1. Wyszukaj interesujący Cię region. Zastosuj parametry akwizycji obrazu, jak wspomniano powyżej.
    2. W przypadku długich akwizycji (np. wizualizacji tworzenia się lub wydłużania propłytek) należy uzyskać obrazy stosu z optymalnymi odstępami czasu (zwykle od 0,85 do 1,34 μm) za pomocą skanera rezonansowego 8 kHz.
      UWAGA: Skaner rezonansowy 12 kHz może zwiększyć szybkość akwizycji.
    3. Uzyskaj obrazy o rozdzielczości 384 x 384 pikseli, aby zwizualizować całe megakariocyty i naczynia. W razie potrzeby należy korzystać z uśredniania linii, aby uzyskać szybką akwizycję z dobrą rozdzielczością. Określ przedział czasowy akwizycji stosu obrazów, zwykle 10 s lub 30 s w przypadku wizualizacji propłytkowej.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano uśrednianie linii wynoszące 8, aby uzyskać wyższy stosunek sygnału do szumu, co pozwoliło na uzyskanie 1 obrazu/10 s za pomocą skanera rezonansowego 8 kHz. Upewnij się, że uśrednianie linii podczas akwizycji na żywo jest dozwolone.
  6. Krótka i szybka akwizycja (płytki krwi)
    UWAGA: W celu krótszej akwizycji gwałtownych zdarzeń, takich jak prędkość płytek krwi, konieczne jest zmaksymalizowanie szybkości akwizycji klatek. Wybór odpowiedniego typu akwizycji zoptymalizuje szybkość akwizycji klatek (tj. typ akwizycji czasoprzestrzennej "xyt").
    1. Zminimalizuj (np. 256 x 90 pikseli) i dostosuj rozmiar obrazu do naczynia, obracając pole obrazowania, jeśli jest to wymagane.
    2. Użyj najwyższej dostępnej szybkości skanowania.
    3. Użyj skanowania dwukierunkowego.
      UWAGA: W przypadku skanowania dwukierunkowego upewnij się, że faza jest dobrze wyregulowana.
    4. Zminimalizuj uśrednianie linii, aby znaleźć optymalny kompromis między rozdzielczością obrazu a szybkością akwizycji.
      UWAGA: W przypadku pomiarów prędkości płytek krwi obraz z pikselami może być wystarczający, jeśli pomaga zwiększyć szybkość akwizycji.
    5. Zminimalizuj z-stack, aby zwiększyć szybkość akwizycji. Uzyskanie tylko 1 z-stack jest wystarczające do ilościowego określenia prędkości płytek krwi. Pobieraj przez 10-20 s, aby zmierzyć prędkość płytek krwi.
      UWAGA: W tych warunkach można uzyskać maksymalnie 133 klatki/s za pomocą skanera rezonansowego 12 kHz. Parametry muszą być dostosowane do warunków. W niektórych naczyniach prędkość płytek krwi jest jednak zbyt wysoka, aby można było wiarygodnie określić ilościowo prędkość płytek krwi przy tych ustawieniach.
  7. Pomiar szerokości i długości propłytek krwi
    UWAGA: Aby załadować pliki LIF uzyskane w oprogramowaniu Leica za pomocą ImageJ, najpierw pobierz i zainstaluj wtyczkę LOCI na ImageJ, aby korzystać z importera Bio-Formats.
    1. Szerokość propłytek
      1. Otwórz film za pomocą ImageJ. Do wykonania pomiaru szerokości należy używać tylko filmu z płytkami krwi bez naczynia. Aby oddzielić różne kanały, kliknij Obraz|Pokoloruj i wybierz opcję Podziel kanały.
      2. W przypadku filmu ze stosem z uśrednioną projekcją z dla każdego punktu czasowego, klikając Obraz|Stosy i wybierz opcję Z Project. W polu Typ projekcji wprowadź średnią intensywność.
      3. Traktuj obraz, aby usunąć szum. Odejmij tło, klikając Proces|Odejmij tło i zastosuj promień toczącej się kuli: 50,0 pikseli.Wygładź obraz, klikając Przetwarzaj i Wygładzaj.
      4. Narysuj linię w pobliżu podstawy propłytki (w pobliżu megakariocytów, unikając innych obiektów).
        UWAGA: Nie zapomnij ustawić skali obrazu, aby uzyskać wartość w żądanej jednostce, klikając Analizuj i ustaw skalę. Domyślnie jednostką obrazu są piksele.
