Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62519

⸱

11 maja 2021

 ,  ,  , 
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Streszczenie

Trójwymiarowy (3D) biodruk wykorzystuje kompozyty na bazie hydrożelu (lub atramenty biomateriałowe), które są osadzane we wzorze, tworząc podłoże, na którym osadzane są komórki. Ponieważ wiele atramentów biomateriałowych może być potencjalnie cytotoksycznych dla komórek pierwotnych, konieczne jest określenie biokompatybilności tych kompozytów hydrożelowych przed ich wykorzystaniem w kosztownych procesach inżynierii tkankowej 3D. Niektóre metody hodowli 3D, w tym biodrukowanie, wymagają osadzenia komórek w matrycy 3D, co utrudnia ekstrakcję i analizę komórek pod kątem zmian w żywotności i ekspresji biomarkerów bez wywoływania uszkodzeń mechanicznych. Protokół ten opisuje jako dowód koncepcji, metodę oceny biokompatybilności kompozytu agarozowego osadzonego w krystalicznej nanocelulozie (CNC), wytworzonego w 24-dołkowym systemie hodowli, z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy (BMMC) przy użyciu testów cytometrii przepływowej dla żywotności komórek i ekspresji biomarkerów.

Po 18 godzinach ekspozycji na matrycę CNC/agarozy/D-mannitolu, żywotność BMMC pozostała niezmieniona, mierzona przepuszczalnością jodku propidyny (PI). Jednak BMMC hodowane na stylu Substrat CNC/agarozy/D-mannitolu wydawał się nieznacznie zwiększać ekspresję receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI) i receptora czynnika komórek macierzystych (Kit; CD117), chociaż nie wydaje się, aby było to zależne od ilości CNC w kompozycie z biotuszu. Żywotność BMMC oceniono również po ekspozycji w czasie na rusztowania hydrożelowe, które zostały wytworzone z komercyjnego tuszu biomateriałowego składającego się z nanocelulozy fibrylarnej (FNC) i alginianu sodu przy użyciu biodrukarki wytłaczanej 3D. W okresie od 6 do 48 godzin substraty FNC/alginianu nie wpływały negatywnie na żywotność BMMC określoną za pomocą cytometrii przepływowej i testów mikromiareczkowych (XTT i dehydrogenaza mleczanowa). Protokół ten opisuje skuteczną metodę szybkiego badania biochemicznego kompatybilności potencjalnych atramentów biomateriałowych pod kątem ich użyteczności jako rusztowań 3D do wysiewu po wydruku z komórkami tucznymi.

Wprowadzenie

Niedawne zainteresowanie systemami hodowli 3D i biodrukiem 3D skupiło uwagę na hydrożelach i kompozytach hydrożelowych. Kompozyty te służą jako lepkie, ale porowate biomimetyki i mogą składać się z do 99% zawartości wody w masie, co jest porównywalne z tkankami biologicznymi1,2,3. Te cechy kompozytów hydrożelowych umożliwiają tym samym wzrost komórek bez wpływu na ich żywotność i funkcję. Jednym z takich kompozytów jest krystaliczna nanoceluloza (CNC), która została wykorzystana jako materiał wzmacniający w kompozytach hydrożelowych, rusztowaniach komórkowych przy opracowywaniu implantów biomateriałowych oraz w dwuwymiarowych (2D) i 3D hodowlach komórkowych in vitro4,5. W większości matryce złożone z CNC nie są jawnie cytotoksyczne dla ludzkich komórek nabłonka rogówki6, komórki nabłonka jelitowego7, mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego ludzkiego8, lub komórki podobne do neuronów9. Jednak aktywność metaboliczna i proliferacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego zmniejsza się w korelacji ze zwiększoną lepkością kompozytów nanocelulozowych na bazie drewna, co sugeruje, że skład matrycy musi być dokładnie przetestowany pod kątem jej szkodliwego wpływu na funkcje komórek8.

Podobnie, CNC może wywołać reakcje zapalne w makrofagach po internalizacji, co może mieć poważne konsekwencje w systemach hodowli komórek odpornościowych 3D10,11. W rzeczywistości dostępnych jest bardzo niewiele danych na temat tego, w jaki sposób CNC może wpływać na inne odpowiedzi komórek odpornościowych, w szczególności alergiczne reakcje zapalne, które są inicjowane przez komórki tuczne. Komórki tuczne to granulowane leukocyty, które wyrażają receptor IgE o wysokim powinowactwie, FceRI, odpowiedzialny za aktywację odpowiedzi zapalnych na alergeny. Ich proliferacja i różnicowanie są zależne od czynnika komórek macierzystych (SCF), który wiąże receptor tyrozyny, Kit. Komórki tuczne pochodzą z komórek progenitorowych szpiku kostnego, które dostają się do krążenia, a następnie migrują obwodowo, aby rozproszyć się we wszystkich tkankach ludzkich12. Ponieważ komórki tuczne funkcjonują w środowisku tkankowym 3D, są idealnym kandydatem na komórki odpornościowe do badania procesów immunologicznych w modelach tkanek 3D in vitro. Jednak do tej pory nie ma realnego modelu tkanki 3D in vitro zawierającego komórki tuczne.

Ze względu na bardzo czułą naturę komórek tucznych i ich skłonność do wywoływania prozapalnych reakcji na bodźce zewnętrzne, wymagane jest dokładne rozważenie składników matrycy 3D i metody biodruku polegającej na wprowadzaniu komórek tucznych do rusztowania 3D, jak omówiono dalej. Konstrukty tkankowe mogą być biowytwarzane z dwóch szerokich kategorii biomateriałów, tj. biotuszy i atramentów biomateriałowych. Różnica polega na tym, że biotusze są kompozytami hydrożelowymi obciążonymi komórkami, podczas gdy tusze biomateriałowe to kompozyty hydrożelowe, które są pozbawione komórek, zgodnie z definicją Groll i wsp.13,14. W związku z tym konstrukcje 3D wydrukowane za pomocą biotuszy zawierają komórki wstępnie osadzone w matrycy hydrożelowej, podczas gdy konstrukcje 3D wydrukowane za pomocą atramentów biomateriałowych muszą zostać zasiane komórkami po wydrukowaniu. Biofabrykacja rusztowań hodowlanych z biotuszów na bazie hydrożelu/tuszy biomateriałowych jest najczęściej wykonywana przy użyciu biodrukarek 3D do wytłaczania, które wytłaczają atrament biotuszowy/atramentowy przez dyszę mikroskalową pod ciśnieniem za pomocą pneumatycznie lub mechanicznie napędzanego tłoka14. Biodrukarki wytłaczające wytwarzają rusztowania 3D, osadzając biotusz w przekrojach 2D, które są sekwencyjnie układane jeden na drugim w podejściu "oddolnym".

