Barwienie cytoplazmatycznego Ca2+ Fluo-4/AM w miazgi jabłkowej

Podsumowanie

Izolowane protoplasty komórek miazgi jabłkowej zostały załadowane odczynnikiem fluorescencyjnym wapnia w celu wykrycia cytoplazmatycznego stężenia Ca²⁺.

Streszczenie

Cytozolowy Ca²⁺ odgrywa kluczową rolę w rozwoju roślin. Obrazowanie wapnia jest najbardziej wszechstronną metodą wykrywania dynamicznych zmian Ca²⁺ w cytoplazmie. W tym badaniu uzyskaliśmy żywotne protoplasty komórek miazgi w procesie hydrolizy enzymatycznej. Wyizolowane protoplasty inkubowano z drobnocząsteczkowym odczynnikiem fluorescencyjnym (Fluo-4/AM) przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Sondy fluorescencyjne z powodzeniem wybarwiały cytozolowy Ca²⁺, ale nie gromadziły się w wakuolach. La^{3 +}, bloker kanału Ca^{2 +}, zmniejszał intensywność fluorescencji cytoplazmatycznej. Wyniki te sugerują, że Fluo-4/AM może być stosowany do wykrywania zmian w cytozolowym Ca²⁺ w miąższu owocu. Podsumowując, przedstawiamy metodę skutecznego izolowania protoplastów z komórek miąższowych owocu i wykrywania^Ca2+ poprzez załadowanie małocząsteczkowego odczynnika fluorescencyjnego wapnia do cytoplazmy komórek miazgi.

Wprowadzenie

Ca²⁺ odgrywa ważną rolę w transdukcji i metabolizmie sygnałów roślinnych^1,2. Ponadto reguluje cechy jakości owoców^3,4, w tym twardość, zawartość cukru i podatność na zaburzenia fizjologiczne podczas przechowywania^5,6. Cytoplazmatyczny Ca²⁺ odgrywa ważną rolę w transdukcji sygnału oraz reguluje wzrost i rozwój roślin⁷. Zaburzenie komórkowej homeostazy wapnia może wywołać gorzką pestkę u jabłek⁸, chorobę brązowej plamistości u gruszek⁹ oraz zgniliznę pępkową u pomidorów¹⁰, wpływając na jakość owoców i powodując poważne straty ekonomiczne3^,11. Obrazowanie wapnia ma wystarczającą rozdzielczość przestrzenną i czasową i jest ważną metodą obserwacji dynamiki Ca²⁺ w żywych komórkach^12,13.

Obecnie istnieją dwie główne metody wewnątrzkomórkowego obrazowania wapnia w żywych komórkach: jedna wykorzystuje chemiczne małocząsteczkowe sondy fluorescencyjne¹⁴, a druga to czujnik kodujący geny (GECI)^15,16. Biorąc pod uwagę trudności w ustanowieniu stabilnego systemu transgenicznego na drzewach owocowych i dłuższy rozwój owoców, GECI_S nie nadaje się do obrazowania fluorescencyjnego owoców^Ca2+.

Małocząsteczkowe sondy fluorescencyjne, takie jak Fluo-4/AM, mają szczególną zaletę: ich forma estru AM (przepuszczalna dla komórek pochodna estru acetoksymetylowego) może być łatwo ładowana masowo do żywych komórek bez potrzeby transfekcji, co czyni ją elastyczną, szybką i niecytotoksyczną¹⁷. Fluo-4/AM może być z powodzeniem załadowany do łagiewki pyłkowej Pyrus pyrifolia¹⁸ i Petunia,¹⁹, a także do komórek ochronnych²⁰ i włośników Arabidopsis²¹.

Obecnie istnieje niewiele doniesień na temat barwienia komórek miazgi fluorescencyjnym wapniem²². Jako ważny pierwiastek mineralny, wapń odgrywa kluczową rolę we wzroście i kontroli jakości owoców drzew, takich jak jabłka. Jabłonie są uznawane na całym świecie za ważny gatunek gospodarczy, a jabłka są uważane za zdrową żywność²³. W tym badaniu uzyskaliśmy żywotne protoplasty z miąższu owoców jabłoni poprzez hydrolizę enzymatyczną, a następnie załadowaliśmy drobnocząsteczkowe odczynniki fluorescencyjne do cytoplazmy w celu wykrycia Ca²⁺.