      5. Wykreśl profil intensywności, dopasuj krzywą Gaussa i oblicz pełną szerokość przy połowie maksimum (FWHM). W tym celu napisz następujący skrypt w makrze, klikając Wtyczki|Nowy i wybierz Makro i uruchom je, klikając Makro |Uruchom makro: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.długość); Fit.doFit("Gaussowski";x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; print(FWHM).
        UWAGA: Upewnij się, że w skanie linii znajduje się tylko jeden pik, odpowiadający intensywności propłytkowości.
      6. Wykonaj czynności opisane w kroku 4.7.5 na 1 plasterku lub powtarzaj w czasie, aby uzyskać średnią szerokość propłytki
    2. Długość propłytek
      1. Narysuj linię wzdłuż propłytki, od podstawy w pobliżu megakariocytów do góry. Użyj linii segmentowej, aby podążać za kształtem propłytki. Powtórz to dla każdego punktu czasowego.
      2. Pamiętaj, aby zapisać każdą linię za pomocą Menedżera ROI: kliknij Analizuj | Narzędzia i wybierz Menedżer ROI. Kliknij Dodaj w oknie Menedżer ROI, aby dodać każdy wiersz do menedżera w takiej postaci, w jakiej jest wybrany. Aby zapisać wszystkie wiersze w folderze, kliknij w Menedżerze ROI na Odznacz | Więcej i kliknij Zapisz. Z Menedżera zwrotu z inwestycji wyodrębnij wartość długości każdej linii (miary) z tabeli wyników.
        UWAGA: Nie zapomnij ustawić skali obrazu, aby uzyskać wartość w żądanych jednostkach, klikając Analizuj i ustaw skalę. Domyślnie jednostką obrazu są piksele.
  8. Pomiar prędkości płytek krwi
    UWAGA: Prędkość płytek krwi oblicza się na podstawie nagrania wideo fluorescencyjnych płytek krwi przepływających do naczynia przez 10-20 s. Zabieg pierwszego obrazu jest wykonywany w celu uzyskania cyklicznie powtarzanych danych ze skanowania liniowego. Ruch prowadzi do powstawania smug, których kąt zależy od prędkości, co pozwala na jej obliczenie. W tym przypadku prędkość została obliczona za pomocą metody wykorzystującej transformację Radona, która jest bardziej niezawodna niż klasyczna metoda dekompozycji wartości osobliwych (SVD)15.
    1. Obróbka obrazu za pomocą ImageJ
      1. Otwórz film za pomocą ImageJ. Zastosuj filtr Rozmycie gaussowskie, klikając Proces | Filtry, wybierz Rozmycie gaussowskie i zastosuj Sigma (promień): 2.00. Wybierz mały obszar, aby zmierzyć przepływ, i narysuj 3 sąsiednie linie zgodnie z kierunkiem przepływu.
        UWAGA: Nie zapomnij zapisać każdej linii za pomocą Menedżera ROI, klikając Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Kliknij Dodaj w oknie Menedżera ROI, aby dodać każdą linię i zapisać je; kliknij najpierw Odznacz | Więcej, a następnie kliknij Zapisz.
      2. Korzystając z oprogramowania do skanowania linii ImageJ, zbuduj kimograf dla każdej linii, klikając Obraz | Stosy; wybierz opcję Reslice i zastosuj następujące parametry: Odstęp wyjściowy (mikrony): 1.000 / Liczba plasterków: 1 / Unikaj interpolacji. Zapisz powstałe obrazy czasoprzestrzenne.
        UWAGA: Uzyskany obraz pokazuje smugi odpowiadające liniowemu ruchowi płytek krwi w przepływie krwi w czasie. Kąt smugi jest funkcją prędkości.
    2. Pomiar prędkości za pomocą oprogramowania Matlab lub GNU Octave
      UWAGA: Prędkość płytek krwi w przepływie krwi jest szacowana na podstawie obrazów czasoprzestrzennych przy użyciu metody analizy obliczeniowej opartej na transformacji Radonu opisanej przez Drew i współpracowników15. Opis tej metody matematycznej wykracza poza zakres tej recenzji, a czytelnik jest odsyłany do publikacji Drew et al. w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat obliczeń15. Zarówno kod Matlaba, jak i więcej informacji są dostępne na ich stronie internetowej https://www.drew-lab.org/code.