Aby być kompatybilnym z biodrukiem ekstruzyjnym, hydrożelowy tusz do biotuszu/biomateriału musi posiadać właściwości tiksotropowe (rozrzedzenie ścinające), dzięki czemu polimery hydrożelowe wchodzące w skład tuszu do biotuszu/biomateriału przepływają jak płyn przez dyszę mikrokanałową, gdy są poddawane naprężeniom ścinającym, ale wracają do lepkiego, żelowego stanu po usunięciu naprężenia ścinającego15. Ze względu na wysoką zawartość wody, polimery biotuszy / atramentów biomateriałowych na bazie hydrożelu muszą być usieciowane, fizycznie lub kowalencyjnie, aby zachować architekturę i integralność strukturalną biodrukowanej struktury 3D. W przypadku biotuszów obciążonych komórkami, komórki są bezpośrednio poddawane naprężeniom chemicznym podczas procesu sieciowania. Proces wytłaczania komórek zamkniętych w matrycy hydrożelowej biotuszu również poddaje komórki naprężeniom ścinającym, co może prowadzić do zmniejszenia żywotności i/lub śmierci komórki. Po biodruku modelu tkanki 3D trudno jest rozróżnić poziomy cytotoksyczności wywołane przez samą matrycę hydrożelową oraz odpowiednio procesy ekstruzji i sieciowania. Jest to szczególnie trudne w kontekście rusztowań 3D, w których komórki są wstępnie osadzone w matrycy hydrożelowej, co utrudnia usunięcie komórek do późniejszych analiz, co byłoby szkodliwe dla żywotności komórek tucznych.

Łagodniejsze podejście do generowania konstruktów tkanek 3D zawierających komórki tuczne polega na umieszczaniu komórek w wstępnie wydrukowanych, porowatych rusztowaniach 3D z biomateriału z zawiesiny hodowli komórkowej, która wykorzystuje wrodzoną zdolność komórek tucznych do migracji z krążenia do tkanek obwodowych. Korzyści płynące z tego podejścia do wysiewu komórek są dwojakie: (i) komórki tuczne nie są poddawane naprężeniom ścinającym i chemicznym w procesach wytłaczania i sieciowania, odpowiednio, oraz (ii) komórki można łatwo usunąć z rusztowania 3D po ekspozycji poprzez delikatne mycie w celu analizy bez negatywnego wpływu na ich żywotność. Dodatkową korzyścią z wysiewu i analizy żywotności komórek tucznych na biodrukowanych, porowatych rusztowaniach hydrożelowych 3D w przeciwieństwie do dysków hydrożelowych 2D jest to, że biodrukowane rusztowania hydrożelowe 3D podsumowują cechy topograficzne tkanek in vivo w skali mikroskali, które nie występują w masowych, płaskich dyskach hydrożelowych 2D. Podejście to jest odpowiednim, szybkim i opłacalnym podejściem do określenia potencjalnie katastrofalnych skutków cytotoksycznych kandydujących matryc hydrożelowych biotuszu na komórki tuczne, a także inne komórki immunologiczne, przed zainwestowaniem w kosztowne eksperymenty inżynierii tkankowej 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół składa się z pięciu sekcji: (1) izolacja szpiku kostnego myszy i różnicowanie komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy (BMMC), (2) wytwarzanie substratów hydrożelowych CNC/agarozy/D-mannitolu w systemie 24-dołkowym i hodowla BMMC na substratach, (3) usuwanie BMMC z substratów CNC/agarozy/hydrożelu D-mannitolu oraz analiza żywotności i ekspresji biomarkerów za pomocą cytometrii przepływowej, (4) Biodrukowanie 3D rusztowań hydrożelowych z dostępnego na rynku atramentu biomateriałowego z kompozytu fibrylarnego nanocelulozy (FNC) / alginianu sodu oraz (5) hodowla BMMC na rusztowaniach hydrożelowych FNC / alginianu sodu i analiza żywotności za pomocą testów cytometrii przepływowej, XTT i dehydrogenazy mleczanowej (LDH).

1. Generacja kultury BMMC

UWAGA: Myszy zostały poddane eutanazji przez uduszenieCO2 po znieczuleniu izofluranem. Kość piszczelowa i kość udowa zostały odizolowane, a następnie pobrano cały szpik kostny. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i polityką Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Alberty.