Protokół

1. Ekstrakcja protoplastu

1. Przygotować roztwór podstawowy: 20 mM CaCl₂, 5 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego i 0,4 M D-sorbitolu.
   UWAGA: pH roztworu podstawowego dostosowano do 5,8 za pomocą 0,1 M buforu Tris, przefiltrowano przez filtry rozpuszczalne w wodzie 0,22 μm i przechowywano w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować roztwór enzymatyczny: zmieszać 0,3% (m/v) Macerozymu R-10 i 0,5% (m/v) celulazy R-10 z roztworem zasadowym.
3. Dodać 0,5 ml roztworu enzymatycznego do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wybierz zdrowe i dojrzałe jabłko. Następnie pokrój miazgę na rozmiary 10 x 5 x 1 mm³ (Rysunek 1A-1C).
4. Umieść kawałki miąższu owoców jabłek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór enzymatyczny, a następnie zamknij probówkę (Rysunek 1D).
5. Inkubować probówkę w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 70 obr./min w wytrząsarce w ciemności.
6. Umyj kawałki miazgi. Odessać cały roztwór enzymatyczny, a następnie dodać 0,5 ml roztworu podstawowego.
7. Wirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Aby uzyskać zawiesinę protoplastów, należy odessać roztwór z dna probówki wirówkowej (Rysunek 1E).

2. Barwienie fluorescencyjne drobnocząsteczkowymi jonami wapnia

1. Przygotuj roztwór ładujący Fluo-4/AM z 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 i 10x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 80 mM Na₂HPO₄, 1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄ i 26 mM KCI) w stosunku 1:1:2.
2. Dodać 1 μl roztworu nasycającego Fluo-4/AM do 99 μl zawiesiny protoplastów obecnej w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że końcowe stężenie barwnika fluorescencyjnego wynosi 5 μM. Wymieszaj roztwór, a następnie zamknij probówkę.
3. Leczenie La³⁺: Przygotować 100 μM roztworu La³⁺ z 98 μl zawiesiny protoplastów, 1 μl 10 mM La³⁺ i 1 μl roztworu ładującego Fluo-4/AM. Wymieszaj roztwór i zamknij probówkę.
4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
5. Przemyć protoplasty przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać 70 μl roztworu i dodać 70 μl roztworu podstawowego.
6. Zawiesinę protoplastów inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu całkowitej deestryfikacji.
7. Odessać 15 μl zawiesiny protoplastów i wlać na szkiełko.
8. Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek uzupełniający S1).
   UWAGA: Użyj kolorowej kamery o wysokiej czułości, tj. matrycy CMOS 3.2 MP (2048 x 1536) o rozdzielczości piksela 3.45 μm.
9. Wybierz kanał GFP do obrazowania (20x). Ustaw jasność na 0.5.
   UWAGA: Oświetlenie to kostki świetlne LED o regulowanej intensywności ze zintegrowanym zestawem filtrów z twardą powłoką. Długość fali wzbudzenia Fluo-4/AM wynosi 490 nm.

3. Test żywotności protoplastów

1. Przygotować roztwór podstawowy dioctanu fluoresceiny (FDA): Rozpuścić FDA w acetonie, aż końcowe stężenie wyniesie 1 mg/ml.
2. Przygotować roztwór roboczy FDA z 1 μl roztworu podstawowego i 99 μl acetonu.
3. Dodać 1 μl roztworu roboczego FDA do 99 μl zawiesiny protoplastów. Wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół, a następnie zamknąć probówkę.
   UWAGA: Końcowe stężenie FDA wynosi 100 μg/L.
4. Bejcować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności.
5. Przygotuj szkiełka i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.
6. Wybierz kanał GFP do obrazowania ( Rysunek 1F).