      1. Otwórz kod za pomocą oprogramowania Matlab lub GNU Octave.
        UWAGA: Kod może wymagać adaptacji zgodnie z pożądanym badaniem.
      2. Wyodrębnij wartość z 3 obrazów czasoprzestrzennych, odpowiadających sąsiednim liniom narysowanym w tej samej części naczynia. Obliczyć średnią wartość prędkości przepływu płytek krwi dla tej części naczynia.
        UWAGA: Nie zapomnij przeliczyć wyniku na odpowiednią jednostkę miary (np. μm/s).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując ten protokół, marker fluorescencyjny Qtracker-655 podano dożylnie w celu zobrazowania anastomozujących naczyń zatokowych szpiku w szpiku kostnym czaszki oraz kierunku przepływu, który przedstawiono za pomocą strzałek (Rycina 4A, lewo). Wykorzystując myszy mTmG, zarejestrowano fluorescencyjne płytki krwi eGFP przez 20 s w każdym odgałęzieniu naczynia, a ich prędkość zmierzono przy użyciu oprogramowania ImageJ oraz GNU Octave (Rysunek 4A, prawo). Zwróć uw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mechanizmy powstawania płytek krwi są w dużym stopniu zależne od środowiska szpiku kostnego. W związku z tym mikroskopia przyżyciowa stała się ważnym narzędziem w tej dziedzinie do wizualizacji procesu w czasie rzeczywistym. Myszy z fluorescencyjnymi megakariocytami można uzyskać, krzyżując myszy z ekspresją rekombinazy Cre w megakariocytach z dowolnymi myszami reporterowymi z floksami zawierającymi warunkową kasetę ekspresji genu fluorescencyjnego. Tutaj użyto myszy reporterowych mTmG (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sor

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Florianowi Gaertnerowi (Instytut Nauki i Technologii Austria, Klosterneuburg, Austria) za jego fachowe porady dotyczące eksperymentów z mikroskopią dwufotonową w czasie, gdy ustaliliśmy tę technikę w laboratorium, oraz Yves'owi Lutzowi z Centrum Obrazowania IGBMC /CBI (Illkirch, Francja) za jego ekspertyzę i pomoc przy mikroskopie dwufotonowym. Dziękujemy również Jean-Yves'owi Rinkelowi za pomoc techniczną i Ines Guinard za narysowanie schematu na rysunku 1. Dziękujemy firmie ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) za wsparcie w zakupie mikroskopu dwufotonowego. AB było wspierane przez stypendia podoktorskie z Etablissement Français du Sang (APR2016) oraz z Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie GNU OctaveProjekt GNU https://www.gnu.org/software/octave/
  Histoacryl 5 x 0,5 mLBraun1050052roztwór do wstrzykiwań kleju chirurgicznego
Detektory hybrydowe HyD Leica Microsystems 4tunesLeica Microsystems
ImageJGNU projectWymagana minimalna wersja
Imalgen/Ketamina 1000 fl/10 mLBoehring03661103003199ochrona oczu
Mikroskop Leica SP8 MP DIVE wyposażony w 25-krotny obiektyw wodny, apertura numeryczna 0,95Leica Microsystemsjednoczesne wzbudzenie AlexaFluor-488 i Qtracker-655
Matlab MathWorkshttps://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 gLaboratoires T.V.M.03700454505621Silikonowa pasta dentystyczna niebiesko-żółta
Picodent twinsin speedRotec13001002
Qtracker 655 etykieta naczyniowaInvitrogenQ21021MProztwór do wstrzykiwań
Skaner rezonansowy, 8 lub 12 kHz
Rompun Ksylazyna 2% fl/25 mLBayer04007221032311
ŻelSupergluedo przyklejenia pierścienia do kości
Cewnik Surflo IV - Niebieski 22 GTerumoSR-OX2225C1
Ti:Laser pulsacyjny Saph (koherentny) (femtosekundowy)Koherentny

Bibliografia

  1. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  2. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
  3. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
  4. Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
  5. Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
  6. Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
  7. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  8. Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).
  9. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  11. Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
  12. Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
  13. Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361(2012).
  14. Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127(2017).
  15. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  16. Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
  17. Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
  18. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
  19. Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
  20. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).
  21. Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).
  22. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12(2018).
  23. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  24. Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie megakariocyt wtworzenie prop yteknaczynia sinusoidalnepr dko p ytek krwimikroskopia in vivoznaczniki fluorescencyjnechirurgia szpiku kostnegosi y przep ywu krwi
In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.