  1. Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną RPMI-1640, dodając suplementy wymienione w tabeli 1 do wskazanych stężeń końcowych. Dostosuj pH pożywki do 7,4-7,6 za pomocą NaOH, wysterylizuj metodą filtracyjną za pomocą jednorazowego filtra butelkowego (wielkość porów 0,2 μm) i przechowuj w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 2 miesięcy.
  2. Uzyskaj kości udowe od myszy zgodnie z lokalnymi protokołami i procedurami Uniwersyteckiego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami.
    UWAGA: W tym badaniu kości udowe wyizolowano od myszy C57BL / 6, ale można użyć dowolnego szczepu, jeśli jest to istotne dla badania.
  3. Za pomocą nożyczek usuń skórę i mięśnie ze stawu biodrowego, a następnie delikatnie pociągnij kość udową, lekko wykręcając ją z panewki biodrowej (Rysunek 1). Uważaj, aby nie odłamać głowy kości udowej. Odetnij kość piszczelową od kości udowej na przyśrodkowej kości brzusznej za pomocą nożyczek. Usuń łapę, przecinając tuż nad kością piętową i wyrzuć.
  4. Za pomocą skalpela usuń skórę i chrząstki z części kości udowej i piszczelowej. Za pomocą nożyczek wykonaj czyste cięcie na każdym końcu kości udowej i piszczelowej, odsłaniając znajdujący się w nich czerwony szpik kostny. W razie potrzeby usuń kość strzałkową w tym miejscu, ale pamiętaj, że może to pomóc w manipulacji piszczelą podczas płukania szpiku kostnego.
  5. Przygotować igłę o sile 26 g z 5 ml strzykawki typu luer-lock i wypełnić około 5 ml kompletnego podłoża przygotowanego w sposób opisany powyżej.
    UWAGA: W tym momencie można również użyć niepełnego RPMI bez dodatków, aby zaoszczędzić na odczynnikach.
  6. Trzymając kość udową lub piszczelową kleszczami, włóż igłę do jednego końca kości i delikatnie naciśnij strzykawkę. Przytrzymaj kość nad sterylną stożkową probówką o pojemności 50 ml i delikatnie wstrzyknij około 5 ml pożywki do kości, wywierając pewien nacisk. Obserwuj, jak kawałki szpiku kostnego wypadają z drugiego końca kości w postaci cienkich czerwonych wstążek do stożkowej rurki.
  7. Odwirować aspiraty i ponownie zawiesić w kompletnym pożywce lub przenieść bezpośrednio do sterylnej kolby do hodowli tkankowych T175 cm2 zawierającej 50 ml kompletnej pożywki RPMI-1640. Utrzymuj aspiracje w kompletnym pożywce RPMI-1640 za pomocą 30 ng / ml rekombinowanej interleukiny (IL)-3 myszy.
  8. Po 1 dniu obserwuj kultury pod mikroskopem świetlnym. Hodowla będzie składała się z niejednorodnej populacji komórek o różnych kształtach i rozmiarach oraz jeszcze większych kawałków szpiku kostnego. Nakarmić hodowle komórkowe, dodając 15 ml świeżej pożywki co 3-5 dni przy użyciu kompletnej pożywki RPMI-1640, jak opisano powyżej, i upewnij się, że gęstość komórek nigdy nie przekracza 1 × 106 komórek/ml. Raz w tygodniu odwiruj komórki w ilości 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawieś w świeżej kompletnej pożywce RPMI-1640 i podziel 1:4 na 50 ml pożywki w świeżych kolbach T175.
  9. Po 4 tygodniach oznaczyć czystość komórek, mierząc ekspresję powierzchniową receptorów CD117 (Kit) i FceRI za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano poniżej (sekcja 3.2).
    UWAGA: Po 4 tygodniach 99% komórek powinno być podwójnie dodatnich dla CD117 (Kit) i FcεRI.
  10. Po 4 tygodniach i później utrzymuj BMMC z 20 ng/ml IL-3 w kompletnym pożywce RPMI-1640. Po około 6 tygodniach komórki przestaną się dzielić i nie będą już wymagały dzielenia. Karmić kultury co 3–5 dni, granulować komórki przez wirowanie raz w tygodniu i ponownie zawiesić w świeżej, kompletnej pożywce RPMI-1640.

2. Wytwarzanie substratów hydrożelowych CNC/agarozy/D-mannitolu i hodowli BMMC

  1. W szklanej butelce dodać 0,2 g proszku agarozy do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (2% w/v) do końcowej objętości 10 ml i gotować przez 1 minutę w temperaturze 100 °C do rozpuszczenia.
  2. Rozpuścić 2,5 g proszku CNC w PBS do końcowej objętości 10 ml, aby przygotować mieszaninę 25% w/v.
  3. Rozpuścić 2 g proszku CNC w PBS do końcowej objętości 10 ml, aby przygotować mieszaninę 20% w/v i seryjnie rozcieńczyć mieszaninę 20% w/v, aby przygotować mieszaniny CNC 10, 5 i 2% w/v.
  4. Podgrzej mieszaniny CNC 25, 20, 10, 5 i 2% w/v do 37 °C przez 10 minut (Rysunek 2A).
  5. Dodać 0,46 g D-mannitolu do gorącego roztworu agarozy (4,6% w/v) i rozpuścić.
  6. Wymieszaj wstępnie podgrzane mieszaniny CNC-PBS 25, 20, 10, 5 i 2% w/v z gorącym roztworem agarozy/D-mannitolu w oddzielnych stożkowych probówkach w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenia CNC 12,5, 10, 5, 2,5 i 1% w/v w mieszaninach hydrożelowych.
  7. Pracując szybko, dodaj 500 μl / basenik powyższych roztworów przygotowanych w kroku 2.6 w poczwórnym powiększaniu do 24-dołkowej płytki hodowlanej i odstaw na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby ułatwić polimeryzację (Rysunek 2B).
  8. Ostrożnie nałożyć 1000 μl zawiesiny BMMC o gęstości 1,1 × 106 komórek/ml na wierzch substratów hydrożelowych za pomocą mikropipetora i unikać dotykania żelu końcówką pipety, ponieważ spowoduje to uszkodzenie powierzchni żelu i wytworzenie cząstek.
  9. Inkubować BMMC na podłożach hydrożelowych w sterylnym inkubatorze (5% CO2 , wilgotna atmosfera) w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.