4. Analiza obrazu

1. Analizuj uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów i arkuszy kalkulacyjnych (np. Image-Pro Plus i Excel 2010).
2. Wybierz dwie średnice pionowe z protoplastów, aby obliczyć intensywność fluorescencji (rysunek uzupełniający S2). Zmierzono intensywność fluorescencji wszystkich protoplastów poddanych różnym zabiegom. Do końcowej obróbki użyj oprogramowania do edycji zdjęć.

5. Analiza statystyczna

1. Przeprowadzić analizę statystyczną za pomocą oprogramowania statystycznego (rysunek uzupełniający S3). Dane prezentowane są w postaci średniej ± SD. Test t studenta został wykorzystany do analizy różnic między grupami eksperymentalnymi.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, zastosowano metodę enzymatyczną w celu uzyskania żywotnych protoplastów z miąższu (Rysunek 1). Niektóre protoplasty posiadały wakuole, inne zaś nie. Protoplasty nie wykazywały fluorescencji, gdy nie wprowadzono do nich fluorescencyjnego wskaźnika Ca²⁺. Po wprowadzeniu Fluo-4/AM do protoplastów, cytoplazma, a nie wakuola, stała się fluorescencyjna (Rysunek 2). Wynik ten wskazał, że Fluo-4/AM skutecznie zabarwił Ca...

Dyskusja

W tym badaniu żywe protoplasty uzyskano w procesie hydrolizy enzymatycznej. Pamiętaj, że ta metoda wymaga świeżych jabłek. Obecny protokół pozwala na szybką izolację dużej liczby protoplastów z miazgi owocowej w celu wykorzystania w badaniach naukowych. Możliwość zastosowania tej metody nie ogranicza się do "Fuji"; protoplasty miazgi jabłkowej odmian 'Dounan' i 'Honey Crisp' mogą być również ekstrahowane za pomocą tego samego protokołu (rysunek uzupełniający S4). Roztwór protoplastu po enzymolizie zawier...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10&krotnie buforowana solą fizjologiczną	Solarbio	P1022	PBS (roztwór buforowany fosforanem) to buforowy roztwór fosforanowy, który może zapewnić stosunkowo stabilne środowisko jonowe i zdolność buforowania pH. Jest to roztwór soli buforowej często stosowany w biologii do klonowania molekularnego i hodowli komórek. pH wynosi 7,4.
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy	Solarbio	M8010	Bufor biologiczny
CaCl2· 2H2O	Solarbio	C8370	Dwuwodny chlorek wapnia jest białą lub szarą substancją chemiczną, głównie w postaci granulatu.
Celulaza R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade ściany komórkowe roślin.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	Posiada dobre właściwości nawilżające, zapobiega wysuszeniu, a także zapobiega krystalizacji cukru, soli itp.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 to niejonowy poliol powierzchniowo czynny (masa cząsteczkowa około 12500 daltonów), który okazał się korzystny w promowaniu rozpuszczania nierozpuszczalnych w wodzie barwników i innych materiałów w pożywkach fizjologicznych.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA to perfekcyjny substrat esterazy przenikający komórkę, który może służyć jako sonda żywotności, która mierzy zarówno aktywność enzymatyczną, która jest wymagana do aktywacji jej fluorescencji, jak i integralność błony komórkowej, która jest wymagana do wewnątrzkomórkowego zatrzymywania ich produktu fluorescencyjnego.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	Zielony fluorescencyjny wskaźnik wapnia Fluo-4/AM jest ulepszoną wersją wskaźnika wapniowego Fluo-3/AM. Fluo-4/AM ładuje się szybciej i jest jaśniejszy przy tym samym stężeniu. Można go dobrze wzbudzić za pomocą lasera jonowego argonu o długości fali 488 nm.
Mikroskop fluorescencyjny	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Obserwować obraz fluorescencyjny.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Rozkład tkanki roślinnej w celu oddzielenia pojedynczych komórek.
Tris	Solarbio	T8060	Jest szeroko stosowany do przygotowywania w eksperymentach biochemicznych i biologii molekularnej.