3. Analizy cytometryczne przepływowe

  1. Analiza cytometrii przepływowej żywotności BMMC poprzez wykluczenie PI
    1. Ostrożnie wyjmij pożywkę hodowlaną zawierającą BMMC z górnej części CNC/agarozy/D-mannitolu, unikając żelu, i przenieś komórki do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
    2. Przemyć BMMC dwukrotnie PBS (pH 7,4) zawierającym 0,5% w/v albuminy surowicy bydlęcej w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 180 μl PBS-0,5% w/v BSA do końcowej gęstości 1,5 × 106 komórek/ml. Przenieś komórki na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem.
      UWAGA: Wszystkie roztwory BSA PBS-0,5% w/v należy dwukrotnie wysterylizować za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 20 μl PBS-0,5% w/v BSA lub 10x PI (100 μg/mL) przygotowanych w PBS-0,5% w/v BSA, do komórek do końcowego stężenia 10 μg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C lub 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Pozyskaj dane fluorescencyjne za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser argonowo-jonowy (488-514 nm) i filtr pasmowoprzepustowy, aby umożliwić detekcję emisji fluorescencji przy 578 nm. Rejestruj 20 000 zdarzeń na próbkę przy natężeniu przepływu 30 μl/min w temperaturze pokojowej. Przeanalizuj dane zgodnie z poniższym opisem (sekcje 3.2.7-3.2.10).
  2. Analiza cytometryczna przepływowa BMMC pod kątem ekspresji receptora powierzchniowego Kit (CD117) i FcεRI
    1. Ostrożnie wyjmij pożywkę hodowlaną zawierającą BMMC z górnej części CNC/agarozy/D-mannitolu, unikając żelu, i przenieś komórki do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
    2. Przemyć BMMC dwukrotnie przefiltrowanym PBS-0,5% BSA w ilości 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 180 μl PBS zawierającego 0,5% w/v BSA (1,5 × 106 komórek/ml). Przenieść zawieszone komórki na 96-dołkową płytkę o okrągłym dnie.
    3. Dodaj 20 μl 10x roztworów roboczych przeciwciał do komórek, aby uzyskać końcowe stężenie odpowiednio 0,06 μg/ml CD117 (c-Kit)-fikoerytryny (PE) i 0,06 μg/ml FcεRIα-allofikocyjaniny (APC).
      UWAGA: 10x roztwory robocze przeciwciał muszą być przygotowane w sterylizowanym filtrem PBS-0,5% w/v BSA.
    4. Dodać 20 μl 10-krotnych kontrolnych roztworów roboczych izotypu zawierających kontrolę izotypu IgG2b κ szczura PE lub kontrolną izotyp IgG chomika ormiańskiego do oddzielnych studzienek zawierających komórki, które nie zostały wybarwione żadnym z koniugatów przeciwciało-fluorofor w kroku 3.2.3.
      UWAGA: Kontrole izotypu, kontrola izotypu IgG2b κ szczura i kontrola izotypu IgG chomika ormiańskiego-APC służą do kontroli niespecyficznego przyłączania przeciwciał do BMMC. Ponieważ BMMC nie wyrażają wysokich poziomów FcR, rzadko wykrywa się wysoką fluorescencję tła za pomocą przeciwciał kontrolnych izotypu. Przygotować 10-krotne roztwory robocze do kontroli izotypu w sterylizowanym filtrem PBS-0,5% w/v BSA.
    5. Inkubować 96-dołkową płytkę okrągłodenną przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
    6. Umyj komórki, dodając 200 μl świeżego buforu BSA PBS-0,5% w/v do każdej studzienki i odwiruj przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz krok prania jeszcze raz. Ostrożnie usunąć supernatant, nie dotykając osadu komórkowego; Pozostawić trochę supernatantu, aby zapewnić, że osad komórkowy pozostanie nienaruszony.
    7. Po umyciu ponownie zawieś komórki w 100 μl 0,5% w/v BSA, 0,05% w/v azydku sodu w PBS (pH 7,4), który został dwukrotnie sterylnie przefiltrowany za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,2 μm. Uzyskać dane fluorescencji w kanałach detektora PE i APC za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano powyżej w kroku 3.1.3.
    8. Analizuj dane za pomocą oprogramowania zdolnego do przeglądania i analizowania plików danych cytometrii przepływowej z rozszerzeniem ".fcs".
    9. Rozpocznij analizę od wykreślenia rozproszenia do przodu (FSC) wzdłuż osi x i rozrzutu bocznego (SSC) wzdłuż osi y oraz bramki dla konserwatywnej populacji komórek z zakresem FSC logarytmu10 1,5-5,0 i zakresem SSC logarytmu10 0,75-3,25 w komórkach nietraktowanych i niebarwionych, jak pokazano w Rysunek 3A(i),(ii).
      UWAGA: Ma to na celu zapewnienie, że resztki komórek o niskich wartościach FSC i SSC zostaną wyeliminowane z analizy. Komórki tuczne są zwykle komórkami bardzo ziarnistymi (wysoki SSC) i dużymi (wysoki FSC) w porównaniu z innymi typami komórek immunologicznych, takimi jak monocyty i limfocyty.
    10. Następnie wygeneruj wykresy punktowe FSC i SSC oraz profile histogramu próbek niepoddanych działaniu substancji, które zostały wybarwione barwnikiem, przeciwciałami lub kontrolami izotypu, i uzyskaj średnią intensywność fluorescencji (MFI) w kanałach PE lub APC zgodnie z widmem emisyjnym zastosowanego specyficznego koniugatu przeciwciało-fluorofor lub barwnika. Zastosować ten sam zestaw bramek i parametrów do wszystkich próbek BMMC inkubowanych z różnymi substratami CNC/agarozy/D-mannitolu i barwionych odpowiednimi kontrolami izotypu, przeciwciałami lub barwnikiem; uzyskać MIF.
      UWAGA: Zasadniczo, wykresy punktowe FSC i SSC niepoddanych obróbce próbek barwionych powinny być nie do odróżnienia od próbek niepoddanych obróbce/niebarwionych, uzyskanych w kroku 3.2.9, aby zapewnić, że procedura barwienia nie zmieni wielkości komórki (mierzonej przez FSC) ani ziarnistości (mierzonej przez SSC) (Rysunek 3A(i),(ii)).
    11. Oblicz średnie MIF i błąd standardowy średniej (SEM) dla każdej próbki z 4 niezależnych eksperymentów, a następnie wygeneruj wykresy za pomocą pakietu oprogramowania do analizy statystycznej.
    12. Przygotuj nakładki histogramu w oprogramowaniu do analizy danych cytometrii przepływowej (Rysunek 3B, 4A(ii),B(ii)).

4. 3D Bioprinting substratów hydrożelowych FNC/alginianu sodu

UWAGA: Biodrukarka 3D użyta w tym badaniu to system pneumatyczno-ekstruzyjny wyposażony w dwie niezależne głowice drukujące o kontrolowanej temperaturze. Tusz biomateriałowy używany do biodruku 3D rusztowań hydrożelowych składa się z (a) wysoce uwodnionej nanocelulozy fibrylarnej (FNC), która jest morfologicznie podobna do kolagenu, (b) alginianu sodu i (c) D-mannitolu. Jest dostarczany w postaci sterylnej zawiesiny hydrożelowej w wkładach o pojemności 3 ml, do których można dołączyć sterylne stożkowe dysze do biodruku typu luer-lock (22, 25 lub 27 G).

  1. Protokołu tego należy używać z głowicami drukującymi i stołem roboczym w temperaturze pokojowej, gdzie temperatura pokojowa wynosi 20-25 °C.
  2. Wkłady z tuszem z biomateriału należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zachować stabilność kompozytu hydrożelowego. Przed rozpoczęciem biodruku 3D wyjmij wkład (3 ml) z lodówki i pozwól mu zrównoważyć się do temperatury pokojowej.
  3. Instalacja wkładu Bioink na biodrukarce 3D INKREDIBLE+
    1. Usuń niebieskie zaślepki z wkładu z tuszem biomateriałowym o pojemności 3 ml ( Rysunek 5B (i)) i przymocuj sterylną stożkową dyszę do biodruku 22 G (niebieska) na końcówce typu luer-lock wkładu Bioink.
      UWAGA: Konieczne jest przymocowanie żądanej stożkowej dyszy do biodruku do wkładu z biotuszem przed zainstalowaniem wkładu i wykonaniem kolejnych kroków kalibracji, ponieważ niewykonanie tego spowoduje nieprawidłową kalibrację osi z biodrukarki 3D.
    2. Podłącz rurkę doprowadzającą powietrze do głowicy drukującej 1 (PH1, po lewej) do przeciwległego końca wkładu i włóż wkład z dołączoną stożkową dyszą do biodruku do pionowej szczeliny PH1 (Rysunek 5A (ii)).
    3. Mocno osadź wkład w PH1 ze stożkową dyszą do biodruku wystającą poniżej głowicy drukującej. Dokręć na PH1 zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż dokręci się palcem, aby zablokować wkład z biotuszem na miejscu. Należy pamiętać, że biodruk 3D można wykonać z PH2 pozostawionym pustym.
  4. Kalibracja osi x-y-z biodrukarki 3D
    1. Włącz biodrukarkę 3D i uruchom oprogramowanie biodrukarki na komputerze podłączonym do biodrukarki 3D za pomocą USB 2.0.
    2. W oprogramowaniu kliknij przycisk POŁĄCZ, aby zsynchronizować oprogramowanie z bioprinterem 3D.
      UWAGA: Synchronizacja powiedzie się, gdy diody elektroluminescencji światła ultrafioletowego głowicy drukującej będą się włączać i wyłączać, a wentylator filtra HEPA wyłączy się i ponownie włączy. Oprogramowanie musi zostać zsynchronizowane z biodrukarką 3D przed bazowaniem osi biodrukarki i kalibracją punktu początkowego, zgodnie z opisem w kolejnych krokach.
    3. Zwróć uwagę na cztery opcje w głównym menu sterowania biodrukarki 3D: (i) PRZYGOTUJ BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) MENU NARZĘDZI i (iv) EKRAN STANU. Wybierz opcję PREPARE BIOPRINT, a następnie przewiń w dół i wybierz opcję HOME AXES.
      UWAGA: Biodrukarka 3D przesunie następnie zespół głowicy drukującej do tyłu i w lewo, aby skalibrować odpowiednio osie y i x. Następnie, gdy głowice drukujące zostaną zatrzymane w skrajnym lewym położeniu, biodrukarka podniesie stół roboczy, aż przełącznik kalibracji osi z (znajdujący się na stole drukującym) zetknie się ze stożkową dyszą biodrukową zainstalowaną na głowicy drukującej 1
    4. Po udanej kalibracji osi x-y-z obserwuj lekkie obniżenie stołu roboczego i przemieszczenie głowic drukujących powyżej punktu środkowego stołu roboczego (Rysunek 5A(i)).
  5. Punkt początkowy kalibracji biodrukarki do biodruku na płytkach 24-dołkowych
    1. Wyjąć sterylną 24-dołkową płytkę hodowlaną z jej szczelnie zamkniętego plastikowego opakowania i zaznaczyć kropkę w środkowym punkcie basenika D1 na spodniej stronie płytki trwałym markerem. Zdejmij pokrywę płytki i umieść 24-dołkową płytkę hodowlaną na stole roboczym z dołkiem D1 znajdującym się w lewym przednim rogu stołu.
    2. W głównym menu sterowania wybierz MENU NARZĘDZIOWE, a następnie wybierz PRZESUŃ OŚ. Przesuwaj głowice drukujące w krokach co 1 mm wzdłuż osi x i y, aż stożkowa dysza biodrukująca PH1 znajdzie się bezpośrednio nad kropką oznaczoną pod studzienką D1. W razie potrzeby dostosuj położenie stożkowej dyszy do biodruku nad kropką, przesuwając głowice drukujące w krokach co 0,1 mm.
    3. Zapisz współrzędne x i y stożkowej dyszy do biodruku, gdy znajduje się ona bezpośrednio nad środkiem studzienki D1, jak wskazano na ekranie panelu sterowania biodrukarki 3D.
      UWAGA: W przypadku zastosowanej tutaj biodrukarki 3D INKREDIBLE+ współrzędne x i y są następujące: x : -46,5 i y : -27,5. Współrzędne te służą jako punkt początkowy w środku dołka D1 do biodruku w płytce 24-dołkowej.
    4. Następnie podnoś stół roboczy w krokach co 1 mm, aż dno studzienki D1 prawie dotknie stożkowej dyszy biodrukującej zainstalowanej w głowicy drukującej 1. W razie potrzeby dostosuj ruch stołu roboczego w krokach co 0,1 mm (Rysunek 5A(ii)). Następnie z MENU NARZĘDZIA wybierz opcję KALIBRACJA OSI Z, a następnie wybierz i potwierdź opcję STORE Z CALIBRATION.
    5. Wróć do menu głównego i wybierz opcję PRZYGOTUJ BIOPRINT. Przewiń w dół i wybierz opcję KALIBRUJ Z.
      UWAGA: Biodrukarka 3D obniży teraz stół roboczy po pomyślnym wykonaniu kalibracji osi z (Rysunek 5A(iii)).
  6. Aktualizacja pliku G-code z 24-dołkową płytką o prawidłowe współrzędne punktu początkowego
    1. Otwórz dostarczony plik z kodem geometrycznym (G-code) płytki 24-dołkowej w oprogramowaniu biodrukarki (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Ten 24-dołkowy plik G-code koduje drukowanie 2-warstwowych konstrukcji prostoliniowych o wymiarach 5 x 5 x 1 mm w każdym dołku (Rysunek 5C(i),(iii)). Dostarczone pliki G-code mogą być używane z dowolnym oprogramowaniem do biodruku 3D.
    2. Zwróć uwagę, że wiersz 1 pliku G-code brzmi G0 X-50.0 Y-33.5 ; Środkowa pozycja studni D1. Zaktualizuj współrzędne x i y w wierszu 1 o wartości uzyskane w kroku 4.5.3, tj. wiersz 1 powinien teraz wyglądać następująco: G0 X-46.5 Y-27.5 ; Środkowa pozycja studni D1. Zapisz plik pod nową nazwą.
      UWAGA: Ta procedura służy do kalibracji pliku G-code tak, aby drukowanie rozpoczęło się w środku dołka D1 w oparciu o współrzędne x,y konkretnej używanej biodrukarki 3D. To podejście można wykorzystać do kalibracji pliku G-code z 24-dołkową płytką do drukowania za pomocą dowolnej biodrukarki 3D do wytłaczania. Na potrzeby tego badania wydrukowano tylko lewą połowę płytki 24-dołkowej, tj. dołki A1-3, B1-3, C1-3 i D1-3. Dostępny jest również oddzielny plik G-code, który koduje drukowanie 2-warstwowych konstrukcji prostoliniowych o wymiarach 5 x 5 x 1 mm w siatce 3 x 4 (plik uzupełniający 2, Rysunek 5C(ii)).
  7. Regulacja ciśnienia wytłaczania dla głowicy drukującej 1 (PH1)
    1. Upewnij się, że pompa pneumatyczna jest szczelnie podłączona do tylnego portu wlotu powietrza biodrukarki 3D INKREDIBLE+ i włącz pompę pneumatyczną.
    2. Wyciągnij przednie pokrętło sterujące znajdujące się po prawej stronie biodrukarki 3D INKREDIBLE+.
      UWAGA: Przednie pokrętło sterujące reguluje ciśnienie dla PH1, podczas gdy tylne pokrętło sterujące reguluje ciśnienie dla PH2.
    3. Obserwuj, jak cyfrowe manometry PH1 i PH2 znajdujące się z przodu biodrukarki wskazują wartość bliską 0 kPa. Powoli obracaj przednie pokrętło sterujące zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ciśnienie wskazane na lewym manometrze dla PH1 osiągnie 12 kPa (Rysunek 5A(iii)).
    4. Umieść złożoną bibułkę lub kawałek wodoodpornej, uszczelniającej folii pod dyszą drukującą zainstalowanego wkładu, uważając, aby nie dotknąć dyszy drukującej.
    5. Z głównego menu sterowania na biodrukarce 3D wybierz PRZYGOTUJ BIOPRINT.
    6. Przejdź do i wybierz opcję WŁĄCZ PH1. Zwróć uwagę, że atrament z biomateriału zaczyna wytłaczać się z dyszy drukującej. W razie potrzeby zwiększ ciśnienie wytłaczania, obracając pokrętło sterujące zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż atrament z biomateriału zostanie wytłoczony w ciągłym włóknie, i zapisz nowe ustawienie ciśnienia. Pracuj szybko, aby uniknąć marnowania atramentu biomateriałowego.
    7. Wybierz WYŁĄCZ PH1, aby zatrzymać wytłaczanie atramentu biomateriałowego, usuń bibułkę lub folię zawierającą wytłaczany atrament biomateriałowy ze stołu roboczego i zamknij drzwiczki biodrukarki.
      UWAGA: Biodrukarka 3D automatycznie włączy dopływ powietrza do PH1 podczas drukowania zgodnie z instrukcjami w pliku G-code.
  8. Biodruk 3D prostoliniowych podłoży hydrożelowych w formacie płytki 24-dołkowej
    1. Z głównego menu sterowania w biodrukarce 3D wybierz MENU NARZĘDZIOWE. Przejdź do i wybierz opcję WYŁĄCZ DRUKOWANIE SD, co umożliwi oprogramowaniu biodrukarki przesyłanie plików G-code do biodrukarki 3D w celu wydrukowania.
    2. Kliknij przycisk LOAD w oprogramowaniu biodrukarki i wybierz zaktualizowany plik G-code z 24-dołkową płytką zapisany w kroku 4.6.2.
    3. W prawym panelu sterowania w oprogramowaniu wybierz zakładkę PODGLĄD WYDRUKU i kliknij przycisk DRUKUJ, aby rozpocząć biodrukowanie w dołku D1.
      UWAGA: W przypadku korzystania z pliku G-code płytki siatkowej 3 x 4, bioprinting zakończy się w dołku A3 płytki 24-dołkowej (Rysunek 5C(ii),D), w przeciwieństwie do dołka A6, jeśli drukowana jest pełna płytka 24-dołkowa.
    4. Po zakończeniu biodrukowania konstruktów prostoliniowych przykryj 24-dołkową płytkę pokrywką i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
    5. Zanurz każdą prostoliniową konstrukcję w dwóch kroplach sterylnego 50 mM roztworu CaCl2 (Rysunek 5B(ii)) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      UWAGA: Służy to jonowemu sieciowaniu łańcuchów polimerowych alginianowych z jonami Ca2+ i pozwala konstruktom prostoliniowym zachować integralność strukturalną.
    6. Ostrożnie odessać roztwór CaCl2 z każdego konstruktu i spłukać raz na 1 ml 1x PBS (pH 7,4), aby usunąć nadmiar CaCl2 (Rysunek 5D).
    7. Aby zapobiec odwodnieniu biodrukowanych konstruktów hydrożelowych, utrzymuj biodrukowane konstrukcje prostoliniowe 3D w świeżym 1x PBS, aż BMMC będą gotowe do zasiania na konstruktach (Rysunek 5D).

5. Inkubacja BMMC na biodrukowanych rusztowaniach prostoliniowych 3D i testowanie żywotności

  1. Inkubacja BMMC na biodrukowanych w 3D prostoliniowych rusztowaniach hydrożelowych
    1. Nasiona porcji BMMC na biodrukowane w 3D rusztowania prostoliniowe w trzech egzemplarzach przez cztery różne czasy, np. 6, 18, 24 i 48 godzin, tak aby wszystkie zabiegi zakończyły się jednocześnie. Stosować BMMC wysiane do pustych studzienek w trzech egzemplarzach przez taki sam czas, jak w przypadku niepoddanych działaniu substancji kontroli.
    2. Aseptycznie przenieść BMMC z kolby hodowlanej T175 cm2 do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zagnieździć BMMC w ilości 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zawiesić osad w 50 ml świeżej, kompletnej pożywki RPMI zawierającej 20 ng/ml IL-3 i obliczyć gęstość żywych komórek, licząc podwielokrotność BMMC barwionych trypanem na niebiesko za pomocą hemacytometru.
    4. Na podstawie gęstości komórek obliczonej w kroku 5.1.3 przygotować 6 ml podwielokrotności zawiesiny BMMC o końcowej gęstości 1 × 106 komórek/ml.
    5. W przypadku 48-godzinnej konfiguracji inkubacji odessać PBS z dołków A1-3 zawierających biodrukowane w 3D prostoliniowe rusztowania hydrożelowe i pipetować 1 ml zawiesiny BMMC (1 × 106 komórek/ml) do każdej studzienki. Ponadto należy odpipetować 1 ml zawiesiny BMMC (1 × 106 komórek/ml) do studzienek A4-6 bez biodrukowanych konstruktów, które mają służyć jako nieleczona kontrola. Pozostałe studzienki zawierające rusztowania z biodrukiem (B1-3, C1-3, D1-3) inkubować w RPMI bez dodatków, aby zapobiec odwodnieniu, aż do osiągnięcia odpowiedniego czasu na wysiew z BMMC przez 24, 18 i 6 godzin trwania zabiegu. Wypełnij studzienki bez rusztowań z biodrukiem (B4-6, C4-6, D4-6) 1 ml PBS, aż do osiągnięcia odpowiedniego czasu na wysiew za pomocą BMMC dla 24, 18 i 6 godzinnych punktów czasowych.
    6. Inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO2 .
    7. W przypadku 24-godzinnej inkubacji należy odessać istniejącą wcześniej pożywkę/bufor z dołków B1-6 i zasiać 1 ml zawiesiny BMMC (1 ×10 6 komórek/ml) do tych studzienek. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
    8. W przypadku 18-godzinnej inkubacji należy odessać istniejącą wcześniej pożywkę/bufor hodowlany z dołków C1-6 i zasiać 1 ml zawiesiny BMMC (1 × 106 komórek/ml) do tych studzienek. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
    9. W przypadku 6-godzinnej inkubacji należy odessać istniejącą wcześniej pożywkę/bufor hodowlany z dołków D1-6 i zasiać 1 ml zawiesiny BMMC (1 × 106 komórek/ml) do tych studzienek. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
    10. W celu zakończenia inkubacji należy pobrać próbki z każdej studzienki z 24-dołkowej płytki w celu (i) barwienia PI i analizy za pomocą cytometrii przepływowej, (ii) testu żywotności komórek XTT oraz (iii) testu uwalniania LDH. Dlatego należy upewnić się, że okrągłodenna 96-dołkowa płytka i niezbędne probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml są oznakowane na długo przed zakończeniem inkubacji.
  2. Pobieranie próbek komórek do testu metabolicznego XTT
    1. Dokładnie zawieś BMMC w pożywce hodowlanej w każdym dołku, uważając, aby nie uszkodzić i nie rozdrobnić biodrukowanych w 3D rusztowań hydrożelowych.
    2. Przeprowadzić aseptycznie 40 μl jednorodnej zawiesiny BMMC z każdej studzienki do sterylnych probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml zawierających 760 μl świeżej, pełnej pożywki RPMI (objętość końcowa = 800 μl) i krótko wymieszać.
    3. Dozować 100 μl rozcieńczonych zawiesin BMMC w trzech egzemplarzach do płaskodennej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania, która jest odpowiednia do rejestrowania pomiarów absorbancji (patrz tabela materiałów) na spektrofotometrze mikropłytkowym.
    4. Dozować 50 μl roztworu roboczego XTT do każdej studzienki zawierającej zawiesinę komórek BMMC za pomocą wielokanałowej mikropipety.
      UWAGA: Przygotować roztwór roboczy XTT, mieszając 5 ml odczynnika XTT ze 100 μl odczynnika sprzęgającego elektrony. Rozmrozić te składniki w temperaturze od -20 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C bezpośrednio przed użyciem.
    5. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO2 przez 24 godziny.
    6. Pod koniec inkubacji wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Zapisać wartości absorbancji na spektrofotometrze mikropłytkowym przy długości fali 450 nm z odejmowaniem tła przy długości fali 650 nm.
  3. Pobieranie próbek sklarowanych nad osadem do testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
    1. Przenieść pozostałe zawiesiny BMMC (960 μl) z każdej studzienki 24-dołkowej płytki do probówek do mikrofuge i granulować komórki w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Pobrać pipetą trzy podwielokrotności 100 μl supernatantu z hodowli komórkowej z każdej probówki do mikrodymki na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem do mikromiareczkowania. Wyrzucić resztki supernatantów z każdej probówki do mikrofuge i zachować granulki BMMC do dalszego barwienia PI w sekcjach 5.4.1-5.4.8.
    3. Odpipetować 50 μl roztworu roboczego LDH do każdych 100 μl porcji supernatantu.
      UWAGA: Patrz Plik uzupełniający 3 w celu przygotowania odczynników do oznaczania LDH.
    4. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
    5. Odpipetować 50 μl 1 M kwasu octowego do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
    6. Zapisać wartości absorbancji na spektrofotometrze mikropłytkowym przy długości fali 490 nm z odejmowaniem tła przy długości fali 680 nm.
  4. Analiza cytometryczna przepływowa żywotności BMMC poprzez wykluczenie jodku propidyny (PI)
    1. Zawiesić granulki BMMC w buforze przepływowym do przemywania (PBS [pH 7,4] zawierający 0,5% w/v BSA) i osadzać komórki w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Powtórz etap mycia z buforem do płukania przepływowego jeszcze raz.
    3. Zawiesić każdą osadkę BMMC w 400 μl buforu do płukania.
      UWAGA: W sumie zostaną poddane 24 zawieszonym próbkom BMMC: 12 próbek BMMC inkubowanych na biodrukowanych podłożach hydrożelowych (4 punkty czasowe w trzech egzemplarzach) i 12 próbek BMMC inkubowanych w studzienkach bez biodrukowanych konstruktów (4 punkty czasowe w trzech
      4. egzemplarzach).
    4. Na okrągłodennej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania odpipetować 20 μl przepływowego buforu płuczącego do studzienek A1-12 i B1-12. Na tej samej płytce do mikromiareczkowania odpipetować 20 μl 10 x roztworu barwiącego PI (100 μg/ml PI w buforze do płukania przepływowego) do studzienek C1-12 i D1-12.
    5. Dozować 180 μl z 12 próbek BMMC inkubowanych na biodrukowanych podłożach hydrożelowych do studzienek A1-12 (jedna próbka na studzienkę). Dozować 180 μl z 12 próbek BMMC inkubowanych bez biodrukowanych substratów hydrożelowych do studzienek B1-12 (jedna próbka na studzienkę). Próbki BMMC dozowane do studzienek A1-12 i B1-12 należy wykorzystać jako niebarwione kontrole dla każdego warunku leczenia (w sumie 24 kontrole).
    6. Dozować 180 μl z 12 próbek BMMC inkubowanych na biodrukowanych konstruktach do studzienek C1-12 (jedna próbka na studzienkę). Dozować 180 μl z 12 próbek BMMC inkubowanych bez biodrukowanych konstruktów do studzienek D1-12 (jedna próbka na studzienkę).
      UWAGA: Próbki BMMC w studzienkach C1-12 i D1-12 zostaną wybarwione przy końcowym efektywnym stężeniu PI wynoszącym 10 μg/ml (łącznie 24 barwione próbki).
    7. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C lub 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    8. Pod koniec okresu inkubacji przeanalizować próbki bezpośrednio z płytki mikromiareczkowej na cytometrze przepływowym, jak opisano poprzednio w sekcji 3.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jedną z najważniejszych cech skutecznego tuszu biomateriału lub podłoża hodowlanego jest biokompatybilność. Przede wszystkim podłoże nie może indukować śmierci komórkowej. Istnieje kilka metod opartych na mikropłytkach oraz metod cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania żywotności i nekrozy komórek; jednak metody te nie nadają się do analizy komórek zatopionych w macierzy hydrożelowej. W niniejszym protokole powyższe ograniczenie omija się poprzez wysiewanie BMMCs na podłoże hydrożelowe lub wydrukowany biologicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wytwarzanie tkanek biomimetycznych 3D wymaga udanego połączenia biotuszu, który naśladuje składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, ze składnikami komórkowymi w celu stworzenia fizjologicznych analogów tkanek in vivo . Wymaga to użycia komórek pierwotnych, a nie komórek przekształconych, podczas wytwarzania fizjologicznych tkanek biomimetycznych. Pierwotne komórki immunologiczne, takie jak komórki tuczne, są jednak szczególnie podatne na działanie cytotoksyczne i zmiany fenotypowe, które mogą być wywołane przez sam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Prace te były wspierane przez National Research Council Canada i Alberta Innovates.

Podziękowania

Dziękujemy firmie Alberta Innovates za dostarczenie CNC oraz Kenowi Harrisowi i Jae-Young Cho za ich techniczne porady podczas przygotowywania matrycy CNC/agarozy/D-mannitolu. Dziękujemy również Benowi Hoffmanowi, Heather Winchell i Nicole Diamantides za ich porady techniczne i wsparcie w konfiguracji i kalibracji biodrukarki 3D INKREDIBLE+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A
Acetic Acid (lodowaty)Sigma AldrichAX0074-6
Agaroza (OmniPur)EMD Millipore Corporation2125-500GM
Kontrola izotypu IgG chomika ormiańskiego, APC (klon: eBio299Arm)Thermo Fisher Scientific17-4888-82
B
b-MerkaptoetanolFisher ScientificO3446I-100
Sól sodowa dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD)Sigma AldrichN0632-5G
BD 5 ml Strzykawka (końcówka Luer-Lok)Igła BD309646
PrecisionGlide 26G x 1/2 calaBD305111
BioLite 24-dołkowa wielomisowaThermo Fisher Scientific930-186
BioLite 96 Well MultidishThermo Fisher Scientific130-188
BioLite 175 cm2 TermoFisher Scientific130-191
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IIMicrozone Corp., KanadaBK-2-6-B3
BSA, frakcja V (OmniPur)EMD Millipore Corporation2930-100GM
< myszy strong>C
C57BL/6Laboratorium Jacksona Przeciwciało
CD117 (c-Kit), PE (klon: 2B8)Thermo Fisher Scientific12-1171-82
CELLINK BIOINK (wkład 3 x 3 mL)CELLINK LLCIK1020000303
Środek sieciujący CELLINK CaCl2 - sterylna butelka 1 x 60 mLCELLINK LLC
CELLINK Puste wkłady 3cc z nasadkami końcowymi i końcówkowymiCELLINK LLCCSC0103000102
CELLINK HeartWare na PCCELLINKLLC wersja 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ BIODRUKARKA 3DCELLINK LLCS-10003-001
CELLINK Sterylne standardowe stożkowe dysze do biodruku 22GCELLINK LLC
CELLINK Sterylne standardowe stożkowe dysze do biodruku 25GCELLINK LLC
CELLINK Sterylne standardowe stożkowe dysze do biodruku 27GCELLINK LLC
Zestaw do proliferacji komórek II (XTT) (Roche)Wirówka 11465015001
(stołowa)Eppendorf5804R
Gwiazda Corning  96 Well Clear, płaskodenna, nieobrobiona mikropłytka PSSigma AldrichCLS3370
CO2 IncubatorBinder GmbH, Niemcy9040-0113
Cytometr przepływowy CytoFLEXBeckman CoulterA00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)Fisher Scientific44-390-7100GM
F
Falcon 15 ml polistyrenowe probówki stożkowe, sterylneCorning352095
Falcon 50 ml polistyrenowe probówki stożkowe, sterylneCorning352070
FceR1 alfa przeciwciało monoklonalne, APC (klon: MAR-1)Thermo Fisher Scientific17-5898-82
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, ciepło dezaktywowaneThermo Fisher Scientific12484028
FlowJoBecton Dickinson & Co. USAWersja 10.6.2
G
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCWersja 8.4.3
H
Hemacytometer (ulepszona Neubauer 0,1 mmm głębokości poboru)VWR15170-208
HEPES Sól sodowaFisher ScientificBP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chlorek (INT)Sigma AldrichI10406-5G
L
L-Glutamina 200 mM (Gibco)Thermo Fisher Scientific25030-081
L-mleczan lituSigma AldrichL2250-100G
M
MEM Aminokwasy endogenne 100 ml 100x (Gibco)Thermo Fisher Scientific11140-050
1-metoksy-5-metylofenazynosiarczan metylu (MPMS)Sigma AldrichM8640
Mikroprobówki (1,7 ml przezroczyste)AxygenMCT-175-C
Mikroprobówki (2,0 ml przezroczyste)AxygenMCT-200-C
MilliQ Academic (do produkcji ultraczystej wody MilliQ)MilliporeZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Jednostka filtrująca (0,2 mm Wielkość porów, 500 ml)Thermo Fisher Scientific566-0020
Filtr strzykawkowy Nalgene (0,2 mm PES, 25 mm)Thermo Fisher Scientific725-2520
P
Penicylina Streptomycyna 100 ml (Gibco)Thermo Fisher Scientific15140-122
PBS pH 7,4, bez wapnia/magnezu, 500 ml (Gibco) Thermo Fisher Scientific10010-023
Jodek propidyny, 1,0 mg/ml (invitrogen) Thermo Fisher ScientificP3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (klon: eB149/10H5)Thermo Fisher Scientific12-4031-82
Rekombinowana mysia IL-3PeproTech, Inc. 213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2,05 mM L-glutamina (Hyklon)GE HealthcareSH30027.01<
strong>S
Sarstedt 96-dołkowa okrągła podstawa PS przezroczysta mikropłytka testowa (82.1582.001)Fisher ScientificNC9913213
Azek sodu, 500 gFisher ScientificBP922I-500
Pirogronian sodu (100 mM) 100X (Gibco)Thermo Fisher Scientific11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol)Sigma Aldrich252859
roztwór błękitu trypanowego (0,4%, do mikroskopii)Sigma Aldrich93595
V
Spektrofotometr mikropłytkowy VARIOSKAN LUX (typ: 3020)Thermo Fisher ScientificVLBL00D0
monoklonalne 000664 CL1010006001 NZ4220005001 NZ4250005001 NZ4270005001 Sigma Aldrich oprogramowanie

Bibliografia

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57(2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35(2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613(2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010(2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001(2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biodruk 3Dkom rki tuczne szpiku kostnegorusztowanie hydro elowecytometria przep ywowatest ywotno ci kom rekekspresja biomarker wtest XTTuwalnianie LDH
Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.